Biz microjetting parametreleri üzerinde tavsiye California, Berkeley Üniversitesi&#39;nde Fletcher Lab Mike Vahey teşekkür ederim. Bu çalışma NIH hibe DP2 HL117748-01 tarafından sponsor oldu.

1.. Infinity Odası Fabrikasyon <ol><li> Bir bilgisayar destekli tasarım (CAD) yazılımı kullanılarak (şekli adını) sonsuzluk odasını tasarlayın ve bir lazer kesici ile uyumlu şekilde dosyayı kaydedin. Lazer kesici ile açık olarak akrilik 1/8- 3/16 arasındaki bölmeyi kesme kriteri: 0.15 &#39;lik bir merkez-merkez mesafe ile de bu şekil, çapı 0,183 ayrı iki daire oluşturmak. Sonsuzluk şekli damlacık arayüzü iki tabakalı oluşumunu ve istikrar kolaylaştırır. </li><li> Sonsuzluk şeklindeki oyuğa akrilik odasının kenarı boyunca bir 1/16 bir delik delin. Karşı tarafta tekrarlayın. Makas ile bir 0.2 mm akrilik levha ya da bir alt oyuklara olarak hizmet etmek üzere bir lazer kesici küçük bir dikdörtgen kesin. </li><li> 0.2 mm akrilik bir tarafına çabuk kuruyan bir yapışkan ince fakat tam bir tabaka uygulanır ve odacığın dibine tutkal. Bölmenin tabanına sıkıca yerine 0.2 mm akrilik tutun ve dağıtmakTutkal, bir mühür oluşturmak ancak görüntüleme alanı kapsayan önlemek için izin vermek için ara-yapıştırıcı. Onun kenarı oda duvarının kenarı ile aynı hizada ve tamamen sonsuzluk odası kesme kapsar şekilde akrilik hizalamak için emin olun. Bu yeterli jet nüfuz etmesi için izin vermek ve kuyu sızmasını engeller. </li><li> Delinmiş delikleri kapatmak için doğal kauçuk iki küçük parçalar kesin. Deliğin etrafında çabuk kuruyan yapıştırıcı uygulayın. Sabitlemek için forseps bir çift ile tüm alanlarda delik ve basın üzerinde lastik yerleştirin. Her iki delinmiş delikler için tekrarlayın. Herhangi bir sızıntıyı önlemek amacıyla tüm yapıştırılmış bağlantıların tam mühürler emin olun. </li><li> Iğne, bir 23 G 1 kullanarak, piezoelektrik inkjet ucu sokulmasını kolaylaştırmak için bölmenin her iki yanında, doğal kauçuk bir delik açmak. </li></ol> 2. Deneysel Hazırlık -20 ° C derin dondurucuda kloroform Mağaza stok lipid çözüm. Bu çalışmada, 1,2-diphytano yail-sn-glisero-3-fosfokolin (DPhPC) veya 1,2-dioleoil-sn-glisero-3-fosfokolin (DOPC) kullanılmıştır. 2 ml 25 mg / ml lipid çözeltisi, tipik olarak, bu protokolde hazırlanır ve -20 ° C&#39;de saklandığında iki ay sürecektir <ol><li> N-dekan içinde lipid tekrar süspansiyon, önce küçük bir cam kavanoza bir stok şişesinden aktarmak ve argon veya azot altında hafifçe kurulayın. Lipid daha hızlı kurumasına izin gaza daha fazla yüzey alanı ortaya çıkarmak için kurutma sırasında bir açıyla kavanoz tutun. </li><li> Sadece biraz vidalanmış kavanozun kapağı ile kurutuldu, çözelti, 1-2 saat boyunca bir desikatör içinde vakum altında bekletin. Daha sonra 25 mg / ml &#39;de lipide resolubilize n-dekan ekleyin. Vortex lipid çözelti kısa bir süre için ve 15 dakika boyunca bir banyo sonikatörü içinde sonikasyon. -20 ° C&#39;de n-dekanda yeniden lipidin saklayın </li><li> Bir stok sakaroz çözeltisini hazırlayın. Bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde, 300 mM sukroz 900 ul ve 100 ul ekle% 1 metilselüloz (MC) içinde. Metilselüloz jeti yardımcıları çözeltinin viskozitesini arttırmak için eklenir. İsteğe bağlı adım: Sırasıyla, görüntülemede daha fazla kontrast veya floresan ödünç koyu renkli gıda boyası veya floresan boncuk, isteğe bağlı 1 ul ekleyin. Bu çözüm hücresel ozmolariteyi maç ve microjetting sırasında kontrast sağlamak için tasarlanmış bir 300 mOsm sakaroz çözümdür. </li><li> Bir tek 1 ml plastik şırıngaya çözüm çizin. Ucu yukarı bakacak şekilde şırınga tutarken, ucuna doğru kabarcıkları çıkarmak için tekrar tekrar mili fiske ve sıkışan havayı çıkarmak için pistonu itmek. O jeti sorumlu uygun piezoelektrik kasılması engel olacak şekilde, devam etmeden önce şırınga tüm havayı tahliye etmek için emin olun. </li><li> Şırınganın ucunda bir 0.22 um filtre takın. Filtrenin içinde kalmasını önlemek için hava, dikey olarak şırınga tutun ve bir damla ucu üzerinde oluşturulmuştur kadar pistonu itin. Not: A33 mm çaplı bir şırınga filtre ünitesi, en iyi olarak çalıştığı bulunan, ancak, 3 mm çapında bir şırınga filtresi kadar küçük alternatif filtresi ölü hacim azaltmak için