Yazarlar NJC Ulusal Araştırma Vakfı (UÇK -NRFF2011-01 ve NRF2015NRF-POC0001-19), Ulusal Medikal Araştırma Konseyi (NMRC / CBRG / / 2012 0005) ve Nanyang Technological University gelen destek için teşekkürlerimizi sunarız

Bir Hidrofilik Katı Destek Desteklenen çift katlı lipid 1. oluşumu <ol><li> 10 mg / ml 1,2-dioleoil-sn -glisero-3-fosfokolin lipid stok çözelti hazırlayın (DOPC) ve 1 mg / ml 1,2-dioleoil-sn -glisero-3-phosphoethanolamine- A ^ - (lisamin rodamin B ilgili lipid tozlar çözülmesiyle sülfonil) (Rh-PE) (uygun şekilde izopropanol çözeltisi içinde bir analitik kitle balansı) ile daha önce tartılmış. </li><li> Seyreltilir ve nihai konsantrasyonda istenilen lipid karışımı hazırlamak için izopropanol içindeki stok çözeltileri karıştırın. Floresans mikroskobu ve sıkı bağlamak deneyler için,% 0.5 ağırlık Rh-PE lipit karışımı içinde dahil edilmelidir. </li><li> Dolana kadar o mikroakışkan kanal içine izopropanol lipid karışımı enjekte edilir. </li><li> Yaklaşık 10 dakika boyunca bir cam yüzeyi üzerinde, lipid karışımı inkübe edin. </li><li> Yavaş yavaş çok düşük bir akış hızında, bir peristaltik pompa kullanılarak, su veya tampon solüsyonu ile lipid çözeltisi yerine(10-50 ul / dakika). Seçenek olarak ise, tekrar pipetleme lipit karışımı değiştirin. </li><li> Kalıntı izopropanol çıkartmak için aşırı tamponu ile iyice kanal durulayın. </li></ol> Kolesterol zenginleştirilmiş Desteklenen Membran 2. oluşumu Not: Katı yüzeyi (SiO 2) vezikül füzyon destekler, ancak kolesterol zenginleştirilmiş kesecikler yüksek sertliği 30 bükme çünkü membran bileşimi (yüksek kolesterol) vezikül füzyon engeller. <ol><li> İlk izopropanol ilgili tozların eritilmesi ile 10 mg / ml lipid DOPC, 10 mg / ml kolesterol ve 1 mg / ml Rh PE ihtiva eden bir stok çözelti hazırlayın. </li><li> Yineleyin adımda 2.1 hazırlanan stok solüsyonları kullanılarak 1.2-1.6 adımları tekrarlayın. </li></ol> 3. Membran Akışkanlık Testi <ol><li> 10 dakika boyunca, sodyum dodesil sülfat (SDS) çözeltisi (% 1) içinde cam slayt bırakın. </li><li> Deiyonize su ile iyice yıkayın slaytlar ve zekâ durulamah etanol. </li><li> Darbe-kuru hafif bir azot akımı kullanılarak slaytlar. </li><li> Oksijen plazma odasına maksimum radyofrekans gücünde 30 saniye boyunca oksijen plazma slaytlar Açığa. </li><li> Dipsiz ticari mikroakışkan odası (Şekil 1A) koruyucu film kaplamayı bir cımbız kullanarak çıkartın ve bölmenin (Şekil 1B) yapışkan yüzüne cam slayt takın. </li><li> Odasının giriş ve çıkış pozisyonlarına içine konnektörleri ve tüp monte edin ve mikroskop sahne (Şekil 1C) üzerine mikroakışkan kanal yerleştirin. </li><li> Mikroakışkan kanal bir floresan etiketli desteklenen lipid çift Form [istenen lipit bileşimi kullanılarak tekrar aşama 1 (örneğin, 0.5 mg / ml DOPC) 0.5 ağırlık% Rh-PE organik bir çözücü de dahil olmak üzere]. </li><li> Görüntü yakalamak için 60X yağa batırılmış objektif (NA 1.49) ile iki tabakalı uçağı bulun. </li><li> İki ön ağartıcı görüntüleri çekmek, daha sonra 30 foto-ağartıcı1; a 532 nm, 100 mW lazer ışını ile geniş dairesel nokta m. Onun yoğunluğu dengeli hale gelene kadar photobleaching önce, lazer ısınmak. Hemen photobleaching sonra, ağartılmış noktada floresan kurtarma takip etmek amacıyla 2 dakika süreyle her 1 sn görüntüleri bir dizi yakalamak. </li></ol> 4. Kolesterol Ölçümü Testi <ol><li> Oksijen plazma odasına maksimum radyofrekans gücünde 30 saniye boyunca oksijen plazma silikon dioksit kaplı kuvars kristal sensör çipi Açığa. Odasından çipini çıkarın ve hemen ölçüm odasında çip monte edin. </li><li> Deneyden önce, ilk olarak uygun bir şekilde monte edilebilmesini sağlamak için hava içinde sensör yongasının sıklığı ve dağılımı elde. <ol><li> Ticari Q-Sense E1 veya E4 QCM-D enstrüman için, Q-Soft yazılım programı çalıştırın ve &quot;Toplama&quot; linkine tıklayın ve &quot;Kurulum Ölçüm&quot; seçeneğini seçin. </li><li> Görüntülenen Yeni penceresinde, 3, 5, 7 çek, 9, 11 ve 13 imalar ardından bulun ve rezonans spektrumları kontrol etmek için çalıştırın tıklayın. 24 sıcaklık ayarlama ° C. Kişinin ya da daha fazla rezonans frekansları beklenen değerlerle kabul etmiyorsanız, montaj çip kontrol edin ve bir anlaşmaya ulaşılana kadar bu adımı tekrar gerçekleştirin. </li></ol></li><li> Peristaltik pompayı 100 ul / dakikalık bir akış hızında ölçüm haznesine tampon çözeltisi (10 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7.5) akar. </li><li> Yazılım programında, &quot;Toplama&quot; linkine tıklayın ve rezonans frekansı ve enerji sönümleme sinyallerini kaydetmek için &quot;Yeniden Ölçümü&quot; seçeneğini seçin. Istikrarlı bir temel frekans ve dağıtma vardiya için elde edilene kadar bu adımı yineleyin. Not: zamanın bir fonksiyonu olarak kaydedilmektedir edilebilir ilave frekans ve enerji kaybı değişimleri olacak bundan sonra adımlar için. </li><li> 10 dakika boyunca (lipid) olmadan izopropanol enjekte edilir. </li><li> En DOPC lipid / kolesterol karışımı enjekte10 dakika boyunca, izopropanol içinde 0.5 mg / ml&#39;lik bir toplam lipid konsantrasyonu, istenen mol oranı. </li><li> 100 ul / dakikalık bir akış oranında 20 dakika boyunca tampon enjekte edilir. </li><li> Tampon maddesi (oran 100 ul / dakika akış) frekans sinyalinin stabil bir değere ulaşıncaya kadar hazırlanan 1 mM metil-β-siklodekstrin (MβCD) ihtiva eden bir çözelti enjekte edilir. </li><li> MβCD muamele aşamasından kaynaklanan görece olumlu frekans değişimleri ölçün ve [Δm = Sauerbrey denklemi kullanarak toplu değerlere kadar taşınmış cho ve mesafe kadar taşınmış DOPC değerleri dönüştürerek kolesterol ve DOPC lipidlerin kütlesi hesaplamak - (C / n) × mesafe kadar taşınmış, burada C = 17,7 ng / cm 2, n: overtone]. </li><li> Dikkate DOPC lipid (786,1 g / mol) ve kolesterol (386.6 g / mol) molekül ağırlıklarına alarak SLB içinde kolesterol mol fraksiyonu hesaplayın. </li></ol>

