Bu araştırma Science, ICT ve Gelecek Planlaması (Hibe No 2013M3C8A1075908) Bakanlığı tarafından finanse edilen Ulusal Araştırma Vakfı Derneği için Ar-Ge Programı (UÇK) tarafından desteklenmiştir.

FFPE Referans Standart Hücre Hatları 1. DNA Ekstraksiyon Not: Bu işlem için, DNA izolasyonu, aşağıdaki protokolde tarif edildiği gibi FFPE Doku DNA izolasyon kiti kullanılarak FFPE referans standardı hücre hatları (HD598, HD593, HD617, HD273 ve vahşi tip (WT)) için yapıldı. Otomatik DNA ekstraksiyon toplam DNA izolasyonu için üreticinin yönergelerini izleyerek elde edildi. <ol><li> Bir mikrotom ve orijinal FFPE bloğunu kullanan, elle prosedürlere göre, önce, DNA ekstraksiyon ve analiz taze kesitler hazırlamak. Doku bölümünde (ler) için örnek bir giriş 10 um arasında kombine bir toplam kalınlığını aşmaz analiz emin olun ve yüzey alanı, tek bir bölüm için 600 mm 2 aşmamasına dikkat. </li></ol> 1.2 TPS protokolü Not: Tablo 1 &#39;de gösterilen birimleri 48 numune işleme için gereken minimum karşılık gelir ve prosedür,gösterilen TPS kurallarına uygundur. Deneye başlamadan önce otomatik programı sırasında örneklerin kaybını önlemek için, 600 x g&#39;de santrifüj e-tüp içinde FFPE örnekleri yerleşmek. <ol><li> Otomatik DNA izolasyonu enstrüman ve bilgisayarı açın. Run kontrol yazılımı açın ve TPS güverte yükleme alanı içine otomatik yük tepsi yerleştirin. </li><li> Şekil 1 &#39;de gösterildiği gibi, karşılık gelen olukları içine reaktifleri koyun. <ol><li> Numune taşıyıcı raflarına 4 örnekleri (BRAF WT BRAF V600E 50,% 5 ve% 1%) yerleştirin. </li><li> Sütunları 2 ve 3 teknelerde uç kutuları yerleştirin ve çalıştırın iptal edecek, ucu başına birden fazla filtre varlığını ipuçlarına bakın. </li><li> Onlara 3-5 kez ters yüz edilerek lizis tamponu ve yıkama tamponu uygun karışmasını sağlamak ve sütunda 4 (Şekil 1) ilgili olukları içine yerleştirin. </li><li> Birkaç kez veya hafif Vort için tersini sonraexing, (Şekil 1, Tablo 1) belirtilen yerlerde 1 yuva boş bırakarak, sütunda 5 küçük teknelerde elüsyon tamponu, manyetik boncuk ve FFPE tampon yerleştirin. </li><li> Plaka taşıyıcısı (Şekil 1) üzerine 2 ml derin kuyu plaka (DWP) yükleyin. </li></ol></li><li> Bir çalışma başlamadan önce aşağıdaki nihai adımları gerçekleştirin: <ol><li> Tüm tüpleri ve reaktif olukları şapkasını çıkarmak. Yeterli kapasite sıvı atık şişe mevcuttur onaylayın. Katı atık şişesi boş ve biyolojik tehlikeli bir çanta ile kaplı olduğunu doğrulayın. Ucu çıkarma plaka atık montaj merkezli olduğunu doğrulayın. </li><li> Ön kapağı kapatın. </li></ol></li><li> Yazılımını başlatın. NA_Prep_Main_MLSTARlet.med dosyasını açın. </li><li> Tıklayın &quot;Başlat&quot;. Enstrüman durumu çalıştıran boşta geçiş olacaktır. </li><li> Bu çalışma için örneklerin sayısını girin. Bu çalışma (DNA = 0) için istenen yöntemi seçin. İlk yüksek vol konumunu girinume ucu, tüm tepsiler doluysa &quot;1&quot; seçilmesi. Tüm tepsiler doluysa &quot;1&quot; seçilerek, ilk standart hacim ucunun konumunu girin. Not: Cihaz sonra kullanıcı müdahalesi olmadan otomatik adımlarda çalışacaktır. Ayrıntılı iş akışı Şekil 2&#39;de gösterilmiştir. Deney bittiğinde, reaktif atıklar ve ipuçları atık montaj enjekte edilir. </li><li> Florometrik bir yöntemi kullanarak saflaştırılmış genomik DNA ölçmek. Not: 3,3 ng / ul&#39;lik bir konsantrasyona az ihtiva eden DNA numuneleri ddPCR analizi (bölüm 2) tabi tutulur. </li></ol> 2. DNA Mutasyon profil: ddPCR Protokolü Not: 1) Damlacık nesil 2) Konvansiyonel PCR büyütmesi, 3) Damlacık okuma ve 4), DNA mutasyonu profilleme: DNA mutasyonu profilleme için protokol 3 büyük adımlardan oluşur. 