Bu protokol, in vitro ekimine ve deepitelizasyon ve hava yolu dokusu rejenerasyonu gibi farklı doku manipülasyon prosedürleri sırasında izole hava yolu dokularının doğrudan mikroskobik olarak görselleştirilmesine izin verir. Bu çalışmada önerilen in situ görüntüleme, endojen epitelin görüntüleme eşliğinde kontrollü çıkarılması ve eksojen hücrelerin verilmesi sırasında trakeal lümenin hızlı ve tahribatsız izlenmesini sağlar. Görüntüleme rehberliğinde biyoreaktif platform ve doku manipülasyon protokolleri, hastalık modellemesi ve ilaç taraması için biyomühendislik hava yolu dokusu oluşturmak için kullanılabilir.
Görüntüleme özellikli hava yolu doku biyoreaktörünün yapımı ve kullanımı, araştırma grubumuzdan iki doktora öğrencisi Mohammad Mir ve Jiawen Chen tarafından gösterilecektir. Yerinde görüntüleme aygıtı oluşturmaya başlamak için, istiflenebilir bir lens tüpüne bir tüp lens yerleştirin ve bir tutma halkası kullanarak sabitleyin. Ardından, lens tablası tertibatını bir C montaj adaptörü aracılığıyla bilimsel bir CMOS kameraya monte edin.
Kamerayı çalıştırmak ve fotoğraf ve video almak için Micromanager yazılımını kullanın. Kameradan 10 metre uzakta bulunan bir nesneyi hedeflerken, bilgisayar ekranında nesnenin odaklanmış bir görüntüsü oluşana kadar tüp lensi ile kameranın görüntüleme sensörü arasındaki mesafeyi ayarlayın. Ardından, bir filtre lensini çift kenarlı, süper çözünürlüklü, dikroik aynaya ve bir lazere cihaza monte etmek için montaj çubuğu, dişli kafes plakası ve kafes küpü gibi optik kafes sistemi bileşenlerini kullanın.
Cihaza 20X objektif lens bağlayın. Ardından, X-Y tercümanı aracılığıyla lens tüpünün distal ucuna 500 mikrometre çapında yeşil bir lens takın. Odaklanmış mikroskobik görüntüleri oluşturmak için yeşil ve objektif lensler arasındaki mesafeyi ayarlayın.
İzole sıçan trakea lümenini parlak alanda veya floresanda görselleştirmek için, biyoreaktörü görüntüleme aşamasına yerleştirin. Daha sonra, taze hazırlanmış karboksifloresein süksinimidil ester veya CFSE çözeltisinin 500 mikrolitresini, trakea kanülünün borusuna bağlı şırınga pompası aracılığıyla trakeadan dakikada beş mililitre akış hızında infüze edin. CFSE çözeltisi trakeayı doldurduktan sonra, pompayı durdurun.
10 dakika sonra, artık dahil edilmemiş CFSE reaktiflerini çıkarmak için şırınga pompasını kullanarak 10 mililitre PBS infüze ederek trakea lümenini yıkayın. Yıkamadan sonra, yeşil lensin distal görüntüleme ucunu trakea'nın bir ucuna bağlı luer konektörü aracılığıyla trakeaya yerleştirin. Ardından, trakea yüzeyi odaklanana kadar yeşil lensi trakeanın içinde yavaşça hareket ettirin.
Micromanager yazılımında parlak alan görüntülerini yakalamak için, trakea lümenini kafes küpü boyunca beyaz ışıkla aydınlatın. Ardından, trakeanın parlak yüzeyini gerçek zamanlı olarak göstermek için Canlı simgesine tıklayın. Pozlama süresini istenen değere değiştirmek için Görüntüleme ayarını ve Pozlama sekmelerini kullanın.
Görüntülerin kontrastını ve parlaklığını ayarlamak için, etkileşimli histogram ekranının bitiş noktasındaki siyah beyaz okları taşımak üzere histogram ve yoğunluk ölçeklendirme penceresini kullanın. Tutturma simgesini etkinleştirmek için Canlı Olarak Durdur'u tıklayın, ardından görüntüyü dondurmak için Tutturma simgesine tıklayın. Ardından, görüntüleri istenen biçimde kaydetmek için Görüntüleri Dışa Aktar ve ardından Yer Değiştir sekmeleri olarak ayarı kullanın.
Floresan modunda fotoğraf ve video elde etmek için, trakea lümenini kafes küpünden CFSE'ye özgü lazer ışığıyla aydınlatın ve görüntüleme probunu ileri geri hareket ettirerek görüntüleri gerçek zamanlı olarak elde edin. Fotoğraflar ve videolar elde edildikten sonra, yeşil lensi trakeadan yavaşça çıkarın. Trakeanın epitelizasyonu için, trakea lümeni üzerinde ince bir deterjan çözeltisi filmi oluşturmak için trakea kanülünden taze hazırlanmış% 2 sodyum dodesil sülfatın 50 mikrolitresini aşılayın.
Damlatma işleminden sonra, erkek veya dişi luer tapaları kullanarak biyoreaktörün boru bağlantılarını kapatın ve SDS'nin trakea içinde yaşamasına izin vermek için biyoreaktörü 10 dakika boyunca 37 santigrat derecelik bir inkübatöre aktarın. Damlatma işlemini bir kez tekrarlayın. İkinci damlatma işleminden sonra, trakea lümenini dakikada 10 mililitre akış hızında şırınga pompası aracılığıyla 500 mikrolitre PBS ile üç kez sulayarak lize epitel ve SDS'yi çıkarın.