kullanılabilir. </li><li> Inkjet dişi luer adaptörü sökün ve güvenli bir filtrenin ucuna yere basın. Yine, hava yakalama önlemek için sıvının püskürtülmesi. Inkjet üstüne vidalayın. Tamamen takıldıktan sonra sıvı mürekkep püskürtmeli ucuna alması gerekir. </li></ol> 3. Ekipman Readying <ol><li> V-kelepçe kullanarak, mikroskop sahnede şırınga monte. Inkjet kontrol için mürekkep püskürtmeli tel takın. Not: Özel bir sahne bu protokol için inşa edilmiş, sahne tasarımı kullanıcı tarafından tespit edilebilir iken, şırınga ve numune sahibinin xy kontrolünden bağımsız xyz kontrolünü olması önemlidir. </li><li> Istenen görüntüleme elde etmek için büyütme ve gerekli lens kombinasyonunu belirleyin. İşte 10X objektif ve 10X mercek kullanılır. </li&gt; <li> Jeti ve vezikül nesil görselleştirmek için yüksek hızlı bir kamera (≥ 1,000 fps) kullanın. Önce görüntüleme, gerekli kamera kalibrasyonu gerçekleştirin. Görüntü yakalama başlatmak için kamera yazılım içinde görüntü-tabanlı otomatik tetik yararlanın. </li><li> Mikroskop sahneye sonsuzluk odasını monte edin. Sahnede yerine Kaydettiğini tarafından odasına sabitleyin. </li><li> Dikkatle doğal kauçuk delinmiş delik (Şekil 1b bakınız) ile mürekkep püskürtmeli ucu hizalamak. Bunu yapmak odasına yakın inkjet getirmek ve göz tarafından konumunu ayarlamak için, daha sonra mikroskop merceğinden daha hassas ayarlamalar yapmak. Kaba hareketler inkjet ucu zarar verebilir gibi, dikkatle devam edin. </li><li> Inkjet hizalanmış sonra, kuyuların yükleme sırasında mürekkep püskürtmeli hasar görmesini önlemek için uzak odasından şırınga geri. Bu zar içindeki delik ile hizalanmış kalır, böylece mürekkep püskürtmeli hareket tek yönlü olduğundan emin olun. </li><li> Plun hafifçe basınMürekkep püskürtmeli meme küçük bir damlacık oluşana kadar şırınganın ger. Bu bazı ilk backpressure sağlayacaktır. </li><li> Girdi püskürtme parametreleri. Bir trapez bipolar dalga için, aşağıdaki parametreleri kullanın: 20 kHz darbe frekansı, 3 mikro saniye olduğu yükselme zamanı, 35 mikro-saniye darbe süresi, 3 mikro saniye olduğu düşme zamanı, 65 V gerilim uygulanmıştır (darbe genlik) ve tetik başına 100 jet bakliyat (darbe sayısı) . Bununla birlikte, uygulanan gerilim (darbe genlik) ve darbe sayısı (tetik başına jet darbeler) vezikül boyutunu kontrol etmek için de değiştiirlebilir. </li></ol> 4. Vezikül Üretimi <ol><li> Her ikisi de kuyu tüm yüzeyini kaplayan, sonsuz bölmeye n-dekanda süspansiyon 25-30 ul lipid çözeltisi ekleyin. </li><li> Bir de, pipetleme yavaş ve düzgün bir en dış kenarı (sakaroz çözeltisi ile aynı ozmotik basıncı) 25 ul glikoz eklenmektedir. Glükoz ve lipid çözeltisi karışmaz çünkü birikimi üzerine, glikoz, bir damla, oluşturmalıdır. Ekle başka 251, bir damla yapmak ve 5-10 dakika içinde bölmenin ortasında lipid iki katmanlı zar oluşturacak ters kuyu, glukoz l. </li><li> Doğal kauçuk sayesinde mürekkep püskürtmeli yerleştirin ve dikkatli bir damlacık arayüzü bilayeri doğru yol gösterir. Tanıtılan inkjet hacmi yerinden ve bilayeri kopma gibi, yavaş yavaş bilayeri yaklaşın. </li><li> İnkjet ~ 200 um içinde olduğunda, aşama 3.8 &#39;de tarif edilen ayarlarla jeti geçerlidir. Iki tabaka arasındaki mesafe, diğer değişkenler arasında, gerilim ve darbe sayısı ile ilgili olarak temel olarak değişebilir. Bu protokol yavaş ayarlarını (gerilim ve darbe sayısı) giderek artan ve bilayeri deformasyon gözlemleyerek önerir. </li></ol> 5. Ekipman Temizleme <ol><li> Mikroskop aşamasından şırınga ayırın ve 1 ml plastik şırınga ve filtre atmayın. </li><li> Inkjet temizlemek için, eriyik içindeki daldırma ucu ile sırayla aşağıdaki çözümleri aspiren 7-10x her: ılık su,% 70 etanol ve GKD 2 O.% 70 etanol,% 2 Neutrad çözüm Inkjet aspirasyon pipet üzerinde güvenli bir şekilde uymazsa, bir adaptör oluşturmak için bir pipet kesti. </li><li> Doku ile odası kurutun. 5-10 dakika süreyle% 2 v / v ılık suda Neutrad ve sonikasyon ile 250 ml çanak içinde sonsuz odası yerleştirin. Sonikasyon sonrasında, iyice sıkıştırılmış hava altında kuyu kurutun. Kuyularda nem, lipid iki katmanlı membran stabilitesini tehlikeye atabilir ve bu, odalar 15 dakika boyunca 60 ° C&#39;de bir fırına yerleştirilir önerilir. </li></ol>

