The authors would like to thank Dr Rita Shaknovich and members of Elemento lab, Melnick lab, and Tam lab for thoughtful discussions. We would also like to thank the Genomics Resources Core Facility at Weill Cornell Medical College for performing the VDJ-sequencing. YJ was supported by ASH Scholar Award. WT and OE are supported by Weill Cornell Cancer Center Pilot Grant. OE is supported by the NSF CAREER award, the Starr Cancer Consortium and the Hirschl Trust. We would also like to thank Katherine Benesch, JD, MPH for her generous support to this project.

1. VDJ Büyütme Tümör Örneklerinden 1.1) DNA Ekstraksiyon <ol><li> Donmuş Ekim gömülü normal veya malign dokuların ince kesitlerinin (10-20 mikron) DNA ayıklayın. <ol><li> Proteinaz K ile (0.5 mg / ml, son konsantrasyon elde 4 mi Nükleik Lizis Tamponu (; 0.3 M NaCl 0.002 M Na2EDTA 0,0075 M Tris HCI, pH 8.2) bir kriyostat mikrotom ile kesilmiş gömülü doku 10-30 ince kesitler Digest ) ve gece boyunca bir 37 ° C su banyosu içinde, 15 ml santrifüj tüpü içinde 0,625% SDS. </li><li> Sindirim karışımı, doymuş NaCl (5 M) 1 ml ilave edilir ve 15 saniye boyunca kuvvetli bir şekilde çalkalanır. </li><li> Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 1100 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Yeni bir 15 ml santrifüj tüpüne süpernatant aktarın ve 100% etanolden iki hacmin ilave edin. </li><li> Tüpü 6-8 kez tersine çevirerek karıştın. 4 ° C&#39;de 60 dakika boyunca 5000 x g&#39;de santrifüjleyin Çökelen DNA toplamak. </li><li> % 70 etanol ile iki kez DNA pelet yıkayın. Centr15 dakika pelet toplamak için her zaman için 5.000 xg&#39;de ifuge. </li><li> Bir çalkalama gece boyunca oda sıcaklığında 100-400 ul TE tampon maddesi içinde DNA içinde çözülür. DNA verimi doku boyutuna bağlı olarak 5 ila 200 ug (50-500 ng / ul arasında nihai konsantrasyon) </li></ol></li><li> Formalinle sabitlenmiş, parafin gömülü (FFPE), normal veya habis doku ince bölümler (10-20 um) DNA ekstrakte edin. <ol><li> Iki kez 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde, 10 dakika, her seferinde, oda sıcaklığında de-paraffinize ksilen 1 ml parafin kesitleri inkübe edin. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 13.000 x g&#39;de iplik doku bölümleri toplayın. </li><li> Oda sıcaklığında 10 dakika tortu, ksilenler çıkarmak için her iki kez 1 ml% 100 etanol içinde bölümleri inkübe edin. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 13.000 x g&#39;de iplik doku bölümleri toplayın. Parafin tamamen bu noktada çözülür ve sadece doku bölümü ayakta durmaktadır. </li><li> Oda te de bölümleri Hava kuruması10-15 dakika boyunca mperature. </li><li> (Nükleaz içermeyen su ile 10x PCR tamponu seyreltilmiş), 1x PCR tampon maddesi ile bir 0.5 mg / ml Proteinaz K solüsyonu sağlayın. 50-100 ul&#39;lik bir nihai hacim içinde örnekleri Proteinaz K solüsyonu ilave edin ve gece boyunca 37 ° C enkübe edilir. </li><li> Proteinaz K. inaktive etmek için 10 dakika boyunca 95 ° C &#39;de ısıtınız örnekleri Not: Bu adımda, örnek DNA, PCR tampon maddesi içinde çözülmüş ve direkt Adım 1.2 ve 1.3 &#39;de kullanılabilir. DNA verimi doku boyutuna bağlı olarak 0.5 ila 20 ug (10-200 ng / ul arasında nihai konsantrasyon). </li></ol></li></ol> 1.2) DNA Kalite Değerlendirmesi <ol><li> PCR tüpünde ticari merdiven kiti ana karışımı 45 ul 0,25 ul Taq DNA polimeraz karıştırın. </li><li> PCR tüpüne 1.1.1.7 veya 1.1.2.5 hazırlanabilir 5 ul DNA ekleyin ve en az 5 kez pipetleme aşağı iyice karıştırın. </li><li> 95 ° C için: DNA&#39;yı büyütmek için aşağıdaki şartları kullanın7 dakika; 95 ° C, 60 ° C &#39;de 45 saniye ve 72 ° C&#39;de 90 saniye, 45 saniye 35 döngü, ardından; daha sonra 10 dakika boyunca 72 ° C ve 15 ° C &#39;de sabit. </li><li> TBE (Tris / borat / EDTA) ve% 2 agaroz jeli hazırlayın. </li><li> 4 ul 6x yükleme boyası ile 20 ul PCR reaksiyon karışımı, bir% 2 agaroz jeli üzerine yüklenir. </li><li> 0.5 ug / ml etidyum bromür solüsyonu ile agaroz jel leke ve bir jel hayal sistemi ile PCR ürünleri algılar. Not: 100, 200, 300, 400 ve 600 bp ebatlarda 5 PCR ürünleri elde edildi örnekleri VDJ amplikonları oluşturmak için devam edilecektir. DİKKAT: Etidyum bromür güçlü bir mutajen olduğunu. Koruyucu dişliler, yani eldiven giyerek son derece dikkatli ele ve kurumun kurallarına göre belirli kaplara atın. </li></ol> 1,3) VDJ PCR 1.3.1) Çerçeve Bölgesinde 1 Amplify recombined IgH VDJ Segmenti (IgVHFR1) <ol><li> Tüp etiketi 45 ul ana karışımı karıştırıned ticari bir somatik IGH Hipermutasyon Deneyi Jel Tespiti için kitin &quot;karışımı 2&quot;, Taq DNA polimeraz ul 0.25, ve bir PCR tüpü içinde 1.1.1.7 veya 1.1.2.5 hazırlanabilir 5 ul numune DNA kullanılabilir. </li><li> DNA&#39;yı büyütmek için aşağıdaki koşullar kullanın: 7 dakika boyunca 95 ° C; 95 ° C, 60 ° C &#39;de 45 saniye ve 72 ° C&#39;de 90 saniye, 45 saniye 35 döngü, ardından; daha sonra 10 dakika boyunca 72 ° C ve 15 ° C &#39;de sabit. </li><li> Elektroforez ile% 2 agaroz jeli içinde