This work has been funded by the National Research Foundation grant NRF-CRP4-2008-02 (J.T.) and Tier 1 grant RG 51/13.

Bu protokol daha fazla ayrıntı ve özel hususlar 3, 25-28 sevk edilecek olan aşağıdaki kaynaklara dayanmaktadır. 2, H2O ile deterjan miseller 1. Yoğunluk eşleştirme Not: tampon çözeltisi yoğunluklu deterjan miseller yoğunluğuna uyumlu olması gerekir. Ortak yoğunluk ayarlayıcı maddeler 2 H2O, H2 18 O, 2H 2 18 O, gliserol ve sakaroz 29 içerir. &#39;H 2 18 O 2 H2O ile aynı yoğunluğa sahiptir ve protein değiştirilebilir protonlar dötertumlanma istenmiyorsa, daha iyi bir seçim olabilir. Bu prosedürde, 50 mM Tris, pH 7.3, 3- (N, N-dimethylmyristylammonio) -propanesulfonate (C14SB) deterjan yoğunluğu, 100 mM NaCI 2 H2O ile uyumlu olacak Bir ilk tahmin olarak, aşağıdaki konsantrasyonlar2 H2O kullanılacaktır: 10, 30, ve% 50 hac / hac. 1.1. Örnek hazırlanması <ol><li> Aşağıdaki stok çözeltileri ve filtre bir 0.2 mikron bir şırınga filtreden geçirilmiştir sterilize hazırlanması: 50 ml, 500 mM Tris pH 7.3, 1 M NaCI (10 X tampon çözeltisi); 1 mi, 250 mM C14SB (50X deterjan çözeltisi). </li><li> 20 ul 10X tampon çözeltisi, 4 ul 50X deterjan çözeltisi, 20 ul 2 H2O (% 99.9) ve 156 ul karıştırılarak numune çözeltisinin 200 ul hazırlayın H 2 O deiyonize 20 ul 2 H2O (% 99.9) ve 160 ul, 20 ul 10X tampon çözeltisi karıştırılarak bir referans çözeltisi, 200 ul hazırlayın H 2 O deiyonize </li><li> Diğer 2 H2O konsantrasyonları için yineleyin 1.1.2, uygun 2 H2O ve H2O miktarlarını ayarlamaya,% 30 ve% 50, yani. </li></ol> 1.2. 6-kanal A MeclisiHücre içine UC hücreleri ve örnek yükleme. Not: Örnek yükleme yöntemine bağlı olarak EAA hücrenin iki türü vardır. Hücreler mühürlü sonra hücreler yüklenebilir dış dolgu ise dış dolgu olmadan Hücreler, hücre sızdırmazlık önce yüklenecek olan. Harici-dolgu AUC hücre Meclis, daha önce 3 tarif edilmiştir. Bu protokolde, dış dolgu olmadan 6-kanal EAA hücre montajı anlatılmıştır. Ana fark, ayrıca sıkılır her iki tarafta vida halkalar olmasıdır, ve (Şek. 1) muhafaza fişleri gerek yoktur. montaj aşamalarında fark aşağıda belirtilmiştir. <img alt="Şekil 1," src="/files/ftp_upload/52404/52404fig1.jpg" /> Şekil 1. Harici dolgu olmadan 6-kanal EAA hücre görünümü patladı. Bu rakam Beckman Coulter An-50 Ti modifiye ve An-60 Ti Analyti olmuşturcal Rotor, Hücreler ve karşı ağırlıklar kullanım kılavuzu. <ol><li> Safir penceresinin yerine kuvars penceresinde (Şekil. 2) Her EAA hücre için iki pencere meclisleri hazırlayın. Pencere tutucu içine pencere conta yerleştirin. Biraz pencere astarı viraj ve boşluk pencere tutucu şafta karşısında oluşturacak şekilde pencere tutucu içine yerleştirin. Pencere tutucu yivli işareti hizalayarak, pencere liner içine safir penceresini yerleştirin. . Not: Bu tür bu yoğunluk eşleştirme deneyde olduğu gibi 30000 rpm üzerinde parazit ölçümleri, Bu nedenle yüksek hızda 28, 30 daha fazla ışık kırılma üretecek ve böylece kuvars cam sıkıştırılabilir ve safir camlar kullanılmaktadır. Bir safir cam kuvars penceresinden daha ağırdır ve yüzüne kazınmış bir &quot;X&quot; vardır. </li></ol><img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52404/52404fig2.jpg" /> Şekil 2. patlamış görünümü of pencere montajı. Bu rakam Beckman Coulter An-50 Ti ve An-60 Ti Analitik Rotor, Hücreleri ve karşı ağırlıklar kılavuzdaki modifiye edilmiş <ol><li> Parça numarası baş aşağı hücre gövdesini yerleştirin. Konut tuşu ile uyumlu kama yatakları ile, (sol, Şek. 1) aşağı bakan pencere ile bir pencere montajı ardından, öncelikle hücre konut aşağı eğimli tarafı 6-sektör merkezinde içine kaydırın. </li><li> Hafifçe kat spinkote vida halka konuları ve vida halkası yıkama. Pencere montaj üstüne bir vida halka pulu yerleştirin. Dışında bakan kelime &quot;OUT&quot; pencere gövde içine vida halkası takın. Hücre hizalama aracını kullanarak vida halkası elle sıkın. </li><li> Tork anahtarı kullanarak, sadece 60 inç-pound vida halka sıkın. </li><li> Parça numarası dik ve 12-öğle saatlerinde konumlandırılmış olan hücreyi yerleştirin. LSol satır içine OAD 120 ul referans ve sağ satır içine 110 ul örnek. Her numune ve referans doğru eşleştirilmiş emin olun. Not: Tam numune hacmi kritik öneme sahip değildir, ancak örnek menisküs farklı olacak şekilde bir referans numunesi (5-10 ul) biraz daha fazla hacme sahip olması gerekir. </li><li> Dikkatle pencere (Şekil. 1, sağ) aşağı bakacak şekilde hücre gövdesi, bir pencere montaj içine kaydırın. Aşırı hücre rahatsız ve içeriğini dökmek için değil dikkat edin. </li><li> Adımı yineleyin 1.2. 3 ve 1.2. 4, 120 inç-pound ikinci vida sıkma halkasını. Hücreyi ters çevirin ve 120 inç-pound ilk vidalı halka yeniden sıkın. </li><li> , Rotor içine hücreleri yükleyin santrifüj içine rotor yüklemek ve üreticinin talimatlarına göre 28 monokromatörü yükleyin. Not: Bu st AyrıntılarAP, bu referansta 3 bulunabilir. </li></ol> 1.3. Girişim ölçümü kurma <ol><li> Kısaca şu aşamada özetlenebilir olacak üreticinin talimatlarına göre, EAA enstrüman için kullanıcı arabirimi yazılımını başlatın ve 3000 rpm&#39;de her hücre için lazer kurulum ve radyal kalibrasyonu yapın. </li><li> Yeterli bir vakum sonra 1.3.1.1 (&lt;100 mikron), 3000 rpm&#39;de santrifüj çalıştırmak ulaşıldı. Kullanıcı arayüzü yazılımı girişim deseni önizlemesini ve yüksek kontrast elde etmek için lazer parametrelerini ayarlamak. </li><li> &quot;Denge&quot; ve &quot;Girişim&quot; ölçüm belirterek | (Yeni Dosya Dosya) Yeni kurmak dosyası oluşturun. Bir sedimantasyon denge yöntemi (&quot;Yöntem&quot; düğmesi) 20 ° C&#39;de çalışma sıcaklığı, 45000 rpm veya daha yüksek hangisi protein örnekleri için beklenen en yüksek hızında çalışacak ve 1 tarama toplamak için her 15 dakikada ayarlayın. MonitoHeteroAnalysis veri dosyaları açma ve en az 12 saat sonra &quot;Maç&quot; fonksiyonunu seçerek r denge ilerleme (yaklaşık gecede Şekil. 3). Not: Benzer bir fonksiyonu da SEDFIT (Seçenekler | Yükleme Seçenekleri | Denge Test Yaklaşımı) mevcuttur. </li></ol><img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52404/52404fig3.jpg" /> Şekil HeteroAnalysis Maç işlevi 3. Sonuç. Maç işlevi ardışık tarama ve son tarama arasındaki RMSD karşılaştırarak denge ilerlemesini izlemek için kullanılabilir. X ekseni asimptotik RMSD değerleri ile gösterildiği gibi bu örneğin 8 saat sonra denge elde edilmesini gösterir. 1.4. Veri analizi <ol><li> Numunelerin her bir grubu için, 2 H2O konsantrasyonuna karşı radyal dağılım profili eğimini çizilir. Not: Dağıtım çok sığ üstel o ap olacakyaklaşımlar çok doğrusallık. X ekseni ile kesişme noktasını eşleşen 2 H2O konsantrasyonuna karşılık gelir. </li><li> Daha doğru sonuçlar için, çeşitli çoğaltır deneyi gerçekleştirmek. Seçenek olarak ise, 2 H2O konsantrasyonunun daha dar bir aralık deneyi tekrar. </li></ol> C14SB miselleri içine SH 2. çökelme dengesi 2.1. Run parametreler <ol><li> SEDNTERP kullanarak tampon yoğunluk ve viskozite, protein kısmi spesifik hacim ve santrifüj hızı hesaplayın. D 2 O konsantrasyonu da dahil olmak üzere, &quot;Tampon Veri Seç&quot; bölümündeki tampon ve yoğunluk seçin Compute hesaplamak ve buna göre tampon bileşenleri girmek için. </li><li> 2.1.1.1 &quot;V-bar&quot; bölümünde protein kısmi spesifik hacim seçin Compute hesaplamak ve protein amino asit dizisini girin. &quot;N = Bu monomer bir oligomer olun&quot; en yüksek beklenen oligomerik boyutunu belirtinalan, bu durumda N = 5. ana penceresinde RPM alanındaki değerleri girerek hızını hesaplayın kadar σ ≈ 1; Bu radyal dağılım profili 25 iyi bir üstel şekli sağlamak için başparmak bir kuraldır. Not: Bu, aşağıdaki gibi deney için hesaplanan değerler olarak: ρ = 1,03839 