The Swedish Research Council (VR) is greatly acknowledged for financial support of this work by a young investigator grant #621-2013-5138. The PDC Center for High Performance Computing at the KTH Royal Institute of Technology is acknowledged for providing computational support.

1. Giriş Silico Bilgisayar Modellemesi <ol><li> Protein veri bankası (PDB) ilginin bir protein PDB yapısı indirin. Aşırı alt birimleri kaldırılması ve ardından &quot;Hücre Nötralizasyon ve p K tahmin&quot; YASARA 16 deney kullanarak eksik hidrojen atomlarını ve açık solvent ekleyerek yapıyı hazırlayın. Membrana bağlı triterpen siklazlar için, su kutusu uygun boyutları 91x67x77 Å bulunmaktadır. El katalitik olarak aktif amino asitler protonlanma durumunu ayarlayın. Not: PDB dosyasında bir alt-tabaka analog &quot;Edit | takas | atom&quot; kullanarak gerçek bir alt-tabaka için değiştirilebilir Gerekirse komutu. </li><li> AMBER kuvvet alan suite 17 ile &quot;Enerji minimizasyonu&quot; komutu ile yapısını en aza indirin. Uzun menzilli elektrostatik etkileşimler için hesap parçacık örgü Ewald yaklaşımı (PME) 18 kullanın. Göre van der Waals etkileşimleri için cut-off Setstandart ayarlara. Not: yakınsama ulaşılana kadar &quot;Enerji minimizasyonu&quot; komutu sonra kısa dik iniş minimizasyonu, bir tavlama benzetimi ile yapısal stres ortadan kaldırır (timestep 2 FSEC, 0.9 her 10 inci adım tarafından küçülttüm atom hızları) gerçekleştirilir (yani, enerji gelişme ) 200 adımları sırasında atom başına en az 0.012 kcal / mol olarak. </li></ol> Aktif Sitesi çözme ve Su Erişim 2. Model <ol><li> Tavlama benzetimi sonra, 20 NSEC moleküler dinamik (MD) yörüngesini çalıştırın ve &quot;Dosya | Kaydet | Simülasyon Snapshot&quot; en az 10 enstantane oluşturmak &quot;Simülasyon On&quot; izledi komuta. Kanonik toplulukta altında periyodik sınır koşulları ile standart bir bilgisayarda simülasyonlar çalıştırın. Bir Berendsen termostat kullanılarak 298 K sıcaklık koruyun. </li><li> Tüm su molekülleri ve nihai ligandlar / maddeleri kullanarak silerek 2.1 elde edilen anlık hazırlayın4; Düzenle | Sil | Üst üste Kalıntı &quot;orijinal PDB-yapısına ayrı komut Üst üste her anlık.&quot; | Object &quot;komutu tüm yapıların aynı uzaysal konumunu paylaşan sağlamak, yeni bir PDB Bu şekilde hazırlanan her anlık kaydet. -dosya (kullanarak &quot;Dosya | Farklı kaydet | PDB&quot; komutu). Deneyimli modelleyicileri için: Not Ek Kod Dosya 1&#39;de verilen şablona göre bu işlemi otomatik hale getirmek için bir komut dosyası yazın. </li><li> Yazılım caver 3.0 19 girdi olarak 3D uzayda hizalanmış olan 2.2 den hazırlanan fotoğraf (PDB) kullanın. Anlık sınırlı sayıda analizi için, standart bir bilgisayar üzerinde Caver çalıştırın. Su moleküllerinin taşınması için özel olan tünellerin saptanmasını sağlamak için 0,7 Å 19 bir sonda yarıçapı kullanın. </li><li> Bir moleküler grafik yazılımı Caver 3.0 tarafından oluşturulan tüneller gözünüzde canlandırın. Tünellerin kolay görsellik için, Ek Kod Fil gösterilen makro kullanmake 2. </li></ol> Silico Enzim Mühendisliği 3. Su Desenleri ve Su Dynamics Değiştir <ol><li> Caver 3.0 yazılımından üretilen çıktı dosyası &quot;Summary.txt&quot; bölümünde listelenen başlığı &quot;ID&quot; göre yüksek sıralamadaki tünelleri tanımlayın. </li><li> En üst sırada yer tüneller (3.1) ve bu ekran (2.4 elde edilen modeli kullanarak) görsel inceleme yoluyla kanal içine doğru bakan bir küçük yan zincir astar amino asitler tanımlayın. &quot;Takas Kalıntı&quot; komutunu kullanarak artan sterik engelleme ile tünel engeller tek amino asit yer değiştirmelerini tanımlayın. Tünel adımları protokolün 1.2-3.1 tekrarlayarak sonra görsel inceleme ile tıkalı ve emin olun. </li></ol> Mutasyona uğramış genlerin 4. İfade <ol><li> Örtüşmeyen primerler 20 ile mutagenezi, PCR ile, vahşi tip gen mutasyonu tanıtmak. </li><li> Tüpe ilgili geni içeren plazmid DNA eklemeuygun bir klonlama soyunun güçlü hücrelerle s ve 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir. 42 ° C olarak ayarlandı sıcaklıkta bir su banyosu içinde 45 sn için bir ısı şoku dönüşümü gerçekleştirir. Taze zengin ortamdan 500 ul ekle (2YT, 16 g / L tripton, 10 g / L maya ekstresi, 5 g / L NaCl), 37 ° C&#39;de inkübe, 45 dakika boyunca 200 rpm. Uygun antibiyotik ile takviye agar plaklarına dönüştürülmüş hücreleri kaplama ile bir seçim yapın. </li><li> Mutasyona uğramış genin DNA dizisini doğruladıktan sonra, yukarıda tarif edildiği gibi, ısı şoku kullanılarak bir ekspresyon suşu plazmid DNA dönüşümü. Membrana bağlı triterpen siklaz ekspresyonu için, BL21 (DE3) kullanın. </li><li> Uygun antibiyotikler ile takviye edilmiş ortam içinde 2YT-sentezleme suşu 37 ° C&#39;de 5 ml O / N kültür başlatın. </li><li> 0.05-0.09 nihai OD, uygun antibiyotik ile takviye edilmiş 300 ml 2YT ortam-ihtiva eden bir 2 L&#39;lik bölmeli bir çalkalama şişesi inoküle (600 nm &#39;de ölçülür). 0.6-0 bir OD indüksiyon sonrası.8 ve protein ifadesi, 80 ° C&#39;de hücre pelletini ve mağaza dondurma. <ol><li> Bir pD861 vektörü içinde zara bağlı triterpen siklazlar için, protein 21, yüksek verim elde etmek için 37 ° C&#39;de 0.5 saat ifade mM ramnoz 2 ve 4 ile neden olur. </li></ol></li></ol> Normal Santrifüj ve Protein Saflaştırılması Kullanılması 5. Membran Ekstraksiyon <ol><li> Aşağıdaki tamponlar hazırlayın: Tekrar süspansiyona, tampon (100 mM potasyum fosfat, proteas engelleyici tabletleri ile takviye edilmiş, pH 7.5), deterjan tamponu (% 1 (v / v) Triton X-100, 50 mM potasyum fosfat, pH 7.5) eklendi ve reaksiyon tampon maddesi (0.2 % Triton X-100, 50 mM potasyum fosfat, pH 7.5). <ol><li> Skualen siklaz hopene veya daha düşük bir pH optimumuna sahip, diğer zara-bağlı enzimler için, sitrat ile yeniden süspansiyon haline getirme tamponu içinde potasyum fosfat değiştirin. Deterjan tamponu (% 1 Triton X-100: Bu tür enzim için, aşağıdaki tamponlar, 60 mM sitrat, pH 6.0) eklendi ve reaksiyon tampon maddesi (% 0.2 Triton-X 100, 60 mM sitrat, pH 6.0). Not: His-tag saflaştırılması için kullanılırsa, 20 mM imidazol (nihai konsantrasyon) ile yeniden süspansiyon haline tampon tamamlar. </li></ol></li><li> Bir cam beher içinde, bir donmuş hücre topağı tartılır. / Ml 0,3 g hücrelerin nihai bir konsantrasyona kadar bir homojenleştirici kullanılarak yeniden süspansiyon tamponunda tekrar süspansiyon hücreleri. % 80 genlik ve 1 saniye ve 1 saniye kapalı bir darbe ile ultrasonication tarafından Lyse yeniden süspanse hücreleri. 