Hücre izolasyonu sonra tüm protokol, yaklaşık olarak 2 saat sürer. 1.. Mikrocerrahi Hazırlık <ol><li> 9,12 hücreler, hayvan işlem gerçekleştirilir süre boyunca dinlenmeye bırakın standart protokollere göre vericinin kemik iliği ve izole edilmiş alt populasyonun floresan etiketleme kök hücre izolasyon yapın. Floresan etiketleme için biz CFDA (Carboxyfluorescein diasetate succinimidyl ester) öneririz. </li><li> Ketamin (75 mg / kg) ve ksilazin (2.5 mg / kg) ile, 20-25 g ağırlığında, erkek fare anestezisi. (Genellikle her 30-60 dk) gerektiği gibi cerrahi işlemler ve deneysel protokolleri boyunca, anestezi takviyeleri (ilk enjeksiyon% 10, ip) muhafaza edilmelidir. </li><li> Yavaşça sağ skrotum ön yönü yanı sıra sağ uyluk ve kasık tıraş. Tüm nemlendirilmiş pamuklu çubukla saç kaybetmek toplayın. Pleksiglas görüntüleme sahnede fare ventral yüzü yukarı yerleştirin ve ücretini saptamakelastik örtü kullanarak t. Sahne bacak ve skrotum hem yüksekliği için taban plakasının kaudal kenarında bir taban plakası ve bir ikinci levha içeren, özel yapılır. 37 ° C de vücut ısısını korumak için bir ısıtma pedi üzerine yerleştirin sahne Sahnede tespit sonra, operasyon mikroskobu altında hayvan koyun ve 10 kullanılarak aşağıdaki işlem adımları gerçekleştirin - 16 kat büyütme. </li><li> Kasık kadar sağ uyluk, diz femoral damarların sadece anterior cilt makas kullanarak ilk kesi olun. </li><li> Femoral arter tespit ve yumuşak doku çevreleyen arter seferber, proksimale izleyin. Belirlemek ve thermocautery kullanarak sol testis büyük bir dalı kesti. Bundan sonra sol testiste yüzeysel bir konaklama dikiş yerleştirin. Nazik çekiş femoral arter daha yakın seferber kolaylaştıracaktır. </li><li> Proksimal harekete tamamlanmasından sonra, tespit etmek ve büyük bir dal çalışan kesme MEDIALLthermocautery tarafından uyluk y. Bundan sonra sağ uyluk distal kısmında femoral arteri bağlayın. Bağı nazik traksiyon daha hazırlanmasına yardımcı olacaktır. </li><li> Yine proksimal femoral arter şimdi dikkat ters çevirin ve proksimale mümkün arter çevresinde bir dikiş yerleştirin. Bir düğüm hazırlayın ancak henüz aşağı kravat yok. Sütür hafifçe çekin ve bir arteriyel dolaştırmaktan oluşturun. </li><li> Dolaştırmaktan kurduktan sonra, arter dikkatli bir microscissor kullanıyor deşmek. Femoral ven zarar vermemek için özel dikkat gösterin. </li><li> Insizyon ile hazırlanmış bir mikrokateter (iç çapı 0.28 mm) takın. Kateter (% 0.9 sodyum klorür, NaCl) deaired ve 1 ml&#39;lik bir şırınga, sokulmadan önce bağlanmalıdır. </li><li> Kateterin başarılı yerleştirilmesinden sonra, dikkatli bir şekilde, kateterin geçişini kolaylaştırmak için bir dolaşması gevşetin. Arteryal kan akımı, kateter içinde hemen görünür olmalıdır. Kateter yavaşça birkaç milimetre ilerlemekönceki dolanma ötemde. Bundan sonra, kateter tespiti için hazırlanan ligatürün aşağı kravat. </li><li> Yavaşça doğru konumunu onaylamak için kateter (% 0.9 NaCl) ve aspire yıkayın. Bundan başka, işlem aşamasına kateteri sağlamak için bir parça bant kullanın. </li><li> Yeterli Tespit edildikten sonra, Cremaster&#39;ın kas aşağıdaki adımları hazırlanması için bir kenara kateter koydu. Pıhtı oluşumunu önlemek için normal yıkama ve kateter, her 5-10 dk aspirasyonunun uygulanır. </li><li> Sağ testis şimdi dikkat açın ve sağ skrotum ventral yukarıda cilt ve fasya kesim tarafından bir kesi yapmak. Herhangi aletleri ile altta yatan doku dokunmamaya özen gösterin. </li><li> Kadar inguinal kat ve kaudal skrotum uzak ucuna kesi uzatın. </li><li> Dokunmadan Cremaster&#39;ın çuvalın üzerinde dikkatle ayrı yatan yumuşak ve bağ dokusu. Cremaster&#39;ın uzak