g / ml, η = 1,0267 cP = 0,7569 ml / g arasında, ω 1 = 16000 rpm. </li><li> Bir hız ve sonraki 25 de dağıtım profili arasında yeterli fark sağlamak için takip sonraki hızları hesaplayın. Not: Bu da işlevinden yapılabilir hesaba çözüm sütunu (dolum hacmi) alır SEDFIT içinde, &quot;denge rotor işlevi hızlandırır tahmin&quot;. </li></ol> 2.2. Numune hazırlanmasına, <ol><li> 5 mM C14SB ile 1 ml referans solüsyonu ve% 32,3 2 H 2 O hazırlayın 100 ul 10X tampon Solutio karıştırarak yoğunluk eşleştirme deney (bölüm 1), belirlenen şekilden, (aşama 1.1.1), 20 ul 50X deterjan çözeltisi (aşama 1.1.1), 323 ul 2 H2O (% 99.9) ve 527 ul H2O deiyonize </li><li> Örneğin metanol veya% 50 h / h sulu asetonitril gibi uygun bir çözücü içinde, liyofilize edilmiş, HPLC ile saflaştırılmış, SH peptidleri (daha önce tarif edilen 31 ifadesi ve saflaştırılması) çözündürülür. Her bir seyreltilmiş bir 280 vermek üzere üç numune için bir mikrolitre ölçekli UV / Vis spektrometre ve kısım içinde çözülmüş peptidlerin A280 ölçümü, 12 mm = 0.3, 0.5 ve 0.8 (A 280, 10 mm = 0.25, 0.417 ve 0.67) 130 ul. Gecede örnekleri liyofilize ve tekrar süspansiyon 130 ul referans çözeltisi (adım 2.2.1) örnek çözümleri vermek. Not: Trp, Tyr ve kalıntılarını içerdiği için, SH proteini 280 nm&#39;de UV / Vis emme tespit edilebilir. Aromatik artıkların olmayan proteinler ya da müdahale ile, uygun bir kromofor ile etiketleyerek Bir Trp ihtiva eden mutant kullanılarak tespit edilebiliryerine absorbans ım ölçümleri. </li><li> Kuvars pencereli bir 6-kanal EAA hücre montajı bölüm 1.2 adımları izleyin. En yakın rotor merkezine rotor merkezi ve en düşük konsantrasyon numunesi (A 280, 12mm = 0.3) uzak (A 280, 12mm = 0.8) kanal yüksek konsantrasyon örneği yükleyin. </li></ol> 2.3. Absorbans ölçümleri ayarlama <ol><li> &quot;Denge&quot; ve &quot;Absorbans&quot; ölçümü belirterek | (Yeni Dosya Dosya) Yeni kurmak dosyası oluşturun. Dedektör dalga boyu olarak 280 nm belirtin. </li><li> Tek Tarama Radyal adım büyüklüğü = 0.01 cm, çoğaltır = 3 (düşük çözünürlükte, hızlı) ile örneğin, düşük çözünürlükte veri toplama belirterek, Tarama Seçenekleri &quot;ilk taramadan önce Radyal kalibrasyon&quot; kontrol ve yürüterek 3000 rpm&#39;de radyal kalibrasyon yapın . Tarama tamamlandıktan sonra, seçeneğinin işaretini kaldırın. </li><li> &quot;(Metho bir sedimantasyon denge yöntemi kurmak&quot;düğmesi) d 20 ° C&#39;de, adım 2.1.3 hesaplanan ilk hızda çalışacak ve 1 Tarama her 30 dakikada bir toplamak. Her hücrelerin &quot;Detay&quot;, adım 2.3.2 gibi düşük çözünürlükte veri toplama belirtin. En az 18 saat sonra &quot;Maç&quot; fonksiyonunu HeteroAnalysis veri dosyaları açma ve seçerek denge ilerlemesini izlemek (yaklaşık gecede, Şek. 4). Not: sonraki hızları daha az zaman alacak ise denge ulaşılması, ilk hız için önemli ölçüde daha uzun sürebilir. </li></ol><img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/52404/52404fig4.jpg" /> HeteroAnalysis Maç işlevinden Şekil 4. sonuçları. Birinci ve ikinci hızları (sol üst ve sağ) dengeye ulaşmış görünüyor, ama emin olmak için bir kaç saat daha beklemek daha iyidir. Buna karşılık, üçüncü ve dördüncü hızları (alt sol ve sağ) açıkça dengeye ulaşmıştırdaha kısa sürede. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52404/52404fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <ol><li> Denge ulaşıldığında, Radyal adım büyüklüğü = 0.001 cm, çoğaltır = 10 (yüksek çözünürlüklü, yavaş) ile yüksek çözünürlükte, örneğin tek bir tarama toplamak. </li><li> Tarama tamamlandıktan sonra, bir sonraki hız için adım 2.3.3 ve 2.3.4 tekrarlayın. </li><li> Zaman, her hız için denge bilinen (hesaplanan veya deneyim) ulaşması için gerekli zaman İsteğe bağlı, her biri için dengeleme süre sonra 1 tarama toplamak için adım ve 2.1.3 hesaplanan tüm hızları dahil sedimantasyon denge yöntemi tarama kurmak hız. Bu durumda, her bir hücrelerin &quot;Detay&quot; yüksek çözünürlüklü veri toplama belirtin. </li></ol> 2.4. SEDFIT ve SEDPHAT Veri analizi Not: Daha fazla bilgi ve veri analizi okuyucu olarak hususlar için t denirwww.analyticalultracentrifugation.com: Aşağıdaki web o. <ol><li> Açık yüksek çözünürlüklü SEDFIT içinde taramalar (Veri | yük sedimantasyon denge verileri) ve 3 kanallar (; | Yükleme Seçenekleri | 3 Alt Grupları 6-kanal ham veri kaydetme Seçenekler bu farklı her bir örnek için konsantrasyonlara karşılık) veri bölünmüş. </li><li> Yeniden-açık SEDFIT aynı örnek ve aynı konsantrasyonda ancak farklı hızlarda ait veri dosyaları. Menisküs (dikey kırmızı çizgi), hücre alt (dikey mavi çizgi) ve montaj sınırları (dikey yeşil çizgiler) ayarlayın ve SEDPHAT kullanılmak üzere veri ihracat (Veri | SEDPHAT İhracat Verileri). Girdi istendiği gibi rotor türü ve merkezinde türü yanı sıra, adım 2.1.1 hesaplanan parametreler. Her numune ve konsantrasyon için bu adımı tekrarlayın. </li><li> SEDPHAT aynı örnekten tüm verileri (tüm konsantrasyonlar ve hızlar) açın ve Deney Parametreleri doldurun; Bir örnek, Şekil l&#39;de gösterilmiştir. 5. Not: D 2 O tamponu Deut ilave edildiğinde<html> Değiştirilebilir protonlar birleşmeleri T ciddi ölçüde suda çözünür proteinleri, protein moleküler ağırlığı değiştirebilir. Membran-gömülü bölgeler döviz korunur, çünkü zar proteinleri, SH proteini gibi özellikle küçük olanlar, daha az etkilenir. Bunu düzeltmek için, girişi &quot;D mol fraksiyonu tampon&quot;. Not: Bu aşamada menü Veri seçerek ayrı ayrı düzenlenmiş veri kümesi kaydetmek için tavsiye edilir | Yeni Yapılandırması Olarak Kopyala Tüm Veri ve Kaydet. </li><li> Bir Model seçin ve bu model için Küresel Parametreleri doldurun. Not: Örnek olarak, &quot;monomer-n-mer kendi kendine birleşmeme özelliği&quot; modeli ve parametreleri Şekil l&#39;de gösterilmektedir. 6. </li></ol><img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/52404/52404fig5.jpg" /> Şekil 5. Deneysel Parametreler doldurmak için nasıl bir örnek. dosya / ftp_upload / 52.404 / 52404fig6.jpg &quot;/&gt; Şekil 6. Monomer-n-Mer Self-Dernek modeli için Küresel Parametreleri doldurmak için nasıl bir örnek. <ol><li> Menü Fit seçerek Küresel Fit çalıştırın | Küresel Fit ve fit yakınsak kadar bekleyin. Aşağı Not (veya bir ekran görüntüsü almak) uydurma sonuçlar, özellikle küresel azaltılmış ki-kare ve K adet bir günlük değerleri. Termodinamik Bilgileri Göster | sığdırma veri ve menü Kopyala ve Display montaj artıklar gibi diğer verileri ayıklayın. </li><li> Küresel Parametreler dönün ve (1) monomer molekül ağırlığı uyacak ve adım 2.4.5 tekrarlamak için M kontrol edin. Takılan molekül ağırlığı ve küresel azaltılmış ki-kare not edin. </li><li> Adımı yineleyin 2.4.3 her model test edilecek için 2.4.6 ve düşük küresel ki-kare değerinin yanı sıra montaj artıklar karşılaştırarak, her modelin uygun kalitesini karşılaştırmak için. Not: Küçük ve rastgele uydurma artıklar genelde iyi bir uyum gösterir, ve olur en uygun modeliküçük küresel azaltılmış ki-kare var. monte monomer molekül ağırlığı ve ki-kare değeri sabit (teorik) molekül ağırlığı bundan önemli ölçüde farklılık olmamalıdır. </li><li> İlk seçme İstatistik göre değer elde günlüğüne Ka için güven aralığı hesaplayın | Kritik hata yüzey projeksiyonları için ki-kare ve istenen güven aralığı girilerek. Günlük Ka için ki-kare değerleri elde etmek için Küresel Parametreleri iletişim Ka giriş 1-boyutlu hata yüzey projeksiyon oluşturun ve seçimini kaldırabilirsiniz | Sonraki İstatistik gidin. Not: okuyucular, bu yöntemin 33 yöntemi 32 yanı sıra illüstrasyon hakkında daha fazla bilgi için aşağıdaki kaynakları (http://www.analyticalultracentrifugation.com/ sedphat / statistics.htm) başvurmaları önerilir. </li></ol>