50 sn her üç tekrarlanan döngülerini kullanın. </li><li> % 0.2 (h / h) deterjan nihai bir konsantrasyona kadar tampon, deterjan ekleyin. 1 saat süre ile 4 ° C &#39;de, karıştırma ucu-üzerinde-sonuna dengelenmesi. 4 ° C&#39;de 50 dakika boyunca 39.000 x g&#39;de tek bir santrifüj aşamasında sonra süpernatant kaydederek membran proteini fraksiyonu yeniden elde. Not: His-tag saflaştırma kullanılırsa, agaroz / g hücre, yaklaşık 1.5 ml Ni-NTA ekleyin ve 1 saat kuluçkada bırakın. </li><li> Bir birinci arıtma işlemleriniiyon değişimi veya His-tag arıtma 21 ya adım. % 0.2 Triton X-100 ile dengeleme ve elüsyon tamponlarının Ek. Saflaştırılmış proteini 10 kDa&#39;lık bir kesim ile Santrifüj Filtre Birimleri kullanılarak beş kez konsantre edilir. Not: deterjan konsantrasyonunda Triton X-100 miseller sonuçlar büyüklüğü yaklaşık olarak% 1 bir son konsantrasyona seyreltildi. </li><li> . 10 6 × 2 × 10 4 -8 arasında küresel proteinler için bir fraksiyon aralığı ile uyumlu konsantre protein ve bir matris kullanılarak jel süzme parlatma adım arınma tamamlayın tampon olarak çalışan reaksiyon tamponu kullanın. Üreticinin protokolüne uygun olarak Bradford Ultra kiti kullanılarak saflaştırılmış protein miktarını ölçün. </li></ol> 6. Kinetik <ol><li> Reaksiyon tampon maddesi içinde alt-tabaka taze 5 mM stok solüsyonu olun. 2-5 dakika boyunca% 30 genliğinde ultrasonikasyon ile homojen bir emülsiyon elde edilir. </li><li> Bir termomikser dengelenmesiistenen reaksiyon sıcaklığında gerçekleştirilir. Harici termometre ile cam şişe su içeren içindeki sıcaklığı kontrol edin. </li><li> Tek substrat kinetikleri, aynı nihai alt yapı konsantrasyonu en az beş cam şişelere emülsiyon haline alt-tabakanın seyreltin. <ol><li> Birden fazla alt-tabakalar ile tek-kap göre kinetiği için, her bir küçük şişe içinde, tüm tabakaları karıştırarak en az beş eşit cam gibi tüp hazırlanır. Hidrofobik triterpenler için, 10-200 uM aralığı içinde son substrat konsantrasyonları kullanırlar. </li></ol></li><li> 10 dakika termomikser cam şişeleri Preincubate. Enzim ilave ederek reaksiyonu başlatın. 1 ml&#39;lik bir toplam reaksiyon hacmi uygundur. En az 1200 rpm çalkalama hızı kullanın. </li><li> 500 ul etilasetat ekleyerek farklı zaman noktalarında reaksiyonlar durdurun entegrasyon standart olarak 100 uM dekanol ile çivili. </li></ol> 7. Ekstraksiyon ve Termodinamik Analizi <ol><li> Ile reaksiyon karışımları ekstraktevorteks elle 1 dakika boyunca güçlü bir şekilde cam gibi tüp çalkalanarak. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca masa üstü bir santrifüj içerisinde 9600 xg&#39;de cam şişeleri santrifüjleyin. Boş bir tüp üst tabaka (organik faz) aktarın. Reaksiyon tüplerine özütleme çözücüsü ilave bir 500 ul ilave edin ve ekstraksiyon prosedürü tekrarlayın. </li><li> Na 2 SO 4 ile ekstre Reaksiyon karışımları kurutun. 5 saniye Vortex ve tüpler 10 dakika dinlenmeye bırakın. Bir masa üstü santrifüj kullanılarak oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 9600 x g&#39;de santrifüj adımı nihai gerçekleştirin. Gaz kromatografisi (GC) flakon ayıklanır örnekleri aktarın. </li><li> (Tek alt-tabaka kinetiklerinin) alt-tabakanın, en az dört farklı başlangıç ​​konsantrasyonuna ve (tek alt-tabaka ve rekabetçi kinetiği her ikisi için), dört farklı sıcaklıklarda, ilgi konusu her bir enzim varyantı için 6.1-7.2 altındaki adımları tekrarlayın. </li><li> Daha önce 3 açıklandığı gibi GC-analiz gerçekleştirin. Hidrofob analizi için polar olmayan bir sütun kullanarakic pentasiklik ürünleri. Ürünleri ve sütun bağlı olarak, 120 ° C, başlangıç ​​fırın sıcaklığı ayarlamak ve 5 ° C / dakikalık bir sıcaklık gradyanı kullanılır. </li><li> Ürün (ler) in entegre pik alanları ve (100 uM karşılık gelen) entegrasyonu standart alana sahip karşılık gelen bir ürün konsantrasyonlara ürün zirve alanları dönüşümü. Reaksiyon süresi (t) karşı her bir ürün ([P]) konsantrasyonunu çizilir. % 10&#39;dan daha az dönüşüm tekabül eden veri noktalarının doğrusal regresyonu gerçekleştirin. Başlangıç ​​reaksiyon hızı (V 0) &#39;e göre, uydurulmuş çizginin eğimini ile elde edilir: <img alt="Denklem 1" src="/files/ftp_upload/53168/53168equation1.jpg" /> Not: birden çok malzeme ile tek-kap göre kinetiği için, V 0, diğer alt-tabakaların etkisi altında, belirli bir alt-tabaka ilk oranıdır. </li><li> Tek substrat kinetiği, arsa V 0 İçin </suİlgili substrat konsantrasyonları karşı b&gt; / [E]. Belirgin k cat / K M değerine göre grafik doğrusal parçası eğimi ile verilir: <img alt="Denklem 2" src="/files/ftp_upload/53168/53168equation2.jpg" /> [S] substrat ve konsantrasyonudur [E] dönüşüm. K cat kullanılan son enzim konsantrasyonu / K M, Michaelis sabiti üzerinde katalitik katsayısına denk gelmektedir. Her sıcaklık ve her enzim çeşidi için analiz tekrarlayın. </li><li> Tek substrat kinetiği için, geçiş durumu teorisi 22 uygun bir termodinamik analizi gerçekleştirmek <img alt="Denklem 3" src="/files/ftp_upload/53168/53168equation3.jpg" /> k b Boltzmann sabiti, h Planck sabiti, T Kelvin sıcaklık ve gaz sabiti R. K ((ln arsa bir lineer regresyon analizi yapın <sub&gt; Kedi / K M) / ((k b * T) / h))) 1 / T karşı. Aktivasyon entalpisi (Δ H ‡) (-slope) * R ve aktivasyon entropi (Δ S ‡) (kesişme) * R tarafından verilen tarafından verilir. Not: Benzer şekilde, alt-tabaka saturasyon konsantrasyonu altındaki bir analiz denklem 3 sabit oran olarak k cat kullanılarak gerçekleştirilebilir. </li><li> Birden substratları ile tek pota göreli kinetik için, bağıl belirgin elde k cat / 23 K M değerleri: (K cat / K M) A / (k cat / K M) B = V 0, A / V 0, B * [B] / [A] (4) ki burada V 0, bir alt tabaka, B ile rekabet alt tabaka A için, ilk oran değinmektedir </li><li> Tek pota göreli ki&#39;nin içinBirden substratları ile davi s, doğrusal olmayan regresyon ile, A olarak referans ile karşılaştırıldığında, B aktivasyon göreceli termodinamik parametreleri edinin: <img alt="Denklem 5" src="/files/ftp_upload/53168/53168equation5.jpg" /></li><li> Aktivasyon entalpisi ve referans bileşik A entropi substrat B mutlak aktivasyon parametreleri hesaplamak: <img alt="Denklem 6" src="/files/ftp_upload/53168/53168equation6.jpg" /></li></ol>