bütün PCR ürünü giderin. </li><li> 0.5 ug / ml etidyum bromür solüsyonu ile agaroz jel leke ve bir jel görüntüleme sistemi ile PCR ürünleri algılar. Bir monoklonal amplikon 310-380 bp boyut aralığı ile tahmin edilmektedir. </li><li> 310-380 bp arasındaki monoklonal amplikonu içeren jel bölümü tüketim. </li><li> Üreticinin protokolüne göre, standart bir Gel Extraction Kit, çıkarılan jel DNA saflaştınlır. Not: FR1 fragmanları elde edilebilir örnekleri için, iGV bol miktarda olan gerek yokturHFR2 ve IgVHFR3. </li></ol> 1.3.2) Çerçeve Bölgesinde 2 Amplify recombined IgH VDJ Segmenti (IgVHFR2) <ol><li> PCR tüpü içinde 1.1.1.7 veya 1.1.2.5 hazırlanabilir jel Tespit kiti ticari bir IGH Gen Klonalite Testinin &quot;Tüp B&quot;, Taq DNA polimeraz ul 0,25 ve 5 ul örnek DNA olarak adlandırılan tüp 45 ul ana karışımı karıştırın . </li><li> DNA&#39;yı büyütmek için aşağıdaki koşullar kullanın: 7 dakika boyunca 95 ° C; 95 ° C, 60 ° C &#39;de 45 saniye ve 72 ° C&#39;de 90 saniye, 45 saniye 35 döngü, ardından; daha sonra 10 dakika boyunca 72 ° C ve 15 ° C &#39;de bırakın. </li><li> Elektroforez ile% 2 agaroz jeli içinde bütün PCR ürünü giderin. </li><li> 0,5 ug / ml etidyum bromür boyama PCR ürün (ler) görselleştirme. Bir monoklonal amplikon 250-295 bp büyüklüğünde bir aralık içinde görülebilir. </li><li> 250-295 bp arasındaki monoklonal amplikonu içeren jel bölümü tüketim. </li><li> Standart Jel Özü kullanılarak eksize jelden DNA arındırmaküreticinin protokolüne uygun iyon Kit. </li></ol> 1.4) Optimize VDJ PCR <ol><li> 7 dakika, 60 saniye, 60 saniye boyunca 60 ° C, 95 ° C 40 döngü, 90 saniye için 72 ° C sıcaklıkta son uzatma, 95 ° C: IgVHFR1 ve IgVHFR2 optimal DNA kullanılarak amplifiye etmek için, aşağıdaki tadil edilmiş PCR koşulları kullanarak 10 dakika boyunca 72 ° C. </li></ol> 2. VDJ Amplikon Kütüphane hazırlanması ve Sekanslanması 2,1) Kütüphane hazırlanması 2.1.1) End-onarım <ol><li> PCR tüp içine 1.3 VDJ PCR ürünü aktarın ve 60 ul hacim getirmek için DNA Numune Hazırlama Seti Tekrar Süspansiyonu Buffer ekleyin. </li><li> DNA Numune Hazırlama Seti sonu Onarım Mix 40 ul ekleyin ve iyice karıştırın. </li><li> 100 ° C&#39;de önceden ısıtılmış bir kapak ile önceden ısıtılmış bir ısıl çevrim (30 ° C) &#39;de 30 dakika süre ile 30 ° C&#39; de reaksiyon inkübe edin. </li><li> 136 ul manyetik boncuk ve 24 ul PCR g MixRade Suyun ilk olarak 1.5 ml bir tüp içinde, daha sonra 1,5 ml tüp içine 2.1.1.3&#39;de tamamını sonu tamir reaksiyonunu aktarmak ve boncuk çözeltisi ile iyice karıştırılır. </li><li> 2 dakika için bir manyetik stand üzerine yerleştirin borular çözeltiden boncuk ayrılmasını sağlamak için. Süpernatantı aspire ve tüp manyetik standında açıkken iki kez% 80 taze hazırlanmış EtOH ile boncuk yıkayın. </li><li> Tamamen etanol çözeltisi aspire ve 15 dakika için oda sıcaklığında 15 dakika boyunca havada kurumaya boncuklar verir. </li><li> 17.5 ul Tekrar Süspansiyonu Tampon manyetik standı ve tekrar süspansiyon boncuk kapalı tüp atın. </li><li> Geri Tekrar Süspansiyonu Tampon ayrı boncuk 2 dakika süreyle manyetik stand üzerine yerleştirin tüpleri. Temiz bir PCR tüpüne Tekrar Süspansiyonu Buffer (Son onarım ürünü şimdi Tekrar Süspansiyonu tamponunda yeniden süspanse) çıkarın. </li></ol> 2.1.2) A-atık <ol><li> Son onarım ürünü ihtiva eden PCR tüpüne 12.5 ul A-atık karışımı ekleyin ve iyice karıştırın. </li&gt; <li> 100 ° C &#39;de bir ön-ısıtılmış kapak ile, bir önceden ısıtılmış bir ısıl çevrim (37 ° C)&#39; de 30 dakika süre ile 37 ° C &#39;de, PCR tüpü inkübe edin. </li></ol> 2.1.3) Adaptör ligasyonu <ol><li> A-atık reaksiyona 2.5 ul Tekrar Süspansiyonu Buffer, 2.5 ul ligasyon Mix ve 2.5 ul DNA Adaptör Endeksi ekleyin. </li><li> 100 ° C&#39;de önceden ısıtılmış bir kapak ile önceden ısıtılmış bir ısıl çevrim (30 ° C) &#39;de 30 minl 30 ° C&#39; de reaksiyon inkübe edin. </li><li> Her reaksiyon içine 5 ul Dur ligasyon Buffer ekleyin ve iyice karıştırın. </li><li> 2.1.1.5 2.1.1.8 adımları aşağıdaki reaksiyonu temizlemek için 42.5 ul iyi karıştırılmış manyetik boncuk karıştırın. &#39;Adaptörü bağlı ürünü elüte etmek için 50 ul Tekrar süspansiyona, Tamponu ekleyin. </li><li> 50 ul iyi karıştırılmış AMPure XP boncuklar kullanılarak ikinci bir defa &#39;adaptörü bağlı ürün temizleme ve temiz bir PCR tüpüne 25 ul Tekrar süspansiyona, Tamponu içinde, ürünü yıkamak. </li></ol> 2.1.4) Genişletme DNA Fragments <ol><li> Adaptör bağlandı ürünü içeren PCR tüp 5 ul PCR Primer Kokteyl ve 25 ul PCR Master Mix ekleyin ve iyice karıştırın. </li><li> Aşağıdaki koşullar ile önceden programlanmış bir PCR amplifikasyon yapın: 30 saniye için 98 ° C; 10 sn için 98 ° C 10 döngü, 30 saniye için 60 ° C ve 30 sn için 72 ° C; Daha sonra 5 dakika boyunca 72 ° C ve 10 ° C&#39;de tutun. </li><li> 50 ul iyi karıştırılmış manyetik boncuklar kullanarak tepkisini temizleyin ve 30 ul Tekrar Süspansiyonu Tampon nihai ürün Zehir. </li></ol> 2.1.5) Kütüphane Doğrulama <ol><li> Üreticinin protokolü kullanılarak