ucunu belirlemek ve sl burada bir konaklama sütür koyunightly kas uzanır. Yavaşça kaudal ve öne kas çekerek kas çuval altında artık kalan yumuşak doku rezeke. </li><li> Bağ dokusundan tam ayrılmasından sonra, makas kullanılarak kraniyal kenarında bir noktada Cremaster&#39;ın çuval açın. Kas uzak ucuna bu açıklıktan aşağı kesi uzatın. </li><li> Sonra makas kullanarak kas ve testis arasında kalan bağlantıları kesilmiş, thermocautery kullanarak testisi ve Cremaster&#39;ın bağlayan küçük bir gemi Seal. </li><li> Mikroskop alanının dışında, testis kenara koymak. </li><li> Açıldı Cremaster&#39;ın artık sahnede düz bırakır. Cremaster&#39;ın kas dokusu yaymak amacıyla doku kenarlarında dört 6-0 Prolene kalmak sütür koyun ve elastik örtü ile onları düzeltmek. Şu andan itibaren sürekli bir 1 ml şırınga (Şekil 1) kullanılarak, fosfat tamponlu tuz (PBS) ile doku ıslatın. </li><li> Artık, 15 dakika boyunca geri kalanı için hazırlık izin verin. Bundan sonra enjekteMikro damarların kontrast için sol femoral arter yoluyla,% 1 Rodamin-dekstran 0.05-0.1 ml. Herhangi bir kemokin veya inflamatuvar ajanlar uygulaması için planlanan ise, şimdi topikal 1 ml şırınga kullanarak ilgili reaktif ile kas nemlendirin gerekir. Bir kontrol deneyi durumunda, PBS ile nemlendirme devam etmektedir. </li></ol> 2. İntra vital mikroskopik <ol><li> Işletme aşamasında sabit fare tutmak ve epi-aydınlatma için modifiye edilmiş ve bir CCD (şarj bağlı cihaz) video kamera bağlanmış bir floresan mikroskop altında hareket. Femoral arter kateteri yerinden değil özel özen gösterin. </li><li> Bir suya daldırma objektif kullanarak deneyler. </li><li> Cremaster&#39;ın mikrodolaşımında yeterli görselleştirme ve hücre enjeksiyonu öncesi hedefi ayarladıktan sonra, davranışsal firma kök hücre bağlılık daha sonra analiz için altı postkapiller venüllerinde tanımlar. </li><li> Floresan etiketli kök hücreleri yönetmek,Femoral arter kateteri kullanılarak beş ardışık enjeksiyonları toplam bir 1 ml şırınga ile, enjeksiyon başına 0.4 x 10 6 hücre, 200 ul PBS içinde çözülmüştür. Dikkatle önce ilk enjeksiyondan hücre örneği sallayın. </li><li> Record kök hücre böylece tipik bir hücresel birlikte endotel hücre astar boyunca bir hız daha fazla% 50 azalma olarak &quot;pano&quot; tanımlayan hücre enjeksiyonundan hemen sonra haddeleme &quot;çubuğu ve serbest&quot; hareketleri. Haddeleme kök hücre sayma ve her enjeksiyonunu takiben gözlem 1 dakika boyunca önceden tanımlanmış bir venüler mesafeyi geçen tüm kök hücreleri gerçekleştirin. Kök hücre haddeleme miktarı her geçen hücrelerin yüzdesi olarak ifade edilir. Haddeleme hücreleri gibi rasgele kısa bağlama olayları sergileyen hücreler sayılmaz. </li><li> Son hücre enjeksiyon sayılması ile sıkıca yapışık kök hücre sayısını belirlemek ve th hesaplanan endotel yüzeyine göre miktarı ifade izlenerekE önceden tanımlanmış altı venüller (çap x uzunluk x π) yapışık hücre / mm 2 olarak. Hiçbir hücre hareketi, 30 saniye için tespit olduğunda Firma yapışma olarak kabul edilir. </li><li> Intravital mikroskopi tamamlanmasından sonra dikkatlice Cremaster&#39;ın kas kaldırmak ve daha sonra analiz (immünhistokimya veya moleküler biyoloji) yazışmanın içinde saklayın. Servikal dislokasyon ile hayvan kurban. Kök hücre haddeleme ve sağlam endotel yapışma, yanı sıra kırmızı kan hücresi hızı (mm / sn), damar uzunluğu (um), damar çapı (mikron), duvar payı oranı olarak mikrovasküler hemodinami, ölçümü için intravital mikroskopi kayıtların analizi (sn -1); bir görüntü işleme yazılımı kullanan ilgili deneysel doku tedavisi bilmeyen bir araştırmacı tarafından çevrimdışı yapılmalıdır. </li></ol>