2.1. Damlacık oluşturma Not: ddPCR Supermix olduğuBu karışım damlacık üretimi için gerekli olan reaktif içerdiğinden, ddPCR için önerilir. <ol><li> , Kontaminasyonu önlemek gibi bir temiz PCR kaput, temiz pipetleri ve düşük protein bağlama tüpleri kullanan, eldiven giymiş gibi standart önlemler, izleyin. </li><li> İnsan genomik DNA örneği minimum konsantrasyonu 3.3 ng / ml olduğundan emin olun. Not: saflaştırılmış DNA örneği konsantrasyonu miktarı% mutasyon sıklığı algılama analizine göre değişir. </li><li> 96 gözlü PCR plakaları içinde reaksiyon karışımlarını bir araya getirin. Çözülme ve oda sıcaklığına kadar reaksiyon bileşenlerini dengeye getirin. (Her saflaştırılmış DNA örneği (66ng / 2 ul), distile su ile 20 ul&#39;ye kadar yapmak, 2X ddPCR SuperMix (10 | il) ve 20 primerleri (ileri ve geri, 900 nM) ve sonda (250 nM) birleştirilerek PCR reaksiyonları hazırlayın ) damlacık jeneratör protokolü başına </li><li> Dağıtım önce tüpün alt kısmında içeriğini toplamak için homojenlik ve kısaca santrifüj sağlamak için iyice karışımı karıştırın. Yük 20 &amp; #181; damlacık oluşumu için kartuş üzerine l. </li><li> İmalatçının tavsiye ettiği protokole göre damlacık jeneratör çalışması, <ol><li> Sahibinin sol üst tarafına yerleştirilmiş kartuş içinde çentik ile tutucu içine kartuşu takın. Alt kuyulara ortasına örnekleri içeren bir reaksiyon karışımı 20 ul, ve jeneratör yağı 70 ul ekle. </li><li> Kartuşun üstünde conta takın. Conta sahibinin iki ucunda güvenli bağımlısı olduğundan emin olun; aksi halde, damlacık oluşturma için yeterli basınç elde edilemez olacaktır. </li><li> Cihazın üstündeki yeşil düğmeye basarak damlacık jeneratör açın ve kartuşu takın. Tutucu gücü (sağdan sola) ve tutucu (orta sağ) gösterge ışıkları yeşil, hem doğru konumda olduğunda. </li><li> Kapıyı kapatmak için tekrar enstrüman üst düğmesine basın ve damlacık nesil başlatırlar. Not: b bastıktan sonrabasıp bırakın, damlacıklar oluşturulan mikroakışkan kanallar aracılığıyla petrol ve örnekleri çizim çıkış kuyuları üzerinde manifoldu pozisyonları kendisi. Onlar birikir nerede Damlacıklar, iyi damlacık içine akar. 10 saniye damlacık nesil devam etmekte olduğunu göstermek için daha sonra damlacık gösterge ışığı (sağda) yeşil renkte yanıp söner. </li><li> Damlacık oluşturma tamamlandığında, 3 gösterge ışıkları katı yeşile; düğmesine basarak kapıyı açın ve üniteden tutucu çıkarın. Yuvasından atılan contasını çıkartın ve atın. Not: kartuşun üst kuyu damlacıkları içerir ve orta ve alt oyuklar kalıntı yağın küçük bir miktarı ile, hemen hemen boş olduğunda. </li></ol></li></ol> 2.2. PCR için Preparasyon <ol><li> Üreticinin aygıt protokolde belirtilen her bir numune için, tavsiye edilen bir 96-çukurlu PCR plaka tek bir kuyunun içine en iyi kartuşlardan damlacık içeriğinin 40 ul üzerinden pipetleyin. Hayırte: çok kanallı bir pipet kullanarak damlacıklar emülsiyon aktarmak için