The authors have no competing financial interests to disclose.

Bu çalışmada, bir çözücü-değişimi protokolü, bir katı destek ile inkübe edilir alkol (izopropanol, etanol veya n-propanol), hangi lipidler içinde sunulmaktadır ve daha sonra alkol, bir dizi kumanda etmek üzere, sulu bir tampon solüsyonu ile yavaş yavaş değiştirilir Faz geçişleri sonunda katmanlı fazlı çift katlı lipit katmanını 24 üreten. Bu yöntem, vezikül füzyon yöntemine dirençli olan altın gibi yüzeyler üzerinde desteklenen lipid iki katmanlı imalatım mümkün olduğu gösterilmiştir. Optimal bir lipid konsantrasyonu aralığı (0,1-0,5 mg / ml) Şimdiye kadar test edilen standart deneysel biçimleri tam çift katlı bir oluşum için tespit edilmiştir. Iki katmanlı 0.1 mg / ml arasında, ayrı ayrı, mikroskopik yamalar aşağıdaki lipit konsantrasyonlarında kurdu. Diğer taraftan, 0.1 mg / ml&#39;nin üzerindeki konsantrasyonlarda ve daha az daha 0,5 mg / ml, tam ve düzgün bir iki katmanlı oluşturulmaktadır. Bu aralığın üstüne lipit konsantrasyonlarında, iki katmanlı bir sıvı hala doğrulanmadan olarak elde edildiFRAP analizi ile ed Ancak, floresan mikroskobu çift katmanı üstüne ilave lipit yapıların varlığını gösterir. QCM-D analizi ile belirlendiği gibi, çarpıcı bir biçimde, bu ek de lipit yapıların morfolojisi, inkübasyon kademesi sırasında kullanılan alkolün bağlıydı. Etanol olması durumunda, nispeten yüksek Δ F ve Δ D kaymalar bir adsorbe vezikül tabakası için elde edilen QCM-D imza benzer. Izopropanol ya da n-propanol yerine kullanıldığı zaman Δ D kayda değer ölçüde daha yüksek iken, Δ f bir iki katmanlı (-30 Hz -40 arasında nihai Δ f) için tahmin edilen değerden biraz daha yüksek olmuştur. Bu tür QCM-D yanıtları (bazı durumlarda flüoresans mikroskopi ile görünür gibi) membran yüzeyinden dışarı doğru çıkıntı yapan uzun bir lipit yapıların (örneğin, solucan benzeri miseller) için beklenir. Çözücü değişimine oranı espec, kritik öneme sahip bir başka önemli parametredirAlt lipid konsantrasyonları (örneğin, 0,1 mg / ml) kullanılmıştır selülazlar olduğunda. Düşük lipid konsantrasyonunda hızlı solvent alış veriş eksik çift tabakaların oluşmasına yol açar. Bu yazıda QCM-D ölçümlerinin (Q-Sense E4 ölçüm odası), yaklaşık 100 ul / dk akış oranları için kullanılan standart ölçüm odasında, yüksek tekrarlanabilir tam iki katmanlı oluşumuna uygun idi. Diğer geometriler ve hacim ile akış hücreleri için, uygun bir akış hızı değişebilir ve ampirik olarak burada önerilen adımları göre belirlenmelidir. Vezikül füzyon dirençli olan yüzeyler üzerinde desteklenen lipid ikili katlar oluşturacak ek olarak, SALB böylece kompleks bileşimleri ile desteklenen zarların imalat kapı açma, yırtılabilir lipid vezikülleri için ihtiyaç aşmak için kullanılabilir. Açıklayıcı bir örnek, bir bileşim olarak, kolesterol, yüksek fraksiyonlu lipit karışımları incelenmiştir. Kolesterol memeli konakçının önemli bir bileşenidiralian hücre zarları ve onun fraksiyonu (eritrositler içinde, örneğin) membran lipid bileşiminin 45-50 mol% yaklaşım olabilir. Bu durumda, bir insan hücre zarı temsil eden bir çift katlı lipid bile basit bir model kolesterol içermelidir. Vezikül füzyon sadece% 10-15 kolesterol ihtiva eden akışkan bir lipid ikili tabakaları imal etmek için kullanılabilir ise 36 (QCM-D ölçümleri sayıya dökülmüş olarak 57% mol kadar), SALB yöntemi yüksek kolesterol içeren fraksiyonlar akışkan lipid iki katmanlı oluşum sağlamaktadır. Kolesterol seviyesi daha (63 mol kadar%) yükselmiş, ancak, şerit şeklinde alanları 37 gözlendi. Yandaş etki hava-su arayüzünde kolesterol / fosfolipidler tek tabaka faz diyagramı β bölgede gözlenen anımsatan sıvı vardı. Genel olarak, SALB yöntemi özellikle, desteklenen lipid ikili katlar oluşturacak için basit ve verimli bir yaklaşım olduğu gösterilmiştirGeleneksel vezikül füzyon yöntemi kapsamı dışındadır n olgu. Şu ana kadar, QCM-D tekniği ve floresan mikroskobu esas SALB metodu ile oluşturulmuş desteklenen lipit katmanlarını karakterize etmek için kullanıldı. İleriye yönelik olarak, yüzey plasmon rezonansı (SPR) 38, atomik kuvvet mikroskobu (AFM) 39,40 olmak üzere yüzey duyarlı analitik ölçümler teknikleri, geniş bir yelpazede, kızılötesi spektroskopi 41 Fourier-dönüşümü, X-ışını 42 ve nötron yansıtma 43 can, Daha fazla karakterize ve basit ve karmaşık iki katmanlı yapılandırmaları SALB yöntemiyle hazırlamak incelemek için kullanılabilir. Bunlar gelişmekte olan yetenekleri basit ve sağlam deneysel protokol yararlanarak yapay hücre zarlarını keşfedebilirsiniz bilim adamlarının daha fazla sayıda kapıyı açın.