<ol>
	<li>Liu, A. P., Fletcher, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+under+construction:+in+vitro+reconstitution+of+cellular+function.">Biology under construction: in vitro reconstitution of cellular function.</a> Nature reviews. Mol. Cell Biol. 10, 644-650 (2009).</li><li>Yeh, B. J., Lim, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+biology:+lessons+from+the+history+of+synthetic+organic+chemistry.">Synthetic biology: lessons from the history of synthetic organic chemistry.</a> Nat. Chem. Biol. 3, 521-525 (2007).</li><li>Richmond, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forming+giant+vesicles+with+controlled+membrane+composition,+asymmetry,+and+contents.">Forming giant vesicles with controlled membrane composition, asymmetry, and contents.</a> Proc. Natl. Acad. Soc. U.S.A. 108, 9431-9436 (2011).</li><li>Liu, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-induced+bundling+of+actin+filaments.">Membrane-induced bundling of actin filaments.</a> Nat. Phys. 4, 789-793 (2008).</li><li>Brown, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+tropicalis+egg+extracts+provide+insight+into+scaling+of+the+mitotic+spindle.">Xenopus tropicalis egg extracts provide insight into scaling of the mitotic spindle.</a> J. Cell Biol. 176, 765-770 (2007).</li><li>Loose, M., Fischer-Friedrich, E., Ries, J., Kruse, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+regulators+for+bacterial+cell+division+self-organize+into+surface+waves+in+vitro.">Spatial regulators for bacterial cell division self-organize into surface waves in vitro.</a> Science. 320, 789-792 (2008).</li><li>Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposome+electroformation.">Liposome electroformation.</a> Faraday Disc. Chem. Soc. 81, 301-311 (1986).</li><li>Bucher, P., Fischer, A., Luisi, L. P., Oberholzer, T., Walde, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+Vesicles+as+Biochemical+Compartments:+The+Use+of+Microinjection+Techniques.">Giant Vesicles as Biochemical Compartments: The Use of Microinjection Techniques.</a> Langmuir. 14, 2712-2721 (1998).</li><li>Shum, H. C., Lee, D., Yoon, I., Kodger, T., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+emulsion+templated+monodisperse+phospholipid+vesicles.">Double emulsion templated monodisperse phospholipid vesicles.</a> Langmuir. 24, 7651-7653 (2008).</li><li>Matosevic, S., Paegel, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stepwise+Synthesis+of+Giant+Unilamellar+Vesicles+on+a+Microfluidic+Assembly+Line.">Stepwise Synthesis of Giant Unilamellar Vesicles on a Microfluidic Assembly Line.</a> J. Am. Chem. Soc. 133, 2798-2800 (2011).</li><li>Hu, P. C. C., Li, S., Malmstadt, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+Fabrication+of+Asymmetric+Giant+Lipid+Vesicles.">Microfluidic Fabrication of Asymmetric Giant Lipid Vesicles.</a> ACS Appl. Mater. Inter. 3, 1434-1440 (1021).</li><li>Hwang, W. L., Chen, M., Cronin, B., Holden, M. A., Bayley, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+droplet+interface+bilayers.">Asymmetric droplet interface bilayers.</a> J. Am. Chem. Soc. 130, 5878-5879 (2008).</li><li>Stachowiak, J. C., Richmond, D. L., Li, T. H., Brochard-Wyart, F., Fletcher, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inkjet+formation+of+unilamellar+lipid+vesicles+for+cell-like+encapsulation.">Inkjet formation of unilamellar lipid vesicles for cell-like encapsulation.</a> Lab Chip. 9, 2003-2009 (2009).</li><li>Meleard, P., Bagatolli, L. A., Pott, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+unilamellar+vesicle+electroformation+from+lipid+mixtures+to+native+membranes+under+physiological+conditions.">Giant unilamellar vesicle electroformation from lipid mixtures to native membranes under physiological conditions.</a> Methods Enzymol. 465, 161-176 (2009).</li><li>Nishimura, K., Suzuki, H., Toyota, T., Yomo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size+control+of+giant+unilamellar+vesicles+prepared+from+inverted+emulsion+droplets.">Size control of giant unilamellar vesicles prepared from inverted emulsion droplets.</a> J. Colloid Interface Sci. 376, 119-125 (2012).</li><li>Teh, S. Y., Lin, R., Hung, L. H., Lee, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+Microfluidics.">Droplet Microfluidics.</a> Lab Chip. 8, 198-220 (2008).</li><li>Stachowiak, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unilamellar+vesicle+formation+and+encapsulation+by+microfluidic+jetting.">Unilamellar vesicle formation and encapsulation by microfluidic jetting.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 4697-4702 (2008).</li><li>Osaki, T., Yoshizawa, S., Kawano, R., Sasaki, H., Takeuchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid-coated+microdroplet+array+for+in+vitro+protein+synthesis.">Lipid-coated microdroplet array for in vitro protein synthesis.</a> Anal. Chem. 83, 3186-3191 (2011).</li><li>Liu, A. P., Fletcher, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+polymerization+serves+as+a+membrane+domain+switch+in+model+lipid+bilayers.">Actin polymerization serves as a membrane domain switch in model lipid bilayers.</a> Biophys. J. 91, 4064-4070 (2006).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Birçok teknik electroformation, emülsiyon ve damlacık oluşturma 14-16 dahil olmak üzere, kabarcık üretimi için geliştirilmiştir. Ancak, yeni deneysel teknikler canlı sistemler için artan benzerliği olan biyolojik sistemlerin tasarımı için izin vermek için gereklidir. Özellikle mikroakışkan yöntemler yakın biyoloji kesecik modelleri getirerek, membran unilamellarity, büyüklüğü monodispersiteye ve iç içeriği 17,18 yöneten kontrol artan bir düzeyde teklif var. Ayrıca, ...