<ol>
	<li>Madlambayan, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=marrow+stem+and+progenitor+cell+contribution+to+neovasculogenesis+is+dependent+on+model+system+with+SDF-1+as+a+permissive+trigger.">marrow stem and progenitor cell contribution to neovasculogenesis is dependent on model system with SDF-1 as a permissive trigger.</a> Blood. 114, 4310-4319 (2009).</li><li>Lapidot, T., Dar, A., Kollet, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+do+stem+cells+find+their+way+home?.">How do stem cells find their way home?.</a> Blood. 106, 1901-1910 (2005).</li><li>Lehr, H. A., Vollmar, B., Vajkoczy, P., Menger, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+fluorescence+microscopy+for+the+study+of+leukocyte+interaction+with+platelets+and+endothelial+cells.">Intravital fluorescence microscopy for the study of leukocyte interaction with platelets and endothelial cells.</a> Methods Enzymol. 300, 462-481 (1999).</li><li>Gavins, F. N., Chatterjee, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+for+the+study+of+mouse+microcirculation+in+anti-inflammatory+drug+research:+focus+on+the+mesentery+and+cremaster+preparations.">Intravital microscopy for the study of mouse microcirculation in anti-inflammatory drug research: focus on the mesentery and cremaster preparations.</a> J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 49, 1-14 (2004).</li><li>Leister, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+peritoneal+cavity+chamber+for+intravital+microscopy+of+the+liver+under+conditions+of+pneumoperitoneum.">A peritoneal cavity chamber for intravital microscopy of the liver under conditions of pneumoperitoneum.</a> Surg. Endosc. 17, 939-942 (2003).</li><li>Sriramarao, P., Anderson, W., Wolitzky, B. A., Broide, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+bone+marrow-derived+mast+cells+roll+on+P-selectin+under+conditions+of+flow+in+vivo.">Mouse bone marrow-derived mast cells roll on P-selectin under conditions of flow in vivo.</a> Lab Invest. 74, 634-643 (1996).</li><li>Baez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+open+cremaster+muscle+preparation+for+the+study+of+blood+vessels+by+in+vivo+microscopy.">An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy.</a> Microvasc. Res. 5, 384-394 (1973).</li><li>Bagher, P., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+cremaster+muscle+preparation+for+intravital+imaging+of+the+microcirculation.">The mouse cremaster muscle preparation for intravital imaging of the microcirculation.</a> J. Vis. Exp. , e2874 (2011).</li><li>Kaminski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+NOS+is+required+for+SDF-1alpha/CXCR4-mediated+peripheral+endothelial+adhesion+of+c-kit++bone+marrow+stem+cells.">Endothelial NOS is required for SDF-1alpha/CXCR4-mediated peripheral endothelial adhesion of c-kit+ bone marrow stem cells.</a> Lab Invest. 88, 58-69 (2008).</li><li>Furlani, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HMGB-1+induces+c-kit++cell+microvascular+rolling+and+adhesion+via+both+toll-like+receptor-2+and+toll-like+receptor-4+of+endothelial+cells.">HMGB-1 induces c-kit+ cell microvascular rolling and adhesion via both toll-like receptor-2 and toll-like receptor-4 of endothelial cells.</a> J. Cell Mol. Med. 16, 1094-1105 (2012).</li><li>Furlani, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+the+intravascular+administration+of+mesenchymal+stem+cells+safe?+Mesenchymal+stem+cells+and+intravital+microscopy.">Is the intravascular administration of mesenchymal stem cells safe? Mesenchymal stem cells and intravital microscopy.</a> Microvasc. Res. 77, 370-376 (2009).</li><li>Donndorf, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysing+migratory+properties+of+human+CD+133(+)+stem+cells+in+vivo+after+intraoperative+sternal+bone+marrow+isolation.">Analysing migratory properties of human CD 133(+) stem cells in vivo after intraoperative sternal bone marrow isolation.</a> Cell Transplant. , (2012).</li></ol>