<ol>
	<li>Laue, T. M., Stafford, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modern+applications+of+analytical+ultracentrifugation.">Modern applications of analytical ultracentrifugation.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 28, 75-100 (1999).</li><li>Lebowitz, J., Lewis, M. S., Schuck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modern+analytical+ultracentrifugation+in+protein+science:+A+tutorial+review.">Modern analytical ultracentrifugation in protein science: A tutorial review.</a> Protein Sci. 11, 2067-2079 (2002).</li><li>Balbo, A., Zhao, H., Brown, P. H., Schuck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell. , e1530 (2009).</li><li>Rivas, G., Stafford, W., Minton, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+heterologous+protein-protein+interactions+using+analytical+ultracentrifugation.">Characterization of heterologous protein-protein interactions using analytical ultracentrifugation.</a> Methods-a Companion to Methods in Enzymology. 19, 194-212 (1999).</li><li>Howlett, G. J., Minton, A. P., Rivas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+ultracentrifugation+for+association+and+assembly+the+study+of+protein.">Analytical ultracentrifugation for association and assembly the study of protein.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 10, 430-436 (2006).</li><li>MacGregor, I. K., Anderson, A. L., Laue, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+detection+for+the+XLI+analytical+ultracentrifuge.">Fluorescence detection for the XLI analytical ultracentrifuge.</a> Biophys. Chem. 108, 165-185 (2004).</li><li>Phizicky, E. M., Fields, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-Protein+Interactions+-+Methods+for+Detection+and+Analysis.">Protein-Protein Interactions - Methods for Detection and Analysis.</a> Microbiol. Rev. 59, 94-123 (1995).</li><li>Alexandrov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+facile+method+for+high-throughput+co-expression+of+protein+pairs.">A facile method for high-throughput co-expression of protein pairs.</a> Mol. Cell. Proteomics. 3, 934-938 (2004).</li><li>Nooren, I. M. A., Thornton, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+characterisation+and+functional+significance+of+transient+protein-protein+interactions.">Structural characterisation and functional significance of transient protein-protein interactions.</a> J. Mol. Biol. 325, 991-1018 (2003).</li><li>Ebel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sedimentation+velocity+to+characterize+surfactants+and+solubilized+membrane+proteins.">Sedimentation velocity to characterize surfactants and solubilized membrane proteins.</a> Methods. 54, 56-66 (2011).</li><li>Minton, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+characterization+of+reversible+macromolecular+associations+via+sedimentation+equilibrium:+an+introduction.">Quantitative characterization of reversible macromolecular associations via sedimentation equilibrium: an introduction.</a> Exp. Mol. Med. 32, 1-5 (2000).</li><li>Dowell, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+syncytial+virus+is+an+important+cause+of+community-acquired+lower+respiratory+infection+among+hospitalized+adults.">Respiratory syncytial virus is an important cause of community-acquired lower respiratory infection among hospitalized adults.</a> J. Infect. Dis. 174, 456-462 (1996).</li><li>Bukreyev, A., Whitehead, S. S., Murphy, B. R., Collins, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+respiratory+syncytial+virus+from+which+the+entire+SH+gene+has+been+deleted+grows+efficiently+in+cell+culture+and+exhibits+site-specific+attenuation+in+the+respiratory+tract+of+the+mouse.">Recombinant respiratory syncytial virus from which the entire SH gene has been deleted grows efficiently in cell culture and exhibits site-specific attenuation in the respiratory tract of the mouse.</a> J. Virol. 71, 8973-8982 (1997).</li><li>Fuentes, S., Tran, K. C., Luthra, P., Teng, M. N., He, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function+of+the+respiratory+syncytial+virus+small+hydrophobic+protein.">Function of the respiratory syncytial virus small hydrophobic protein.</a> J. Virol. 81, 8361-8366 (2007).</li><li>Jin, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+respiratory+syncytial+viruses+with+deletions+in+the+NS1,+NS2,+SH,+and+M2-2+genes+are+attenuated+in+vitro+and+in+vivo.">Recombinant respiratory syncytial viruses with deletions in the NS1, NS2, SH, and M2-2 genes are attenuated in vitro and in vivo.</a> Virology. 273, 210-218 (2000).</li><li>Karron, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+syncytial+virus+(RSV)+SH+and+G+proteins+are+not+essential+for+viral+replication+in+vitro:+clinical+evaluation+and+molecular+characterization+of+a+cold-passaged,+attenuated+RSV+subgroup+B.">Respiratory syncytial virus (RSV) SH and G proteins are not essential for viral replication in vitro: clinical evaluation and molecular characterization of a cold-passaged, attenuated RSV subgroup B.</a> Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 94, 13961-13966 (1997).</li><li>Whitehead, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+respiratory+syncytial+virus+bearing+a+deletion+of+either+the+NS2+or+SH+gene+is+attenuated+in+chimpanzees.">Recombinant respiratory syncytial virus bearing a deletion of either the NS2 or SH gene is attenuated in chimpanzees.</a> J. Virol. 73, 3438-3442 (1999).</li><li>Rixon, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+small+hydrophobic+(SH)+protein+accumulates+within+lipid-raft+structures+of+the+Golgi+complex+during+respiratory+syncytial+virus+infection.">The small hydrophobic (SH) protein accumulates within lipid-raft structures of the Golgi complex during respiratory syncytial virus infection.</a> J. Gen. Virol. 85, 1153-1165 (2004).</li><li>Collins, P. L., Mottet, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+orientation+and+oligomerization+of+the+small+hydrophobic+protein+of+human+respiratory+syncytial+virus.">Membrane orientation and oligomerization of the small hydrophobic protein of human respiratory syncytial virus.</a> J. Gen. Virol. 74, 1445-1450 (1993).</li><li>Collins, P. L., Olmsted, R. A., Johnson, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+small+hydrophobic+protein+of+human+respiratory+syncytial+virus:+comparison+between+antigenic+subgroups+A+and+B.">The small hydrophobic protein of human respiratory syncytial virus: comparison between antigenic subgroups A and B.</a> J. Gen. Virol. 71, 1571-1576 (1990).</li><li>Chen, M. D., Vazquez, M., Buonocore, L., Kahn, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conservation+of+the+respiratory+syncytial+virus+SH+gene.">Conservation of the respiratory syncytial virus SH gene.</a> J. Infect. Dis. 182, 1228-1233 (2000).</li><li>Gan, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+small+hydrophobic+protein+of+the+human+respiratory+syncytial+virus+forms+pentameric+ion+channels.">The small hydrophobic protein of the human respiratory syncytial virus forms pentameric ion channels.</a> J. Biol. Chem. 287, 24671-24689 (2012).</li><li>Gan, S. W., Ng, L., Xin, L., Gong, X., Torres, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+ion+channel+activity+of+the+human+respiratory+syncytial+virus+(hRSV)+small+hydrophobic+protein+transmembrane+domain.">Structure and ion channel activity of the human respiratory syncytial virus (hRSV) small hydrophobic protein transmembrane domain.</a> Protein Sci. 17, 813-820 (2008).</li><li>Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+the+Human+Respiratory+Syncytial+Virus+Small+Hydrophobic+Protein+and+Structural+variations+in+a+bicelle+environment.">Inhibition of the Human Respiratory Syncytial Virus Small Hydrophobic Protein and Structural variations in a bicelle environment.</a> J. Virol. 88 (22), 11899-914 (2014).</li><li>Burgess, N. K., Stanley, A. M., Fleming, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+membrane+protein+molecular+weights+and+association+equilibrium+constants+using+sedimentation+equilibrium+and+sedimentation+velocity.">Determination of membrane protein molecular weights and association equilibrium constants using sedimentation equilibrium and sedimentation velocity.</a> Meth. Cell. Biol. 84, 181-211 (2008).</li><li>Cole, J. L., Lary, J. W., Moody, T. P., Laue, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+Ultracentrifugation:+Sedimentation+Velocity+and+Sedimentation+Equilibrium.">Analytical Ultracentrifugation: Sedimentation Velocity and Sedimentation Equilibrium.</a> Meth. Cell. Biol. 84, 143-179 (2008).</li><li>Fleming, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+membrane+protein+molecular+weight+using+sedimentation+equilibrium+analytical+ultracentrifugation.">Determination of membrane protein molecular weight using sedimentation equilibrium analytical ultracentrifugation.</a> Curr. Protoc. Prot. Sci. 53, 17.12.11-17.12.13 (2008).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> An-50 Ti and An-60 Ti Analytical Rotor, Cells, and Counterbalance. , (2005).</li><li>Mayer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+membrane+proteins+in+detergent+solution+by+analytical+ultracentrifugation:+Different+methods+for+density+matching.">Studying membrane proteins in detergent solution by analytical ultracentrifugation: Different methods for density matching.</a> Prog. Colloid Polym. Sci. 113, 176-181 (1999).</li><li>Laue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+20.3.">Ch. 20.3.</a> Current Protocols in Protein Science. 20, 20.23.21-20.23.13 (2001).</li><li>Gan, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Small+Hydrophobic+Protein+Of+The+Human+Respiratory+Syncytial+Virus+Forms+Pentameric+Ion+Channels.">The Small Hydrophobic Protein Of The Human Respiratory Syncytial Virus Forms Pentameric Ion Channels.</a> J. Biol. Chem. 287, 24671-24689 (2012).</li><li>Bevington, P. R., Robinson, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Data reduction and error analysis for the physical sciences. 336, (1969).</li><li>Schuck, P., Radu, C. G., Ward, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sedimentation+equilibrium+analysis+of+recombinant+mouse+FcRn+with+murine+IgG1.">Sedimentation equilibrium analysis of recombinant mouse FcRn with murine IgG1.</a> Molecular Immunology. 36, 1117-1125 (1999).</li><li>Gan, S. W., Vararattanavech, A., Nordin, N., Eshaghi, S., Torres, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cost-effective+method+for+simultaneous+homo-oligomeric+size+determination+and+monodispersity+conditions+for+membrane+proteins.">A cost-effective method for simultaneous homo-oligomeric size determination and monodispersity conditions for membrane proteins.</a> Anal. Biochem. 416, 100-106 (2011).</li><li>Montserret, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMR+structure+and+ion+channel+activity+of+the+p7+protein+from+hepatitis+C+virus).">NMR structure and ion channel activity of the p7 protein from hepatitis C virus).</a> J. Biol. Chem. 285, 31446-31461 (2010).</li><li>Stouffer, A. L., DeGrado, W. F., Lear, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+Ultracentrifugation+Studies+of+the+Influenza+M2+Homotetramerization+Equilibrium+in+Detergent+Solutions.">Analytical Ultracentrifugation Studies of the Influenza M2 Homotetramerization Equilibrium in Detergent Solutions.</a> Progr Colloid Polym Sci. 131, 108-115 (2006).</li><li>Sorkin, A., von Zastrow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+transduction+and+endocytosis:+Close+encounters+of+many+kinds.">Signal transduction and endocytosis: Close encounters of many kinds.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 3, 600-614 (2002).</li><li>Gan, S. W., Ng, L., Lin, X., Gong, X., Torres, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+ion+channel+activity+of+the+human+respiratory+syncytial+virus+(hRSV)+small+hydrophobic+protein+transmembrane+domain.">Structure and ion channel activity of the human respiratory syncytial virus (hRSV) small hydrophobic protein transmembrane domain.</a> Protein science : a publication of the Protein Society. 17, 813-820 (2008).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Bu çalışma, numune hazırlama ve denge sedimantasyon kullanılarak deterjan küçük bir zar proteini oligomerizasyon analizi için bir deney protokolü sağlar. yoğunluk eşleme aşaması gerekli değildir olarak açıklanan protokol, aynı derecede geçerlidir -ve çözünür proteinler için simpler- olup. Gerçekten de, deterjanlar ve proteinin bir karışımından teşekkül eder. Parçacık flotasyon katkıda bulunmaz, böylece sedimantasyon çalışmalar yapmak, deterjan yerçekimi alanına görünmez olmalı...