<html> Bu hücre biyolojisi moleküllerin hücrelere anlayışımızı entegre içeren çok-ölçekli bir sorun olduğunu giderek daha açık hale gelmiştir. Sonuç olarak, moleküller tek tek çalışmak nasıl tam bilmeden kompleks hücresel davranışları anlamak için yeterli değildir. Bu 5 özü Xenopus lipid iki katmanlı kesecikler 4, mitotik iğ takımı ile aktin ağ etkileşim yeniden oluşturulması ile örneklendiği gibi, kısmen çok bileşenli sistemlerin ortaya çıkan davranış varlığına ve bakteriyel hücre bölünmesi makine 6 mekânsal dinamiği. Canlı sistemlerin moleküler süreçleri diseksiyon indirgemeci yaklaşımını tamamlamak için tek yolu, biyolojik bileşenlerin en az bir dizi kullanarak hücresel davranışları yeniden yapılandırma tersi bir yaklaşım almaktır. Bu yaklaşımın önemli bir parçası, bir kapalı hacim içinde biyomoleküllerin güvenilir kapsülleme, bir hücrenin önemli bir özelliği içerir. e_content &quot;&gt; birkaç strateji biomimetik sistemlerin çalışılması için biyomoleküllerin kapsülleyici için vardır. biyolojik olarak en uygun sistem, hücrenin plazma zarının tarafından uygulanan biyokimyasal ve fiziksel kısıtlamaları taklit eder. electroformation 7 tarafından dev tek katmanlı veziküller (GUVs) oluşturulması lipid iki katmanlı membranlar, olduğu, saflaştırılmış proteinler ile çalışmak için bir sorun olabilir GUV nesil 14 için en yaygın kullanılan tekniklerden biri, tipik olarak yüksek tuz tamponu 8 ile uyumsuzluk nedeniyle kötü kapsülleme verim vardır. Electroformation de büyük örnek hacimleri gerektirir (&gt; 100 ul), ve verimsiz yakın aralıklı lipid tabakaları arasında difüzyon zorluğu nedeniyle büyük molekülleri kapsar. lipid veziküllerin üretilmesi için çeşitli yaklaşımlar mikroakışkan. W / O (katmanlar, su-yağ-su arasında iki arayüzleri üzerinden geçiş bileşeni çift emülsiyon yöntemleri geliştirilmiştir / W), bir vo buharlaşması dayanırlipid iki katmanlı oluşum 9 sürücüye latile solvent. Diğer lipid iki katmanlı veziküller 10 ya da iki bağımsız adımda 11 içinde sürekli bir akış üreten bir mikroakışkan montaj hattı kullanılmıştır. Biz hızla kontrollü boyutu, kompozisyon ve kapsülleme GUVs üretmek için bir damlacık arayüz çift-katlı 12 karşı sıvı darbeleri uygulamadan dayalı alternatif bir teknik geliştirdiler. Microfluidic jeti olarak bilinen bizim yaklaşım, biyolojik sorunları çeşitli araştırılması için fonksiyonel biyomoleküler sistemleri yaratmak için bir yaklaşım sağlayarak, mevcut birkaç vezikül üretim teknikleri kombine avantajlar sunuyor.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:633px;" width="633">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:153px;">Name</td>
			<td style="width:163px;">Company</td>
			<td style="width:157px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:160px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:153px;">Piezoelectric Inkjet</td>
			<td style="width:163px;">MicroFab Technologies</td>
			<td style="width:157px;">MJ-AL-01-xxx</td>
			<td style="width:160px;">xxx denotes orifice diameter in microns</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:153px;">Jet Drive III Controller</td>
			<td style="width:163px;">MicroFab Technologies</td>
			<td style="width:157px;">CT-M3-02</td>
			<td style="width:160px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:153px;">High-speed camera</td>
			<td style="width:163px;">Vision Research</td>
			<td style="width:157px;">MiroEX2</td>
			<td style="width:160px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:153px;">DPhPC lipid in chloroform</td>
			<td style="width:163px;">Avanti</td>
			<td style="width:157px;">850356C</td>
			<td style="width:160px;">Ordered in small aliquots in vials</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:153px;">33mm PVDF filters, 0.2 &#181;m</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:157px;">SLGV033RS</td>
			<td style="width:160px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:153px;">1ml syringes</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:157px;">14823434</td>
			<td style="width:160px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:153px;">n-Decane</td>
			<td style="width:163px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:157px;">111871000</td>
			<td style="width:160px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:153px;">Glucose</td>
			<td style="width:163px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:157px;">410950010</td>
			<td style="width:160px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:153px;">Sucrose</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">S7903-1KG</td>
			<td style="width:160px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:153px;">Methylcellulose</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:157px;">NC9084958</td>
			<td style="width:160px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:153px;">1/8&#34; Acrylic</td>
			<td style="width:163px;">McMaster Carr</td>
			<td style="width:157px;">8560K239</td>
			<td style="width:160px;">CAD designs for the infinity-shaped chamber are available upon request</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:153px;">0.2 mm Acrylic</td>
			<td style="width:163px;">Astra Products</td>
			<td style="width:157px;">Clarex clear 001</td>
			<td style="width:160px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:153px;">Acrylic Cement</td>
			<td style="width:163px;">TAP Plastics</td>
			<td style="width:157px;">10693</td>
			<td style="width:160px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:153px;">Loctite 495 Superglue</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:157px;">NC9011323</td>
			<td style="width:160px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:153px;">Loctite 3494 UV Strengthening Adhesive</td>
			<td style="width:163px;">Strobels Supply</td>
			<td style="width:157px;">30765</td>
			<td style="width:160px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:153px;">Natural rubber</td>
			<td style="width:163px;">McMaster Carr</td>
			<td style="width:157px;">85995K14</td>
			<td style="width:160px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:153px;">Custom stage</td>
			<td style="width:163px;">Home made</td>
			<td style="width:157px;">N/A</td>
			<td style="width:160px;">CAD designs are available upon request</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lipid bilayer vesicle generation using microfluidic jetting