Bu yazının için yapılan tüm hayvan deneyleri, yerel hayvan bakımı ve kullanımı komitesi tarafından onaylanmıştır. Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.

<html> Intravital floresan mikroskopi doğrudan görselleştirme ve kök hücre-endotel etkileşimleri kantitatif analiz için izin verir. Mikrocerrahi teknikleri maruz kalma ve intravital görselleştirme de lökosit-endotel etkileşimleri ve çeşitli kimyasal bileşenlerin üzerinde yapılan araştırmalar sırasında seçici olarak basit bir teknik ile süperfüzyon hedef dokuya uygulanabilir kurulmuştur yana Cremaster&#39;ın kas modeli, özellikle yararlıdır. Nedeniyle hareket artefaktları ve ağır görüntü ...

Bu makalenin amacı, periferik kemik iliği kök hücre göçü doğrudan gözlem ve analiz için fare Cremaster&#39;ın mikrosirkülasyonda uygulanan intravital mikroskopi tekniği (IVM) tanımlamaktır. Kök hücre mevcut kavram tabanlı doku ve organ yenilenmesi yaralı dokuya 1 kemik iliği kaynaklı kök hücrelerin homing içerir. Başarılı bir kök hücre göçü için önemli bir adım transendotelyal göç ve sonunda organı engraftment 2 tarafından takip yaralanan organ içinde yerel endotel ile hücre etkileşimini kök içermektedir. Bu kök hücre Intravital analizi - endotel hücre etkileşimleri in vivo olarak farklı patofizyolojik ortamlarda bir kök hücre tabanlı rejeneratif tepkisinin ölçümü için ideal bir parametre oluşturur. Bundan başka, bu akla görünüyor ki, gelecekte belirli kök hücre p göç kapasitesinin intravital analizistandardize mikrosirkülatuar ortamlarında opulations, önce başka klinik testler için bu popülasyonları ilerleyen uygulanan olabilir. İntra vital mikroskopik ilk olarak enflamatuar araştırma 3 alanında, in vivo olarak lökosit-endoteliyal hücre etkileşiminin gözlenmesi ve ölçümü için geliştirilmiştir. Intravital mikroskopi çalışmaların ilk başarılı kayıtları bir ışık mikroskobu altında 4 kurbağaların dilleri ve mesentere okuyan, 19. yüzyılda zaten Cohnheim tarafından bildirilmiştir. Ilk kullanım IVM büyük bir teknik gelişme ve bugün uğramıştır yana bazı temel bileşenleri kantitatif IVM gerçekleştirmek için, ön koşullar meydana getirir: (i) ya da doku, optik erişim izni preparasyonlar, (ii) bir mikroskop ile tespit edilebilir, moleküler problar, (iii ) bir algılama sistemi ve görüntü verilerinden ilgi parametreleri özü (iv) bilgisayar destekli analiz sistemlerine bağlı bir mikroskop4. set. Doku preparatlarının çeşitli mesentere ve fare ve sıçan 5, 6 ve fare, hamster, tavşan kulak ve birkaç isim Hamster yanak kese dorsal Deri kıvrım odalarının karaciğer de dahil olmak üzere IVM çalışmalar için getirilmiştir. Ancak, hazırlık ve görselleştirme iyi standardize cerrahi işlemin mümkün olduğu kadar aşağıda biz intravital gözlemleri için ideal doku temsil fare Cremaster&#39;ın kas, üzerinde durulacak, ve genel olarak hareket eserler hiçbir sorunlar oluşur. Açık Cremaster&#39;ın kas hazırlık Baez tarafından 1970&#39;li yıllarda ilk kez gerçekleştirilen ve arkadaşları 7. oldu. Başlangıçta tarif edilen fareler için, bu fare 8 de başarılı bir şekilde kabul edilmiştir. Önceki çalışmalarda ağırlıklı olarak damar duvarı ile lökosit etkileşimlerine odaklanmış ettikten sonra, kendi grubu son bir değerleme olarak fare Cremaster&#39;ın kas hazırlık tanıttıdoğrudan görselleştirme ve tanımlanmış bir mikro 9 içindeki kök hücre-endotel etkileşimleri kantitatif analiz için ble aracı. Çeşitli kök hücresi alt-popülasyonları murin c-kit + kemik iliği kök hücre ve mezenkimal kök hücreleri, hem de insan CD 133 + kemik iliği kök hücreleri, 10-12 de dahil olmak üzere, bu model kullanılarak incelenmiştir. Vericinin kemik iliği ve görselleştirme için floresan etiketleme hücre izolasyonu takiben, kök hücreler selektif bir şekilde uzak organlardaki içinde herhangi bir cep tutulmasının önüne, femoral arter yoluyla arteriyel enjeksiyonu kullanan Cremaster&#39;ın mikrosirkülasyondaki içine uygulanır. Potansiyel olarak ilgili ayarları içinde yerel kök hücre göçü aracılık çeşitli kemokinler, topikal basit süperfüzyon tekniği ile hedef dokuya uygulanabilir Bundan başka, Cremaster&#39;ın kas modeli özellikle yararlıdır.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carboxy-fluorescein diacetate succinimidylester (CFDA)</td>
			<td>Invitrogen, Carlsbad, CA, USA</td>
			<td>C1157</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine 6 G (1%)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Munich, Germany</td>
			<td>83697</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamin (Ketanest)</td>
			<td>Pfizer, Berlin, Germany</td>
			<td>not available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylacin (Rompun)</td>
			<td>Bayer, Leverkusen, Germany</td>
			<td>not available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate - buffered saline (PBS)</td>
			<td>PAN Biotech, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P04-36500</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intravital microscopy of the microcirculation in the mouse cremaster muscle for the analysis of peripheral stem cell migration

Rejeneratif hücre tedavisinin bağlamında intravasküler hücre uygulama protokolleri çağında, doku nonmarrow için kök hücre göçünün altında yatan mekanizmaları tamamen açıklığa olmamıştır. Burada in vivo çevresel kemik iliği kök hücre göçü analizi için fare Cremaster&#39;ın mikro uygulanan intravital mikroskobu tekniğini tarif eder. M. Cremaster&#39;ın Intravital mikroskopi önceden vasküler endotel ile lökosit etkileşiminin doğrudan gözlem için inflamatuar araştırma alanında girmiştir. Yeterli periferik kök ve progenitör hücre göçü bu endotel ile intravasculary uygulanan kök hücre etkileşim gözlem ve ölçümü için M. Cremaster&#39;ın modeli uygulamak için düşünülebilir astar endotel yanlarında ve sağlam yapışma haddeleme benzer ilk adımları içerdiğinden. Çeşitli kimyasal bileşenlerin seçici olarak hedef t uygulanabilir gibiBasit süperfüzyon teknikleri ile sorun, bu kemik iliği dışında yaşayan organizmada gerçekleşecek ilk kök hücre toplanması için, gerekli microenvironmental önkoşullar kurmak mümkündür.