idealdir. Damlacıkların Yavaş ve nazik aspirasyon transferleri sırasında damlacık kesme aza indirmek için tavsiye edilir. </li><li> Hemen buharlaşmasını önlemek için damlacıkların aktardıktan sonra folyo ile PCR plaka mühür. PCR plaka kapatıcı ve damlacık okuyucu iğneler ile uyumlu delinebilir folyo plaka contaları kullanın. PCR plaka mühürleyen kullanım kılavuzunda yönergeleri izleyin. </li><li> 180 ° C plaka mühürleyen sıcaklığı ve 5 sn saati ayarlayın. </li><li> Tepsi kapıyı açmak için oka dokunun. 96-iyi tarafı yukarı bakacak şekilde tepsiye destek bloğu yerleştirin. Destek blok üzerine 96-plaka koyun ve tüm plaka kuyuları destek bloğu ile uyumlu olduğundan emin olun. </li><li> Delinebilir folyo mühür 1 levha ile 96-plaka örtün. 96-plaka destek bloğu üzerinde güvenli ve delinebilir folyo mühür ile kaplıdır sonra, mühür düğmesine dokunun. Tepsi kapanacakve ısı yalıtım başlatacaktır. </li><li> Isı yapıştırma işlemi tamamlandığında, kapı otomatik olarak açılır; Termal bisiklet için ısı bloğu plaka kaldırmak ve daha sonra ısı bloğu kaldırmak. </li><li> Plaka tüm kuyu folyo depresyonlar her bir üzerinde aşikar olduğu kontrol ederek sızdırmaz olduğundan emin olun. Mühürlü sonra, plaka, termal bisiklet için hazırdır. </li><li> Damlacıklar çıkarıldıktan sonra, açmak için kartuş tutucu üzerindeki mandalları basın. Boş kartuşu çıkarın ve atın. </li><li> Tablo 2&#39;de ayrıntılı parametreleri takip ederek geleneksel PCR gerçekleştirin. </li></ol> 2.3 Damlacık okuma (üreticinin tavsiye ettiği protokole göre) Not: damlacıklar halinde nükleik asit hedefin PCR amplifikasyonu takiben damla okuyucu cihaz tek bir 2-renk algılama sistemi 13 kullanılarak her damlacık analiz eder. Biz genellikle FAM algılayıp ayarlamakd VIC muhabiri floroforlar. <ol><li> Başbakan damlacık okuyucuya &quot;Flush sistemi&quot; tıklayın ve ddPCR analiz için hazır olun. </li><li> Damlacık okuyucu plaka yükleyin ve tıklayın &quot;start&quot;. Damlacık okuyucu, her bir örnek aspire damlacıkları singulates ve 2 renkli dedektörü geçmiş bunları tek dosyaya akarsu. Dedektör olumlu ve olumsuz örnekleri numaralandırmak damlacıkları okur. </li><li> Damlacık okuma tamamlandığında, kapıyı açmak ve üniteden plaka tutucu çıkarın. Sahibinden 96-PCR plakasını çıkarın ve atın. </li><li> Doğru bakım için, damlacık okuyucu yağı yerine ve gerektiğinde atık yuvasını boşaltın. Mikrobiyal büyümeyi önlemek için atık şişeye% 10 çamaşır suyu 50 ml ekleyin. </li></ol> 2.4 DNA mutasyonu profilleme (üreticinin tavsiye ettiği protokole göre) Not: PCR pozitif ve PCR-negatif damlacıkları mutlak quantific sağlamak için sayılırveri analiz yazılımı kullanılarak dijital formda, hedef BRAF V600E DNA mutasyonlarının asyon. <ol><li> Numuneler, tahliller ve deneyler hakkında bilgi girmek için Kur&#39;u tıklatın. </li><li> Kurulumu penceresinde, bir tabak (filename.qlp) yüklemek, sonra verileri açıp analiz analiz tıklatın. Sonuçlar Tablo, Kuyu Seçici ve İşlenmiş Data / Grafik Ekran: Veri analizi arayüzü üç pencere ayrılır. </li><li> İşlenmiş Veri penceresinde, her hedef için konsantrasyon veri plakası haritası kuyularda görünür ve Sonuçlar Tablo tabloda gösterilmektedir. Konsantrasyon araziler verileri görselleştirmek için Konsantrasyon tıklayın. </li></ol>