<ol>
	<li>Ball, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Water+as+an+active+constituent+in+cell+biology.">Water as an active constituent in cell biology.</a> Chem. Rev. 108 (1), 74-108 (2008).</li><li>Snyder, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+the+hydrophobic+effect+in+the+biomolecular+recognition+of+arylsulfonamides+by+carbonic+anhydrase.">Mechanism of the hydrophobic effect in the biomolecular recognition of arylsulfonamides by carbonic anhydrase.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108 (44), 17889-17894 (2011).</li><li>Syren, P. O., Hammer, S. C., Claasen, B., Hauer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entropy+is+Key+to+the+Formation+of+Pentacyclic+Terpenoids+by+Enzyme-Catalyzed+Polycyclization.">Entropy is Key to the Formation of Pentacyclic Terpenoids by Enzyme-Catalyzed Polycyclization.</a> Angew. Chem., Int. Ed. 53 (19), 4845-4849 (2014).</li><li>Persson, F., Halle, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+Access+to+the+Protein+Interior:+Simulation+versus+NMR.">Transient Access to the Protein Interior: Simulation versus NMR.</a> J. Am. Chem. Soc. 135 (23), 8735-8748 (2013).</li><li>Abel, R., Young, T., Farid, R., Berne, B. J., Friesner, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+Active-Site+Solvent+in+the+Thermodynamics+of+Factor+Xa+Ligand+Binding.">Role of the Active-Site Solvent in the Thermodynamics of Factor Xa Ligand Binding.</a> J. Am. Chem. Soc. 130 (9), 2817-2831 (2008).</li><li>Michel, J., Tirado-Rives, J., Jorgensen, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energetics+of+Displacing+Water+Molecules+from+Protein+Binding+Sites:+Consequences+for+Ligand+Optimization.">Energetics of Displacing Water Molecules from Protein Binding Sites: Consequences for Ligand Optimization.</a> J. Am. Chem. Soc. 131 (42), 15403-15411 (2009).</li><li>Pearlstein, R. A., Sherman, W., Abel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contributions+of+water+transfer+energy+to+protein-ligand+association+and+dissociation+barriers:+Watermap+analysis+of+a+series+of+p38&#206;&#177;+MAP+kinase+inhibitors.">Contributions of water transfer energy to protein-ligand association and dissociation barriers: Watermap analysis of a series of p38&#206;&#177; MAP kinase inhibitors.</a> Proteins: Struct., Funct., Bioinf. 81 (9), 1509-1526 (2013).</li><li>Young, T., Abel, R., Kim, B., Berne, B. J., Friesner, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motifs+for+molecular+recognition+exploiting+hydrophobic+enclosure+in+protein-ligand+binding.">Motifs for molecular recognition exploiting hydrophobic enclosure in protein-ligand binding.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104 (3), 808-813 (2007).</li><li>Matsuoka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Water-Mediated+Recognition+of+Simple+Alkyl+Chains+by+Heart-Type+Fatty-Acid-Binding+Protein.">Water-Mediated Recognition of Simple Alkyl Chains by Heart-Type Fatty-Acid-Binding Protein.</a> Angew. Chem., Int. Ed. 54 (5), 1508-1511 (2014).</li><li>Pavlova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redesigning+dehalogenase+access+tunnels+as+a+strategy+for+degrading+an+anthropogenic+substrate.">Redesigning dehalogenase access tunnels as a strategy for degrading an anthropogenic substrate.</a> Nat. Chem. Biol. 5 (10), 727-733 (2009).</li><li>Breiten, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Water+Networks+Contribute+to+Enthalpy/Entropy+Compensation+in+Protein-Ligand+Binding.">Water Networks Contribute to Enthalpy/Entropy Compensation in Protein-Ligand Binding.</a> J. Am. Chem. Soc. 135 (41), 15579-15584 (2013).</li><li>Oldfield, E., Lin, F. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terpene+biosynthesis:+Modularity+rules.">Terpene biosynthesis: Modularity rules.</a> Angew. Chem., Int. Ed. 51 (5), 1124-1137 (2012).</li><li>Henzler-Wildman, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hierarchy+of+timescales+in+protein+dynamics+is+linked+to+enzyme+catalysis.">A hierarchy of timescales in protein dynamics is linked to enzyme catalysis.</a> Nature. 450 (7171), 913-916 (2007).</li><li>Tzeng, S. R., Kalodimos, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+activity+regulation+by+conformational+entropy.">Protein activity regulation by conformational entropy.</a> Nature. 488 (7410), 236-240 (2012).</li><li>Warshel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrostatic+origin+of+the+catalytic+power+of+enzymes+and+the+role+of+preorganized+active+sites.">Electrostatic origin of the catalytic power of enzymes and the role of preorganized active sites.</a> J. Biol. Chem. 273, 27035-27038 (1998).</li><li>Krieger, E., Darden, T., Nabuurs, S. B., Finkelstein, A., Vriend, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+optimal+use+of+empirical+energy+functions:+Force-field+parameterization+in+crystal+space.">Making optimal use of empirical energy functions: Force-field parameterization in crystal space.</a> Proteins: Struct., Funct., Bioinf. 57 (4), 678-683 (2004).</li><li>Duan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+point-charge+force+field+for+molecular+mechanics+simulations+of+proteins+based+on+condensed-phase+quantum+mechanical+calculations.">A point-charge force field for molecular mechanics simulations of proteins based on condensed-phase quantum mechanical calculations.</a> J. Comput. Chem. 24 (16), 1999-2012 (2003).</li><li>Essmann, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+smooth+particle+mesh+Ewald+method.">A smooth particle mesh Ewald method.</a> J. Chem. Phys. 103, 8577-8593 (1995).</li><li>Chovancova, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAVER+3.0:+a+tool+for+the+analysis+of+transport+pathways+in+dynamic+protein+structures.">CAVER 3.0: a tool for the analysis of transport pathways in dynamic protein structures.</a> PLoS Comput. Biol. 8 (10), e1002708 (2012).</li><li>Zheng, L., Baumann, U., Reymond, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+one-step+site-directed+and+site-saturation+mutagenesis+protocol.">An efficient one-step site-directed and site-saturation mutagenesis protocol.</a> Nucleic Acids Res. 32 (14), e115/1-e115/5 (2004).</li><li>K&#252;rten, C., Uhlen, M., Syren, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+functional+human+oxidosqualene+cyclase+in+Escherichia+coli.">Overexpression of functional human oxidosqualene cyclase in Escherichia coli.</a> Protein Express. Purif. , (2015).</li><li>Eyring, H., Stearn, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+application+of+the+theory+of+absolute+reaction+rates+to+proteins.">The application of the theory of absolute reaction rates to proteins.</a> Chem. Rev. 24 (2), 253-270 (1939).</li><li>Fersht, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+mechanism+in+protein+science:+a+guide+to+enzyme+catalysis+and+protein.">Structure and mechanism in protein science: a guide to enzyme catalysis and protein.</a> , (1999).</li><li>Wendt, K. U., Poralla, K., Schulz, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+a+squalene+cyclase.">Structure and function of a squalene cyclase.