Katı destekli lipid iki katmanlı 1 (SLB) bu tür iki tabakalı bir kalınlıkta, iki boyutlu lipit yayılma ve membran bağlantılı biyomoleküllerin barındırmak yeteneği gibi biyomembranlar temel özelliklerini koruyan çok yönlü bir platformdur. Nedeniyle doğal hücre membranlarının karmaşıklığı nedeniyle, bu basit bir platform 3, virüs ve virüs benzeri partikül 4,5 ciltleme gibi Sal oluşumu 2, protein gibi zara bağlı süreçlerin, in vitro çalışmalar için etkili bir platform işlevi gösterilmiştir ve hücre 6 sinyalizasyon. Katı bir desteğe yakın olarak kurulan SLB bu platform, toplam iç yansıma mikroskobu (TIRF), kuartz kristali mikro--dağılımı (QCM-D) ve empedans spektroskopi gibi yüzey duyarlı ölçümleri bir dizi teknik ile uyumludur. Çeşitli yöntemler de dahil olmak üzere hava kabarcığı SLBs farklı üretmek için geliştirilmiştirmikrondan daha küçük ebatlı lipit noktalar çöküşü 7 ve dip-kalem Nanolitografi 8, spin-kaplama iki tabakalı yığınları ve Langmuir-Blodgett (LB) 10 ve tam yayılarak, tek çift katlı lipid kaplamalar için vezikül füzyon (VF) 11 9. VF yöntem, sürekli bir lipid çift oluşturmak için katı bir destek ve daha sonra kendiliğinden kopma ve füzyon küçük tek lamelli vesiküller adsorpsiyonu oluşur. Bununla birlikte, fizyolojik koşullar altında kendiliğinden vezikül yırtılması ağırlıklı olarak silikon dioksit, cam ve mika gibi silikon bazlı malzemeler ile sınırlıdır. Buna ek olarak, vezikül yırtılması kolesterol veya negatif yüklü yüksek lipid içeren fraksiyonlar gibi karmaşık lipid bileşimlerin keseler kendiliğinden oluşmaz. Sisteme bağlı olarak, vezikül yırtılması daha sıcaklık 12, çözelti pH 13 ve tuzluluk 14, ozmotik şok 15 gibi deneysel koşulların uyarlayarak indüklenebilir </sbasınç 16, ya da Ca2 + gibi iki değerlikli iyonların yanı sıra yukarı&gt; ya da 17. Buna alternatif olarak zar aktif peptidi AH bir dizi vezikül kopma ve iki tabakalı bir oluşumuna yol açan, adsorbe veziküller bir tabaka destabilize etmek için dahil edilebilir 18-22 yüzeyleri. Ayrıca, başarılı bir şekilde iki katmanlı oluşum zaman alıcı ve belli membran bileşimleri için elde etmek zor olabilir küçük tek lamelli vesiküller ve iyi kontrol edilen bir nüfus hazırlanmasını gerektirir. Bu nedenle, optimal durumlarda yüksek verimliliğine rağmen (örneğin, veziküller 23 geniş dondurma-eritme öncesi işlemden sonra), vezikül füzyon genel uygulama için uygun alt tabakalar ve membran bileşimlerinin kapsamı ile sınırlıdır. Çözücü yardımlı lipid iki katmanlı (SALB) yöntemi 24-28 lipid kabarcıklar gerektirmeyen alternatif bir üretim tekniğidir. Yöntem biriktirme o dayanmaktadırSLB oluşumunu tetiklemek için, sulu bir tampon çözelti ile bu çözücü yavaş yavaş değişimi, ardından su ile karışabilen bir organik çözücünün varlığında, bir katı yüzey üzerine ön lipit molekülleri. Solvent değişim aşamasının, lipidler, bir organik çözücü üçlü karışım ve su sırasında yığın solüsyonu içinde bir katmanlı faz yapısında oluşumu ve katı bir substrat üzerinde SLB neden su oranının, artan bir dizi faz değişimlerine maruz kalır. Önemli olarak, bu kendi kendini montaj yolu genellikle SLB içinde adsorbe veziküllerin transformasyonu için sınırlayıcı bir adımdır vezikül yırtılması, ihtiyacı atlar. Protokol silikon dioksit, alüminyum oksit, krom, indiyum tin oksit, altın yüzeyleri de dahil olmak üzere geniş bir yelpazede uygulanabilir. Bu yazıda ve beraberindeki video, SALB ve vezikül füzyon yöntemleri ile lipid birikimi bir karşılaştırma sunulmaktadır. Özel olarak, deney parametreleri etkisi de dahil olmak üzere, lipid konsantrasyonu,Akış oranı ve SALB yöntemi ile oluşturulan çift katlı kalitesi su ile karışabilen bir organik çözücü seçimi, tartışılmıştır. Imal edilmiş SLBs