Daha sonra, SDS ile muamele edilen epitel hücrelerinin trakea lümeninden ayrılmasını fiziksel olarak teşvik etmek için biyoreaktörü 20 Hertz frekansında ve 0.3 milimetrelik bir yer değiştirme genliğinde mekanik olarak titreşmesi için bir çalkalayıcıya yerleştirin. Trakea mekanik olarak titreştirilirken, artık SDS ve hücre kalıntılarını gidermek için trakea lümeninden iki kez 500 mikrolitre PBS aşılayın. Epitel çıkarılmasını takiben, yeşil lens görüntüleme cihazını kullanarak CFSE'nin yoğunluğunu ölçerek epitel tabakasının klirensini değerlendirin.
Epitelize edilmiş bir sıçan trakeasını hazırladıktan sonra, dondurulmuş mezenkimal kök hücreleri veya MSC'leri 37 santigrat derecelik bir su banyosunda 30 saniye boyunca çözün. Daha sonra, hücreleri bir hemositometre ile sayın, ardından mililitre başına altı hücreye beş kez 10 konsantrasyonda bir hücre çözeltisi hazırlayın. Daha sonra, hücreleri oda sıcaklığında iki mililitre 100 mikromolar CFSE çözeltisi ile inkübe ederek floresan olarak etiketleyin.
15 dakika sonra, hücreleri beş mililitre PBS ile üç kez durulayın, ardından taze bir DMEM kültür ortamında, mililitre başına yedi hücreye üç kez 10 oranında son bir konsantrasyonda yeniden askıya alın. Kollajen I hidrojelinin hazırlanmasından hemen sonra, makalede açıklandığı gibi, hücreleri istenen konsantrasyonda hidrojel çözeltisine ekleyin. Daha sonra, düzgün bir hücre-hidrojel karışımı elde etmek için hücreleri ve jel çözeltisini bir mikropipetle karıştırın.
Daha sonra, biyoreaktör içindeki trakeanın bir ucunu bir luer konektöründen programlanabilir bir şırınga pompasına takın ve trakeanın dış yüzeyini kaplamak için 37 santigrat derecede biyoreaktör odasına beş mililitre taze kültür ortamı verin. Daha sonra, trakea lümeni üzerinde bir hücre-hidrojel tabakası oluşturmak için biyoreaktör içindeki de-epitelize trakeaya hücre-hidrojel karışımının 10 mikrolitre bolusunu uygulayın. Hücre enjeksiyonundan sonra, biyoreaktörü steril bir hücre kültürü inkübatörüne 37 santigrat derecede ve jelleşmeye izin vermek için 30 dakika boyunca jelleşme için% 5 karbondioksit yerleştirin.
İmplante edilen hücrelerin dağılımını görselleştirmek için, yeşil lensi% 70 izopropil alkol veya etanol ile sterilize edin ve fotoğrafları ve videoları hem parlak alan hem de floresan modlarında elde etmek için biyoreaktörü görüntüleme aşamasına yerleştirin. 30 dakikalık hücre tohumlamasından sonra, trakea lümenine dakikada bir mililitre akış hızında bir mililitre kültür ortamı demleyin. Son olarak, biyoreaktör içindeki hücre tohumlu trakeayı bir inkübatörde istenen süre boyunca 37 santigrat derecede kültürleyin.
Hücre kültürü sırasında, medyayı lümen statik içinde tutarken, trakea dışındaki medya sürekli olarak tek yönlü bir akış yoluyla perfüze edilir. Epitelize trakeanın parlak alan ve floresan görüntülerinde, CFSE etiketlemesinden önce floresan sinyali gözlenmedi. CFSE ile, epitel boyunca düzgün bir floresan sinyali gözlendi.
Epitelizasyonun kesilmesini takiben, floresan yoğunluğu önemli ölçüde azaldı ve epitelin ablasyonunu gösterdi. Deepitelize trakeanın hematoksilin ve eozin boyaması, psödo-tabakalaşmış epitelin trakea lümeninden uzaklaştırılmasını ve altta yatan doku katmanlarında hücrelerin ve hücre dışı matriksin veya ECM mikro yapılarının korunmasını göstermiştir. Ayrıca, pentakrom ve trikrom boyama, trakea doku mimarisinin ve kollajen ve proteoglikanlar gibi ECM bileşenlerinin korunmasını doğruladı.
Epitel hücrelerinin ve kollajen I'in immünofloresansı, epitelin tamamen çıkarıldığını ve kollajen I'in subepitel dokusu içinde korunduğunu ortaya koydu. Taramalı elektron mikrografları, doğal trakeanın multisiliye ve kadeh hücreleri ile doldurulduğunu gösterdi. Deepitelize trakeada, bazal membran, hücre dışı matriks liflerinin bir ağ ağı ve epitel hücrelerinin yokluğu ile belirtildiği gibi açığa çıktı.
Epitelize trakeanın PBS ve kollajen ile tohumlandıktan sonra floresan görüntüleri burada gösterilmiştir. Kültür ortamı yoluyla tohumlanan hücrelerle karşılaştırıldığında, hidrojel yoluyla verilen floresan etiketli hücreler, lümen boyunca daha düzgün bir şekilde yapışmış olarak kaldı. Hücre canlılığı çalışması, canlılığın hücre dağıtım prosedüründen etkilenmediğini ve hücrelerin% 90'ından fazlasının canlı kaldığını göstermiştir.
Deepitelizasyon işleminde ince bir deterjan filmi oluşturmak ve hidrojeli hücreler için bir dağıtım aracı olarak kullanmak, bu protokolün başarısı için gerekli adımlardır. Bir sonraki araştırma hedefimiz, fonksiyonel hava yolu dokusunun hazırlanıp hazırlanamayacağını araştırmak için laboratuarda yetiştirilen hava yolu primer veya kök hücresini deepitelize hava yolu dokusuna implante etmektir.