<ol>
	<li>Vogelstein, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+alterations+during+colorectal-tumor+development.">Genetic alterations during colorectal-tumor development.</a> The New England journal of medicine. 319, 525-532 (1988).</li><li>Davies, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+of+the+BRAF+gene+in+human+cancer.">Mutations of the BRAF gene in human cancer.</a> Nature. 417, 949-954 (2002).</li><li>Solit, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRAF+mutation+predicts+sensitivity+to+MEK+inhibition.">BRAF mutation predicts sensitivity to MEK inhibition.</a> Nature. 439, 358-362 (2006).</li><li>Wong, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+developments+in+anti-cancer+agents+targeting+the+Ras/Raf/+MEK/ERK+pathway.">Recent developments in anti-cancer agents targeting the Ras/Raf/ MEK/ERK pathway.</a> Recent patents on anti-cancer drug discovery. 4, 28-35 (2009).</li><li>Brose, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRAF+and+RAS+mutations+in+human+lung+cancer+and+melanoma.">BRAF and RAS mutations in human lung cancer and melanoma.</a> Cancer research. 62, 6997-7000 (2002).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRAF+mutations+in+colon+cancer+are+not+likely+attributable+to+defective+DNA+mismatch+repair.">BRAF mutations in colon cancer are not likely attributable to defective DNA mismatch repair.</a> Cancer research. 63, 5209-5212 (2003).</li><li>Hindson, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+Droplet+Digital+PCR+System+for+Absolute+Quantitation+of+DNA+Copy+Number.">High-Throughput Droplet Digital PCR System for Absolute Quantitation of DNA Copy Number.</a> Anal Chem. 83, 8604-8610 (1021).</li><li>Pinheiro, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+Droplet+Digital+Polymerase+Chain+Reaction+Format+for+DNA+Copy+Number+Quantification.">Evaluation of a Droplet Digital Polymerase Chain Reaction Format for DNA Copy Number Quantification.</a> Anal Chem. 84, 1003-1011 (1021).</li><li>Jones, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+copy+target+detection+by+Droplet+Digital+PCR+through+application+of+a+novel+open+access+bioinformatic+pipeline,+'definetherain'.">Low copy target detection by Droplet Digital PCR through application of a novel open access bioinformatic pipeline, 'definetherain'.</a> Journal of virological methods. 202, 46-53 (2014).</li><li>Strain, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+precise+measurement+of+HIV+DNA+by+droplet+digital+PCR.">Highly precise measurement of HIV DNA by droplet digital PCR.</a> PloS one. 8, e55943 (2013).</li><li>Miotke, L., Lau, B. T., Rumma, R. T., Ji, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+sensitivity+detection+and+quantitation+of+DNA+copy+number+and+single+nucleotide+variants+with+single+color+droplet+digital+PCR.">High sensitivity detection and quantitation of DNA copy number and single nucleotide variants with single color droplet digital PCR.</a> Anal Chem. 86, 2618-2624 (2014).</li><li>Bizouarn, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+applications+using+digital+PCR.">Clinical applications using digital PCR.</a> Methods in molecular biology. 1160, 189-214 (2014).</li><li>McDermott, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+target+detection+using+DNA-binding+dye+chemistry+in+droplet+digital+PCR.">Multiplexed target detection using DNA-binding dye chemistry in droplet digital PCR.</a> Anal Chem. 85, 11619-11627 (2013).</li><li>Milbury, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+lower+limits+of+detection+of+digital+PCR+assays+for+cancer-related+gene+mutations.">Determining lower limits of detection of digital PCR assays for cancer-related gene mutations.</a> Biomolecular detection and quantification. 1, 8-22 (2014).</li><li>Zhu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Sensitive+Droplet+Digital+PCR+Method+for+Detection+of+EGFR+Activating+Mutations+in+Plasma+Cell-Free+DNA+from+Patients+with+Advanced+Non-Small+Cell+Lung+Cancer.">Highly Sensitive Droplet Digital PCR Method for Detection of EGFR Activating Mutations in Plasma Cell-Free DNA from Patients with Advanced Non-Small Cell Lung Cancer.</a> The Journal of molecular diagnostics: JMD. , (2015).</li><li>Fan, H., Gulley, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+extraction+from+paraffin-embedded+tissues.">DNA extraction from paraffin-embedded tissues.</a> Methods in molecular medicine. 49, 1-4 (2001).</li><li>Nadauld, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+and+Sensitive+Detection+of+Cancer+Genome+Amplifications+from+Formalin+Fixed+Paraffin+Embedded+Tumors+with+Droplet+Digital+PCR.">Quantitative and Sensitive Detection of Cancer Genome Amplifications from Formalin Fixed Paraffin Embedded Tumors with Droplet Digital PCR.</a> Translational medicine. 2, (2012).</li></ol>