Aşağıdan yukarıya sentetik biyoloji potansiyel biyokimyasal sistemleri ve, minimal organizmalar soruşturma ve yeniden yapılandırmak için yeni bir yaklaşım sunuyor. Bu gelişmekte olan bir alan aşağıdan yukarıya karmaşık, işleyen sistemlere temel biyolojik bileşenlerini tasarlamak ve oluşturmak için mühendisleri, kimyagerler, biyologlar, ve fizikçileri yürütmektedir. Bu gibi alt-up sistemleri temel biyolojik öğrenmek ve yeni tedavilerin 1,2 yapay hücre gelişimine neden olabilir. Dev tek tabakalı veziküller (GUVs) nedeniyle hücre benzeri zar yapısı ve boyutu sentetik biyoloji için bir model platform olarak hizmet edebilir. Mikroakışkan jeti veya microjetting, kontrollü boyutu, zar kompozisyonu, transmembran protein dahil edilmesi, ve kapsülleme 3 GUVs üretimi sağlayan bir tekniktir. Bu yöntemin temel ilkesi, bir süspansiyon haline l deforme edilmesi için bir piezo-mürekkep püskürtme çalıştırılan cihazı tarafından oluşturulan birden çok, yüksek frekanslı darbe sıvı kullanılmasıdırBir GUV içine IPID iki tabakalı. Süreç bir sabun filmden sabun baloncukları üfleme benzer. Jeti çözeltisi kapsayan çözeltisinin kompozisyon ve / veya bileşenlerin bileşimi değiştirilerek ikili katmanın dahil, araştırmacılar özelleştirilmiş vezikülleri oluşturmak için bu tekniği uygulayabilir. Bu kağıt microjetting bir damlacık arayüzü bilayeri basit veziküller oluşturmak için prosedürü açıklar.

Bu makine parçaları ve manuel mikrometreden monte özel bir kademe (Şekil 1) ile, geleneksel bir ters flüoresan mikroskop üzerinde bir mikro-akışkan püskürtme kurulum toplandı. Inkjet karakterizasyonu kese oluşturma işlemi içgörü sağlar. Mürekkep püskürtmeli meme ve lipid çift katlı arasındaki mesafeyi değiştirilmesi kuvvet, zarı deformasyonuna neden olmak için uygulanan etkiler. Çift-katlı yakınlık jet akışı odaklanır ve uzak vezikül kuşağın alanına enerji dağıt...

Watch this Scientific Journal Video about Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting at JoVE.com

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

Bir damlacık arayüz lipid ikili tabakasına karşı mikroakışkan jeti zar asimetri, zar proteinlerinin dahil edilmesi, ve malzeme kapsülleme üzerinde kontrol ve veziküllerin üretilmesi için güvenilir bir yöntem sağlar. Bu teknik, bölümlere biyomoleküllerin istenen biyolojik sistemlerin çeşitli çalışma uygulanabilir.

Mikroakışkan jeti kullanarak çift katlı lipid Vesikül Üretimi

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

lipid-bilayer-vesicle-generation-using-microfluidic-jetting

Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.8K Görüntüleme.  University of Michigan.  Bir damlacık arayüz lipid ikili tabakasına karşı mikroakışkan jeti zar asimetri, zar proteinlerinin dahil edilmesi, ve malzeme kapsülleme üzerinde kontrol ve veziküllerin üretilmesi için güvenilir bir yöntem sağlar. Bu teknik, bölümlere biyomoleküllerin istenen biyolojik sistemlerin çeşitli çalışma uygulanabilir. 