</a> Science. 277 (5333), 1811-1815 (1997).</li><li>Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+proteins,+lipids+and+detergents:+not+just+a+soap+opera.">Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera.</a> Biochim. Biophys. Acta, Biomembr. 1666 (1-2), 105-117 (2004).</li><li>Garcia-Viloca, M., Gao, J., Karplus, M., Truhlar, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+enzymes+work:+analysis+by+modern+rate+theory+and+computer+simulations.">How enzymes work: analysis by modern rate theory and computer simulations.</a> Science. 303 (5655), 186-195 (2004).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Yabani tip membran enzimi ve tünel varyantlar için yüksek kaliteli, deneysel termodinamik verileri ulaşmada en kritik adımlar şunlardır: Bilgisayarınızın modeline 1) nesil; 2) homojen saflaştırılmıştır proteinler; 3) emülsifiye substrat stokları; 4) kinetik sırasında sıcaklığın kontrolü; Iç standart kullanılarak tepkime karışımlarından 5) elde edilmesi. Bilgisayar modeli nesil ölçüde platformlarda çeşitli destekler kullanıcı dostu arayüzü ile bir yazılımın kullanımı kolaylaştırılmıştır. Dolayısıyla, bu protokol bile olmayan uzmanlar modelleme bizim strateji erişilebilir hale getirmek için YASARA modelleme paketi 16 yapılanır. Su tüneli tanımlanması için bir bilgisayar modelinin, ilgi 24 enzimin bir kristal yapısı dayanmalıdır. Bu amaç için, protein veri bankası uygun kristal yapılarının zenginliği çok faydalıdır. Bizim deneyim, tem başarılı hazırlanmasında önemli bir yönüyleTünel tanımlanması için plakalar kristalografik suları tutmaktır. Bu normal bir bilgisayarda çalıştırılabilir moleküler dinamik simülasyonları, yaparken bir çözülmüş enzim kutusunu kullanın eşit öneme sahiptir. Alicyc acidocaldarius gelen triterpen siklaz MD simülasyonları 3 esnasında su stabildir. Bununla birlikte, kristalografik deterjanlar tutmak ve / veya hücre membranı taklit eder kullanılarak belki de uzun bir MD simülasyonlar için izin vermek için potansiyel olarak kararsız enzimler için gerekli olacaktır. Bu tünel örgütün dinamik yönlerini ele olmaz, ancak son derece zorlu hedeflerin minimize kristal yapısı, protokolü kullanılarak önemli mekanik fikir verebilir öngörülmektedir. Tek veya girdi olarak anlık sınırlı sayıda temel modda Caver 19, standart bir dizüstü bilgisayarda olmayan uzmanlar tarafından da kullanılabilir. Bizim deneyim 3, bir darboğaz yarıçaplı tüneller (yani, yarıçap dayanaraken dar noktasında) 1&#39;den küçük Å kristalografik su molekülleri sol orta), tahmin edilen tünelin (Şekil 1 içinde ikamet, özellikle su son derece alakalı olabilir. Diğer yandan, daha büyük bir dar boğaz çapı ve aktif sitenin 10 üzerinden alt-tabakanın taşınması için bir tünel anlamına gelebilir. Tamamlayıcı Kodu komut 2. öngörülen tünellerin görünüm için olmayan uzmanlar tarafından kullanılabilir Dosya. Gelecek deneyler homoloji modelleri, su şebekeleri ve dinamikleri atomistik çalışma için izin yeterince yüksek çözünürlük olup olmayacağını ortaya koyacaktır. Ve aktif bölgede bulunan bir bağ olmadan, moleküler dinamik simülasyonları performans nasıl ışık tutan, tünel tanımlama süreci de önemli olacağını etkiler. Membran proteinlerinin Kinetik zorlu bir 25 teşkil edebilir. Protokol, burada basit bir zar çıkarma protokolüne dayalıörneğin, bir ultra santrifüj gibi pahalı ekipman kullanılmaksızın membran enzim elde edildi. Son cilalama aşaması olarak jel filtrasyonu kullanımı potansiyeli artık zar partikülleri temizler ve uygun bir deterjan ortamı 25 tanımlamak için izin verir. Protokolden tekrarlanabilir kinetik sonuçlar elde önemli bir yönü ultrasonication substrat stok çözelti emülsifiye etmektir. Reaksiyon tampon maddesi içinde seyreltilmiş, hidrofobik yüzeylere basit vorteksleme homojen olmayan alt tabaka, deterjan karışımları vermektedir. Olmayan emülsifiye edilmiş alt-tabaka çözeltilerinin pipetleme başlangıç ​​hızları doğru belirlenmesini önler (kantitatif GC ile teyit) &#39;tekrarı konsantrasyonlarına yol açar. Buna karşılık, doğru emülsiyon haline Stok çözeltilerin pipetleme 0.98-0.99 aralığında R 2 ile başlangıç ​​hızları lineer regresyon analizi ile sonuçlanmalıdır. Hidrofobik alt-tabakaların bir diğer önemli yönü görünür substrat çözünürlüğüdürve alt tabaka-deterjan karışımlarında kullanılabilirlik. Aslında, bu referans substrat skualen ile Triterpen siklaz doyurmak mümkün değildi. Bu nedenle belirgin k kedi / K M değerleri hem bağlayıcı ve kimya katkıları içerebilir hangi burada sunulmuştur. Ancak, kimya k kedi için sınırlayıcı hızı olduğu görülmüştür / triterpen siklazlar 3 tarafından yürütülen polycyclization kaskad K M. Harici bir termometre ile bir reaksiyon cam bir şişe içindeki gerçek sıcaklık kontrol etmek için büyük önem taşımaktadır. Yine de, doğrusal uyan farklı sıcaklıklarda temel sabit görünen k cat / K M değerlerine sahip varyantlar için kötü olabilir. Bu sıfır (Şekil 2B ve 2C) yakın bir aktivasyon entalpisi ile S168F varyantı burada (Şekil 2A) için olduğunu vurguladı. Çok smalbelirgin k kedi l sıcaklığa bağlı değişimleri / K M, gözlenen aktivasyon entropi belirsizlik neden olabilir Δ S ‡ (yani, Şekil 2B&#39;de doğrusal araziler kesişimi). Prensip olarak, gözlemlenen aktivasyon entropi aynı zamanda protein konsantrasyonu ölçülerek tespit olmaz farklı türevleri aktif enzim, farklı bir bolluk etkilenebilir. Bu tek bir kapta birden fazla alt-tabakaların karıştırırken deneysel hatalar azaltılır beklenmektedir. Farklı alt-tabakalar, bu, tüm koşullar altında enzim aynı miktarda (denklem 4) ile etkileşim olmasıdır. Bir ekstraksiyon çözücünün kullanımı, bir iç standart ekstre etme ve / veya GC-enjeksiyon sırasında farklılıkları hesaba önemlidir ile çivili. Geçiş devlet teorisi başarıyla enzimoloji 26 kullanılmıştır. Bu önemli teorik çerçeve başlangıçta de oldugaz fazında tek moleküllü reaksiyonlar için veloped. Bununla birlikte, enzimlerin çoğu klasik aktivasyon enerji bariyerini 26 düşürerek çalışması gösterilmiştir. Tek, burada olduğu varsayılır iletim katsayısı ölçülen aktivasyon entalpisi ve / veya entropi etkileyebilir. Tünel katkısı ve bu geçiş halinin recrossing gibi diğer klasik olmayan etkiler, kabaca enerjide yaklaşık 4 kcal / mol tekabül kataliz 26 1000 kat katkıda bulunabilirsiniz. Bu (328 K, Şekil 2C, 16 kcal / mol), vahşi tip enzimin tarafından görüntülenen aktivasyon entropi muntazam olmayan bir aktarım katsayısı nedeniyle örneğin klasik olmayan etkileri çok daha büyük olduğu görülebilir. Protokolünü kullanarak vahşi tip ve tünel türevleri için aktivasyon termodinamik parametreleri karşılaştırırken iletim katsayısının etkisi azaltmak gerekir. Aktivasyon Gibbs serbest enerjisi (Δ G ‡) bileşim olupBir enthalpic (Δ H ‡) ve Entropic hem sed (- T * Δ S ‡) terim. Kataliz sırasında enzimlerin Solvent yeniden yapılanma hem parametreleri etkileyebilir. Mevcut protokol gerekli biyofiziksel deneysel çerçeve ile ilgili ve silico kullanıcı dostu hesaplama araçları araç kutusu monte ederek bu olayların incelenmesini kolaylaştırmak bekleniyor. Yöntem, membrana bağlı enzimler ile kataliz içeren enzimatik yöntemlerle, bir bolluk çalışmak için faydalı olduğu düşünülmektedir.