Myung Ryuri Oh, Si Eun Kim ve Young DEUG Kim ABION CRO çalışanlarıdır.

Burada, belirli bir gen mutasyonu değerlendirmesi için FFPE referans standardı hücre çizgisi örneklerinden ddPCR uygulanabilirliğini ve DNA izolasyonu vurgulayın. Bu çalışmada, TPS otomatik DNA izolasyon yöntemi kolayca, otomatik adapte edilebilir kullanılır ve büyük ölçekli deneyler ve alt değişkenliği sağlayan, aynı anda 48 farklı örnekleri kapasitelidir. Mevcut çalışmada DNA izolasyonu sınırlamaları biri her FFPE örnek tektir ve yüzey kirleticiler, mikrobiyal flora birbirlerini deği?...

Kilit düzenleyici genlerde genetik mutasyon birikimi kanseri 1 giden, hücre proliferasyonu, farklılaşması ve hayatta kalma gibi normal hücre programlamayı değiştirir. RAS-RAF-MAP kinaz yolu, büyüme sinyallerine hücresel tepkileri aracılık eder. Onkogenik BRAF mutasyonlar 2 aşırı aktif olma onkoprotein BRAF neden olabilir BRAF genindeki mutasyonlar sürücüsü, kaynaklanabilir. BRAF genindeki mutasyonlar da sırayla, büyüme faktörü aracılığında düzenlenmesinin 4-6 bağımsız aşırı hücre büyümesi ve çoğalmasına neden, MEK ve ERK 3 aracılığıyla aşırı akış aşağı sinyal ile sonuçlanır. Bazı araçlar örneğin ddPCR tarafından formalinle sabitlenmiş, parafine gömülmüş (FFPE) referans standardı hücre hatlarında kantitatif gerçek zamanlı BRAF V600E mutasyonlar gibi DNA mutasyonu profil mevcuttur. ddPCR mutlak ölçümü için bir PCR bazlı yöntemGeleneksel kantitatif gerçek zamanlı PCR (qPCR) 7,8 oranla daha yüksek doğruluk sunar. ddPCR aynı zamanda daha detaylı kanser araştırma ve tanı 9 sağlayan DNA şablonları nadir mutasyonların saptanması için güç ve doğruluk çözme daha içerir. Düşük şablon kopya sayıları 10-12 okuyan zaman geleneksel qPCR üzerinde ddPCR ek avantajları geliştirilmiş hassasiyet ve doğruluk içerir. Burada, otomatik ddPCR tarafından BRAF V600E mutasyonların varlığını veya yokluğunu tespit ederek, ardından FFPE referans standardı hücre çizgileri, DNA ekstre için bir protokol olduğunu göstermiştir. Veri analizi ve sonuçlarının grafik bir gösterimi için yazılım kullanımı da tarif edilmektedir. Tüm işlem nispeten basittir ve tamamen profilli numune sayısı ve mevcut klasik bir PCR ve ddPCR makineleri sayısına bağlıdır. Aşağıdaki protokol BR standart prosedürleri açıklar<html> AF V600E pozitif FFPE referans standardı hücre çizgileri (HD598, HD593, HD617, HD273 ve yabani tipteki (WT)) Doku Hazırlanması System (TPS) protokolü kullanılarak tam otomatik bir cihaz içinde gerçekleştirilir. Ardından, izole edilmiş DNA örnekleri ddPCR sistemi kullanılarak BRAF V600E mutasyonların varlığı için analiz edilir. Tüm örnekler profilli edildikten sonra hedeflenen mutasyon analizi yapılır ve veri veri analiz yazılımı içine yüklendi. Örneklerin sayısına bağlı olarak / grup çalışıldı, veri analizi bir ile birkaç saat gerekebilir. Metodolojinin deneysel bileşeni alınmasında doğruluk gerektirir <a href="http://www.jove.com/science-education/5096/isolating-nucleic-acids-from-yeast" title="Maya nükleik asitlerin izole bir vallahi Fen Bilgisi Öğretmenliği, video RNA bağlamında ilgili daha fazla açıklama">DNA</a> vesayısal hava Pipetler ve Pipet, pipetleme bağlamında ilgili daha fazla açıklayan bir jove Öğrenim Video &quot;&gt; 96 gözlü plakalara pipetleme veri analiz yazılımı kullanılarak yapılır ise.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#160;Hamilton MICROLAB STARlet IVD instrument</td>
			<td>Siemens</td>
			<td>10701001</td>
			<td>Automated DNA isolation instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 Droplet Generator&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>772BR1119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 Droplet Reader</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>771BR1497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conventional PCR machine capable of ramp-time adjustment</td>
			<td></td>
			<td>621BR17718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PX1 PCR plate sealer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>770BR1575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantaSoft software</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA isolation kit&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VERSANT Tissue Preparation Reagents Box 1&#160;</td>
			<td>Siemens</td>
			<td>10632398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VERSANT Tissue Preparation Reagents Box 1&#160;</td>
			<td>Siemens</td>
			<td>10632399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO-RE tips</td>
			<td>Siemens</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR mutation analysis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR Supermix&#160;</td>
			<td>Bio-Rad&#160;</td>
			<td>BR186-3010</td>
			<td>2X concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DG8 cartridge&#160;</td>
			<td>Bio-Rad&#160;</td>
			<td>BR186-4008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet Generator oil</td>
			<td>Bio-Rad&#160;</td>
			<td>BR-186-3005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gasket</td>
			<td>Bio-Rad&#160;</td>
			<td>BR186-3006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet reader oil</td>
			<td>Bio-Rad&#160;</td>
			<td>BR-186-3004</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

employing digital droplet pcr to detect braf v600e mutations in formalin-fixed paraffin-embedded reference standard cell lines

ddPCR is a highly sensitive PCR method that utilizes a water-oil emulsion system. Using a droplet generator, an extracted nucleic acid sample is partitioned into ~20,000 nano-sized, water-in-oil droplets, and PCR amplification occurs in individual droplets. The ddPCR approach is in identifying sequence mutations, copy number alterations, and select structural rearrangements involving targeted genes. Here, we demonstrate the use of ddPCR as a powerful technique for precisely quantitating rare BRAF V600E mutations in FFPE reference standard cell lines, which is helpful in identifying individuals with cancer. In conclusion, ddPCR technique offers the potential to precisely profile the specific rare mutations in different genes in various types of FFPE samples.

Bizim ddPCR analizi için, biz BRAF V600E mutasyonu FFPE referans standardı hücre hatları okudu. Damlacık okuyucu dizüstü bilgisayar çalıştıran veri analiz yazılımı bağlanır. Her bir damlacık pozitif ya da negatif olarak flüoresan genlik bazında tanımlanır. Üretici tarafından sağlanan yazılım da kullanıcı tanımlı kesim pozitif ve negatif damlacıklar arasındaki eşiği tanımlamak için girilmesine izin verir. Bir numune, pozitif ve negatif damlacık sayısıdır kopya / ul açıs?...

Watch this Scientific Journal Video about Employing Digital Droplet PCR to Detect BRAF V600E Mutations in Formalin-fixed Paraffin-embedded Reference Standard Cell Lines at JoVE.com

Employing Digital Droplet PCR to Detect BRAF V600E Mutations in Formalin-fixed Paraffin-embedded Reference Standard Cell Lines

Bu videonun amacı klinik ortamda nadir mutasyonları tespit etmek formalin ile fikse parafine gömülü (FFPE) referans standart hücre hatları ve dijital damlacık PCR (ddPCR) analizden otomatik DNA ekstraksiyon gerçekleştirmek için nasıl göstermektir. FFPE örneklerde mutasyonları tespit edilmesi FFPE örneklerinde ddPCR klinik faydasını ortaya koyar.