Analitik Karakterizasyonu (FRAP) teknikleri ışıkla ağartma sonra QCM-D, flüoresan mikroskobu ve floresan kurtarma ile gerçekleştirilir. QCM-D izleme Keller ve Kasemo 29 tarafından yapılan öncü çalışmalar, çünkü geniş bir nicel iki katmanlı oluşum araştırmak için kullanılmıştır, bir yüzey-duyarlı bir kütle ölçümü tekniğidir. Floresan mikroskopi zar homojenliği denetlenmesine yanı sıra membran etki görselleştirme izin verir. FRAP tekniği akışkan zarlarının esas bir özelliği olan, SLB, lipid moleküllerinin yatay hareketlilik belirlemek için standart bir araçtır. Bu çalışmanın ilk bölümü silikon dioksit ve altın iki tabakalı oluşumunu girişimi uygulanan SALB of QCM-D analizi ve vezikül füzyon yöntemleri içerir. İkinci bölümde ise,hazırlanması ve SALB yöntemi ile kolesterol konsantrasyonlarının bir dizi içeren bir taşıyıcı membran karakterizasyonu gösterilmiştir ve sonuçlar vezikül füzyon metodu ile elde edilen sonuçlarla karşılaştırılmıştır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1459">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:719px;">QCM-D silicon dioxide-coated substrates</td>
			<td style="width:356px;">QSense AB,&#160; Sweden</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QCM-D gold-coated substrates</td>
			<td style="width:356px;">QSense AB,&#160; Sweden</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Q-Sense E4 module</td>
			<td>QSense AB,&#160; Sweden</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Plasma Cleaner, PDC-32G</td>
			<td>Harrick Plasma, Ithaca, NY</td>
			<td>PDC-001 (115V)&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:719px;">1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850375P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (ammonium salt) (Rh-PE)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>810150P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">cholesterol</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:217px;">700000P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methyl-&#946;-cyclodextrin</td>
			<td style="width:356px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:217px;">C4555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:356px;">Sigma&#160;</td>
			<td align="right">673773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:719px;">Ethanol</td>
			<td style="width:356px;">Sigma&#160;</td>
			<td align="right" style="width:217px;">459844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:719px;">n-propanol</td>
			<td style="width:356px;">Sigma&#160;</td>
			<td align="right">279544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:719px;">Sticky-Slide I 0.1 Luer</td>
			<td style="width:356px;">IBIDI</td>
			<td align="right" style="width:217px;">81128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:719px;">Male elbow 1/8&#8221;</td>
			<td style="width:356px;">Cole-Parmer</td>
			<td style="width:217px;">30505-70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:719px;">Silicon tubing 1.6mm ID</td>
			<td style="width:356px;">IBIDI</td>
			<td align="right" style="width:217px;">10842</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:719px;">Glass coverslip No. 1.5H, 25 mm x 75 mm</td>
			<td style="width:356px;">IBIDI</td>
			<td align="right" style="width:217px;">10812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:719px;">Reglo Digital M2-2/12 Peristaltic Pump</td>
			<td style="width:356px;">Ismatec</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:719px;">Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td style="width:356px;">Sigma&#160;</td>
			<td align="right" style="width:217px;">71725</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