Su yaşam 1 kimyasının bir taşını oluşturmaktadır. Su desenleri ve enzim aktif sitelerin çözme entalpisi ve hidrofobik etkisi 2,3 ötesine uzanan oldukça karmaşık bir şekilde 1,2 ve kataliz 3 ligand entropi hem de etkiler. NMR 4, kalorimetre 2 ve çözünmüş proteinlerin moleküler modelleme ligand dernek 5-8, özgüllük ve aktivite 2,9,10 için itici bir kuvvet sağlayan açık su moleküllerinin rolüne ışık tutacak için kullanılır olmuştur. Bu yazıda Enzim kataliz üzerindeki çözücü deplasman termodinamik etkisi (Şekil 1) deneysel değerlendirilmesi için eşsiz bir metodoloji sunuyoruz. Bizim kombine strateji enzim mühendisliği ve termodinamik analizi (Şekil 1) ile uyum içinde bilgisayar simülasyonları kullanarak dayanmaktadır. Bu cata üzerine çözücü dinamiklerin etkisi ek aydınlatan sağlarŞu anda tam olarak anlaşılamamıştır parçalama. Çözünmüş enzim aktif sitelerde su aracılı hidrojen bağları tarafından sağlanan enthalpic etkileşimleri, stabilize, entropik cezalar 1 mahsup edilebilir. Toplu 5 su ile karşılaştırıldığında bu entropik maliyetler protein boşlukları içinde kalan su molekülleri tarafından görüntülenen serbestlik derecesi azalma ile ilişkilidir. Sipariş su moleküllerinin serbest bırakma ve böylece ligand dernek 1 ve kataliz 3 için entropik itici gücünü sağlayabilir. Solvent dinamiklerinin önemli bir yönü proteinlerin iç ve dış solvent 4 arası su moleküllerinin değiştirmesidir. Aktivasyon enerjisi, entalpi, entropi ve 11 İlişikteki değişiklikler tamamen moleküler düzeyde anlaşılmış değildir. Aktivasyonuna enzimlerin suyun taşınması, çözücü dinamikleri önemi ve katkılarından dolayı sorumlu bireysel tüneller engelleyerekEnerji (Şekil 1) değerlendirilebilir. Ayrıca, farklı sıcaklıklarda tek kap kinetik deneyler yaparak çeşitli alt tabakaların göreli termodinamik aktivasyon parametreler, deneylerin sayısı azaltılmış (Şekil 1, sağ) elde edilebilir. Bizim disiplinlerarası yöntem ömrü 12 yüksek öneme sahip polisiklik terpenler oluşturmak karmaşık zara bağlı triterpen siklaz enzimleri onaylanmıştır. Protokol, standart bir santrifüj kullanılarak membran proteini yüksek miktarda (10-20 mg / L) geri kazanımını sağlar. Enzimler, su gelişti rağmen, kataliz teşvik çözücü rolü genellikle ihmal edilir. Şekil geçiş durumuna 15 elektrostatik tamamlayıcılık aktif siteler önceden organize protein dinamikleri 13,14 ek olarak, su dinamiği, verimli enzim kataliz için yüksek öneme sahip olabilir. Birkaç disiplinlerarası teknikleri dövme, bizimAmaç su dinamikleri ve termodinamiğin son derece karmaşık bir çalışma kolaylaştırmaktır. Bilimsel topluluk bu araçları daha erişilebilir hale değişmiş faaliyetleri ve özellikleri için enzim mühendisliği ve protein tasarımında yeni stratejilerin geliştirilmesine yol açacaktır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1053">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">YASARA</td>
			<td style="width:148px;">YASARA Biosciences</td>
			<td style="width:173px;">http://www.yasara.org/</td>
			<td style="width:479px;">Molecular modeling and simulation program&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">CAVER&#160;</td>
			<td style="width:148px;">CaverSoft</td>
			<td style="width:173px;">http://caver.cz/</td>
			<td>Tool for analysis of tunnels in proteins, free license for academic use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Bradford Ultra</td>
			<td style="width:148px;">Expedeon</td>
			<td>BFU1L, BFU05L</td>
			<td>Protein quantitation in solutions containing up to 1% detergent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potter-Elvehjem homogenizer</td>
			<td style="width:148px;">VWR</td>
			<td>432-0205, 432-0217</td>
			<td>Homogenization of frozen cell pellet</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protease Inhibitor Cocktail Tablets</td>
			<td style="width:148px;">Roche</td>
			<td>4693159001</td>
			<td>Protease inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifugal Filter Units</td>
			<td style="width:148px;">Millipore</td>
			<td>UFC901008</td>
			<td>Centrifugal filter units for the concentration of proteins, MWCO 10 kDa</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermomixer&#160;</td>
			<td style="width:148px;">Eppendorf</td>
			<td>5382000015</td>
			<td>Thermomixer for sample incubation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