bir florometre ile nihai ürünü ölçmek. Nihai kütüphanesi konsantrasyonu 2,5 ila 20 ng / ul arasındadır. </li><li> Üreticinin protokolüne göre Yüksek Hassasiyet DNA çip ile bir analitik araç kullanılarak nihai ürünün kalitesini değerlendirmek. IGVHFR1, IGVHFR2 ya IGVHFR3 biri için umulan boyutta tek bir bant bekliyoruz. SanaKütüphane ürünün xpected boyutu orijinal VDJ amplikonun boyutunu artı adaptörleri (~ 125 bp) boyutunu eşittir. </li></ol> 2.2) VDJ-PCR Kütüphane havuzu ve Sıralama <ol><li> Aşağıdaki formül kullanılarak her bir kütüphane fraksiyonu molaritesini hesaplayın: nM = [(ng / 1000) / bp * 660] ng adımda 2.1.5.1 ölçülen VDJ-PCR kütüphane konsantrasyonu 10 9 x ve bp doruğudur VDJ-PCR kütüphanenin ebadı adım 2.1.5.2 kaydedilmiştir. </li><li> DNaz içermeyen su ile 2 nM (10 ul toplam) kütüphaneyi seyreltin. </li><li> Birlikte bir 1,5 ml tüp içine seyreltildi 2 nM kütüphanelerinin 10 ul birleştirin. </li><li> 1,5 ml tüp içine phix başak kontrol eşit hacim. </li><li> Bir akış hücresi üzerine 07:00 konsantrasyonda havuz yükleyin. </li><li> Üreticinin protokolüne göre eşleştirilmiş uç 150 çevrim sequencer kullanarak kütüphaneleri sırası. </li></ol> 3. Veri Analizi Not: SummBu bölümde kullanılan biyoinformatik Dizelerin li bir Ek kod dosyası olarak bulunabilir. 3.1) Uyum ve QC <ol><li> Harita paired-end dizileme, bir insan IGH V karşı okur 2 aralık açık cezası, 1 aralık uzatma cezası ile NCBI temin &#39;BLASTN&#39; dayalı bir uyarlanmış nükleotid blast algoritmasını kullanarak IMGT web sitesinden 11 indirilen Ge ve J bölge veritabanı, 7 sözcük uzunluğu ve 10 -4 e-değeri eşik. Bir IGH V ve J bölge hem eşleşmiyor okuma-çifti atın. </li><li> Tüm örnek üzerinde sıralama çalışmadan elde edilen çiftleri okumak karşısında VJ kombinasyonları eşleşen frekanslarını elde etmek için IGH V ve J eşlemeleri var kalan okuma-çiftleri sayın. Bir IGH V ve J geninin hem eşleştirilmiş ise salt çifti sayın ve sonra belirli VJ kombinasyonu gelen saymak onun alel ekleyin. </li><li> Yüksekten 3.1.2 elde edilen her bir rekombine VDJ bölge için sayıları Ranken est. VDJ bölgesi en yüksek sayısı önemli bir yeniden düzenleme kombinasyonu olarak tanımlanır okur vardır. </li><li> 3.1.3 tanımlanan etki büyük düzenlenmesi az% 35 kapsayacak hizalanmış dizileri atın. </li></ol> 3.2) SHM Profili Kimlik <ol><li> Adım 3.1.3 okur genelinde tüm SHM desenleri güvenin. Bir alt klon olarak her SHM desen tanımlayın. </li><li> Farklı benzersiz SHM desenleri karşılık olan alt grupların sayısını ve bireysel altklonları eşlenen okur sayısını. </li></ol> Sonuçların 3.3) Grafik Temsil <ol><li> Üreticinin protokolüne göre R paketi &quot;maymun&quot; dan yöntemini birleştiren bir mahalle kullanarak gelen SHM kalıplarını kullanarak altklonları üzerinde filogenetik analizi yapın. V tohum çizgisi dizisine köklü altklonüs soyoluşu yeniden bireysel farklı hizalamaları bir mesafe matrisi hesaplayınHer paired sample seti için söz konusu J kombinasyonu. </li><li> Karakter vektör olarak, her alt klonun nükleotit sıklığı kullanımı ve iki eşleştirmede arasındaki mesafe d, x, y ile verilir matematiksel tanı ve Levenshtein mesafe ölçüsünü kullanılarak ilgili nüks numuneler için önemli bir yeniden düzenleme VJ tüm alt-klonları arasındaki yaklaşık dize mesafenin hesaplanması (i, j) d x, y (i, j) = 1 i j ≠ 0, aksi takdirde, ardından dizileri i ve j nükleotid karşılık gelen dize uzunluğu boyunca bu işlevi toplamı ise nerede. </li><li> Grafiksel aşağıdaki iki yolla altklonüs mesafeler ve bunlara karşılık gelen altklonüs sayıları çıkan matris görüntüler: <ol><li> R paketi kullanın &quot;MASS&quot; üreticinin protokolüne göre altklonüs mesafe matris boyutlu ölçekleme uygulamak ve iki boyutlu bir ilke oluşturmak için daha sonra logaritma ile birlikte çizilmiştir harita, koordinatlardairenin yarıçapı olarak subclonal sayar. </li><li> Köşeleri büyük VJ düzenlenmesi kaynaklanan her farklı alt klon karşılık Levenshtein mesafe dayalı bir yönsüz grafik oluşturun. Not: Bir, daha sonra bu iki köşe arasındaki bir kenar bulunduğunu iki ayrı klonlar arasındaki mesafe eşit ise. Uzaktan bir daha büyük ise, daha sonra bunları bağlayan herhangi bir kenarı vardır. </li><li> Üreticinin protokolüne uygun olarak Kamada Kawai düzeni &quot;iGRAPH&quot; R paketinde tkplot fonksiyonunu kullanarak 3.3.3.2 grafiği çizilir. Köşe yarıçapı kendisine eşlenen klonların toplam sayısının küp kökü ile orantılıdır ve gölgeleme ya Tanı (mavi) veya nüks (kırmızı) örneklere ait klonların oranını belirtmek için kırmızı ve mavi aralığını kullanır . </li></ol></li></ol> 3.4) Heterojenite (Entropi) Ölçüm <ol><li> Numaralarını ve altklonüs sayıları inceleyinHer biri için en önemli VJ düzenlenmesi meydana gelen somatik hipermutasyon bireysel desenler numunelerin set eşleştirilmiş. </li><li> Standart histogram tabanlı entropi tahmin kullanarak her numunedeki farklı klonların sayısı için ayarlanmış ampirik entropi ve artık ampirik entropi hesaplayın. </li></ol>