biomembrane fabrication by the solvent-assisted lipid bilayer (salb) method

Hücre zarları taklit etmek amacıyla, desteklenen çift katlı lipid (SLB) katı yüzeylere biyouyumluluk ve biofunctionality kazandıran ise membran ile ilgili süreçlerin in vitro soruşturma sağlayan çekici bir platformdur. Fosfolipit keseciklerin spontan adsorpsiyon ve kopma SLBs oluşturmak için en yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. Bununla birlikte, fizyolojik koşullar altında, vezikül füzyon (VF) lipid bileşimleri ve katı destek, yalnızca bir alt kümesi ile sınırlıdır. Burada, veziküller gerektirmez SLBs oluşturmak üzere çözücü yardımlı lipid iki katmanlı (SALB) oluşumu yöntemi denir tek-aşamalı bir genel prosedür tarif etmektedir. SALB yöntemi SLB oluşumunu tetiklemek amacıyla, su ile karışabilen organik çözücüler (örneğin, izopropanol) ve sulu tampon solüsyonu ile daha sonra solvent değişimi varlığında bir katı yüzey üzerine lipit moleküllerinin birikmesini içerir. Sürekli çözücü değişim aşaması uygulanmasını sağlarİzleme iki katmanlı oluşum ve yüzey duyarlı biyosensör geniş bir yelpazede kullanarak bir sonraki değişiklikler için uygun olan bir akış konfigürasyonunda metot. SALB yöntemi vezikül füzyon dirençli olanlar dahil olmak üzere, hidrofil bir yüzeylerin geniş bir yelpazede SLBs imal etmek için de kullanılabilir. Buna ek olarak, bu vezikül füzyon metodu kullanılarak hazırlanamaz lipid bileşimlerinin oluşan SLBs imalatım mümkün. Burada, iki örnek hidrofilik yüzeyler, silisyum dioksit ve altın SALB ve konvansiyonel vezikül füzyon yöntemleri ile elde edilen sonuçları karşılaştırmak. SALB yöntemi ile hazırlanan, yüksek kaliteli iki katmanlı hazırlanması için deneysel koşullar optimize etmek için, yerleştirme aşamasında organik çözücü tipi, çözücü değişimine oranı ve lipit konsantrasyonu dahil olmak üzere çeşitli parametrelerin etkisi sorun uçları ile birlikte ele alınmaktadır . Yüksek kolesterol içeren fraksiyonlar desteklenen membran oluşumu da cinler olanMembran yapılandırmaları geniş bir aralığı için SALB tekniğinin teknik özelliklerini vurgulayan, SALB yöntemiyle trated.

Watch this Scientific Journal Video about Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer SALB Method at JoVE.com

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer SALB Method

Biz lipid veziküller kullanmadan katı yüzeyler üzerinde desteklenen lipid çift oluşturmak için deneysel bir protokol mevcut. Çeşitli biyolojik uygulamalarda, kolesterol açısından zengin bir etki ile, bir lipid, silikon dioksit ve altın iki tabakalı olarak desteklenen zarları meydana getirmek üzere, bir aşamalı bir yöntemi göstermektedir.

Solvent destekli çift katlı lipid (SALB) Yöntemi ile biyomembran Fabrikasyon

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related ...

biomembrane-fabrication-solvent-assisted-lipid-bilayer-salb

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method

14.6K Görüntüleme.  Nanyang Technological University.  Biz lipid veziküller kullanmadan katı yüzeyler üzerinde desteklenen lipid çift oluşturmak için deneysel bir protokol mevcut. Çeşitli biyolojik uygulamalarda, kolesterol açısından zengin bir etki ile, bir lipid, silikon dioksit ve altın iki tabakalı olarak desteklenen zarları meydana getirmek üzere, bir aşamalı bir yöntemi göstermektedir. 