Dijital Damlacık PCR Formalin sabit Parafin gömülü Referans Standart Hücre Hatlarında BRAF V600E mutasyonları tespit etmek istihdam

ddPCR is a highly sensitive PCR method that utilizes a water-oil emulsion system. Using a droplet generator, an extracted nucleic acid sample is ...

employing-digital-droplet-pcr-to-detect-braf-v600e-mutations-formalin

Research

JoVE Journal

Biology

13.1K Görüntüleme.  Seoul National University.  Bu videonun amacı klinik ortamda nadir mutasyonları tespit etmek formalin ile fikse parafine gömülü (FFPE) referans standart hücre hatları ve dijital damlacık PCR (ddPCR) analizden otomatik DNA ekstraksiyon gerçekleştirmek için nasıl göstermektir. FFPE örneklerde mutasyonları tespit edilmesi FFPE örneklerinde ddPCR klinik faydasını ortaya koyar. 

Video: Employing Digital Droplet PCR to Detect BRAF V600E Mutations in Formalin-fixed Paraffin-embedded Reference Standard Cell Lines

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

Parafin ve Dondurulmuş Bölüm Drosophila Yetişkin Kaslar

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

Biyoloji

DNA Extraction from Paraffin Embedded Material for Genetic and Epigenetic Analyses

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number gains and losses and DNA methylation. Advances in high-throughput, genome-wide profiling technologies, such as microarrays, have significantly improved our ability to identify and detect these specific alterations. However as technology continues to improve, a limiting factor remains sample quality and availability. Furthermore, follow-up clinical information and disease outcome are often collected years after the initial specimen collection. Specimens, typically formalin-fixed and paraffin embedded (FFPE), are stored in hospital archives for years to decades. DNA can be efficiently and effectively recovered from paraffin-embedded specimens if the appropriate method of extraction is applied. High quality DNA extracted from properly preserved and stored specimens can support quantitative assays for comparisons of normal and diseased tissues and generation of genetic and epigenetic signatures 1. To extract DNA from paraffin-embedded samples, tissue cores or microdissected tissue are subjected to xylene treatment, which dissolves the paraffin from the tissue, and then rehydrated using a series of ethanol washes. Proteins and harmful enzymes such as nucleases are subsequently digested by proteinase K. The addition of lysis buffer, which contains denaturing agents such as sodium dodecyl sulfate (SDS), facilitates digestion 2. Nucleic acids are purified from the tissue lysate using buffer-saturated phenol and high speed centrifugation which generates a biphasic solution. DNA and RNA remain in the upper aqueous phase, while proteins, lipids and polysaccharides are sequestered in the inter- and organic-phases respectively. Retention of the aqueous phase and repeated phenol extractions generates a clean sample. Following phenol extractions, RNase A is added to eliminate contaminating RNA. Additional phenol extractions following incubation with RNase A are used to remove any remaining enzyme. The addition of sodium acetate and isopropanol precipitates DNA, and high speed centrifugation is used to pellet the DNA and facilitate isopropanol removal. Excess salts carried over from precipitation can interfere with subsequent enzymatic assays, but can be removed from the DNA by washing with 70% ethanol, followed by centrifugation to re-pellet the DNA 3. DNA is re-suspended in distilled water or the buffer of choice, quantified and stored at -20&deg;C. Purified DNA can subsequently be used in downstream applications which include, but are not limited to, PCR, array comparative genomic hybridization 4 (array CGH), methylated DNA Immunoprecipitation (MeDIP) and sequencing, allowing for an integrative analysis of tissue/tumor samples.

This video demonstrates the protocol for DNA extraction from formalin-fixed paraffin-embedded material. This is a multi-day procedure in which tissue sections are deparaffinized with xylene, rehydrated with ethanol and treated with proteinase K to purify and isolate DNA for subsequent gene-specific or genome-wide analysis.

Genetik ve epigenetik Analizleri Parafin Gömülü Malzeme DNA Ekstraksiyon

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number ...

Proteomic Sample Preparation from Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissue

Preserved clinical material is a unique source for proteomic investigation of human disorders. Here we describe an optimized protocol allowing large scale quantitative analysis of formalin fixed and paraffin embedded (FFPE) tissue. The procedure comprises four distinct steps. The first one is the preparation of sections from the FFPE material and microdissection of cells of interest. In the second step the isolated cells are lysed and processed using 'filter aided sample preparation' (FASP) technique. In this step, proteins are depleted from reagents used for the sample lysis and are digested in two-steps using endoproteinase LysC and trypsin. 
After each digestion, the peptides are collected in separate fractions and their content is determined using a highly sensitive fluorescence measurement. Finally, the peptides are fractionated on 'pipette-tip' microcolumns. The LysC-peptides are separated into 4 fractions whereas the tryptic peptides are separated into 2 fractions. In this way prepared samples allow analysis of proteomes from minute amounts of material to a depth of 10,000 proteins. Thus, the described workflow is a powerful technique for studying diseases in a system-wide-fashion as well as for identification of potential biomarkers and drug targets.