<ol>
	<li>Nowell, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+clonal+evolution+of+tumor+cell+populations.">The clonal evolution of tumor cell populations.</a> Science. 194 (4260), 23-28 (1976).</li><li>Greaves, M., Maley, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+evolution+in+cancer.">Clonal evolution in cancer.</a> Nature. 481 (7381), 306-313 (2012).</li><li>Ding, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+evolution+in+relapsed+acute+myeloid+leukaemia+revealed+by+whole-genome+sequencing.">Clonal evolution in relapsed acute myeloid leukaemia revealed by whole-genome sequencing.</a> Nature. 481 (7382), 506-510 (2012).</li><li>Jiao, W., Vembu, S., Deshwar, A. G., Stein, L., Morris, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inferring+clonal+evolution+of+tumors+from+single+nucleotide+somatic+mutations.">Inferring clonal evolution of tumors from single nucleotide somatic mutations.</a> BMC bioinformatics. 15, 35 (2014).</li><li>Schatz, D. G., Ji, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombination+centres+and+the+orchestration+of+V(D)J+recombination.">Recombination centres and the orchestration of V(D)J recombination.</a> Nature reviews immunology. 11 (4), 251-263 (2011).</li><li>Jacob, J., Kelsoe, G., Rajewsky, K., Weiss, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraclonal+generation+of+antibody+mutants+in+germinal+centres.">Intraclonal generation of antibody mutants in germinal centres.</a> Nature. 354 (6352), 389-392 (1991).</li><li>Coiffier, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CHOP+chemotherapy+plus+rituximab+compared+with+CHOP+alone+in+elderly+patients+with+diffuse+large-B-cell+lymphoma.">CHOP chemotherapy plus rituximab compared with CHOP alone in elderly patients with diffuse large-B-cell lymphoma.</a> N Engl J Med. 346 (4), 235-242 (2002).</li><li>Larouche, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphoma+recurrence+5+years+or+later+following+diffuse+large+B-cell+lymphoma:+clinical+characteristics+and+outcome.">Lymphoma recurrence 5 years or later following diffuse large B-cell lymphoma: clinical characteristics and outcome.</a> J Clin Oncol. 28 (12), 2094-2100 (2010).</li><li>Friedberg, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relapsed/refractory+diffuse+large+B-cell+lymphoma.">Relapsed/refractory diffuse large B-cell lymphoma.</a> Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2011, 498-505 (2011).</li><li>Gisselbrecht, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salvage+regimens+with+autologous+transplantation+for+relapsed+large+B-cell+lymphoma+in+the+rituximab+era.">Salvage regimens with autologous transplantation for relapsed large B-cell lymphoma in the rituximab era.</a> J Clin Oncol. 28 (27), 4184-4190 (2010).</li><li>Lefranc, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IMGT,+the+International+ImMunoGeneTics+Information+System+for+Immunoinformatics+:+methods+for+querying+IMGT+databases,+tools,+and+web+resources+in+the+context+of+immunoinformatics.">IMGT, the International ImMunoGeneTics Information System for Immunoinformatics : methods for querying IMGT databases, tools, and web resources in the context of immunoinformatics.</a> Molecular biotechnology. 40 (1), 101-111 (2008).</li><li>Jiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+sequencing+reveals+clonal+evolution+patterns+and+mutation+events+associated+with+relapse+in+B-cell+lymphomas.">Deep sequencing reveals clonal evolution patterns and mutation events associated with relapse in B-cell lymphomas.</a> Genome biology. 15 (8), 432 (2014).</li><li>Hanna, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+reprogramming+of+terminally+differentiated+mature+B+lymphocytes+to+pluripotency.">Direct reprogramming of terminally differentiated mature B lymphocytes to pluripotency.</a> Cell. 133 (2), 250-264 (2008).</li></ol>