Video: Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer SALB Method

Constant Pressure-controlled Extrusion Method for the Preparation of Nano-sized Lipid Vesicles

Liposomes are artificially prepared vesicles consisting of natural and synthetic phospholipids that are widely used as a cell membrane mimicking platform to study protein-protein and protein-lipid interactions3, monitor drug delivery4,5, and encapsulation4. Phospholipids naturally create curved lipid bilayers, distinguishing itself from a micelle.6 Liposomes are traditionally classified by size and number of bilayers, i.e. large unilamellar vesicles (LUVs), small unilamellar vesicles (SUVs) and multilamellar vesicles (MLVs)7. In particular, the preparation of homogeneous liposomes of various sizes is important for studying membrane curvature that plays a vital role in cell signaling, endo- and exocytosis, membrane fusion, and protein trafficking8. Several groups analyze how proteins are used to modulate processes that involve membrane curvature and thus prepare liposomes of diameters &lt;100 - 400 nm to study their behavior on cell functions3. Others focus on liposome-drug encapsulation, studying liposomes as vehicles to carry and deliver a drug of interest9. Drug encapsulation can be achieved as reported during liposome formation9. Our extrusion step should not affect the encapsulated drug for two reasons, i.e. (1) drug encapsulation should be achieved prior to this step and (2) liposomes should retain their natural biophysical stability, securely carrying the drug in the aqueous core. These research goals further suggest the need for an optimized method to design stable sub-micron lipid vesicles.
Nonetheless, the current liposome preparation technologies (sonication10, freeze-and-thaw10, sedimentation) do not allow preparation of liposomes with highly curved surface (i.e. diameter &lt;100 nm) with high consistency and efficiency10,5, which limits the biophysical studies of an emerging field of membrane curvature sensing. Herein, we present a robust preparation method for a variety of biologically relevant liposomes.
Manual extrusion using gas-tight syringes and polycarbonate membranes10,5 is a common practice but heterogeneity is often observed when using pore sizes &lt;100 nm due to due to variability of manual pressure applied. We employed a constant pressure-controlled extrusion apparatus to prepare synthetic liposomes whose diameters range between 30 and 400 nm. Dynamic light scattering (DLS)10, electron microscopy11 and nanoparticle tracking analysis (NTA)12 were used to quantify the liposome sizes as described in our protocol, with commercial polystyrene (PS) beads used as a calibration standard. A near linear correlation was observed between the employed pore sizes and the experimentally determined liposomes, indicating high fidelity of our pressure-controlled liposome preparation method. Further, we have shown that this lipid vesicle preparation method is generally applicable, independent of various liposome sizes. Lastly, we have also demonstrated in a time course study that these prepared liposomes were stable for up to 16 hours. A representative nano-sized liposome preparation protocol is demonstrated below.

This protocol describes an extrusion method for preparing lipid vesicles of sub-micron sizes with a high degree of homogeneity. This method uses a pressure-controlled system with controlled nitrogen flow rates for liposome preparation. The lipid preparation1,2, liposome extrusion, and size characterization will be presented herein.

Nano ölçekli Lipid Vesiküller Hazırlanması için Sabit Basınç kontrollü Ekstrüzyon Yöntemi

Liposomes are artificially prepared vesicles consisting of natural and synthetic phospholipids that are widely used as a cell membrane mimicking platform ...

Biyomühendislik

Microfluidic Chip Fabrication and Method to Detect Influenza

Fast and effective diagnostics play an important role in controlling infectious disease by enabling effective patient management and treatment. Here, we present an integrated microfluidic thermoplastic chip with the ability to amplify influenza A virus in patient nasopharyngeal (NP) swabs and aspirates. Upon loading the patient sample, the microfluidic device sequentially carries out on-chip cell lysis, RNA purification and concentration steps within the solid phase extraction (SPE), reverse transcription (RT) and polymerase chain reaction (PCR) in RT-PCR chambers, respectively. End-point detection is performed using an off-chip Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). For peripherals, we used a single syringe pump to drive reagent and samples, while two thin film heaters were used as the heat sources for the RT and PCR chambers. The chip is designed to be single layer and suitable for high throughput manufacturing to reduce the fabrication time and cost. The microfluidic chip provides a platform to analyze a wide variety of virus and bacteria, limited only by changes in reagent design needed to detect new pathogens of interest.

An integrated microfluidic thermoplastic chip has been developed for use as a molecular diagnostic. The chip performs nucleic acid extraction, reverse transcriptase, and PCR. Methods for fabricating and running the chip are described.

Mikroakışkan Chip İmalat ve İnfluenza Algılama Yöntemi

Fast  and effective diagnostics play an important role in controlling infectious  disease by enabling effective patient management and treatment. Here, we ...

Formation of Biomembrane Microarrays with a Squeegee-based Assembly Method

Lipid bilayer membranes form the plasma membranes of cells and define the boundaries of subcellular organelles. In nature, these membranes are heterogeneous mixtures of many types of lipids, contain membrane-bound proteins and are decorated with carbohydrates. In some experiments, it is desirable to decouple the biophysical or biochemical properties of the lipid bilayer from those of the natural membrane. Such cases call for the use of model systems such as giant vesicles, liposomes or supported lipid bilayers (SLBs). Arrays of SLBs are particularly attractive for sensing applications and mimicking cell-cell interactions. Here we describe a new method for forming SLB arrays. Submicron-diameter SiO2 beads are first coated with lipid bilayers to form spherical SLBs (SSLBs). The beads are then deposited into an array of micro-fabricated submicron-diameter microwells. The preparation technique uses a "squeegee" to clean the substrate surface, while leaving behind SSLBs that have settled into microwells. This method requires no chemical modification of the microwell substrate, nor any particular targeting ligands on the SSLB. Microwells are occupied by single beads because the well diameter is tuned to be just larger than the bead diameter. Typically, more 75% of the wells are occupied, while the rest remain empty. In buffer SSLB arrays display long-term stability of greater than one week. Multiple types of SSLBs can be placed in a single array by serial deposition, and the arrays can be used for sensing, which we demonstrate by characterizing the interaction of cholera toxin with ganglioside GM1. We also show that phospholipid vesicles without the bead supports and biomembranes from cellular sources can be arrayed with the same method and cell-specific membrane lipids can be identified.