Analitik Ultrasantrifügasyon 1-5, fizyolojik koşullar altında makromoleküllerin etkileşimleri incelemek zayıf ve güçlü etkileşimler hem erişilebilir olmasının en önemli yöntemlerden biridir. yöntem etiketi içermez ve ışık emiliminin veya girişim kullanır ve hatta floresan optik sistemler büyüklüğü 6 birkaç düzeyleri üzerinde konsantrasyon aralıkları ulaşmak için kullanılabilir. En biyokimyasal işlemler tersine etkileşimine bağlıdır, bu yöntem özellikle faydalıdır. Bu etkileşimlerin stoikiometri ve gücü kantitatif biyolojik süreçleri anlamak için karakterize lazım, ve bir dizi yöntem, bu amaçla 7, 8 için var. Bununla birlikte, geçici etkileşimler 9 çalışma zordur. makromoleküler etkileşimleri tanımlamak için bir yöntem seçimi statik veya dinamik doğasına bağlıdır. İlk durumda, Sedim<html> yönelimi hızı (SV) radyal ulaşım oranı ölçülür ve kompleksleri yüzer kütle ve şekil farklılıkları esasında kesirleştirilmiştir yerlerde kullanılır. Buna karşılık, deney zaman ölçeği üzerinde ters çevrilebilir dinamik dernekler fiziksel ayrılamaz. Bu durumda, kendi kendine ya da kovalent olmayan etkileşimlerin neden hetero etkileşimleri toplam protein konsantrasyonuna bağlı olan bir denge içindedir. Bu dinamik etkileşimler sedimantasyon denge (SE) ve sedimantasyon hızı (SV) 10 hem ele alınabilir. Bununla birlikte, birinci yöntem gerçekleştirmek için basit ve burada tarif edilmiştir. Bir denge difüzyon ve çökelme ile ulaşılır, böylece SE olarak, santrifüj, yeterince düşük bir hızda gerçekleştirilir. Bu noktada her iki radyal mesafenin bir fonksiyonu olarak, bir optik işaret (UV-VIS) denge profili, dernekler 11 için önceden belirlenmiş bir termodinamik modeller kullanılarak analiz edilebilir. ve_content &quot;&gt; Bu yazıda, bir sedimentasyon dengeleme çalışması nedeniyle hidrofobisite. iyon kanallarını oluşturur viral zar proteininin kendi kendine birleşmeme özelliği sunulmuştur deney deterjan varlığında gerçekleştirilir, ve bu durumda yoğunluk olduğu Çözücü deterjan edilene uyumlu olması gerekir. Bununla birlikte, protokol solvent yoğunluk eşleme gerekli olacaktır, bunun dışında, suda çözünür protein halinde olur aynı tanımladı. kullanılan protein, insan solunum sinsisyal virüsü (hRSV), alt solunum yolu bebeklerde hastalığı, yaşlılar ve bağışıklık popülasyonları Dünya çapında 12 neden Paramyxoviridae ailesinden bir zarflı Pneumovirus kodlanmıştır. HRSV enfeksiyonu kadar 64 milyon bildirilen vaka ve ölüm 160,000 her yıl meydana gelir. hRSV genom üç membran proteinleri, F, G ve küçük hidrofobik (SH) dahil olmak üzere 11 proteinleri transkripsiyonunu yapar. SH proteini katılırRSV enfeksiyonu patogenezinde. SH gen (RSVΔSH) eksik RSV mümkün olduğunu sinsitiyumların oluşmasına neden ve vahşi tip (WT) virüsü 13-16 kadar büyüdü. Bununla birlikte, RSVΔSH virüsü üst solunum yolu 15, 16 WT daha az verimli bir şekilde 10-kat çoğaltılır. Ayrıca, RSVΔSH virüs in vivo fare ve şempanze modelleri 13, 17 in zayıflatılmış oldu. SH proteini 64 (RSV alt grup A) veya 65 (RSV alt grup B) amino asitler, uzun türü Golgi 18 zarlarına çoğunlukla birikir II integral membran proteinidir. SH proteini, tek bir yüksek 20,21 korunmuş bir sarmal transmembran (TM) etki 19 tahmin vardır. C- ve N-terminal extramembrane etki lumenally / hücre dışı ve sitoplazmik sırasıyla yönlendirilir. Hem sentetik TM domeni (kalıntılar 18-43) Ve tam uzunlukta SH proteini deterjanların çeşitli homopentamers oluşturmak için gösterilmiştir. homopentameric bir şekilde düzlemsel bir lipid çift tabakaları 22,23 kanal aktivitesi için sorumludur. Lipit TM monomerlerin doğru yönlendirme ilk His-22, bir lümene ilişkin olması yakın yönde arası sarmal için gösterdi alana özel kızılötesi dikroizma 23 kullanılarak belirlenmiştir. Aynı TM domeni yönü (DPC) dodesilfosfokolin olarak pentamerik proteinin tam uzunluğunun bir sarmal demeti yeniden 22 miseller NMR çalışmaları ile teyit edilmiştir. Bu &#39;misel&#39; modelinde, tek bir a-helis TM domeni bir genişletilmiş B-hairpin C-terminal a-helisin göre N-terminal olarak sınırlanan ve edilmiştir. SH proteininin iki protonize kalıntıları, His-22 ve His-51, TM domeni (lumenally yönelimli) bulunur ve extramembrane C-terminali β firketenin ucunda sırasıyla (kadar kanal gözeneğinden). Bir bicellar Çevreyinment, ancak TM α-heliks His-51 kadar uzanır ve her ikisi de His artığı kanalı 24 lümenine erişilebilir. 22 hidrofobik yan zincirler (Ile-32, Ile-36, Ile-40 ve Leu-44), ve kaplı olan kanal yapısı, bir huni benzeri bir mimari 22 dar bölümün benimser (Cys-45, Ser-29) Ile-36 kanal lümen dar noktasını tanımlar. His-51 küçük açıklığın ucunda ise His-22, bu huni büyük açıklık yer almaktadır. Bu yazıda, bir sedimantasyon denge modunda analitik santrifüj O&#39;nun protonlanma SH, protein pentamerin istikrar etkiler olmadığını belirlemek için kullanılmıştır. Bu durumda, SH protein, literatürde bu SH protein yapılarını pentamerik oligomerler 22 göstermek için daha önce kullanılmış olan C14-betain deterjan içinde çözünmüştür.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1345">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:632px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:147px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:448px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:632px;">3-(N,N-dimethylmyristylammonio)propanesulfonate</td>
			<td style="width:147px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T0807</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:632px;">Deuterium oxide 99.8%</td>
			<td style="width:147px;">Cambridge Isotope</td>
			<td style="width:119px;">DLM-4-99.8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:632px;">An-50 Ti Rotor, Analytical, 8-Place</td>
			<td style="width:147px;">Beckman Coulter</td>
			<td align="right" style="width:119px;">363782</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:632px;">An-60 Ti Rotor, Analytical, 4-Place</td>
			<td style="width:147px;">Beckman Coulter</td>
			<td align="right" style="width:119px;">361964</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:632px;">Cell housing</td>
			<td style="width:147px;">Beckman Coulter</td>
			<td align="right" style="width:119px;">334784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:632px;">12 mm six-channel centerpiece, epon charcoal-filled</td>
			<td style="width:147px;">Beckman Coulter</td>
			<td align="right" style="width:119px;">331376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:632px;">Window holder</td>
			<td style="width:147px;">Beckman Coulter</td>
			<td align="right" style="width:119px;">305037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:632px;">Window gasket</td>
			<td style="width:147px;">Beckman Coulter</td>
			<td align="right" style="width:119px;">327021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:632px;">Window liner</td>
			<td style="width:147px;">Beckman Coulter</td>
			<td align="right" style="width:119px;">362329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:632px;">Sapphire window</td>
			<td style="width:147px;">Beckman Coulter</td>
			<td align="right" style="width:119px;">307177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:632px;">Quartz window</td>
			<td style="width:147px;">Beckman Coulter</td>
			<td align="right" style="width:119px;">301730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:632px;">Screw-ring washer</td>
			<td style="width:147px;">Beckman Coulter</td>
			<td align="right" style="width:119px;">362328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:632px;">Screw ring</td>
			<td style="width:147px;">Beckman Coulter</td>
			<td align="right" style="width:119px;">301922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:632px;">Spinkote</td>
			<td style="width:147px;">Beckman Coulter</td>
			<td align="right" style="width:119px;">306812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:632px;">Torque stand assembly</td>
			<td style="width:147px;">Beckman Coulter</td>
			<td align="right" style="width:119px;">361318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:632px;">Counterbalance</td>
			<td style="width:147px;">Beckman Coulter</td>
			<td align="right" style="width:119px;">360219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:632px;">Cell alignment tool</td>
			<td style="width:147px;">Beckman Coulter</td>
			<td align="right" style="width:119px;">362340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SEDNTERP</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://bitcwiki.sr.unh.edu/index.php/Main_Page</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HeteroAnalysis&#160;</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www.biotech.uconn.edu/auf/?i=aufftp</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SEDFIT</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www.analyticalultracentrifugation 
			.com/sedfit.htm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SEDPHAT</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www.analyticalultracentrifugation 
			.com/sedphat/default.htm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sedimentation equilibrium of a small oligomer-forming membrane protein: effect of histidine protonation on pentameric stability