Video: Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and high-fidelity measurements of large systems. Microfluidics promises to fulfill many of these requirements, such as performing high-throughput screening experiments on-chip, encompassing biochemical, biophysical, and cell-based assays1. Since the early days of microfluidics devices, this field has drastically evolved, leading to the development of microfluidic large-scale integration2,3. This technology allows for the integration of thousands of micromechanical valves on a single device with a postage-sized footprint (Figure 1). We have developed a high-throughput microfluidic platform for generating in vitro expression of protein arrays (Figure 2) named PING (Protein Interaction Network Generator). These arrays can serve as a template for many experiments such as protein-protein 4, protein-RNA5 or protein-DNA6 interactions.
The device consist of thousands of reaction chambers, which are individually programmed using a microarrayer. Aligning of these printed microarrays to microfluidics devices programs each chamber with a single spot eliminating potential contamination or cross-reactivity Moreover, generating microarrays using standard microarray spotting techniques is also very modular, allowing for the arraying of proteins7, DNA8, small molecules, and even colloidal suspensions. The potential impact of microfluidics on biological sciences is significant. A number of microfluidics based assays have already provided novel insights into the structure and function of biological systems, and the field of microfluidics will continue to impact biology.

We present a microfluidic approach for the expression of protein arrays. The device consists of thousands of reaction chambers controlled by micro-mechanical valves. The microfluidic device is mated to a microarray-printed gene library. These genes are then transcribed and translated on-chip, resulting in a protein array ready for experimental use.

Bir mikroakışkan Platform kullanarak Yüksek throughput Protein Ekspresyonu Jeneratör

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Biyomühendislik

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related processes while conferring biocompatibility and biofunctionality to solid substrates. The spontaneous adsorption and rupture of phospholipid vesicles is the most commonly used method to form SLBs. However, under physiological conditions, vesicle fusion (VF) is limited to only a subset of lipid compositions and solid supports. Here, we describe a one-step general procedure called the solvent-assisted lipid bilayer (SALB) formation method in order to form SLBs which does not require vesicles. The SALB method involves the deposition of lipid molecules onto a solid surface in the presence of water-miscible organic solvents (e.g., isopropanol) and subsequent solvent-exchange with aqueous buffer solution in order to trigger SLB formation. The continuous solvent exchange step enables application of the method in a flow-through configuration suitable for monitoring bilayer formation and subsequent alterations using a wide range of surface-sensitive biosensors. The SALB method can be used to fabricate SLBs on a wide range of hydrophilic solid surfaces, including those which are intractable to vesicle fusion. In addition, it enables fabrication of SLBs composed of lipid compositions which cannot be prepared using the vesicle fusion method. Herein, we compare results obtained with the SALB and conventional vesicle fusion methods on two illustrative hydrophilic surfaces, silicon dioxide and gold. To optimize the experimental conditions for preparation of high quality bilayers prepared via the SALB method, the effect of various parameters, including the type of organic solvent in the deposition step, the rate of solvent exchange, and the lipid concentration is discussed along with troubleshooting tips. Formation of supported membranes containing high fractions of cholesterol is also demonstrated with the SALB method, highlighting the technical capabilities of the SALB technique for a wide range of membrane configurations.

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer SALB Method

We present an experimental protocol to form a supported lipid bilayer on solid substrates without using lipid vesicles. We demonstrate a one-step method to form a lipid bilayer on silicon dioxide and gold as well as supported membranes with cholesterol-enriched domain for various biological applications.

Solvent destekli çift katlı lipid (SALB) Yöntemi ile biyomembran Fabrikasyon

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related ...

Using Adhesive Patterning to Construct 3D Paper Microfluidic Devices

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol adhesive through a metal stencil, the overall amount of adhesive used in assembling paper microfluidic devices can be significantly reduced. We show on a simple 4-layer planar paper microfluidic device that the optimal adhesive application technique and device construction style depends heavily on desired performance characteristics. By moderately increasing the overall area of a device, it is possible to dramatically decrease the wicking time and increase device success rates while also reducing the amount of adhesive required to keep the device together. Such adhesive application also causes the adhesive to form semi-permanent bonds instead of permanent bonds between paper layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use. Nonplanar 3D origami devices also benefit from the semi-permanent bonds during folding, as it reduces the likelihood that unrelated faces may accidently stick together. Like planar devices, nonplanar structures see reduced wicking times with patterned adhesive application vs uniformly applied adhesive.

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct 3D paper microfluidic devices. This method of adhesive application forms semi-permanent bonds between layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use and to ease folding complex nonplanar structures.

3D Kağıt mikroakışkan Cihazlar Construct Yapışkan Desenlendirme kullanma

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol ...