unraveling entropic rate acceleration induced by solvent dynamics in membrane enzymes

Enzyme catalysis evolved in an aqueous environment. The influence of solvent dynamics on catalysis is, however, currently poorly understood and usually neglected. The study of water dynamics in enzymes and the associated thermodynamical consequences is highly complex and has involved computer simulations, nuclear magnetic resonance (NMR) experiments, and calorimetry. Water tunnels that connect the active site with the surrounding solvent are key to solvent displacement and dynamics. The protocol herein allows for the engineering of these motifs for water transport, which affects specificity, activity and thermodynamics. By providing a biophysical framework founded on theory and experiments, the method presented herein can be used by researchers without previous expertise in computer modeling or biophysical chemistry. The method will advance our understanding of enzyme catalysis on the molecular level by measuring the enthalpic and entropic changes associated with catalysis by enzyme variants with obstructed water tunnels. The protocol can be used for the study of membrane-bound enzymes and other complex systems. This will enhance our understanding of the importance of solvent reorganization in catalysis as well as provide new catalytic strategies in protein design and engineering.

Enzimatik polycyclization kataliz su dinamiklerinin önemi siliko analizi ve tespit edilen tünellerin sonraki görselleştirme (2 File Ek Kanununda komut dosyası kullanarak) tarafından alakalıdır. Protokol bölümünde 3 ardından, S168 Alicyc acidocaldarius gelen triterpen siklaz enziminin içinde tünellerin biri astar bir &quot;sıcak nokta&quot; amino asit kalıntısının (Şekil 1, sol orta) olarak bulunmuştur. Görsel denetim (Şekil 1, sol altta) tarafından görüldüğü gibi silico mutasyon S168F tanıştırarak, tünel tıkanmış. Triterpen siklaz enzimi ile gösterildi: polisiklik ürünlerinin oluşumu için reaksiyon hızı sıcaklığı (Şekil 2A) için yüksek ölçüde duyarlıdır. Protokolü (bölüm 4-7) ardından, bulunan belirgin k cat / K o <susıcaklık 25 ° C (Şekil 2A) ile yükseltildiğinde b&gt; pentasiklik ürünlerinin oluşumu için, vahşi tip enzimin tarafından görüntülenen M elli misli arttırmaktadır. Tek bir nokta mutasyonu tek tek tüneller engelleme deneysel olarak belirlenen mutlak belirgin k cat / K M değerleri üzerinde önemli bir etkisi vardır, yanı sıra sıcaklık bağımlılığı (Şekil 2A) ile. Deneysel olarak belirlenen kinetik parametreleri, doğrusal termodinamik araziler denklemi 3 ile ve tek substrat kinetiği (Şekil 2B) için protokol bölüm 6-7 aşağıdaki tarafından üretilir. Engellenen tüneller barındıran varyantlar için gözlenen aktivasyon entropi ve entalpi çok büyük değişiklikler (Şekil 2B dayalı Şekil 2C, hesaplamalar) önemli bir polycyclization kaskad teşvik su dinamikleri için rol ima eder. DahasıDeğişmiş su tünelleri aktivasyon bir değiştirilmiş Gibbs serbest enerjisi görüntüler ile varyantları (Δ G ‡ = Δ H ‡ - T * Δ S ‡ Şekil 2B-C). Örneğin, 303 K S168F tünel varyantı, yabani tip enzim için 16 kcal / mol ile karşılaştırıldığında 14 kcal / mol aktivasyon Gibbs serbest enerjisi gösterir. Bölüm 7 protokolü sonrasında, denklem 4 tek pota kinetik deneyler ek yüzeylerde (Şekil 3A) için belirgin k cat / K M değerlerinin hesaplanması için izin verir. Ayrıca, doğrusal bir termodinamik arsa (Şekil 3B), farklı sıcaklıklarda (denklem 5) yarışma kompozisyon çalıştırarak yapılabilir. Tek substrat kinetikleri benzer bir şekilde, bir referans bileşiği ile karşılaştırıldığında daha fazla yüzeyler için göreceli aktivasyonu entalpi ve entropi readil olandoğrusal kesişim ve yamaç erişilebilir y deneysel verilere uyuyor. Aktivasyon termodinamik parametrelerin mutlak değerleri, referans bileşiği (denklem 6) ile ilişkili termodinamik veriler kullanılarak aritmetik ilave edilmesinden değerlendirilebilir. Burada protokolü kullanarak, sonuçlar açıkça engellenen su tünelleri farklı boyutlarda (Şekil 3C) ve alt tabakalar için aktivasyon temelde farklı termodinamik parametreleri görüntülemek membran enzimi varyantları olduğunu göstermektedir üretti. <img alt="figür 1" src="/files/ftp_upload/53168/53168fig1.jpg" /> Şekil 1. Protokol özeti:. Deneysel protein tasarımı ve termodinamik analiz ile uyum içinde silico bilgisayar modelleme enzim kataliz üzerindeki çözücü dinamiklerin etkisiyle gelişmiş bir anlayış sağlar <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53168/53168fig1large.jpg" target="_blank">tıklayınız</a>Burada bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/53168/53168fig2.jpg" /> Tek substrat kinetik yabani tip ve tünel varyantları aktivasyon Şekil 2. Termodinamik parametreler. (A) Görünür k cat / deneysel verilerden ve geçiş hali teorisi kullanılarak denklemler 1 ve 2 (B) Termodinamik analiz kullanılarak elde K M değerleri ve deneysel verilerinin doğrusal uygun (B) &#39;de işaretlerinden hesaplandı aktivasyon 3. (C) Termodinamik parametreleri denklem. Önceden katlanmış skualen substrat tahvilleri ile gösterilir oluşturulan / noktalı çizgiler olarak kırık. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53168/53168fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Farklı alt tabakalar için, vahşi tip ve tünel varyantlarının aktivasyon Şekil 3. termodinamik parametreler (A). Nispi k cat / denklemi 4. (B) kullanarak, tek-kaplı bir kinetik elde edilen K M değerleri farklı kinetik verilerin Termodinamik araziler denklem 5. (C) denklemi 6 ile ve referans olarak Şekil 2&#39;de substrat skualen kullanılarak hesaplanan aktivasyon Mutlak termodinamik parametreleri kullanılarak sıcaklıkları. Oluşturulan / yüzeylerde kırık Tahviller noktalı çizgiler olarak gösterilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53168/53168fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Unraveling Entropic Rate Acceleration Induced by Solvent Dynamics in Membrane Enzymes at JoVE.com

Unraveling Entropic Rate Acceleration Induced by Solvent Dynamics in Membrane Enzymes

Enzimler su moleküllerinin taşınması için kanallar aktif bölge solvasyonu ve kataliz etkilemektedir. Bu yazıda siliko bilgisayar modellemesi ve deneylerde dayanarak bu ek katalitik motiflerin mühendislik için bir protokol mevcut. Bu enzim kataliz üzerindeki çözücü dinamiklerin etkisi anlayışımızı artıracaktır.

Membran Enzim Solvent Dynamics Bağlı çözülüyor Entropic Oranı İvme

Enzyme catalysis evolved in an aqueous environment. The influence of solvent dynamics on catalysis is, however, currently poorly understood and usually ...

unraveling-entropic-rate-acceleration-induced-solvent-dynamics

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Chemistry

Thermodynamics

SCIENTISTS IN ACTION

8.9K Görüntüleme.  KTH Royal Institute of Technology.  Enzimler su moleküllerinin taşınması için kanallar aktif bölge solvasyonu ve kataliz etkilemektedir. Bu yazıda siliko bilgisayar modellemesi ve deneylerde dayanarak bu ek katalitik motiflerin mühendislik için bir protokol mevcut. Bu enzim kataliz üzerindeki çözücü dinamiklerin etkisi anlayışımızı artıracaktır. 

Video: Unraveling Entropic Rate Acceleration Induced by Solvent Dynamics in Membrane Enzymes

Analyzing Protein Dynamics Using Hydrogen Exchange Mass Spectrometry

All cellular processes depend on the functionality of proteins. Although the functionality of a given protein is the direct consequence of its unique amino acid sequence, it is only realized by the folding of the polypeptide chain into a single defined three-dimensional arrangement or more commonly into an ensemble of interconverting conformations. Investigating the connection between protein conformation and its function is therefore essential for a complete understanding of how proteins are able to fulfill their great variety of tasks. One possibility to study conformational changes a protein undergoes while progressing through its functional cycle is hydrogen-1H/2H-exchange in combination with high-resolution mass spectrometry (HX-MS). HX-MS is a versatile and robust method that adds a new dimension to structural information obtained by e.g. crystallography. It is used to study protein folding and unfolding, binding of small molecule ligands, protein-protein interactions, conformational changes linked to enzyme catalysis, and allostery. In addition, HX-MS is often used when the amount of protein is very limited or crystallization of the protein is not feasible. Here we provide a general protocol for studying protein dynamics with HX-MS and describe as an example how to reveal the interaction interface of two proteins in a complex. &#160;&#160;

Protein conformation and dynamics are key to understanding the relationship between protein structure and function. Hydrogen exchange coupled with high-resolution mass spectrometry is a versatile method to study the conformational dynamics of proteins as well as characterizing protein-ligand and protein-protein interactions, including contact interfaces and allosteric effects.

Hidrojen Değişim Kütle Spektrometre Kullanarak Protein Dinamiği Analizi

All cellular processes depend on the functionality of proteins. Although the functionality of a given protein is the direct consequence of its unique ...