Analitik ultrasantrifügasyon, (EAA) etkileşim kuvvetleri geniş bir aralıkta ve fizyolojik koşullar altında, makro moleküller arasındaki tersine çevrilebilir etkileşimler üzerinde çalışmak için de kullanılabilir. Bu AUC&#39;sini nicel stoikiyometri ve homo ve biyokimyasal süreçlerde geçici ve geri dönüşümlüdür hetero-Dernek termodinamik değerlendirmek için bir seçim yöntemi yapar. Sedimantasyon denge yöntemi (SE) &#39;de, difüzyon ve çökelme arasında bir denge, belirli bir ilişki modeline bağlıdır radyal mesafenin bir fonksiyonu olarak, bir profil sağlar. Burada detaylı bir GD protokolü bir analitik ultrasantrifüj kullanarak küçük bir zar proteini oligomerin boyut ve monomer ilişki enerjisini tespit etmek üzere tarif edilmiştir. AUC-ES sadece fiziksel ilkelere dayalı, etiket-ücretsiz, ve hem suda çözünür ve membran proteinleri kullanılabilir. Bir örnek ikincisinin gösterilir, insan solunum sinsisyal virüsü küçük hidrofobik (SH) proteini (hRSV), Pentamerik iyon kanallarını oluşturan tek bir α-sarmal transmembran (TM) etki alanı ile 65-amino asit polipeptit. NMR tabanlı yapısal veriler SH proteini kanalının lümen bakan yönlendirilmiş olan zar ötesi etki protonlaştırılabilir iki His kalıntılarını sahip olduğunu göstermektedir. SE deneyleri pH dernek sabiti ve SH protein oligomerik boyutunu nasıl etkilediğini belirlemek için tasarlanmıştır. Pentamerik bir şekilde her durumda muhafaza ederken, bunun birleşme sabiti düşük pH değerinde indirgendi. Bu veriler, SH proteinde iki His tortularının bir lümene ilişkin yönlendirme ile tutarlı SH kanal aktivitesi için gözlenen benzer bir pH bağımlılığı ile uyum içindedir. ikincisi, düşük pH elektrostatik itme ve düşük oligomer istikrarı karşılaşabilirsiniz. Fizyolojik koşullarda ince, protein-protein ilişki değişiklikler hakkında niceliksel bilgi olarak ölçülmesi için her Özetle, bu yöntem uygulanabilir.