Automated Lipid Bilayer Membrane Formation Using a Polydimethylsiloxane Thin Film

An artificial lipid bilayer, or black lipid membrane (BLM), is a powerful tool for studying ion channels and protein interactions, as well as for biosensor applications. However, conventional BLM formation techniques have several drawbacks and they often require specific expertise and laborious processes. In particular, conventional BLMs suffer from low formation success rates and inconsistent membrane formation time. Here, we demonstrate a storable and transportable BLM formation system with controlled thinning-out time and enhanced BLM formation rate by replacing conventionally used films (polytetrafluoroethylene, polyoxymethylene, polystyrene) to polydimethylsiloxane (PDMS). In this experiment, a porous-structured polymer such as PDMS thin film is used. In addition, as opposed to conventionally used solvents with low viscosity, the use of squalene permitted a controlled thinning-out time via slow solvent absorption by PDMS, prolonging membrane lifetime. In addition, by using a mixture of squalene and hexadecane, the freezing point of the lipid solution was increased (~16 &#176;C), in addition, membrane precursors were produced that can be indefinitely stored and readily transported. These membrane precursors have reduced BLM formation time of &#60; 1 hr and achieved a BLM formation rate of ~80%. Moreover, ion channel experiments with gramicidin A demonstrated the feasibility of the membrane system.

We demonstrate a storable, transportable lipid bilayer formation system. A lipid bilayer membrane can be formed within 1 hr with over 80% success rate when a frozen membrane precursor is brought to ambient temperature. This system will reduce laborious processes and expertise associated with ion channels.

Bir polidimetilsiloksan İnce Film Kullanarak Otomatik çift katlı lipid Membran Oluşumu

An artificial lipid bilayer, or black lipid membrane (BLM), is a powerful tool for studying ion channels and protein interactions, as well as for ...

Ligand Nano-cluster Arrays in a Supported Lipid Bilayer

Currently there is considerable interest in creating ordered arrays of adhesive protein islands in a sea of passivated surface for cell biological studies. In the past years, it has become increasingly clear that living cells respond, not only to the biochemical nature of the molecules presented to them but also to the way these molecules are presented. Creating protein micro-patterns is therefore now standard in many biology laboratories; nano-patterns are also more accessible. However, in the context of cell-cell interactions, there is a need to pattern not only proteins but also lipid bilayers. Such dual proteo-lipidic patterning has so far not been easily accessible. We offer a facile technique to create protein nano-dots supported on glass and propose a method to backfill the inter-dot space with a supported lipid bilayer (SLB). From photo-bleaching of tracer fluorescent lipids included in the SLB, we demonstrate that the bilayer exhibits considerable in-plane fluidity. Functionalizing the protein dots with fluorescent groups allows us to image them and to show that they are ordered in a regular hexagonal lattice. The typical dot size is about 800 nm and the spacing demonstrated here is 2 microns. These substrates are expected to serve as useful platforms for cell adhesion, migration and mechano-sensing studies.

We present a protocol to functionalize glass with nanometric protein patches surrounded by a fluid lipid bilayer. These substrates are compatible with advanced optical microscopy and are expected to serve as platform for cell adhesion and migration studies.

Bir Desteklenen lipit iki tabakalı içinde Ligand Nano küme Diziler

Currently there is considerable interest in creating ordered arrays of adhesive protein islands in a sea of passivated surface for cell biological ...

Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to entry for non-specialists who would benefit greatly from the ability to develop their own microfluidic devices to address research questions. Particularly lacking has been the open dissemination of protocols related to photolithography, a key step in the development of a replica mold for the manufacture of polydimethylsiloxane (PDMS) devices. While the fabrication of single height silicon masters has been explored extensively in literature, fabrication steps for more complicated photolithography features necessary for many interesting device functionalities (such as feature rounding to make valve structures, multi-height single-mold patterning, or high aspect ratio definition) are often not explicitly outlined. 
Here, we provide a complete protocol for making multilayer microfluidic devices with valves and complex multi-height geometries, tunable for any application. These fabrication procedures are presented in the context of a microfluidic hydrogel bead synthesizer and demonstrate the production of droplets containing polyethylene glycol (PEG diacrylate) and a photoinitiator that can be polymerized into solid beads. This protocol and accompanying discussion provide a foundation of design principles and fabrication methods that enables development of a wide variety of microfluidic devices. The details included here should allow non-specialists to design and fabricate novel devices, thereby bringing a host of recently developed technologies to their most exciting applications in biological laboratories.

Multilayer microfluidic devices often involve the fabrication of master molds with complex geometries for functionality. This article presents a complete protocol for multi-step photolithography with valves and variable height features tunable to any application. As a demonstration, we fabricate a microfluidic droplet generator capable of producing hydrogel beads.

Ventilli Katmanlı mikroakışkan Cihazlar için çok adımlı Değişken Yükseklik Fotolitografi

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to ...

Fabricating Multi-Component Lipid Nanotube Networks Using the Gliding Kinesin Motility Assay

Lipid nanotube (LNT) networks represent an in vitro model system for studying molecular transport and lipid biophysics with relevance to the ubiquitous lipid tubules found in eukaryotic cells. However, in vivo LNTs are highly non-equilibrium structures that require chemical energy and molecular motors to be assembled, maintained, and reorganized. Furthermore, the composition of in vivo LNTs is complex, comprising of multiple different lipid species. Typical methods to extrude LNTs are both time- and labor-intensive, and they require optical tweezers, microbeads, and micropipettes to forcibly pull nanotubes from giant lipid vesicles. Presented here is a protocol for the gliding motility assay (GMA), in which large scale LNT networks are rapidly generated from giant unilamellar vesicles (GUVs) using kinesin-powered microtubule motility. Using this method, LNT networks are formed from a wide array of lipid formulations that mimic the complexity of biological LNTs, making them increasingly useful for in vitro studies of lipid biophysics and membrane-associated transport. Additionally, this method is capable of reliably producing LNT networks in a short time (&#60;30 min) using commonly used laboratory equipment. LNT network characteristics such as length, width, and lipid partitioning are also tunable by altering the lipid composition of the GUVs used for fabricating the networks.