Supported lipid bilayers and natural membrane particles are convenient systems that can approximate the properties of cell membranes and be incorporated in a variety of analytical strategies. Here we demonstrate a method for preparing microarrays composed of supported lipid bilayer-coated SiO2 beads, phospholipid vesicles or natural membrane particles.

Bir Çekçek tabanlı Meclisi Yöntemi ile Biomembrane Mikroarray&#39;ler oluşumu

Lipid bilayer membranes form the plasma membranes of cells and define the boundaries of subcellular organelles. In nature, these membranes are ...

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This emerging field engages engineers, chemists, biologists, and physicists to design and assemble basic biological components into complex, functioning systems from the bottom up. Such bottom-up systems could lead to the development of artificial cells for fundamental biological inquiries and innovative therapies1,2. Giant unilamellar vesicles (GUVs) can serve as a model platform for synthetic biology due to their cell-like membrane structure and size. Microfluidic jetting, or microjetting, is a technique that allows for the generation of GUVs with controlled size, membrane composition, transmembrane protein incorporation, and encapsulation3. The basic principle of this method is the use of multiple, high-frequency fluid pulses generated by a piezo-actuated inkjet device to deform a suspended lipid bilayer into a GUV. The process is akin to blowing soap bubbles from a soap film. By varying the composition of the jetted solution, the composition of the encompassing solution, and/or the components included in the bilayer, researchers can apply this technique to create customized vesicles. This paper describes the procedure to generate simple vesicles from a droplet interface bilayer by microjetting.

Microfluidic jetting against a droplet interface lipid bilayer provides a reliable way to generate vesicles with control over membrane asymmetry, incorporation of transmembrane proteins, and encapsulation of material. This technique can be applied to study a variety of biological systems where compartmentalized biomolecules are desired.

Mikroakışkan jeti kullanarak çift katlı lipid Vesikül Üretimi

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

Polymeric Microneedle Array Fabrication by Photolithography

This manuscript describes the fabrication of polymeric microneedle (MN) arrays by photolithography. It involves a simple mold-free process by using a photomask consisting of embedded micro-lenses. Embedded micro-lenses were found to influence MN geometry (sharpness). Robust MN arrays with tip diameters ranging between 41.5 &#181;m &#177; 8.4 &#181;m and 71.6 &#181;m &#177; 13.7 &#181;m, with two different lengths (1,336 &#181;m &#177; 193 &#181;m and 957 &#181;m &#177; 171 &#181;m) were fabricated. These MN arrays may provide potential applications in delivery of low molecular and macromolecular therapeutic agents through skin.

Here, we present a protocol describing a mold-free fabrication process of the polymeric microneedles by photolithography.

Fotolitografiyle polimerik Microneedle Dizi Fabrikasyon

This manuscript describes the fabrication of polymeric microneedle (MN) arrays by photolithography. It involves a simple mold-free process by using a ...

Solid Lipid Nanoparticles (SLNs) for Intracellular Targeting Applications

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter cellular signaling and gene expression. In a previous investigation, the synthesis of ultra-small solid lipid nanoparticles (SLNs) for topical drug delivery and biomarker detection applications was demonstrated. SLNs are a well-studied example of a nanoparticle delivery system that has emerged as a promising drug delivery vehicle. In this study, SLNs were loaded with a fluorescent dye and used as a model to investigate particle-cell interactions. The phase inversion temperature (PIT) method was used for the synthesis of ultra-small populations of biocompatible nanoparticles. A 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenylphenyltetrazolium bromide (MTT) assay was utilized in order to establish appropriate dosing levels prior to the nanoparticle-cell interaction studies. Furthermore, primary human dermal fibroblasts and mouse dendritic cells were exposed to dye-loaded SLN over time and the interactions with respect to toxicity and particle uptake were characterized using fluorescence microscopy and flow cytometry. This study demonstrated that ultra-small SLNs, as a nanoparticle delivery system, are suitable for intracellular targeting of different cell types.

Solid Lipid Nanoparticles SLNs for Intracellular Targeting Applications

In this study, a method for synthesizing ultra-small populations of biocompatible nanoparticles was described, as well as several in vitro methods by which to assess their cellular interactions.

Katı Lipit nanopartiküller (SLNs) Hücre içi Hedefleme için başvurular

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter ...