The authors have no conflicts of interest to disclose.

Çünkü insan B hücrelerinin IGH loküsündeki VDJ düzenlenmesi ve SHM tarafından kodlanmış dizi bilgi iterasyon neredeyse sınırsız sayıda, yüksek hacimli derin dizileme ile tüm IGH repertuarının inceleme klonal çizmek için etkin ve kapsamlı bir yol olduğunu kanıtladı ve alt klonal B hücre popülasyonları. Bundan başka, bu strateji hastalığın çeşitli evrelerinde boyunca alınmış hasta örneklerinin klonal ve alt klonal mimarileri karşılaştırarak B hücre tümör gelişiminin remisyon ve...

Kanser klonal bir hastalıktır. Otuz yıl önce Peter C. Nowell kanseri klonal evrim modeli 1 teklif Ne zamandan beri birçok çalışma tümör örnekleri içinde klonal popülasyonları incelemek ve tumorigenezden sürecini 2 altında yatan klonal genişleme ve evrim modellerini yeniden denedim. Son zamanlarda, bütün genom dizileme klonal heterojenite ve evrim 3,4 derin bir bakmak araştırmacıları sağladı. Ancak, pek çok hücre tipinde izlenebilir belirteçlerin eksikliği nedeniyle, kesin klonal mimari ve evrimsel yolu sonucuna zordur. Neyse DLBCL dahil olmak üzere birçok lenfoid maligniteler, kaynaklandığı olgun B hücrelerinde doğal bir klonalite işareti vardır. Antijen uyarılmasına tepki olarak bu segmentlerin büyük bir havuzdan bir araya segmenti, her bir B-hücresi V H (değişken), D (çeşitlilik) katılarak tek bir üretim IgH VDJ sekansı meydana getirebilir, ve J, H (birleştirme). Bu pr sırasındakapsayabilecektir orijinal dizisinin küçük porsiyonlarda silinebilir ve ek olmayan şablonu nükleotidleri benzersiz VDJ yeniden düzenlenmesini oluşturmak için ilave edilebilir. Bu özel VDJ yeniden düzenlenmesi, bu nedenle bireysel olgun B-hücresi ve yavrular 5 etiketleme, bu B-hücre tüm yavrularında kalıtsal olabilir. Bundan başka, antikor, SHM havuz genişlemesi ve antikor afinite 6 arttırılması için ek mutasyonlar dahil etmek için daha sonra germinal merkez (GC) reaksiyonunda rekombine VDJ sekanslarda ortaya çıkar. Bu nedenle, karşılaştırma ve bu işlemleri geçirmiş lenfoma örnekleri VDJ ve SHM desen karşılaştırarak, tümör içi heterojenlik tarif edilebilir ve hastalığın gelişimi klonal yolu saptanabilecektir. Daha önce, VDJ yeniden düzenlenme ve SHM sekans bilgilerini elde etmek için PCR ürünleri, ve daha sonra Sanger sıklıklaştırıcı klonlama, rekombine bölgeleri amplifiye PCR ile tespit edilebilir. Bu yaklaşım, iTüm rekombine VDJ repertuarının, sadece çok küçük bir bölümünü almak ve belirli bir örnek içinde klonal nüfusun genel temsil karakterizasyonu engelleyen, düşük verimlilik ve düşük bir verim s. Modifiye yaklaşım VDJ PCR ürünlerinden NGS endeksli sıralama kütüphaneleri üreten ve numune başına daha yarım milyondan fazla rekombine VDJ dizileri elde etmek için PE 2x150 bp sıralama yapılarak oluşturuldu. Buna ek olarak, özel bir boru hattı filtre VDJ dizileme her okuma düzenlenmeleri ve SHMS belirlemek ve her numunenin klonal mimarisi üzerine filogenetik analizi gerçekleştirmek için okur, kalite kontrol (QC) gerçekleştirmek hizalamak için geliştirilmiştir. Buna ek olarak, yeni bir yaklaşım daha çeşitli hastalık evrelerinde toplanan örneklerin klonal evrim modellerini karakterize etmek kurulmuştur. Biz DBBHL hasta numunelerinin için bu tekniği uyguladık. DBBHL kadar bir inci sık nüks ile non-Hodgkin lenfoma saldırgan formudurHastaların 7 ird. Yaklaşık 5 yıl 8 sonra meydana rağmen DLBCL nüksler normalde ilk tanı 2 ila 3 yıl içinde erken ortaya çıkar. Nüksetmiş hastalarda prognoz sadece% 10 nedeni tedavi seçenekleri kısıtlı 3 yıllık progresyonsuz sağkalım elde kötüdür. Bu DBBHL nüks 9,10 tedavisinde yeni yaklaşımlar için acil ihtiyaç için temeldir. Ancak, DBBHL nüks ile ilişkili moleküler mekanizmalar henüz tam olarak bilinmemektedir. Özellikle, DBBHL nüks gelişimi sırasında tanı ve klonal evrim de klonal heterojenite rolü, halen uncharacterized olan zor nüks tahmin etmek doğru ve yararlı bir biyobelirteci tanımlamak için yapım. Bu soruları gidermek için, biz eşleşti primer tanı nüks DBBHL örnek çiftlerinden birden çiftleri bizim VDJ-sıralama yaklaşımı uygulandı. Nüks İki farklı klonal evrim senaryoları tanı ve nüks samp arasındaki klonal mimarileri karşılaştırıldığında ortaya çıkanBirden moleküler mekanizmaları öneriyor les DLBCL nüks tutulabilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="841">
	<tbody>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:359px;">Ethanol</td>
			<td style="width:163px;">VWR</td>
			<td style="width:123px;">89125-170</td>
			<td style="width:197px;">200 proof, for molecular biology</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:359px;">TE buffer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12090-015</td>
			<td style="width:197px;">10 mM Tris&#183;Cl, pH 8.0; 10mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Xylenes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-XX0055-6</td>
			<td>500 ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Proteinase K&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Life Technonogies</td>
			<td>25530-015</td>
			<td>100 mg</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:359px;">Deoxynucleotide triphosphate (dNTP) Solution Mix</td>
			<td>Promega</td>
			<td style="width:123px;">U1515</td>
			<td style="width:197px;">10 mM each nucleotide</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">10x PCR Buffer&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11699105001</td>
			<td>Without MgCl2</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:359px;">AmpliTaq Gold DNA Polymerase with Gold Buffer and MgCl2</td>
			<td style="width:163px;">Life Technonogies</td>
			<td style="width:123px;">4311806</td>
			<td>50 &#181;l at 5 U/&#181;l</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:359px;">Specimen Control Size Ladder</td>
			<td style="width:163px;">Invivoscribe Technologies&#160;</td>
			<td>2-096-0020</td>
			<td>33 reactions</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:359px;">IGH Somatic Hypermutation Assay v2.0 - Gel Detection</td>
			<td style="width:163px;">Invivoscribe Technologies&#160;</td>
			<td style="width:123px;">5-101-0030</td>
			<td style="width:197px;">33 reactions, Mix 2 for IGVHFR1 detection</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;">IGH Gene Clonality Assay - Gel Detection</td>
			<td style="width:163px;">Invivoscribe Technologies&#160;</td>
			<td>1-101-0020</td>
			<td style="width:197px;">33 reactions, Tube B for IGVHFR2 detection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GoTaq Flexi DNA Polymerase</td>
			<td>Promega</td>
			<td style="width:123px;">M8291</td>
			<td>20 &#181;l at 5 U/&#181;l</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">10X Tris-Borate-EDTA (TBE) buffer</td>
			<td>Corning (cellgro)</td>
			<td style="width:123px;">46-011-CM</td>
			<td style="width:197px;">6x1 L</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">50X TAE BUFFER&#160;&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>101414-298</td>
			<td style="width:197px;">1 L</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethidium bromide solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1510</td>
			<td style="width:197px;">10 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">25 bp DNA Ladder</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10597011</td>
			<td style="width:197px;">1 &#181;g/&#181;l</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">100 bp DNA Ladder</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15628-019</td>
			<td style="width:197px;">1 &#181;g/&#181;l</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">UltraPure Agarose</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16500-500</td>
			<td style="width:197px;">500 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">40% Acrylamide/Bis Solution</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1610144</td>
			<td style="width:197px;">500 ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td style="width:197px;">50 columns</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:359px;">Agencourt AMPure XP</td>
			<td style="width:163px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:123px;">A63881</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:359px;">Qubit dsDNA High Sensitivity Assay Kit</td>
			<td style="width:163px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:123px;">Q32854</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:359px;">High Sensitivity DNA Kit</td>
			<td style="width:163px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:123px;">5067-4626</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:359px;">2100 Bioanalyzer</td>
			<td style="width:163px;">Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:359px;">PhiX Control v3</td>
			<td style="width:163px;">Illumina</td>
			<td>FC-110-3001</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:359px;">MiSeq</td>
			<td style="width:163px;">Illumina</td>
			<td></td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Qubit 2.0 Fluorometer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q32872</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:359px;">Resuspension buffer (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)</td>
			<td style="width:163px;">Illumina</td>
			<td>FC-121-2001</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:359px;">End repair mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)</td>
			<td style="width:163px;">Illumina</td>
			<td>FC-121-2001</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:359px;">A-tailing mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)</td>
			<td style="width:163px;">Illumina</td>
			<td>FC-121-2001</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:359px;">Ligation mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)</td>
			<td style="width:163px;">Illumina</td>
			<td>FC-121-2001</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:359px;">DNA adaptor index (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)</td>
			<td style="width:163px;">Illumina</td>
			<td>FC-121-2001</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:359px;">Stop ligation buffer (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)</td>
			<td style="width:163px;">Illumina</td>
			<td>FC-121-2001</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:359px;">PCR primer cocktail (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)</td>
			<td style="width:163px;">Illumina</td>
			<td>FC-121-2001</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:359px;">PCR master mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)</td>
			<td style="width:163px;">Illumina</td>
			<td>FC-121-2001</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:359px;">Magnetic stand</td>
			<td style="width:163px;">Life Technologies</td>
			<td align="right">4457858</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:359px;">Gel imaging system</td>
			<td style="width:163px;">Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>170-8370</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

vdj-seq: deep sequencing analysis of rearranged immunoglobulin heavy chain gene to reveal clonal evolution patterns of b cell lymphoma