Genel olarak, doğrudan bir etkileşim Cremaster&#39;ın kas mikro dolaşımı içinde vasküler endotelyum ile kök veya projenitör hücreleri enjekte edilen bir nadir bir olaydır ve kılcal damarlar (çap: 30-80 um) içinde özel olarak ortaya çıkar. Dolayı floresan etiketleme haddeleme ve sıkıca yapışık kök hücreleri net bir şekilde (Şekil 2) gözlenen venüllerde lökosit endojen dolaşan ayrılmasında belirlenebilir. Kan akım hızı ve duvar kayma hızı...

Watch this Scientific Journal Video about Intravital Microscopy of the Microcirculation in the Mouse Cremaster Muscle for the Analysis of Peripheral Stem Cell Migration at JoVE.com

Intravital Microscopy of the Microcirculation in the Mouse Cremaster Muscle for the Analysis of Peripheral Stem Cell Migration

Fare M. Cremaster&#39;ın mikro intravital mikroskopi eşsiz ve çevresel kemik iliği kök hücre göçü analizi için in vivo model yanı sıra standart sunmaktadır.

Periferik Kök Hücre Göç Analizi Fare Cremaster Muscle Mikrosirkülasyon Intravital Mikroskopi

In the era of intravascular cell application protocols in the context of regenerative cell therapy, the underlying mechanisms of stem cell migration to ...

intravital-microscopy-microcirculation-mouse-cremaster-muscle-for

Research

JoVE Journal

Biology

15.1K Görüntüleme.  University Rostock.  Fare M. Cremaster'ın mikro intravital mikroskopi eşsiz ve çevresel kemik iliği kök hücre göçü analizi için in vivo model yanı sıra standart sunmaktadır. 

Video: Intravital Microscopy of the Microcirculation in the Mouse Cremaster Muscle for the Analysis of Peripheral Stem Cell Migration

The Mouse Cremaster Muscle Preparation for Intravital Imaging of the Microcirculation

Throughout the body, the maintenance of homeostasis requires the constant supply of oxygen and nutrients concomitant with removal of metabolic by-products. This balance is achieved by the movement of blood through the microcirculation, which encompasses the smallest branches of the vascular supply throughout all tissues and organs. Arterioles branch from arteries to form networks that control the distribution and magnitude of oxygenated blood flowing into the multitude of capillaries intimately associated with parenchymal cells. Capillaries provide a large surface area for diffusional exchange between tissue cells and the blood supply. Venules collect capillary effluent and converge as they return deoxygenated blood towards the heart. To observe these processes in real time requires an experimental approach for visualizing and manipulating the living microcirculation.
The cremaster muscle of rats was first used as a model for studying inflammation using histology and electron microscopy post mortem1,2. 
The first in vivo report of the exposed intact rat cremaster muscle investigated microvascular responses to vasoactive drugs using reflected light3. However 
curvature of the muscle and lack of focused illumination limited the usefulness of this preparation. The major breakthrough entailed opening the muscle, 
detaching it from the testicle and spreading it radially as a flat sheet for transillumination under a compound microscope4. While shown to be a valuable 
preparation to study the physiology of the microcirculation in rats5 and hamsters6, the cremaster muscle in mice7 has proven particularly useful in dissecting 
cellular pathways involved in regulating microvascular function8-11 and real-time imaging of intercellular signaling12. 
The cremaster muscle is derived from the internal oblique and transverse abdominus muscles as the testes descend through the inguinal canal13. 
It serves to support (Greek: cremaster = suspender) and maintain temperature of the testes. As described here, the cremaster muscle is prepared as a thin flat sheet 
for outstanding optical resolution. With the mouse maintained at a stable body temperature and plane of anesthesia, surgical preparation involves freeing the muscle 
from surrounding tissue and the testes, spreading it onto transparent pedestal of silastic rubber and securing the edges with insect pins while irrigating it 
continuously with physiological salt solution. The present protocol utilizes transgenic mice expressing GCaMP2 in arteriolar endothelial cells. GCaMP2 is a 
genetically encoded fluorescent calcium indicator molecule12. Widefield imaging and an intensified charge-coupled device camera enable in vivo study of 
calcium signaling in the arteriolar endothelium.