Automated Lipid Bilayer Membrane Formation Using a Polydimethylsiloxane Thin Film

An artificial lipid bilayer, or black lipid membrane (BLM), is a powerful tool for studying ion channels and protein interactions, as well as for biosensor applications. However, conventional BLM formation techniques have several drawbacks and they often require specific expertise and laborious processes. In particular, conventional BLMs suffer from low formation success rates and inconsistent membrane formation time. Here, we demonstrate a storable and transportable BLM formation system with controlled thinning-out time and enhanced BLM formation rate by replacing conventionally used films (polytetrafluoroethylene, polyoxymethylene, polystyrene) to polydimethylsiloxane (PDMS). In this experiment, a porous-structured polymer such as PDMS thin film is used. In addition, as opposed to conventionally used solvents with low viscosity, the use of squalene permitted a controlled thinning-out time via slow solvent absorption by PDMS, prolonging membrane lifetime. In addition, by using a mixture of squalene and hexadecane, the freezing point of the lipid solution was increased (~16 &#176;C), in addition, membrane precursors were produced that can be indefinitely stored and readily transported. These membrane precursors have reduced BLM formation time of &#60; 1 hr and achieved a BLM formation rate of ~80%. Moreover, ion channel experiments with gramicidin A demonstrated the feasibility of the membrane system.

We demonstrate a storable, transportable lipid bilayer formation system. A lipid bilayer membrane can be formed within 1 hr with over 80% success rate when a frozen membrane precursor is brought to ambient temperature. This system will reduce laborious processes and expertise associated with ion channels.

Bir polidimetilsiloksan İnce Film Kullanarak Otomatik çift katlı lipid Membran Oluşumu

An artificial lipid bilayer, or black lipid membrane (BLM), is a powerful tool for studying ion channels and protein interactions, as well as for ...

Ligand Nano-cluster Arrays in a Supported Lipid Bilayer

Currently there is considerable interest in creating ordered arrays of adhesive protein islands in a sea of passivated surface for cell biological studies. In the past years, it has become increasingly clear that living cells respond, not only to the biochemical nature of the molecules presented to them but also to the way these molecules are presented. Creating protein micro-patterns is therefore now standard in many biology laboratories; nano-patterns are also more accessible. However, in the context of cell-cell interactions, there is a need to pattern not only proteins but also lipid bilayers. Such dual proteo-lipidic patterning has so far not been easily accessible. We offer a facile technique to create protein nano-dots supported on glass and propose a method to backfill the inter-dot space with a supported lipid bilayer (SLB). From photo-bleaching of tracer fluorescent lipids included in the SLB, we demonstrate that the bilayer exhibits considerable in-plane fluidity. Functionalizing the protein dots with fluorescent groups allows us to image them and to show that they are ordered in a regular hexagonal lattice. The typical dot size is about 800 nm and the spacing demonstrated here is 2 microns. These substrates are expected to serve as useful platforms for cell adhesion, migration and mechano-sensing studies.

We present a protocol to functionalize glass with nanometric protein patches surrounded by a fluid lipid bilayer. These substrates are compatible with advanced optical microscopy and are expected to serve as platform for cell adhesion and migration studies.

Bir Desteklenen lipit iki tabakalı içinde Ligand Nano küme Diziler

Currently there is considerable interest in creating ordered arrays of adhesive protein islands in a sea of passivated surface for cell biological ...

A Simple and Scalable Fabrication Method for Organic Electronic Devices on Textiles

Today, wearable electronics devices combine a large variety of functional, stretchable, and flexible technologies. However, in many cases, these devices cannot be worn under everyday conditions. Therefore, textiles are commonly considered the best substrate to accommodate electronic devices in wearable use. In this paper, we describe how to selectively pattern organic electroactive materials on textiles from a solution in an easy and scalable manner. This versatile deposition technique enables the fabrication of wearable organic electronic devices on clothes.

In this paper, we present a protocol to selectively deposit organic materials on textiles, which allows for the direct integration of organic electronic devices with wearables. The fabricated devices can be fully integrated in textiles, respecting their mechanical appearance and enabling sensing capabilities.

Tekstil Organik Elektronik Cihazlar Basit ve Ölçeklenebilir Fabrikasyon Yöntemi

Today, wearable electronics devices combine a large variety of functional, stretchable, and flexible technologies. However, in many cases, these devices ...

Fabrication of Decellularized Cartilage-derived Matrix Scaffolds

Osteochondral defects lack sufficient intrinsic repair capacity to regenerate functionally sound bone and cartilage tissue. To this extent, cartilage research has focused on the development of regenerative scaffolds. This article describes the development of scaffolds that are completely derived from natural cartilage extracellular matrix, coming from an equine donor. Potential applications of the scaffolds include producing allografts for cartilage repair, serving as a scaffold for osteochondral tissue engineering, and providing in vitro models to study tissue formation. By decellularizing the tissue, the donor cells are removed, but many of the natural bioactive cues are thought to be retained. The main advantage of using such a natural scaffold in comparison to a synthetically produced scaffold is that no further functionalization of polymers is required to drive osteochondral tissue regeneration. The cartilage-derived matrix scaffolds can be used for bone and cartilage tissue regeneration in both in vivo and in vitro settings.

Decellularized cartilage-derived scaffolds can be used as a scaffold to guide cartilage repair and as a means to regenerate osteochondral tissue. This paper describes the decellularization process in detail and provides suggestions to use these scaffolds in in vitro settings.

Decellularized matris kıkırdak elde edilen iskele imalatı

Osteochondral defects lack sufficient intrinsic repair capacity to regenerate functionally sound bone and cartilage tissue. To this extent, cartilage ...