Kimya

Cooling Rate Dependent Ellipsometry Measurements to Determine the Dynamics of Thin Glassy Films

This report aims to fully describe the experimental technique of using ellipsometry for cooling rate dependent Tg (CR-Tg) experiments. These measurements are simple high-throughput characterization experiments, which can determine the glass transition temperature (Tg), average dynamics, fragility and the expansion coefficient of the super-cooled liquid and glassy states for a variety of glassy materials. This technique allows for these parameters to be measured in a single experiment, while other methods must combine a variety of different techniques to investigate all of these properties. Measurements of dynamics close to Tg are particularly challenging. The advantage of cooling rate dependent Tg measurements over other methods which directly probe bulk and surface relaxation dynamics is that they are relatively quick and simple experiments, which do not utilize fluorophores or other complicated experimental techniques. Furthermore, this technique probes the average dynamics of technologically relevant thin films in temperature and relaxation time (&#964;&#945;) regimes relevant to the glass transition (&#964;&#945; &#62; 100 sec). The limitation to using ellipsometry for cooling rate dependent Tg experiments is that it cannot probe relaxation times relevant to measurements of viscosity (&#964;&#945; &#60;&#60; 1 sec). Other cooling rate dependent Tg measurement techniques, however, can extend the CR-Tg method to faster relaxation times. Furthermore, this technique can be used for any glassy system so long as the integrity of the film remains throughout the experiment.

Here, we present a protocol for cooling rate dependent ellipsometry experiments, which can determine the glass transition temperature (Tg), average dynamics, fragility and the expansion coefficient of the super-cooled liquid and glass for a variety of glassy materials.

Puan Bağımlı Elipsometri Ölçümleri Soğutma İnce Camsı Filmlerin dinamikleri belirleme

This report aims to fully describe the experimental technique of using ellipsometry for cooling rate dependent Tg (CR-Tg) experiments. These measurements ...

Radiolabeling and Quantification of Cellular Levels of Phosphoinositides by High Performance Liquid Chromatography-coupled Flow Scintillation

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular identity and function. Each of the seven PtdInsPs varies in their distribution and abundance, which are tightly regulated by specific kinases and phosphatases. The abundance of PtdInsPs can change abruptly in response to various signaling events or disturbance of the regulatory machinery. To understand how these events lead to changes in the amount of PtdInsPs and their resulting impact, it is important to quantify PtdInsP levels before and after a signaling event or between control and abnormal conditions. However, due to their low abundance and similarity, quantifying the relative amounts of each PtdInsP can be challenging. This article describes a method for quantifying PtdInsP levels by metabolically labeling cells with 3H-myo-inositol, which is incorporated into PtdInsPs. Phospholipids are then precipitated and deacylated. The resulting soluble 3H-glycero-inositides are further extracted, separated by high-performance liquid chromatography (HPLC), and detected by flow scintillation. The labeling and processing of yeast samples is described in detail, as well as the instrumental setup for the HPLC and flow scintillator. Despite losing structural information regarding acyl chain content, this method is sensitive and can be optimized to concurrently quantify all seven PtdInsPs in cells.

Phosphoinositides are signaling lipids whose relative abundance rapidly changes in response to various stimuli. This article describes a method to measure the abundance of phosphoinositides by metabolically labeling cells with 3H-myo-inositol, followed by extraction and deacylation. Extracted glycero-inositides are then separated by high-performance liquid chromatography and quantified by flow scintillation.

Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografi-birleştiğinde Akış Parıldama tarafından Radyoetiketleme ve Fosfoinosititler Hücresel Düzeylerinin Quantification

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular ...

Dissolution Dynamic Nuclear Polarization Instrumentation for Real-time Enzymatic Reaction Rate Measurements by NMR

The main limitation of NMR-based investigations is low sensitivity. This prompts for long acquisition times, thus preventing real-time NMR measurements of metabolic transformations. Hyperpolarization via dissolution DNP circumvents part of the sensitivity issues thanks to the large out-of-equilibrium nuclear magnetization stemming from the electron-to-nucleus spin polarization transfer. The high NMR signal obtained can be used to monitor chemical reactions in real time. The downside of hyperpolarized NMR resides in the limited time window available for signal acquisition, which is usually on the order of the nuclear spin longitudinal relaxation time constant, T1, or, in favorable cases, on the order of the relaxation time constant associated with the singlet-state of coupled nuclei, TLLS. Cellular uptake of endogenous molecules and metabolic rates can provide essential information on tumor development and drug response. Numerous previous hyperpolarized NMR studies have demonstrated the relevancy of pyruvate as a metabolic substrate for monitoring enzymatic activity in vivo. This work provides a detailed description of the experimental setup and methods required for the study of enzymatic reactions, in particular the pyruvate-to-lactate conversion rate in presence of lactate dehydrogenase (LDH), by hyperpolarized NMR.

The sensitivity enhancement provided by dissolution dynamic nuclear polarization (DNP) enables following metabolic processes in real time by NMR and MRI. The characteristics and performances of a dedicated dissolution DNP setup designed for study enzymatic reactions are discussed.

NMR ile Gerçek zamanlı enzimatik Reaksiyon Hızı Ölçümleri için çözünme Dinamik Nükleer Polarizasyon Aletler

The main limitation of NMR-based investigations is low sensitivity. This prompts for long acquisition times, thus preventing real-time NMR measurements of ...

Electrochemical Impedance Spectroscopy as a Tool for Electrochemical Rate Constant Estimation

Electrochemical impedance spectroscopy (EIS) was used for advanced characterization of organic electroactive compounds along with cyclic voltammetry (CV). In the case of fast reversible electrochemical processes, current is predominantly affected by the rate of diffusion, which is the slowest and limiting stage. EIS is a powerful technique that allows separate analysis of stages of charge transfer that have different AC frequency response. The capability of the method was used to extract the value of charge transfer resistance, which characterizes the rate of charge exchange on the electrode-solution interface. The application of this technique is broad, from biochemistry up to organic electronics. In this work, we are presenting the method of analysis of organic compounds for optoelectronic applications.

Electrochemical impedance spectroscopy (EIS) of species that undergo reversible oxidation or reduction in solution was used for determination of rate constants of oxidation or reduction.

Elektrokimyasal empedans spektroskopisi elektrokimyasal oranı sürekli tahmini için bir araç olarak

Electrochemical impedance spectroscopy (EIS) was used for advanced characterization of organic electroactive compounds along with cyclic voltammetry (CV). ...

Fabrication of Spherical and Worm-shaped Micellar Nanocrystals by Combining Electrospray, Self-assembly, and Solvent-based Structure Control

Micellar nanocrystals (micelles with encapsulated nanocrystals) have become an emerging major class of nanobiomaterials. We describe a method of fabricating micellar nanocrystals based on combining top-down electrospray, bottom-up self-assembly, and solvent-based structure control. This method involves first using electrospray to generate uniform ultrafine liquid droplets, each of which functions as a micro-reactor in which self-assembly reaction occurs forming micellar nanocrystals, with the structures (micelle shape and nanocrystal encapsulation) controlled by the organic solvent used. This method is largely continuous and produces high quality micellar nanocrystal products with an inexpensive structure control approach. By using a water-miscible organic solvent tetrahydrofuran (THF), worm-shaped micellar nanocrystals can be produced due to solvent-induced/facilitated micelle fusion. Compared with the common spherical micellar nanocrystals, worm-shaped micellar nanocrystals can offer minimized non-specific cellular uptake, thus enhancing biological targeting. By co-encapsulating multiple nanocrystals into each micelle, multifunctional or synergistic effects can be achieved. Current limitations of this fabrication method, which will be part of the future work, primarily include imperfect encapsulation in the micellar nanocrystal product and the incompletely continuous nature of the process.

The present work describes a method to fabricate micellar nanocrystals, an emerging major class of nanobiomaterials. This method combines top-down electrospray, bottom-up self-assembly, and solvent-based structure control. The fabrication method is largely continuous, can produce high quality products, and possesses an inexpensive means of structure control.

Küresel ve solucan şeklinde Micellar Nanocrystals Electrospray, kendinden montajlı birleştirerek ve Solvent Bazlı Yapı Denetim imalatı

Micellar nanocrystals (micelles with encapsulated nanocrystals) have become an emerging major class of nanobiomaterials. We describe a method of ...