Archival formalin fixed and paraffin embedded (FFPE) clinical samples are valuable material for investigation of diseases. Here we demonstrate a sample preparation workflow allowing in-depth proteomic analysis of microdissected FFPE tissue.

Formalin gelen Proteomic Numune Hazırlama parafin blok doku Sabit ve

Preserved clinical material is a unique source for proteomic investigation of human disorders. Here we describe an optimized protocol allowing large scale ...

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

In this article we describe a method for colorimetric detection of miRNA in the kidney through in situ hybridization with digoxigenin tagged microRNA probes. This protocol, originally developed by Kloosterman and colleagues for broad use with Exiqon miRNA probes1, has been modified to overcome challenges inherent in miRNA analysis in kidney tissues. These include issues such as structure identification and hard to remove residual probe and antibody. Use of relatively thin, 5 mm thick, tissue sections allowed for clear visualization of kidney structures, while a strong probe signal was retained in cells. Additionally, probe concentration and incubation conditions were optimized to facilitate visualization of microRNA expression with low background and nonspecific signal. Here, the optimized protocol is described, covering the initial tissue collection and preparation through the mounting of slides at the end of the procedure. The basic components of this protocol can be altered for application to other tissues and cell culture models.

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

This article describes an in situ hybridization protocol optimized for colormetric detection of microRNA expression in formalin fixed kidney sections.

MicroRNA<em&gt; In situ</em&gt; Formalin Sabit Böbrek Dokular Hibridizasyon

In this article we describe a method for colorimetric detection of miRNA in the kidney through in situ hybridization with digoxigenin tagged microRNA ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different lineages. A single cell transcriptome assay can be a new approach for dissecting individual variation. We have developed the single cell qRT-PCR method, and confirmed that this method works well in several gene expression profiles. In single cell level, each human embryonic stem cell, sorted by OCT4::EGFP positive cells, has high expression in OCT4, but a different level of NANOG expression. Our single cell gene expression assay should be useful to interrogate population heterogeneities.

Single cell gene expression assay is needed for understanding stem cell heterogeneities.

Kantitatif RT-PCR ile Bireysel İnsan Embriyonik Kök Hücreleri profilleme

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

qPCR Is a Sensitive and Rapid Method for Detection of Cytomegaloviral DNA in Formalin-fixed, Paraffin-embedded Biopsy Tissue

It is crucial to identify cytomegalovirus (CMV) infection in the gastrointestinal (GI) tract of immunosuppressed patients, given their greater risk for developing severe infection. Many laboratory methods for the detection of CMV infection have been developed, including serology, viral culture, and molecular methods. Often, these methods reflect systemic involvement with CMV and do not specifically identify local tissue involvement. Therefore, detection of CMV infection in the GI tract is frequently done by traditional histology of biopsy tissue. Hematoxylin and eosin (H&#38;E) staining in conjunction with immunohistochemistry (IHC) have remained the mainstays of examining these biopsies. H&#38;E and IHC sometimes result in atypical (equivocal) staining patterns, making interpretation difficult. It was shown that quantitative polymerase chain reaction (qPCR) for CMV can successfully be performed on formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) biopsy tissue for very high sensitivity and specificity. The goal of this protocol is to demonstrate how to perform qPCR testing for the detection of CMV in FFPE biopsy tissue in a clinical laboratory setting. This method is likely to be of great benefit for patients in cases of equivocal staining for CMV in GI biopsies.

This protocol describes qPCR detection of cytomegalovirus in formalin-fixed, paraffin-embedded biopsy tissue, which is rapid, sensitive, specific, and useful for interpreting equivocal hematoxylin and eosin or immunohistochemical staining patterns.

QPCR Formalinle sabit, Parafin-gömülü Biyopsi Doku sitomegaloviral DNA tespiti için bir Hassas ve Hızlı Yöntem mi

It is crucial to identify cytomegalovirus (CMV) infection in the gastrointestinal (GI) tract of immunosuppressed patients, given their greater risk for ...

Preparation of Formalin-fixed Paraffin-embedded Tissue Cores for both RNA and DNA Extraction

Formalin-fixed paraffin embedded tissue (FFPET) represents a valuable, well-annotated substrate for molecular investigations. The utility of FFPET in molecular analysis is complicated both by heterogeneous tissue composition and low yields when extracting nucleic acids. A literature search revealed a paucity of protocols addressing these issues, and none that showed a validated method for simultaneous extraction of RNA and DNA from regions of interest in FFPET. This method addresses both issues. Tissue specificity was achieved by mapping cancer areas of interest on microscope slides and transferring annotations onto FFPET blocks. Tissue cores were harvested from areas of interest using 0.6 mm microarray punches. Nucleic acid extraction was performed using a commercial FFPET extraction system, with modifications to homogenization, deparaffinization, and Proteinase K digestion steps to improve tissue digestion and increase nucleic acid yields. The modified protocol yields sufficient quantity and quality of nucleic acids for use in a number of downstream analyses, including a multi-analyte gene expression platform, as well as reverse transcriptase coupled real time PCR analysis of mRNA expression, and methylation-specific PCR (MSP) analysis of DNA methylation.

