Hücresel membranlar, gömülü proteinlerin ve şekerlerin varlığı nedeniyle oldukça kalabalıktır. Sentetik kalabalık destekli lipid çift katmanlı üzerinde tek moleküllü görüntüleme gösteriyoruz. Bu platform, kalabalıklaşmanın membran biyomoleküler reaksiyonları üzerindeki etkisini moleküler düzeyde araştırmak için yararlıdır.
Protokol, membran biyomoleküllerinin bağlanma, difüzyon ve montaj analizini açıklar. Deneydeki başarı, substratın titizlikle temizlenmesine, çift katmanın zarar görmesini önlemeye ve tek moleküllü görüntülemede yüksek sinyal-gürültü oranının korunmasına bağlıdır. Prosedürü benimle birlikte gösteren Aditya Upasani ve Vishwesh Haricharan Rai, laboratuvardan yüksek lisans öğrencileri.
Plazma ile muamele edilmiş akrilik slaytı temiz doku kağıdına yerleştirerek başlayın. Çift taraflı lazer kesim bandını soyun ve slayda yapıştırın. Pipet ucu kullanarak, bir kanaldan diğerine sızıntıyı önlemek için bandı düzleştirin.
Plazma ile işlenmiş kapak kaymasını bantlı kızağın üzerine yerleştirerek odayı kapatın. Bir pipet ucu kullanarak, kanalı suya sıkı tutmak için kapak kaymasını bantlı bölgelere hafifçe bastırın. Cam kaydıraklar kullanılıyorsa, epoksi reçine kullanarak kenarları kapatın.
Hazırlanan mikroakışkan görüntüleme odalarını kurutulmuş koşullar altında bir ila iki hafta saklayın. Piranha çözeltisi kullanılarak önceden temizlenmiş bir cam şişe alın ve tamponu ekledikten sonra üç milimolar'ın son lipit konsantrasyonunu elde etmek için PEG 2000 lipitlerinin istenen mol fraksiyonuna POPC ve DOPE-PEG (2000) kloroform çözeltisi ekleyin. Benzer şekilde, lipitlerin diğer membran bileşimleri de hazırlanabilir.
Daha sonra, kloroformu şişeden küçük bir girdap ile yumuşak bir azot akışı kullanarak kurutun, böylece istenen lipitler şişenin yüzeyinde düzgün bir şekilde kaplanır. Şişeyi bir saat boyunca vakumlu bir kurutucuda tutarak artık kloroformu çıkarın. Daha sonra şişeye bir mililitre PBS ekleyin ve gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.
Gece boyunca inkübasyondan sonra, çözelti bulanık ve sütlü hale gelene kadar şişeyi bir ila iki dakika boyunca yavaşça vorteksleyin. Şimdi bu çözeltinin 100 mikrolitresini küçük bir 500 mikrolitrelik santrifüj tüpüne aktarın. 50 ila 100 nanometre çapında küçük unilamellar veziküller üretmek için, bir banyo sonikatöründe yaklaşık bir saat boyunca çözeltiyi sonikleştirin.
Sonikasyonun sonunda çözüm netleşecektir, eğer çözelti hala bulanıksa, daha sonra 30 dakika daha sonikasyon yapın. Daha sonra lipit çözeltisinde 30 milimolar'lık son bir konsantrasyona soniklenmiş veziküllere kalsiyum klorür ekleyin. Numune çözeltisini deliğe sıkıca oturacak şekilde enjekte etmek için bir mikro pipet ucu kesin.
Lipit çözeltisini karıştırın ve görüntüleme odasındaki deliklerden birinden enjekte edin. Bitişik kanalların kirlenmesini önlemek için odadan çıkıştan çıkan fazla çözeltiyi temiz bir mendille silin. Islak dokuyu 50 mililitrelik bir santrifüj tüpünün sonuna yerleştirerek bir nemlendirme odası hazırlayın.
Sürgüyü tüpe yerleştirin ve tüp kapağını kapatın. Tüpü yana doğru yerleştirin ve bu tertibatı nemlendirilmiş bir odada, 90 dakika boyunca, tercihen 37 santigrat derecede bir inkübatörde bırakın. Odayı bol miktarda PBS tamponu ile iyice yıkayın, yıkama sırasında hava kabarcıklarının odaya girmesini önleyin, çünkü bu membranda kusurlara neden olabilir.
Hareketlilik ve montaj üzerine herhangi bir deney yapmadan önce, bir floresan boncuk örneği hazırlayarak ve bunları mikroakışkan kanala düşük konsantrasyonlarda ekleyerek TIRF mikroskobunu hizalayın, böylece tek boncuklardan floresan lekeler görüntülerde üst üste binmez. İlk olarak, boncukları epifloresan modunda görselleştirin. Aydınlatma epifloresan modundayken, bir çeviri aşamasında oturan M5 aynasını, nesnelden çıkan ışın toplam iç yansıma konfigürasyonu elde edilene kadar bükülecek şekilde hareket ettirin.