Anlama tümör klonalite tumorigenezden ve hastalığın ilerlemesi yer alan mekanizmaların anlaşılması için önemlidir. Buna ek olarak, belirli bir mikro-ortam veya uygulamaya yanıt olarak bir tümör içinde meydana klonal bir bileşim değişiklikleri anlama tümör hücrelerini yok etmek için daha gelişmiş ve etkili yöntem tasarımına yol açabilir. Ancak, izleme tümör klonal alt popülasyonları nedeniyle ayırt belirteçlerin eksikliği zor olmuştur. Bu sorunu çözmek için, bir VDJ seq protokol VDJ rekombinasyonu ve somatik hipermutasyona (SHM), B hücreli lenfomalarda iki benzersiz özellikleri istismar ederek diffüz büyük B hücreli lenfoma (DLBCL) nüks klonal evrim modellerini izlemek için oluşturuldu. Bu protokolde, indeksleme potansiyeli ile Yeni Nesil sıralama (NGS) kütüphaneler birincil tanı ve nüks DLBCL samp çiftleri amplifiye yeniden düzenlenmiş immünoglobulin ağır zincir (IgH) VDJ bölgesinden inşa edildiles. Numune başına ortalama milyondan fazla yarısı VDJ dizileri VDJ yeniden düzenleme ve SHM bilgilerini bir arada bulunduran sıralama, sonra elde edildi On. Buna ek olarak, özel biyoinformatik boru hatları tamamen bu örneklerin içinde IgH-VDJ repertuar karakterizasyonu için sırası bilgilerini kullanmak için geliştirilmiştir. Ayrıca, boru hattı yeniden yapılanma ve tanı tümörlerinin tanı ve nüks tümör çiftleri arasındaki klonal evrim kalıpları düşüldükten içinde klonal heterojenite incelenmesini sağlayan bireysel tümörlerin klonal mimarisi, karşılaştırılmasına olanak sağlar. Birkaç tanı nüks çiftleri bu analizi uygularken, birden fazla ayırt edici tümör evrimsel modeller DLBCL nüks yol açabilecek önemli kanıtlar ortaya çıkardı. Ayrıca, bu yaklaşım, minimal rezidüel hastalığın tanımlanması, nüks ilerleme ve tedaviye yanıtı izlemek ve bağışıklık repertuarıyla soruşturma gibi diğer klinik yönlerini içine genişletilebilirolmayan lenfoma bağlamlarda es.

DNA izolasyonu da dahil olmak üzere VDJ sekanslama (VDJ seq), genel prosedür, işleme ve filogenetik analizi okur VDJ bölgesi amplifikasyon ve saflaştırma, sıralama belge konstrüksiyon rekombine, Şekil 1 &#39;de gösterilmiştir. Rutin 5-200 ug DNA alınabilir dondurulmuş katı doku bölümleri veya formalin ile fikse parafine gömülü doku bölümleri 0,5-20 mg DNA. Kalite, yeniden düzenleme desen, ve tek tek numunelerin SHM derecesine bağlı olarak, farklı örneklerden VDJ PCR ürünlerin...

Watch this Scientific Journal Video about VDJ-Seq: Deep Sequencing Analysis of Rearranged Immunoglobulin Heavy Chain Gene to Reveal Clonal Evolution Patterns of B Cell Lymphoma at JoVE.com

VDJ-Seq: Deep Sequencing Analysis of Rearranged Immunoglobulin Heavy Chain Gene to Reveal Clonal Evolution Patterns of B Cell Lymphoma

This protocol describes an approach to interrogate the recombined immunoglobulin heavy chain VDJ regions of lymphomas by deep-sequencing and retrieve VDJ rearrangement and somatic hypermutation status to delineate clonal architecture of individual tumor. Comparing clonal architecture between paired diagnosis and relapse samples reveals lymphoma relapse clonal evolution modes.

VDJ-Seq: B Hücreli Lenfoma klonal Evrim Patterns Reveal Rearranged İmmünglobulin Ağır Zincir Gen Derin Sıralama Analizi

Understanding tumor clonality is critical to understanding the mechanisms involved in tumorigenesis and disease progression. In addition, understanding ...

vdj-seq-deep-sequencing-analysis-rearranged-immunoglobulin-heavy

Research

JoVE Journal

Medicine

26.5K Görüntüleme.  Weill Cornell Medical College. This protocol describes an approach to interrogate the recombined immunoglobulin heavy chain VDJ regions of lymphomas by deep-sequencing and retrieve VDJ rearrangement and somatic hypermutation status to delineate clonal architecture of individual tumor. Comparing clonal architecture between paired diagnosis and relapse samples reveals lymphoma relapse clonal evolution modes. 

Video: VDJ-Seq: Deep Sequencing Analysis of Rearranged Immunoglobulin Heavy Chain Gene to Reveal Clonal Evolution Patterns of B Cell Lymphoma

Dissection of Human Vitreous Body Elements for Proteomic Analysis

The vitreous is an optically clear, collagenous extracellular matrix that fills the inside of the eye and overlies the retina. 1,2 Abnormal interactions between vitreous substructures and the retina underlie several vitreoretinal diseases, including retinal tear and detachment, macular pucker, macular hole, age-related macular degeneration, vitreomacular traction, proliferative vitreoretinopathy, proliferative diabetic retinopathy, and inherited vitreoretinopathies. 1,2 The molecular composition of the vitreous substructures is not known. Since the vitreous body is transparent with limited surgical access, it has been difficult to study its substructures at the molecular level. We developed a method to separate and preserve these tissues for proteomic and biochemical analysis. The dissection technique in this experimental video shows how to isolate vitreous base, anterior hyaloid, vitreous core, and vitreous cortex from postmortem human eyes. One-dimensional SDS-PAGE analyses of each vitreous component showed that our dissection technique resulted in four unique protein profiles corresponding to each substructure of the human vitreous body. Identification of differentially compartmentalized proteins will reveal candidate molecules underlying various vitreoretinal diseases.

This video shows an effective technique for differentiating and dissecting the various semi-transparent structures of the human vitreous body in post mortem eyes.

Proteomik Analizi İnsan Vitreus Gövde Elemanları diseksiyonu

The vitreous is an optically clear, collagenous extracellular matrix that fills the inside of the eye and overlies the retina. 1,2 Abnormal interactions ...

Tıp

Establishment and Propagation of Human Retinoblastoma Tumors in Immune Deficient Mice

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited time. These cultured tumorspheres may exhibit markedly different cellular phenotypes when compared to the original tumors. Demonstration that cultured cells have the capability of forming new tumors is important to ensure that cultured cells model the biology of the original tumor. 
Here we present a protocol for propagating human retinoblastoma tumors in vivo using Rag2-/- immune deficient mice. Cultured human retinoblastoma tumorspheres of low passage or cells obtained from freshly harvested human retinoblastoma tumors injected directly into the vitreous cavity of murine eyes form tumors within 2-4 weeks. These tumors can be harvested and either further passaged into murine eyes in vivo or grown as tumorspheres in vitro. Propagation has been successfully carried out for at least three passages thus establishing a continuing source of human retinoblastoma tissue for further experimentation. 
Wesley S. Bond and Lalita Wadhwa are co-first authors.

A method is described to propagate human retinoblastoma tumors in mice. Tumor cells are directly injected into the eyes of immune deficient mice. Secondary tumors have been successfully established using both cells directly harvested from human tumors and cultured tumorspheres.

Bağışıklık Eksik Fare Kuruluş ve İnsan Retinoblastom Tümörler yayılımı

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited ...