A tissue preparation is described for visualization and experimental manipulation of the living microcirculation. In anesthetized male mice, the thin, highly vascularized cremaster muscle is prepared for intravital microscopy to study microvascular networks including arterioles, capillaries and venules. This preparation is readily adapted for rats and hamsters.

Mikrosirkülasyon intravital Görüntüleme Fare Cremaster&#39;ın kas Hazırlık

Throughout the body, the maintenance of homeostasis requires the constant supply of oxygen and nutrients concomitant with removal of metabolic ...

Biyoloji

Microiontophoresis and Micromanipulation for Intravital Fluorescence Imaging of the Microcirculation

Microiontophoresis entails passage of current through a micropipette tip to deliver a solute at a designated site within an experimental preparation. Microiontophoresis can simulate synaptic transmission1 by delivering neurotransmitters and neuropeptides onto neurons reproducibly2. Negligible volume (fluid) displacement avoids mechanical disturbance to the experimental preparation. Adapting these techniques to the microcirculation3 has enabled mechanisms of vasodilation and vasoconstriction to be studied at the microscopic level in vivo4,5. A key advantage of such localized delivery is enabling vasomotor responses to be studied at defined sites within a microvascular network without evoking systemic or reflexive changes in blood pressure and tissue blood flow, thereby revealing intrinsic properties of microvessels.
A limitation of microiontophoresis is that the precise concentration of agent delivered to the site of interest is difficult to ascertain6. Nevertheless, its release from the micropipette tip is proportional to the intensity and duration of the ejection current2,7, such that reproducible stimulus-response relationships can be readily determined under defined experimental conditions (described below). Additional factors affecting microiontophoretic delivery include solute concentration and its ionization in solution. The internal diameter of the micropipette tip should be &tilde; 1 &mu;m or less to minimize diffusional 'leak', which can be counteracted with a retaining current. Thus an outward (positive) current is used to eject a cation and a negative current used to retain it within the micropipette.
Fabrication of micropipettes is facilitated with sophisticated electronic pullers8. Micropipettes are pulled from glass capillary tubes containing a filament that 'wicks' solution into the tip of the micropipette when filled from the back end ("backfilled"). This is done by inserting a microcapillary tube connected to a syringe containing the solution of interest and ejecting the solution into the lumen of the micropipette. Micromanipulators enable desired placement of micropipettes within the experimental preparation. Micromanipulators mounted on a movable base can be positioned around the preparation according to the topography of microvascular networks (developed below). 
The present protocol demonstrates microiontophoresis of acetylcholine (ACh+ Cl-) onto an arteriole of the mouse cremaster muscle preparation (See associated protocol: JoVE ID#2874) to produce endothelium-dependent vasodilation. Stimulus delivery is synchronized with digitized image acquisition using an electronic trigger. The use of Cx40BAC-GCaMP2 transgenic mice9 enables visualization of intracellular calcium responses underlying vasodilation in arteriolar endothelial cells in the living microcirculation.

Microiontophoresis entails movement of ions from a micropipette in response to a difference in electrical potential between the inside and outside of the micropipette. Biologically active molecules are thereby delivered in proportion to electrical current. We illustrate acetylcholine microiontophoresis in conjunction with micromanipulation to study endothelium-dependent vasodilation in the microcirculation.

Mikrosirkülasyon intravital Floresans Görüntüleme Microiontophoresis ve Mikromanipülasyon

Microiontophoresis entails passage of current through a micropipette tip to deliver a solute at a designated site within an experimental  preparation. ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

İsteyerek Pluripotent Kök Hücrelerinin Elde Edilen Fare Üretimi

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective isolation in culture. Recently, using fluorescence-activated cell sorting (FACS), we and other researchers prospectively identified and purified three subpopulations of multipotent precursor cells associated with the vasculature of human skeletal muscle. These three cell populations: myogenic endothelial cells (MECs), pericytes (PCs), and adventitial cells (ACs), are localized respectively to the three structural layers of blood vessels: intima, media, and adventitia. All of these human blood-vessel-derived stem cell (hBVSC) populations not only express classic MSC markers but also possess mesodermal developmental potentials similar to typical MSCs. Previously, MECs, PCs, and ACs have been isolated through distinct protocols and subsequently characterized in separate studies. The current isolation protocol, through modifications to the isolation process and adjustments in the selective cell surface markers, allows us to simultaneously purify all three hBVSC subpopulations by FACS from a single human muscle biopsy. This new method will not only streamline the isolation of multiple BVSC subpopulations but also facilitate future clinical applications of hBVSCs for distinct therapeutic purposes.

Blood vessels within human skeletal muscle harbor several multi-lineage precursor populations that are ideal for regenerative applications. This isolation method allows simultaneous purification of three multipotent precursor cell populations respectively from three structural layers of blood vessels: myogenic endothelial cells from intima, pericytes from media, and adventitial cells from adventitia.

İnsan İskelet Kası Kan-damar-türevli Multipotent Öncüleri İzolasyonu

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...