TIR aydınlatmasının sağlanıp sağlanmadığını doğrulamak için, TIR kaçınma alanı boncuk numunesini aydınlatırken ve yüzeyden uzakta serbest yüzen boncuklar gözlenmediğinde yalnızca yüzeydeki boncukların görünür olduğunu kontrol edin. Deneyin başlangıcında, floroforların fotoğraf tahribatını önlemek için lazer gücünü objektif arka odak düzleminde beş ila 10 miliwatt'a ayarlayın. Slaytı mikroskop aşamasında tutun ve önce çıplak membrana odaklanın, lipit membranlarındaki küçük safsızlık izleri membranı görselleştirmek için yeterlidir.
Mikro pipet kullanarak numuneyi PEG SLB kaplı görüntüleme odasına enjekte edin. Tek moleküllü bağlayıcı kinetiği ölçmek için, etiketli biyomolekülleri giriş deliklerinden mikroakışkan odasına dakikada 50 ila 500 mikrolitre akış hızında akıtmak için bir şırınga pompası kullanın. Saniyede 25 ila 50 kare hızında 5.000 kare kaydetmek için gerekli film alma parametrelerini ayarlayın.
Film edinimine başlayın ve membran yüzeyinde yeni lekelerin ortaya çıkmasında daha fazla artış olana kadar şırınga pompasından sürekli akış altında 5.000'den fazla kare elde edin ve makalede açıklandığı gibi bağlayıcı kinetiği analiz edin. Tek parçacık takibi için, etiketli biyomolekülleri düşük konsantrasyonlarda bir mikro pipet kullanarak kanala ekleyin. Veri kümelerinden geri kazanılan izlerin yüksek doğrulukta olmasını sağlamak için, konsantrasyonu mikrometre kare başına 0,1 parçacıktan daha az bir yoğunluğa optimize edin, böylece tek tek parçacıklar nadiren yolları kesişir.
Gerekirse, odayı nemlendirici bir ortamda inkübe edin ve görüntülemeden önce tamponla yıkayın. Tek parçacık yörünge analizi için, saniyede 10 ila 100 karede 200 ila 500 kare elde edin ve görüntü elde etme sırasında minimum aşama kayması ile objektif lensi çift katmanlı düzleme odaklanmış halde tutun. Alt birimleri ölçmek için, etiketli biyomoleküllerin ilgili konsantrasyonunu mikroakışkan görüntüleme odasına ekleyin ve slaytı gerekli süre boyunca istenen sıcaklıkta nemlendirici bir odada inkübe edin.
Görüntülemeden önce, görüntüleme odasını bir tamponla yıkayın. Slaytı bir mikroskop üzerine yerleştirin ve etiketli molekülleri görselleştirmek için odağı ayarlayın. Lazer gücünü, floroforun ağartılmasının kademeli olarak gerçekleştiği bir seviyeye ayarlayın.
Her bir birleştirilmiş kompleks için ideal olarak, foto ağartma adım hızını el yazmasında açıklandığı gibi 10 ila 20 kare arasında tutmak için lazer gücünü kontrol edin ve tüm moleküller tamamen foto ağartılana kadar görüntüleri elde edin. Numune hazneye girer girmez film edinimine başlayarak ve PEG SLB'nin farklı segmentlerinden membran bağlandıktan sonra sabit zaman aralıklarında yeni foto beyazlatma filmleri elde ederek zamana bağlı bir montaj ölçümü gerçekleştirin. Sitolisin A'nın lipit membranlarına yüzde beş mol DOPE-PEG (2000) ile bağlanması, partikül yoğunluğunun arttığını ve doygunluğa ulaştığını göstermiştir.
Bağlı parçacıklara uyan üstel bir bozunma fonksiyonu, Sitolisin A membran bağlanması için zaman sabiti verir. Membranda herhangi bir PEG polimeri olmadan, çoğu izleyici SLB'ler üzerinde sınırlı difüzyon gösterdi. membran çift katmanındaki küçük PEG 2000 seviyeleri, altta yatan yüzeyden kaldırılarak izleyici moleküllerinin yüzey kısıtlamaları olmadan dağılmasına izin verdi.
Bununla birlikte, çift katmanlı membranda yüksek konsantrasyonda aşırı hapsolma gözlenir. İki farklı PEG 2000 lipid membranında lipofilik DNA izleyicinin difüzyonu için ISD2 dağılımı, yüksek konsantrasyonlarda PEG'de azalmış hareketlilik göstermiştir. Kalabalık lipid çift katmanlı membran üzerinde inkübe edildikten sonra Sitolisin A, çeşitli montaj ara ürünlerinin oluşumunu öneren birçok farklı foto beyazlatma adımı sergiledi.
Etiketleme verimliliğini düzelttikten sonra, oligomerlerin son dağılımı baskın yapı olarak dodecamerik Cytolysin A türlerini gösterdi. Membran protein bağlama tertibatı ve diğer reaksiyonlar uygun membran kalabalık ortamlarında yapılmalıdır. Görüntüleme odasını temizlemeye, çift katmanı bozmaktan kaçınmaya ve TIRF mikroskobunun kurulmasına dikkat edilmelidir.