Production and Detection of Reactive Oxygen Species (ROS) in Cancers

Reactive oxygen species include a number of molecules that damage DNA and RNA and oxidize proteins and lipids (lipid peroxydation). These reactive molecules contain an oxygen and include H2O2 (hydrogen peroxide), NO (nitric oxide), O2- (oxide anion), peroxynitrite (ONOO-), hydrochlorous acid (HOCl), and hydroxyl radical (OH-).
Oxidative species are produced not only under pathological situations (cancers, ischemic/reperfusion, neurologic and cardiovascular pathologies, infectious diseases, inflammatory diseases 1, autoimmune diseases 2, etc&hellip;) but also during physiological (non-pathological) situations such as cellular metabolism 3, 4. Indeed, ROS play important roles in many cellular signaling pathways (proliferation, cell activation 5, 6, migration 7 etc..). ROS can be detrimental (it is then referred to as "oxidative and nitrosative stress") when produced in high amounts in the intracellular compartments and cells generally respond to ROS by upregulating antioxidants such as superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT), glutathione peroxidase (GPx) and glutathione (GSH) that protects them by converting dangerous free radicals to harmless molecules (i.e. water). Vitamins C and E have also been described as ROS scavengers (antioxidants).
Free radicals are beneficial in low amounts 3. Macrophage and neutrophils-mediated immune responses involve the production and release of NO, which inhibits viruses, pathogens and tumor proliferation 8. NO also reacts with other ROS and thus, also has a role as a detoxifier (ROS scavenger). Finally NO acts on vessels to regulate blood flow which is important for the adaptation of muscle to prolonged exercise 9, 10. Several publications have also demonstrated that ROS are involved in insulin sensitivity 11, 12.
Numerous methods to evaluate ROS production are available. In this article we propose several simple, fast, and affordable assays; these assays have been validated by many publications and are routinely used to detect ROS or its effects in mammalian cells. While some of these assays detect multiple ROS, others detect only a single ROS.

Production and Detection of Reactive Oxygen Species ROS in Cancers

Here we propose simple methods to test and evaluate the presence of reactive oxygen species in cells.

Kanserler Üretim ve reaktif oksijen türlerinin (ROS Algılama)

Reactive oxygen species include a number of molecules that damage DNA and RNA and oxidize proteins and lipids (lipid peroxydation). These reactive ...

DNA Vector-based RNA Interference to Study Gene Function in Cancer

RNA interference (RNAi) inhibits gene expression by specifically degrading target mRNAs. Since the discovery of double-stranded small interference RNA (siRNA) in gene silencing1, RNAi has become a powerful research tool in gene function studies. Compared to genetic deletion, RNAi-mediated gene silencing possesses many advantages, such as the ease with which it is carried out and its suitability to most cell lines. Multiple studies have demonstrated the applications of RNAi technology in cancer research. In particular, the development of the DNA vector-based technology to produce small hairpin RNA (shRNA) driven by the U6 or H1 promoter has made long term and inducible gene silencing possible2,3. Its use in combination with genetically engineered viral vectors, such as lentivirus, facilitates high efficiencies of shRNA delivery and/or integration into genomic DNA for stable shRNA expression. 
We describe a detailed procedure using the DNA vector-based RNAi technology to determine gene function, including construction of lentiviral vectors expressing shRNA, lentivirus production and cell infection, and functional studies using a mouse xenograft model. 
Various strategies have been reported in generating shRNA constructs. The protocol described here employing PCR amplification and a 3-fragment ligation can be used to directly and efficiently generate shRNA-containing lentiviral constructs without leaving any extra nucleotide adjacent to a shRNA coding sequence. Since the shRNA-expression cassettes created by this strategy can be cut out by restriction enzymes, they can be easily moved to other vectors with different fluorescent or antibiotic markers. Most commercial transfection reagents can be used in lentivirus production. However, in this report, we provide an economic method using calcium phosphate precipitation that can achieve over 90% transfection efficiency in 293T cells. Compared to constitutive shRNA expression vectors, an inducible shRNA system is particularly suitable to knocking down a gene essential to cell proliferation. We demonstrate the gene silencing of Yin Yang 1 (YY1), a potential oncogene in breast cancer4,5, by a Tet-On inducible shRNA system and its effects on tumor formation. Research using lentivirus requires review and approval of a biosafety protocol by the Biosafety Committee of a researcher's institution. Research using animal models requires review and approval of an animal protocol by the Animal Care and Use Committee (ACUC) of a researcher's institution.

RNA interference (RNAi) possesses many advantages over gene knockout and has been broadly used as a tool in gene functional studies. The invention of DNA vector-based RNAi technology has made long term and inducible gene knockdown possible, and also increased the feasibility of gene silencing in vivo.

Kanser gen Fonksiyon Eğitim için DNA vektör tabanlı RNA Girişim

RNA interference (RNAi) inhibits gene expression by specifically degrading target mRNAs. Since the discovery of double-stranded small interference RNA ...

Deep Neuromuscular Blockade Leads to a Larger Intraabdominal Volume During Laparoscopy

Shoulder pain is a commonly reported symptom following laparoscopic procedures such as myomectomy or hysterectomy, and recent studies have shown that lowering the insufflation pressure during surgery may reduce the risk of post-operative pain. In this pilot study, a method is presented for measuring the intra-abdominal space available to the surgeon during laproscopy, in order to examine whether the relaxation produced by deep neuromuscular blockade can increase the working surgical space sufficiently to permit a reduction in the CO2 insufflation pressure. Using the laproscopic grasper, the distance from the promontory to the skin is measured at two different insufflation pressures: 8 mm Hg and 12 mm Hg. After the initial measurements, a neuromuscular blocking agent (rocuronium) is administered to the patient and the intra-abdominal volume is measured again. Pilot data collected from 15 patients shows that the intra-abdominal space at 8 mm Hg with blockade is comparable to the intra-abdominal space measured at 12 mm Hg without blockade. The impact of neuromuscular blockade was not correlated with patient height, weight, BMI, and age. Thus, using neuromuscular blockade to maintain a steady volume while reducing insufflation pressure may produce improved patient outcomes.

This article presents a method for measuring the working abdominal volume during laproscopic myomectomy using the surgical grasper, and applies this technique to obtain pilot data on whether deep neuromuscular blockade (NMB) can enable the use of lower insufflation pressure. Reduced insufflation pressure during laproscopic surgery has been shown to reduce post-operative pain, and thus the use of NMB during surgery may enable improved patient outcomes.

Derin Nöromusküler Abluka Laparoskopi sırasında Büyük Karın İçi Ses yol açar

Shoulder pain is a commonly reported symptom following laparoscopic procedures such as myomectomy or hysterectomy, and recent studies have shown that ...

Detection of Architectural Distortion in Prior Mammograms via Analysis of Oriented Patterns

We demonstrate methods for the detection of architectural distortion in prior mammograms of interval-cancer cases based on analysis of the orientation of breast tissue patterns in mammograms. We hypothesize that architectural distortion modifies the normal orientation of breast tissue patterns in mammographic images before the formation of masses or tumors. In the initial steps of our methods, the oriented structures in a given mammogram are analyzed using Gabor filters and phase portraits to detect node-like sites of radiating or intersecting tissue patterns. Each detected site is then characterized using the node value, fractal dimension, and a measure of angular dispersion specifically designed to represent spiculating patterns associated with architectural distortion.
Our methods were tested with a database of 106 prior mammograms of 56 interval-cancer cases and 52 mammograms of 13 normal cases using the features developed for the characterization of architectural distortion, pattern classification via quadratic discriminant analysis, and validation with the leave-one-patient out procedure. According to the results of free-response receiver operating characteristic analysis, our methods have demonstrated the capability to detect architectural distortion in prior mammograms, taken 15 months (on the average) before clinical diagnosis of breast cancer, with a sensitivity of 80% at about five false positives per patient.