50 mM Tris, C14SB deterjan miseller radyal dağılım profili, 100 mM NaCI, pH 7.3 formları doğrusal modeli (Şekil 7A) monte edilebilir, çok sığ bir üslü. Bu dağılım eğimi ters D 2 O konsantrasyonu (Şekil 7B) ile korele edilir. eğim sıfır olduğu nokta, eşleştirme D 2 O konsantrasyonu,% 32.3 olarak bulunmuştur, yani. Aşağıda Şekil 7 Bkz. Aynı deney f...

Watch this Scientific Journal Video about Sedimentation Equilibrium of a Small Oligomer-forming Membrane Protein: Effect of Histidine Protonation on Pentameric Stability at JoVE.com

Sedimentation Equilibrium of a Small Oligomer-forming Membrane Protein: Effect of Histidine Protonation on Pentameric Stability

Sedimentation equilibrium (SE) can be used to study protein-protein interactions in a physiological environment. This manuscript describes the use of this technique to determine the effect of pH on the stability of a homo-pentamer formed by the small hydrophobic (SH) protein encoded by the human syncytial respiratory virus (hRSV).

Küçük oligomer oluşturan Membran Protein Sedimantasyon Denge: pentameric İstikrar Histidine Protonasyon Etkisi

Analytical ultracentrifugation (AUC) can be used to study reversible interactions between macromolecules over a wide range of interaction strengths and ...

sedimentation-equilibrium-small-oligomer-forming-membrane-protein

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Chemistry

Acids and Bases

SCIENTISTS IN ACTION

10.5K Görüntüleme.  Nanyang Technological University. Sedimentation equilibrium (SE) can be used to study protein-protein interactions in a physiological environment. This manuscript describes the use of this technique to determine the effect of pH on the stability of a homo-pentamer formed by the small hydrophobic (SH) protein encoded by the human syncytial respiratory virus (hRSV).

Video: Sedimentation Equilibrium of a Small Oligomer-forming Membrane Protein: Effect of Histidine Protonation on Pentameric Stability

Iridium(III) Luminescent Probe for Detection of the Malarial Protein Biomarker Histidine Rich Protein-II

This work outlines the synthesis of a non-emissive, cyclometalated Ir(III) complex, Ir(ppy)2(H2O)2+ (Ir1), which elicits a rapid, long-lived phosphorescent signal when coordinated to a histidine-containing protein immobilized on the surface of a magnetic particle. Synthesis of Ir1, in high yields,is complete O/N&#160;and involves splitting of the parent cyclometalated Ir(III) chloro-bridged dimer into two equivalents of the solvated complex. To confirm specificity, several amino acids were probed for coordination activity when added to the synthesized probe, and only histidine elicited a signal response. Using BNT-II, a branched peptide mimic of the malarial biomarker Histidine Rich Protein II (pfHRP-II), the iridium probe was validated as a tool for HRP-II detection. Quenching effects were noted in the BNT-II/Ir1 titration when compared to L-Histidine/Ir1, but these were attributed to steric hindrance and triplet state quenching. Biolayer interferometry was used to determine real-time kinetics of interaction of Ir1 with BNT-II. Once the system was optimized, the limit of detection of rcHRP-II using the probe was found to be 12.8 nM in solution. When this protein was immobilized on the surface of a 50 &#181;m magnetic agarose particle, the limit of detection was 14.5 nM. The robust signal response of this inorganic probe, as well as its flexibility of use in solution or immobilized on a surface, can lend itself toward a variety of applications, from diagnostic use to imaging.

IridiumIII Luminescent Probe for Detection of the Malarial Protein Biomarker Histidine Rich Protein-II

Robust detection reagents are of increasing necessity for developing new malaria diagnostic tools. An iridium(III) probe was designed that emits long-lasting luminescent signal in the presence of a histidine-rich malarial protein biomarker. Detection of the protein either in solution or immobilized on a magnetic particle affords flexibility in application.