This protocol describes a process for fabricating lipid nanotube networks using gliding kinesin motility in conjunction with giant unilamellar lipid vesicles.

Kayan Kinesin Motilite Testi Kullanılarak Çok Bileşenli Lipid Nanotüp Ağlarının Üretilmesi

Lipid nanotube (LNT) networks represent an in vitro model system for studying molecular transport and lipid biophysics with relevance to the ubiquitous ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and organs are either highly expensive, like robotics, or lack nanoliter volume and millisecond time accuracy in liquid manipulation. We herein present the design and fabrication of a microfluidic system, which consists of 1,500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. To demonstrate the capacities of the microfluidic device, neural stem cell (NSC) spheres are maintained in the proposed system. We observed that when the NSC sphere is exposed to CXCL in day 1 and EGF in day 2, the round-shaped conformation is well maintained. Variation in the input order of 6 drugs causes morphological changes to the NSC sphere and the expression level representative marker for NSC stemness (i.e., Hes5 and Dcx). These results indicate that dynamic and complex environmental conditions have great effects on NSC differentiation and self-renewal, and the proposed microfluidic device is a suitable platform for high throughput studies on the complex life machinery.

We present a microfluidic system for high throughput studies on complex life machinery, which consists of 1500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. The microfluidic chip allows for the analysis of the highly complex and dynamic micro-environmental conditions in vivo.

Yüksek Verimli Mikroakışkan Cihaz Kullanarak Dinamik ÇevreSel Koşulların Üretilmesi

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...

Formulating and Characterizing Lipid Nanoparticles for Gene Delivery using a Microfluidic Mixing Platform

Lipid-based drug carriers have been used for clinically and commercially available delivery systems due to their small size, biocompatibility, and high encapsulation efficiency. Use of lipid nanoparticles (LNPs) to encapsulate nucleic acids is advantageous to protect the RNA or DNA from degradation, while also promoting cellular uptake. LNPs often contain multiple lipid components including an ionizable lipid, helper lipid, cholesterol, and polyethylene glycol (PEG) conjugated lipid. LNPs can readily encapsulate nucleic acids due to the ionizable lipid presence, which at low pH is cationic and allows for complexation with negatively charged RNA or DNA. Here LNPs are formed by encapsulating messenger RNA (mRNA) or plasmid DNA (pDNA) using rapid mixing of the lipid components in an organic phase and the nucleic acid component in an aqueous phase. This mixing is performed using a precise microfluidic mixing platform, allowing for nanoparticle self-assembly while maintaining laminar flow. The hydrodynamic size and polydispersity are measured using dynamic light scattering (DLS). The effective surface charge on the LNP is determined by measuring the zeta potential. The encapsulation efficiency is characterized using a fluorescent dye to quantify entrapped nucleic acid. Representative results demonstrate the reproducibility of this method and the influence that different formulation and process parameters have on the developed LNPs.

Lipid nanoparticles are developed using a microfluidic mixing platform approach for mRNA and DNA encapsulation.

Mikroakışkan Karıştırma Platformu Kullanarak Gen Teslimatı için Lipid Nanopartiküllerinin Formülei ve Karakterizasyonsu

Lipid-based drug carriers have been used for clinically and commercially available delivery systems due to their small size, biocompatibility, and high ...

3D Printing of In Vitro Hydrogel Microcarriers by Alternating Viscous-Inertial Force Jetting

Microcarriers are beads with a diameter of 60-250 &#181;m and a large specific surface area, which are commonly used as carriers for large-scale cell cultures. Microcarrier culture technology has become one of the main techniques in cytological research and is commonly used in the field of large-scale cell expansion. Microcarriers have also been shown to play an increasingly important role in in vitro tissue engineering construction and clinical drug screening. Current methods for preparing microcarriers include microfluidic chips and inkjet printing, which often rely on complex flow channel design, an incompatible two-phase interface, and a fixed nozzle shape. These methods face the challenges of complex nozzle processing, inconvenient nozzle changes, and excessive extrusion forces when applied to multiple bioink. In this study, a 3D printing technique, called alternating viscous-inertial force jetting, was applied to enable the construction of hydrogel microcarriers with a diameter of 100-300 &#181;m. Cells were subsequently seeded on microcarriers to form tissue engineering modules. Compared to existing methods, this method offers a free nozzle tip diameter, flexible nozzle switching, free control of printing parameters, and mild printing conditions for a wide range of bioactive materials.

3D Printing of In Vitro Hydrogel Microcarriers by Alternating Viscous-Inertial Force Jetting

Presented here is a mild 3D printing technique driven by alternating viscous-inertial forces to enable the construction of hydrogel microcarriers. Homemade nozzles offer flexibility, allowing easy replacement for different materials and diameters. Cell binding microcarriers with a diameter of 50-500 &#181;m can be obtained and collected for further culturing.

Alternatif Viskoz-Atalet Kuvveti Jetting ile In Vitro Hydrogel Mikrokaçörlerinin 3D Baskısı

Microcarriers are beads with a diameter of 60-250 &#181;m and a large specific surface area, which are commonly used as carriers for large-scale cell ...