Detection of Architectural Distortion in Prior Mammograms via Analysis of Oriented Patterns

We demonstrate methods for the detection of architectural distortion in prior mammograms. Oriented structures are analyzed using Gabor filters and phase portraits to detect sites of radiating tissue patterns. Each site is characterized and classified using measures to represent spiculating patterns. The methods should assist in the detection of breast cancer.

Önceki mamogram Mimari Bozulma Algılama<em&gt; Via</emOdaklı Patterns&gt; Analiz

We demonstrate methods for the detection of architectural distortion in prior mammograms of interval-cancer cases based on analysis of the orientation of ...

Gene-environment Interaction Models to Unmask Susceptibility Mechanisms in Parkinson's Disease

Lipoxygenase (LOX) activity has been implicated in neurodegenerative disorders such as Alzheimer&#39;s disease, but its effects in Parkinson&#39;s disease (PD) pathogenesis are less understood. Gene-environment interaction models have utility in unmasking the impact of specific cellular pathways in toxicity that may not be observed using a solely genetic or toxicant disease model alone.&#160;To evaluate if distinct LOX isozymes selectively contribute to PD-related neurodegeneration, transgenic (i.e. 5-LOX and 12/15-LOX deficient) mice can be challenged with a toxin that mimics cell injury and death in the disorder.&#160;Here we describe the use of a neurotoxin, 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP), which produces a nigrostriatal lesion to elucidate the distinct contributions of LOX isozymes to neurodegeneration related to PD. The use of MPTP in mouse, and nonhuman primate, is well-established to recapitulate the nigrostriatal damage in PD.&#160;The extent of MPTP-induced lesioning is measured by HPLC analysis of dopamine and its metabolites and semi-quantitative Western blot analysis of striatum for tyrosine hydroxylase (TH), the rate-limiting enzyme for the synthesis of dopamine. To assess inflammatory markers, which may demonstrate LOX isozyme-selective sensitivity, glial fibrillary acidic protein (GFAP) and Iba-1 immunohistochemistry are performed on brain sections containing substantia nigra, and GFAP Western blot analysis is performed on striatal homogenates.&#160;This experimental approach can provide novel insights into gene-environment interactions underlying nigrostriatal degeneration and PD.

Gene-environment Interaction Models to Unmask Susceptibility Mechanisms in Parkinson&#039;s Disease

Lipoxygenase (LOX) isozymes can generate products that may increase or decrease neuroinflammation and neurodegeneration.&#160;A gene-environment interaction study could identify LOX isozyme-specific effects. Using the 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) model of nigrostriatal damage in two LOX isozyme-deficient transgenic lines allows for comparison of the contribution of LOX isozymes on dopaminergic integrity and inflammation.

Parkinson Hastalığında Maskeyi Düşürme Duyarlılık Mekanizmalarına Gen-Çevre Etkileşim Modelleri

Lipoxygenase (LOX) activity has been implicated in neurodegenerative disorders such as Alzheimer&#39;s disease, but its effects in Parkinson&#39;s disease ...

Focus Formation: A Cell-based Assay to Determine the Oncogenic Potential of a Gene

Malignant transformation of cells is typically associated with increased proliferation, loss of contact inhibition, acquisition of anchorage-independent growth potential, and the ability to form tumors in experimental animals1. In NIH 3T3 cells, the Ras signal transduction pathway is known to trigger many of these events, what is known as Ras transformation. The introduction of an overexpressed gene in NIH 3T3 cells may promote morphological transformation and loss of contact inhibition, which can help determine the oncogenic potential of that gene of interest. An assay that provides a straightforward method to assess one aspect of the transforming potential of an oncogene is the Focus Formation Assay (FFA)2. When NIH 3T3 cells divide normally in culture, they do so until they reach a confluent monolayer. However, in the presence of an overexpressed oncogene, these cells can begin to grow in dense, multilayered foci1 that can be visualized and quantified by crystal violet or Hema 3 staining. In this article we describe the FFA protocol with retroviral transduction of the gene of interest into NIH 3T3 cells, and how to quantify the number of foci through staining. Retroviral transduction offers a more efficient method of gene delivery than transfection, and the use of an ecotropic murine retrovirus provides a biosafety control when working with potential human oncogenes.

The Focus Formation Assay provides a straightforward method to assess the transforming potential of a candidate oncogene.

Formation Odak: bir hücreye dayalı tahlil, bir genin onkojenik potansiyeli belirlemek için

Malignant transformation of cells is typically associated with increased proliferation, loss of contact inhibition, acquisition of anchorage-independent ...

Unbiased Deep Sequencing of RNA Viruses from Clinical Samples

Here we outline a next-generation RNA sequencing protocol that enables de novo assemblies and intra-host variant calls of viral genomes collected from clinical and biological sources. The method is unbiased and universal; it uses random primers for cDNA synthesis and requires no prior knowledge of the viral sequence content. Before library construction, selective RNase H-based digestion is used to deplete unwanted RNA &#8212; including poly(rA) carrier and ribosomal RNA &#8212; from the viral RNA sample. Selective depletion improves both the data quality and the number of unique reads in viral RNA sequencing libraries. Moreover, a transposase-based &#39;tagmentation&#39; step is used in the protocol as it reduces overall library construction time. The protocol has enabled rapid deep sequencing of over 600 Lassa and Ebola virus samples-including collections from both blood and tissue isolates-and is broadly applicable to other microbial genomics studies.

This protocol describes a rapid and broadly applicable method for unbiased RNA-sequencing of viral samples from human clinical isolates.

Klinik Örneklerden RNA Virüs tarafsız Derin Sıralama

Here we outline a next-generation RNA sequencing protocol that enables de novo assemblies and intra-host variant calls of viral genomes collected from ...

Application of Biochip Microfluidic Technology to Detect Serum Allergen-specific Immunoglobulin E (sIgE)

Allergic disease is common in both adults and children. Identification of the causative allergens is significant in disease management and prevention. However, a specific immunoglobulin E (IgE) measurement system with a high price-performance ratio is lacking in mainland China, especially in the primary care hospitals. This paper describes the principle and operation procedures of using a microfluidic cartridge-based chemiluminescence system to detect allergen-specific IgE in serum. The results were compared with those from ImmunoCAP (System 1), the industrial standard, and the reproducibility of the system to detect patients sensitized to common allergens is evaluated. The results showed that in comparison with ImmunoCAP (System 1), the BioIC System (System 2) has good precision and sensitivity in detecting serum-specific IgE against various inhalant and food allergens but with a significantly lower cost. It can serve as a good alternative to System 1 in primary care hospitals in mainland China who have lower financial affordability.

Application of Biochip Microfluidic Technology to Detect Serum Allergen-specific Immunoglobulin E sIgE

This paper presents a protocol for detecting serum-specific immunoglobulin E with a microfluidic cartridge-based chemiluminescence system and the evaluation of its usefulness in allergy diagnoses.

Biochip mikrosıvısal teknolojisi uygulama algılamak Serum alerjen özgü immünglobulin e (sIgE)

Allergic disease is common in both adults and children. Identification of the causative allergens is significant in disease management and prevention. ...