Malarya Protein Biyomarker Histidin Zengin Protein-II Tespiti için İridyum (III) Lüminesans Probe

This work outlines the synthesis of a non-emissive, cyclometalated Ir(III) complex, Ir(ppy)2(H2O)2+ (Ir1), which elicits a rapid, long-lived ...

Kimya

Dynamic Electrochemical Measurement of Chloride Ions

This protocol describes the dynamic measurement of chloride ions using the transition time of a silver silver chloride (Ag/AgCl) electrode. Silver silver chloride electrode is used extensively for potentiometric measurement of chloride ions concentration in electrolyte. In this measurement, long-term and continuous monitoring is limited due to the inherent drift and the requirement of a stable reference electrode. We utilized the chronopotentiometric approach to minimize drift and avoid the use of a conventional reference electrode. A galvanostatic pulse is applied to an Ag/AgCl electrode which initiates a faradic reaction depleting the Cl&#713; ions near the electrode surface. The transition time, which is the time to completely deplete the ions near the electrode surface, is a function of the ion concentration, given by the Nernst equation. The square root of the transition time is in linear relation to the chloride ion concentration. Drift of the response over two weeks is negligible (59 &#181;M/day) when measuring 1 mM [Cl&#713;]using a current pulse of 10 Am-2. This is a dynamic measurement where the moment of transition time determines the response and thus is independent of the absolute potential. Any metal wire can be used as a pseudo-reference electrode, making this approach feasible for long-term measurement inside concrete structures.

Dynamic measurement of chloride ions is presented. Transition time of an Ag/AgCl electrode, during a chronopotentiometric technique, can give the concentration of chloride ions in electrolyte. This method does not require a stable conventional reference electrode.

Klorür iyonlarının Dinamik Elektrokimyasal Ölçüm

This protocol describes the dynamic measurement of chloride ions using the transition time of a silver silver chloride (Ag/AgCl) electrode. Silver silver ...

Site Directed Spin Labeling and EPR Spectroscopic Studies of Pentameric Ligand-Gated Ion Channels

Ion channel gating is a stimulus-driven orchestration of protein motions that leads to transitions between closed, open, and desensitized states. Fundamental to these transitions is the intrinsic flexibility of the protein, which is critically modulated by membrane lipid-composition. To better understand the structural basis of channel function, it is necessary to study protein dynamics in a physiological membrane environment. Electron Paramagnetic Resonance (EPR) spectroscopy is an important tool to characterize conformational transitions between functional states. In comparison to NMR and X-ray crystallography, the information obtained from EPR is intrinsically of lower resolution. However, unlike in other techniques, in EPR there is no upper-limit to the molecular weight of the protein, the sample requirements are significantly lower, and more importantly the protein is not constrained by the crystal lattice forces. Therefore, EPR is uniquely suited for studying large protein complexes and proteins in reconstituted systems. In this article, we will discuss general protocols for site-directed spin labeling and membrane reconstitution using a prokaryotic proton-gated pentameric Ligand-Gated Ion Channel (pLGIC) from Gloeobacter violaceus (GLIC) as an example. A combination of steady-state Continuous Wave (CW) and Pulsed (Double Electron Electron Resonance-DEER) EPR approaches will be described that will enable a complete quantitative characterization of channel dynamics.

This article describes methods for site-directed spin labeling and reconstitution of pentameric ligand-gated channels for Electron Paramagnetic Resonance studies. This protocol can be adapted for any membrane protein. The reconstitution method described here can also be used for patch-clamp measurements of macroscopic and single-channel currents in a defined lipid system.

Site Yönetmen Spin Etiketleme ve pentameric ligand-kapılı iyon Kanallarının EPR Spektroskopik Çalışmaları

Ion channel gating is a stimulus-driven orchestration of protein motions that leads to transitions between closed, open, and desensitized states. ...

Original Experimental Approach for Assessing Transport Fuel Stability

The study of fuel oxidation stability is an important issue for the development of future fuels. Diesel and kerosene fuel systems have undergone several technological changes to fulfill environmental and economic requirements. These developments have resulted in increasingly severe operating conditions whose suitability for conventional and alternative fuels needs to be addressed. For example, fatty acid methyl esters (FAMEs) introduced as biodiesel are more prone to oxidation and may lead to deposit formation. Although several methods exist to evaluate fuel stability (induction period, peroxides, acids, and insolubles), no technique allows one to monitor the real-time oxidation mechanism and to measure the formation of oxidation intermediates that may lead to deposit formation. In this article, we developed an advanced oxidation procedure (AOP) based on two existing reactors. This procedure allows the simulation of different oxidation conditions and the monitoring of the oxidation progress by the means of macroscopic parameters, such as total acid number (TAN) and advanced analytical methods like gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC-MS) and Fourier Transform Infrared - Attenuated Total Reflection (FTIR-ATR). We successfully applied AOP to gain an in-depth understanding of the oxidation kinetics of a model molecule (methyl oleate) and commercial diesel and biodiesel fuels. These developments represent a key strategy for fuel quality monitoring during logistics and on-board utilization.

Oxidation stability of transport fuels has become a concern for future fuel development. This work presents an original methodology developed by IFP Energies Nouvelles for assessing fuel stability using two different reactors. This methodology was successfully applied to gain an in-depth understanding of the oxidation kinetics and pathways of model molecules and commercial fuels.

Ulaşım Yakıt İstikrar Değerlendirme Orijinal Deneysel Yaklaşım

The study of fuel oxidation stability is an important issue for the development of future fuels. Diesel and kerosene fuel systems have undergone several ...

Application and Methodology of the Non-destructive 19F Time-domain NMR Technique to Measure the Content in Fluorine-containing Drug Products

Here, we describe a protocol developed by our group that uses low-field fluorine-19 (19F) time-domain (TD) nuclear magnetic resonance (NMR) to measure the average content of fluorinated drugs in their formulated drug product forms: tablets or capsules. This method is specific to fluorinated drugs because it detects only the content of fluorine, avoiding interference from the excipients that lack fluorine. The advantages of measuring the active content of fluorinated drugs using low-field 19F TD-NMR versus high-field 19F solid-state (SS) NMR are the simplicity of the method; the low cost; and the non-destructive nature of the technique, with all samples recoverable in intact forms (e.g., powders, tablets, and capsules), making this technique affordable for any laboratory.
We have tested the method with three fluorinated drug products available on the market - cinacalcet, lansoprazole, and ciprofloxacin - with doses ranging from 15 to 500 mg. The results of the analyses, measured by low-field 19F TD-NMR, supported the reported label claims for the average drug content.
Based on the simplicity and reproducibility of the analysis, we envision this methodology being implemented in any laboratory, including manufacturing plants, as a process analytical technology (PAT) tool in the pharmaceutical industry.

Application and Methodology of the Non-destructive 19F Time-domain NMR Technique to Measure the Content in Fluorine-containing Drug Products

A simple and non-destructive technique that measures the average content of drug substances in formulated drug products containing fluorine using low-field fluorine-19 (19F) time-domain (TD) nuclear magnetic resonance (NMR) is presented here. The technique can be applied to the development and manufacturing of drugs in the pharmaceutical industry.

Uygulama ve tahribatsız 19F saat-alan NMR tekniği metodolojisi Flor içeren ilaç ürünleri içeriğindeki ölçmek için

Here, we describe a protocol developed by our group that uses low-field fluorine-19 (19F) time-domain (TD) nuclear magnetic resonance (NMR) to measure the ...