Identification of Key Factors Regulating Self-renewal and Differentiation in EML Hematopoietic Precursor Cells by RNA-sequencing Analysis

Hematopoietic stem cells (HSCs) are used clinically for transplantation treatment to rebuild a patient&#39;s hematopoietic system in many diseases such as leukemia and lymphoma. Elucidating the mechanisms controlling HSCs self-renewal and differentiation is important for application of HSCs for research and clinical uses. However, it is not possible to obtain large quantity of HSCs due to their inability to proliferate in vitro. To overcome this hurdle, we used a mouse bone marrow derived cell line, the EML (Erythroid, Myeloid, and Lymphocytic) cell line, as a model system for this study.
RNA-sequencing (RNA-Seq) has been increasingly used to replace microarray for gene expression studies. We report here a detailed method of using RNA-Seq technology to investigate the potential key factors in regulation of EML cell self-renewal and differentiation. The protocol provided in this paper is divided into three parts. The first part explains how to culture EML cells and separate Lin-CD34+ and Lin-CD34- cells. The second part of the protocol offers detailed procedures for total RNA preparation and the subsequent library construction for high-throughput sequencing. The last part describes the method for RNA-Seq data analysis and explains how to use the data to identify differentially expressed transcription factors between Lin-CD34+ and Lin-CD34- cells. The most significantly differentially expressed transcription factors were identified to be the potential key regulators controlling EML cell self-renewal and differentiation. In the discussion section of this paper, we highlight the key steps for successful performance of this experiment.
In summary, this paper offers a method of using RNA-Seq technology to identify potential regulators of self-renewal and differentiation in EML cells. The key factors identified are subjected to downstream functional analysis in vitro and in vivo.

RNA-sequencing and bioinformatics analyses were used to identify significantly and differentially expressed transcription factors in Lin-CD34+ and Lin-CD34- subpopulations of mouse EMLcells. These transcription factors might play important roles in determining the switch between self-renewing Lin-CD34+ and partially differentiated Lin-CD34- cells.

RNA dizileme Analizi ile EML Hematopoetik Öncü Hücreler Self-yenileme ve farklılaşma Düzenlenmesi Anahtar Faktörler belirlenmesi

Hematopoietic stem cells (HSCs) are used clinically for transplantation treatment to rebuild a patient&#39;s hematopoietic system in many diseases such as ...

Visualization and Quantification of the Cell-free Layer in Arterioles of the Rat Cremaster Muscle

The cell-free layer is defined as the parietal plasma layer in the microvessel flow, which is devoid of red blood cells. The measurement of the in vivo cell-free layer width and its spatiotemporal variations can provide a comprehensive understanding of hemodynamics in microcirculation. In this study, we used an intravital microscopic system coupled with a high-speed video camera to quantify the cell-free layer widths in arterioles in vivo. The cremaster muscle of Sprague-Dawley rats was surgically exteriorized to visualize the blood flow. A custom-built imaging script was also developed to automate the image processing and analysis of the cell-free layer width. This approach enables the quantification of spatiotemporal variations more consistently than previous manual measurements. The accuracy of the measurement, however, partly depends on the use of a blue filter and the selection of an appropriate thresholding algorithm. Specifically, we evaluated the contrast and quality of images acquired with and without the use of a blue filter. In addition, we compared five different image histogram-based thresholding algorithms (Otsu, minimum, intermode, iterative selection, and fuzzy entropic thresholding) and illustrated the differences in their determination of the cell-free layer width.

This study demonstrates the surgical preparation of the rat cremaster muscle for the visualization of the in vivo cell-free layer. Considerable factors affecting the accuracy of the cell-free layer width measurement are discussed in this study.

Sıçan Cremaster&#39;ın Muscle arteriyollerde Hücre-serbest Katman Görselleştirme ve

The cell-free layer is defined as the parietal plasma layer in the microvessel flow, which is devoid of red blood cells. The measurement of the in vivo ...

Analysis of the Gap Junction-dependent Transfer of miRNA with 3D-FRAP Microscopy

Small antisense RNAs, like miRNA and siRNA, play an important role in cellular physiology and pathology and, moreover, can be used as therapeutic agents in the treatment of several diseases. The development of new, innovative strategies for miRNA/siRNA therapy is based on an extensive knowledge of the underlying mechanisms. Recent data suggest that small RNAs are exchanged between cells in a gap junction-dependent manner, thereby inducing gene regulatory effects in the recipient cell. Molecular biological techniques and flow cytometric analysis are commonly used to study the intercellular exchange of miRNA. However, these methods do not provide high temporal resolution, which is necessary when studying the gap junctional flux of molecules. Therefore, to investigate the impact of miRNA/siRNA as intercellular signaling molecules, novel tools are needed that will allow for the analysis of these small RNAs at the cellular level. The present protocol describes the application of three-dimensional fluorescence recovery after photobleaching (3D-FRAP) microscopy to elucidating the gap junction-dependent exchange of miRNA molecules between cardiac cells. Importantly, this straightforward and non-invasive live-cell imaging approach allows for the visualization and quantification of the gap junctional shuttling of fluorescently labeled small RNAs in real time, with high spatio-temporal resolution. The data obtained by 3D-FRAP confirm a novel pathway of intercellular gene regulation, where small RNAs act as signaling molecules within the intercellular network.