DNA-magnetic Particle Binding Analysis by Dynamic and Electrophoretic Light Scattering

Isolation of DNA using magnetic particles is a field of high importance in biotechnology and molecular biology research. This protocol describes the evaluation of DNA-magnetic particles binding via dynamic light scattering (DLS) and electrophoretic light scattering (ELS). Analysis by DLS provides valuable information on the physicochemical properties of particles including particle size, polydispersity, and zeta potential. The latter describes the surface charge of the particle which plays major role in electrostatic binding of materials such as DNA. Here, a comparative analysis exploits three chemical modifications of nanoparticles and microparticles and their effects on DNA binding and elution. Chemical modifications by branched polyethylenimine, tetraethyl orthosilicate and (3-aminopropyl)triethoxysilane are investigated. Since DNA exhibits a negative charge, it is expected that zeta potential of particle surface will decrease upon binding of DNA. Forming of clusters should also affect particle size. In order to investigate the efficiency of these particles in isolation and elution of DNA, the particles are mixed with DNA in low pH (~6), high ionic strength and dehydration environment. Particles are washed on magnet and then DNA is eluted by Tris-HCl buffer (pH = 8). DNA copy number is estimated using quantitative polymerase chain reaction (PCR). Zeta potential, particle size, polydispersity and quantitative PCR data are evaluated and compared. DLS is an insightful and supporting method of analysis that adds a new perspective to the process of screening of particles for DNA isolation.

This protocol describes the synthesis of magnetic particles and evaluation of their DNA-binding properties via dynamic and electrophoretic light scattering. This method focuses on monitoring changes in particle size, their polydispersity and zeta potential of particle surface which play major role in binding of materials such as DNA.

DNA Manyetik Parçacık dinamik ve elektroforetik ışık saçılma göre analiz bağlama

Isolation of DNA using magnetic particles is a field of high importance in biotechnology and molecular biology research. This protocol describes the ...

Visualizing Lignification Dynamics in Plants with Click Chemistry: Dual Labeling is BLISS!

Lignin is one of the most prevalent biopolymers on the planet and a major component of lignocellulosic biomass. This phenolic polymer plays a vital structural and protective role in the development and life of higher plants. Although the intricate mechanisms regulating lignification processes in vivo strongly impact the industrial valorization of many plant-derived products, the scientific community still has a long way to go to decipher them. In a simple three-step workflow, the dual labeling protocol presented herein enables bioimaging studies of actively lignifying zones of plant tissues. The first step consists in the metabolic incorporation of two independent chemical reporters, surrogates of the two native monolignols that give rise to lignin H- and G-units. After incorporation into growing lignin polymers, each reporter is then specifically labeled with its own fluorescent probe via a sequential combination of bioorthogonal SPAAC/CuAAC click reactions. Combined with lignin autofluorescence, this approach leads to the generation of three-color localization maps of lignin within plant cell walls by confocal fluorescence microscopy and provides precise spatial information on the presence or absence of active lignification machinery at the scale of plant tissues, cells and different cell wall layers.

BLISS, a dual labeling protocol for studying lignification dynamics, was developed. Using synthetic monolignol reporters and a sequential combination of SPAAC and CuAAC bioorthogonal click reactions, this methodology paves the way to in-depth analysis of the factors that regulate the biogenesis of lignins in planta.

Lignification Dynamics ile tıklatın kimya tesislerinde görselleştirme: Çift etiketleme BLISS olduğunu!

Lignin is one of the most prevalent biopolymers on the planet and a major component of lignocellulosic biomass. This phenolic polymer plays a vital ...

Membrane Remodeling of Giant Vesicles in Response to Localized Calcium Ion Gradients

In a wide variety of fundamental cell processes, such as membrane trafficking and apoptosis, cell membrane shape transitions occur concurrently with local variations in calcium ion concentration. The main molecular components involved in these processes have been identified; however, the specific interplay between calcium ion gradients and the lipids within the cell membrane is far less known, mainly due to the complex nature of biological cells and the difficultly of observation schemes. To bridge this gap, a synthetic approach is successfully implemented to reveal the localized effect of calcium ions on cell membrane mimics. Establishing a mimic to resemble the conditions within a cell is a severalfold problem. First, an adequate biomimetic model with appropriate dimensions and membrane composition is required to capture the physical properties of cells. Second, a micromanipulation setup is needed to deliver a small amount of calcium ions to a particular membrane location. Finally, an observation scheme is required to detect and record the response of the lipid membrane to the external stimulation. This article offers a detailed biomimetic approach for studying the calcium ion-membrane interaction, where a lipid vesicle system, consisting of a giant unilamellar vesicle (GUV) connected to a multilamellar vesicle (MLV), is exposed to a localized calcium gradient formed using a microinjection system. The dynamics of the ionic influence on the membrane were observed using fluorescence microscopy and recorded at video frame rates. As a result of the membrane stimulation, highly curved membrane tubular protrusions (MTPs) formed inside the GUV, oriented away from the membrane. The described approach induces the remodeling of the lipid membrane and MTP production in an entirely contactless and controlled manner. This approach introduces a means to address the details of calcium ion-membrane interactions, providing new avenues to study the mechanisms of cell membrane reshaping.

We present a technique for contactless micromanipulation of vesicles, using localized calcium ion gradients. Microinjection of a calcium ion solution, in the vicinity of a giant lipid vesicle, is utilized to remodel the lipid membrane, resulting in the production of membrane tubular protrusions.

Yanıt olarak lokalize kalsiyum iyon degradeler dev veziküller membran Remodeling

In a wide variety of fundamental cell processes, such as membrane trafficking and apoptosis, cell membrane shape transitions occur concurrently with local ...

Photoelectron Imaging of Anions Illustrated by 310 Nm Detachment of F&#8722;

Anion photoelectron imaging is a very efficient method for the study of energy states of bound negative ions, neutral species and interactions of unbound electrons with neutral molecules/atoms. State-of-the-art in vacuo anion generation techniques allow application to a broad range of atomic, molecular, and cluster anion systems. These are separated and selected using time-of-flight mass spectrometry. Electrons are removed by linearly polarized photons (photo detachment) using table-top laser sources which provide ready access to excitation energies from the infra-red to the near ultraviolet. Detecting the photoelectrons with a velocity mapped imaging lens and position sensitive detector means that, in principle, every photoelectron reaches the detector and the detection efficiency is uniform for all kinetic energies. Photoelectron spectra extracted from the images via mathematical reconstruction using an inverse Abel transformation reveal details of the anion internal energy state distribution and the resultant neutral energy states. At low electron kinetic energy, typical resolution is sufficient to reveal energy level differences on the order of a few millielectron-volts, i.e., different vibrational levels for molecular species or spin-orbit splitting in atoms. Photoelectron angular distributions extracted from the inverse Abel transformation represent the signatures of the bound electron orbital, allowing more detailed probing of electronic structure. The spectra and angular distributions also encode details of the interactions between the outgoing electron and the residual neutral species subsequent to excitation. The technique is illustrated by the application to an atomic anion (F&#8722;), but it can also be applied to the measurement of molecular anion spectroscopy, the study of low lying anion resonances (as an alternative to scattering experiments) and femtosecond (fs) time resolved studies of the dynamic evolution of anions.

Here, we present a protocol for photoelectron imaging of anionic species. Anions generated in vacuo and separated by mass spectrometry are probed using velocity mapped photoelectron imaging, providing details of anion and neutral energy levels, anion and neutral structure and the nature of the anion electronic state.

F− 310 Nm dekolmanı tarafından resimli anyon photoelectron görüntüleme

Anion photoelectron imaging is a very efficient method for the study of energy states of bound negative ions, neutral species and interactions of unbound ...