The Effect of Interfacial Chemical Bonding in TiO2-SiO2 Composites on Their Photocatalytic NOx Abatement Performance

The chemical bonding of particulate photocatalysts to supporting material surfaces is of great importance in engineering more efficient and practical photocatalytic structures. However, the influence of such chemical bonding on the optical and surface properties of the photocatalyst and thus its photocatalytic activity/reaction selectivity behavior has not been systematically studied. In this investigation, TiO2 has been supported on the surface of SiO2 by means of two different methods: (i) by the in situ formation of TiO2 in the presence of sand quartz via a sol-gel method employing tetrabutyl orthotitanium (TBOT); and (ii) by binding the commercial TiO2 powder to quartz on a surface silica gel layer formed from the reaction of quartz with tetraethylorthosilicate (TEOS). For comparison, TiO2 nanoparticles were also deposited on the surfaces of a more reactive SiO2 prepared by a hydrolysis-controlled sol-gel technique as well as through a sol-gel route from TiO2 and SiO2 precursors. The combination of TiO2 and SiO2, through interfacial Ti-O-Si bonds, was confirmed by FTIR spectroscopy and the photocatalytic activities of the obtained composites were tested for photocatalytic degradation of NO according to the ISO standard method (ISO 22197&#8722;1). The electron microscope images of the obtained materials showed that variable photocatalyst coverage of the support surface can successfully be achieved but the photocatalytic activity towards NO removal was found to be affected by the preparation method and the nitrate selectivity is adversely affected by Ti-O-Si bonding.

The Effect of Interfacial Chemical Bonding in TiO2-SiO2 Composites on Their Photocatalytic NOx Abatement Performance

The focus of the present work is to establish means to generate and quantify levels of Ti-O-Si linkages and to correlate these with the photocatalytic properties of the supported TiO2.

Yüzeyel Kimyasal Yapıştırmanın TiO&#39;ya Etkisi<sub&gt; 2</sub&gt; -SiO<sub&gt; 2</sub&gt; Fotokatalitik NOx Azaltma Performansına Sahip Kompozitler

The chemical bonding of particulate photocatalysts to supporting material surfaces is of great importance in engineering more efficient and practical ...

The Effect of Charging and Discharging Lithium Iron Phosphate-graphite Cells at Different Temperatures on Degradation

The effect of charging and discharging lithium iron phosphate-graphite cells at different temperatures on their degradation is evaluated systematically. The degradation of the cells is assessed by using 10 charging and discharging temperature permutations ranging from -20 &#176;C to 30 &#176;C. This allows an analysis of the effect of charge and discharge temperatures on aging, and their associations. A total of 100 charge/discharge cycles were carried out. Every 25 cycles a reference cycle was performed to assess the reversible and irreversible capacity degradation. A multi-factor analysis of variance was used, and the experimental results were fitted showing: i) a quadratic relationship between the rate of degradation and the temperature of charge, ii) a linear relationship with the temperature of discharge, and iii) a correlation between the temperature of charge and discharge. It was found that the temperature combination for charging at +30 &#176;C and discharging at -5 &#176;C led to the highest rate of degradation. On the other hand, the cycling in a temperature range from -20 &#176;C to 15 &#176;C (with various combinations of temperatures of charge and discharge), led to a much lower degradation. Additionally, when the temperature of charge is 15 &#176;C, it was found that the degradation rate is nondependent on the temperature of discharge.

This article describes the effect of dissimilar charging/discharging temperatures on the degradation of lithium iron phosphate-graphite pouch cells, aiming at simulating close to real case scenarios. In total, 10 temperature combinations are investigated in the range -20 to 30 &#176;C in order to analyze the impact of temperature on degradation.

Şarj etme ve boşaltma Lityum demir fosfat-grafit hücreler farklı sıcaklıklarda bozulması üzerine etkisi

The effect of charging and discharging lithium iron phosphate-graphite cells at different temperatures on their degradation is evaluated systematically. ...

The Effect of Ultraviolet Radiation on the Chemical Bath Deposition of Bis(thiourea) Cadmium Chloride Crystals and the Subsequent CdS Obtention

In this work, the effects on the preparation of bis(thiourea) cadmium chloride crystals when illuminated with ultraviolet (UV) light at a wavelength of 367 nm using the chemical bath deposition technique are studied comparatively. Two experiments are performed to make a comparison: one without UV light and the other with the aid of UV light. Both experiments are performed under equal conditions, at a temperature of 343 K and with a pH of 3.2. The precursors used are cadmium chloride (CdCl2) and thiourea [CS(NH2)2], which are dissolved in 50 mL of deionized water with an acidic pH. In this experiment, the interaction of electromagnetic radiation is sought at the moment the chemical reaction is carried out. The results demonstrate the existence of an interaction between the crystals and the UV light; the UV light assistance causes crystal growths in an acicular shape. Also, the final product obtained is cadmium sulfide and shows no evident difference when synthesized with or without the use of UV light.

The Effect of Ultraviolet Radiation on the Chemical Bath Deposition of Bisthiourea Cadmium Chloride Crystals and the Subsequent CdS Obtention

This article presents a protocol for the synthesis of bis(thiourea) cadmium chloride crystals by chemical bath deposition. Two experiments are described: one aided by ultraviolet light compared to one without ultraviolet light.

Kimyasal banyosu biriktirme ultraviyole radyasyon Bis(thiourea) kadmiyum klorür kristaller ve sonraki CD Obtention etkisi

In this work, the effects on the preparation of bis(thiourea) cadmium chloride crystals when illuminated with ultraviolet (UV) light at a wavelength of ...

Extraction of Lignin with High &#946;-O-4 Content by Mild Ethanol Extraction and Its Effect on the Depolymerization Yield

Lignin valorization strategies are a key factor for achieving more economically competitive biorefineries based on lignocellulosic biomass. Most of the emerging elegant procedures to obtain specific aromatic products rely on the lignin substrate having a high content of the readily cleavable &#946;-O-4 linkage as present in the native lignin structure. This provides a miss-match with typical technical lignins that are highly degraded and therefore are low in &#946;-O-4 linkages. Therefore, the extraction yields, and the quality of the obtained lignin are of utmost importance to access new lignin valorization pathways. In this manuscript, a simple protocol is presented to obtain lignins with high &#946;-O-4 content by relatively mild ethanol extraction that can be applied to different lignocellulose sources. Furthermore, analysis procedures to determine the quality of the lignins are presented together with a depolymerization protocol that yields specific phenolic 2-arylmethyl-1,3-dioxolanes, which can be used to evaluate the obtained lignins. The presented results demonstrate the link between lignin quality and potential for the lignins to be depolymerized into specific monomeric aromatic chemicals. Overall, the extraction and depolymerization demonstrates a trade-off between the lignin extraction yield and the retention of the native aryl-ether structure and thus the potential of the lignin to be used as the substrate for the production of chemicals for higher-value applications.

Extraction of Lignin with High &amp;#946;-O-4 Content by Mild Ethanol Extraction and Its Effect on the Depolymerization Yield

Here, we present a protocol to perform ethanol extraction of lignin from several biomass sources. The effect of the extraction conditions on the lignin yield and &#946;-O-4 content are presented. Selective depolymerization is performed on the obtained lignins to obtain high aromatic monomer products.

Yüksek β-O-4 içeriği ile Lignin çıkarımı hafif etanol ayıklama ve bozulumu verim üzerindeki etkisi

Lignin valorization strategies are a key factor for achieving more economically competitive biorefineries based on lignocellulosic biomass. Most of the ...

Niobium Oxide Films Deposited by Reactive Sputtering: Effect of Oxygen Flow Rate

Reactive sputtering is a versatile technique used to form compact films with excellent homogeneity. In addition, it allows easy control over deposition parameters such as gas flow rate that results in changes on composition and thus in the film required properties. In this report, reactive sputtering is used to deposit niobium oxide films. A niobium target is used as metal source and different oxygen flow rates to deposit niobium oxide films. The oxygen flow rate was changed from 3 to 10 sccm. The films deposited under low oxygen flow rates show higher electrical conductivity and provide better perovskite solar cells when used as electron transport layer.

Here, we present a protocol for niobium oxide films deposition by reactive sputtering with different oxygen flow rates for use as an electron transport layer in perovskite solar cells.

Reaktif Püskürtme Ile Yatırılan Niyöyum Oksit Filmler: Oksijen Akış Hızının Etkisi

Reactive sputtering is a versatile technique used to form compact films with excellent homogeneity. In addition, it allows easy control over deposition ...