Here, we describe the application of three-dimensional fluorescence recovery after photobleaching (3D-FRAP) for the analysis of the gap junction-dependent shuttling of miRNA. In contrast to commonly applied methods, 3D-FRAP allows for the quantification of the intercellular transfer of small RNAs in real time, with high spatio-temporal resolution.

3D-FRAP Mikroskopisi ile Gap Birleşimine Bağlı MiRNA Transferinin Analizi

Small antisense RNAs, like miRNA and siRNA, play an important role in cellular physiology and pathology and, moreover, can be used as therapeutic agents ...

Intravital Subcellular Microscopy of the Mammary Gland

The mammary gland constitutes a model par excellence for investigating epithelial functions, including tissue remodeling, cell polarity, and secretory mechanisms. During pregnancy, the gland expands from a primitive ductal tree embedded in a fat pad to a highly branched alveolar network primed for the formation and secretion of colostrum and milk. Post-partum, the gland supplies all the nutrients required for neonatal survival, including membrane-coated lipid droplets (LDs), proteins, carbohydrates, ions, and water. Various milk components, including lactose, casein micelles, and skim-milk proteins, are synthesized within the alveolar cells and secreted from vesicles by exocytosis at the apical surface. LDs are transported from sites of synthesis in the rough endoplasmic reticulum to the cell apex, coated with cellular membranes, and secreted by a unique apocrine mechanism. Other preformed constituents, including antibodies and hormones, are transported from the serosal side of the epithelium into milk by transcytosis. These processes are amenable to intravital microscopy because the mammary gland is a skin gland and, therefore, directly accessible to experimental manipulation. In this paper, a facile procedure is described to investigate the kinetics of LD secretion in situ, in real-time, in live anesthetized mice. Boron-dipyrromethene (BODIPY)665/676&#160;or monodansylpentane are used to label the neutral lipid fraction of transgenic mice, which either express soluble EGFP (enhanced green fluorescent protein) in the cytoplasm, or a membrane-targeted peptide fused to either EGFP or tdTomato. The membrane-tagged fusion proteins serve as markers of cell surfaces, and the lipid dyes resolve LDs &#8805; 0.7 &#181;m. Time-lapse images can be recorded by standard laser scanning confocal microscopy down to a depth of 15-25 &#181;m or by multiphoton microscopy for imaging deeper in the tissue. The mammary gland may be bathed with pharmacological agents or fluorescent dyes throughout the surgery, providing a platform for acute experimental manipulations as required.

<meta charset="utf8"></head><body>Meme bezinin intravital hücre altı mikroskobu

The present protocol describes a facile technique for the intravital imaging of the lactating mouse mammary gland by laser scanning confocal and multiphoton microscopy.

Meme bezinin intravital hücre altı mikroskobu

The mammary gland constitutes a model par excellence for investigating epithelial functions, including tissue remodeling, cell polarity, and secretory ...

Live Imaging of Microtubule Dynamics in Glioblastoma Cells Invading the Zebrafish Brain

With a dismal median survival time in real populations-between 6 to 15 months-glioblastoma (GBM) is the most devastating malignant brain tumor. Treatment failure is mainly due to the invasiveness of GBM cells, which speaks for the need for a better understanding of GBM motile properties. To investigate the molecular mechanism supporting GBM invasion, new physiological models enabling in-depth characterization of protein dynamics during invasion are required. These observations would pave the way to the discovery of novel targets to block tumor infiltration and improve patient outcomes. This paper reports how an orthotopic xenograft of GBM cells in the zebrafish brain permits subcellular intravital live imaging. Focusing on microtubules (MTs), we describe a procedure for MT labeling in GBM cells, microinjecting GBM cells in the transparent brain of 3 days post fertilization (dpf) zebrafish larvae, intravital imaging of MTs in the disseminating xenografts, altering MT dynamics to assess their role during GBM invasion, and analyzing the acquired data.

We report a technique permitting live imaging of microtubule dynamics in glioblastoma (GBM) cells invading a vertebrate brain tissue. Coupling the orthotopic injection of fluorescently tagged GBM cells into a transparent zebrafish brain with high-resolution intravital imaging allows the measurement of cytoskeleton dynamics during in situ cancer invasion.

Zebra Balığı Beynini İstila Eden Glioblastoma Hücrelerinde Mikrotübül Dinamiğinin Canlı Görüntülenmesi

With a dismal median survival time in real populations-between 6 to 15 months-glioblastoma (GBM) is the most devastating malignant brain tumor. Treatment ...