This modified extraction protocol improves RNA and DNA yields from more precisely targeted regions of interest in histopathologic tissue blocks.

RNA ve DNA Ekstraksiyon hem Formalin sabit Parafin gömülü Doku Çekirdek hazırlanması

Formalin-fixed paraffin embedded tissue (FFPET) represents a valuable, well-annotated substrate for molecular investigations. The utility of FFPET in ...

Magnetic-Activated Cell Sorting Strategies to Isolate and Purify Synovial Fluid-Derived Mesenchymal Stem Cells from a Rabbit Model

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for cartilage tissue engineering. MSCs from synovial fluid (SF-MSCs) have been considered promising candidates for articular regeneration, and their potential therapeutic benefit has made them an important research topic of late. SF-MSCs from the knee cavity of the New Zealand white rabbit can be employed as an optimized translational model to assess human regenerative medicine. By means of CD90-based magnetic activated cell sorting (MACS) technologies, this protocol successfully obtains rabbit SF-MSCs (rbSF-MSCs) from this rabbit model and further fully demonstrates the MSC phenotype of these cells by inducing them to differentiate to osteoblasts, adipocytes, and chondrocytes. Therefore, this approach can be applied in cell biology research and tissue engineering using simple equipment and procedures.

This article presents a simple and economic protocol for the straightforward isolation and purification of mesenchymal stem cells from New Zealand white rabbit synovial fluid.

Manyetik aktif hücre stratejileri yalıtmak ve Sinovyal sıvı elde edilen mezenkimal kök hücre bir tavşan modelinden arındırmak için sıralama

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for ...

Quantitative Immunoblotting of Cell Lines as a Standard to Validate Immunofluorescence for Quantifying Biomarker Proteins in Routine Tissue Samples

Quantification of proteins of interest in formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue samples is important in clinical and research applications. An optimal method of quantification is accurate, has a broad linear dynamic range and maintains the structural integrity of the sample to allow for identification of individual cell types. Current methods such as immunohistochemistry (IHC), mass spectrometry, and immunoblotting each fail to meet these stipulations due to their categorical nature or need to homogenize the sample. As an alternative method, we propose the use of immunofluorescence (IF) and image analysis to determine the relative abundance of a protein of interest in FFPE tissues. Herein we demonstrate that this method is easily optimized, yields a wide dynamic range, and is linearly quantifiable as compared to the gold standard of quantitative immunoblotting. Furthermore, this method permits the maintenance of the structural integrity of the sample and allows for the distinction of various cell types, which may be crucial in diagnostic applications. Overall, this is a robust method for the relative quantification of proteins in FFPE samples and can be easily adapted to suit clinical or research needs.

We describe the use of quantitative immunoblotting to validate immunofluorescence histology coupled with image analysis as a means of quantifying a protein of interest in formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue samples. Our results demonstrate the utility of immunofluorescence histology for ascertaining the relative quantity of biomarker proteins in routine biopsy samples.

Hücre hatları nicel Immunoblotting ayirt rutin doku örneklerinde biyomarker protein miktarının için doğrulamak için standart olarak

Quantification of proteins of interest in formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue samples is important in clinical and research applications. An ...

Two-Step Reverse Transcription Droplet Digital PCR Protocols for SARS-CoV-2 Detection and Quantification

Diagnosis of the ongoing SARS-CoV-2 pandemic is a priority for all countries across the globe. Currently, reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) is the gold standard for SARS-CoV-2 diagnosis as no permanent solution is available. However effective this technique may be, research has emerged showing its limitations in detection and diagnosis especially when it comes to low abundant targets. In contrast, droplet digital PCR (ddPCR), a recent emerging technology with superior advantages over qPCR, has been shown to overcome the challenges of RT-qPCR in diagnosis of SARS-CoV-2 from low abundant target samples. Prospectively, in this article, the capabilities of RT-ddPCR are further expanded by showing steps on how to develop simplex, duplex, triplex probe mix, and quadruplex assays using a two-color detection system. Using primers and probes targeting specific sites of the SARS-CoV-2 genome (N, ORF1ab, RPP30, and RBD2), the development of these assays is shown to be possible. Additionally, step by step detailed protocols, notes, and suggestions on how to improve the assays workflow and analyze data are provided. Adapting this workflow in future works will ensure that the maximum number of targets can be sensitively detected in a small sample significantly improving on cost and sample throughput.

This work summarizes steps on developing different assays for SARS-CoV-2 detection using a two color ddPCR system. The steps are elaborate and notes have been included on how to improve the assays and experiment performance. These assays may be used for multiple SARS-CoV-2 RT-ddPCR applications.

SARS-CoV-2 Tespiti ve Ölçümü için İki Adımlı Ters Transkripsiyon Damlacığı Dijital PCR Protokolleri

Diagnosis of the ongoing SARS-CoV-2 pandemic is a priority for all countries across the globe. Currently, reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) ...