This work has been funded in part with Federal funds from the National Institutes of Health, Office of Director, Innovator (No.: DP2OD06514) (PCS) and from the National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, Department of Health and Human Services, under Contracts (No:HHSN272200900018C, HHSN272200900049C and U19AI110818).

Etik bildirimi: Lassa Ateşi hastalarının Tulane Üniversitesi, Harvard Üniversitesi, Broad Enstitüsü, Irrua Uzmanı Eğitim Hastanesi (ISTH), Kenema Devlet Hastanesi (KGH), Sağlık, Ibadan Oyo Devlet Bakanlığı insan denekler komiteleri tarafından onaylanan protokolleri kullanarak bu çalışmaya alındı , Nijerya ve Sağlık Sierra Leone Bakanlığı. Tüm hastalar bakım benzer bir standart ile muamele edildi ve çalışmaya katılmak için karar olup olmadığını ilaç Ribavirin, sunuldu. Lassa Ateşi (LF) hastalarda, Ribavirin ile tedavi şu anda tavsiye edilen kurallar takip ve genellikle kısa sürede LF kuvvetli şüphe gibi sunuldu. Nedeniyle Ebola virüsü Hastalığı (EVD) şiddetli salgın, hasta standart protokoller yoluyla razı olamazdı. EVD hastaların klinik aşırı örneklerin yerine kullanılması değerlendirilir ve Sierra Leone ve Harvard Üniversitesi Kurumsal İnceleme Kurulları tarafından onaylandı. OffiSierra Leone Etik ve Bilimsel İnceleme Komisyonu, Sağlık ve Sanitasyon Sierra Leone Bakanlığı ve İnsan Deneklerin Kullanımına İlişkin Harvard Komitesi ce sırası ve hasta ve temas örneklerinden elde edilen kamuya açık viral dizileri yapmak için rıza bir feragat verdiğinizi Sierra Leone Ebola salgını sırasında toplanan. Bu organlar da salgın yanıt sırasında bakım alma tüm şüpheli EVD hastalardan toplanan de tanımlanan örnekler için klinik ve epidemiyolojik verilerin kullanımını verdi. Sağlık ve Sanitasyon Sierra Leone Bakanlığı da salgın örneklerinin genomik çalışmalar için geniş Enstitüsü ve Harvard Üniversitesi&#39;ne Sierra Leone bulaşıcı olmayan, biyolojik olmayan örneklerin gönderiler onayladı. Örnek RNA (Toplam RNA Çıkarılan kadar 55 ul ~ 4 saat) 1. DNaz tedavi <ol><li> Tablo 1 &#39;de tarif edildiği gibi, bir biyo-güvenlik kabini, buz üzerinde 96 oyuklu bir plaka içerisinde, PCR DNaz reaksiyonu başlatacak </strong&gt; 1.1 (toplam hacim 70 ul / kuyucuk) Adım. Not: Bir ana karışımı hazırlanmış olabilir. </li><li> Vorteks yavaşça ve iyice, sonra 1 dakika için oda sıcaklığında 280 x g&#39;de santrifüjlenir. </li><li> 30 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> RNA Katı Faz Döner İmmobilizasyonu (SPRI) boncuk kullanılarak Temizleme. <ol><li> Sıcak RNA taneleri oda sıcaklığında 30 dakika için. </li><li> Yavaşça yerleşmiş olabilir herhangi bir manyetik parçacıkların tekrar süspansiyon RNA boncuk şişe çalkalanır. DNaz ile muamele edilmiş RNA (70 ul) RNA tanelerin 1.8x hacmi (126 ul) ilave, pipetle 10 kere karıştırmak ve (iyi, 196 ul toplam hacim) oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edilir. </li><li> Manyetik istasyonunda karışımı yerleştirin. (- 10 dk 5) temizlemek için çözüm bekleyin. </li><li> ise pipet ve artıklar ile istasyonda temizlenir çözüm çıkarın. istasyonda da,% 70 etanol ile pelet içeren boncuk yıkama ve 1 dakika boyunca inkübe edin. Pipet ve ıskarta ile etanol çıkarın. İki yıkamadan toplam tekrarlayın. Not: tam olarak% 70 taze hazırlanmış et kullanılmasınumunenin 7 kaybına neden olabilir &lt;% 70 etanol ise daha yüksek bir yüzdesi, küçük ölçekli moleküllerin verimsiz yıkama neden olacaktır olarak HANOL, kritik öneme sahiptir. </li><li> istasyonunda plaka tutun ve kurumaya açık bırakın. Not: boncuk çatlamak başlayana kadar boncuklar tamamen kurumasını bekleyin emin olun. </li><li> RNA elüte etmek için plakaya nükleaz içermeyen su 55 ul ekle. iyice pipetleme boncuk ve su karışımı istasyonundan plakasını sökün. Not: Alternatif olarak, toplam RNA konsantre etmek için (10 ul ≤) daha az su kullanın. </li><li> geri istasyonunda plaka koyun. çözüm uzun süreli depolama için yeni vidalı kapaklı tüp pipet ile transfer temizler kadar bekleyin (-80 ° C). tükenmesi için yeni 96-PCR plaka 5 ul RNA yerleştirin (adım. 2.4). </li><li> İsteğe bağlı. Kaydedin ve rRNA QRT-PCR için 19 ul su (1:20) 1 ul seyreltik (örneğin, 18S, 28S rRNA) (Tablo 2) ve viral belirteçler 5 &lt;/ Li&gt; </ol></li></ol> Viral RNA Numune gelen Ribosomal ve Taşıyıcı RNA 2. Seçici tükenmesi (~ 4 saat) <ol><li> Tablo 1 &#39;de tarif edildiği gibi lineer akrilamid taşıyıcı ile 5x hibridizasyon ve 10x RNase H, reaksiyon tamponları ve nükleaz içermeyen su sağlayın. </li><li> Tablo 1 &#39;de tarif edildiği gibi, bir 96-yuvalı PCR plaka buz üzerinde rRNA tükenmesi oligolar (Tablo 3) ve oligo (dT) RNA birleştirerek melezleştirme reaksiyonu ayarlayın. Not: Bir ana karışımı hazırlanmış olabilir. Özel bir sentetik RNA (ERCCs 8) 50 femtogram (FG), viral sıralama işlemi ve potansiyel indeksi okunur çapraz kontaminasyonu iki izleme için ilave edilebilir. <ol><li> Vorteks yavaşça ve iyice, sonra 1 dakika için oda sıcaklığında 280 x g&#39;de santrifüjlenir. saniyede -0.1 ° C de 45 ° C, 2 dakika, yavaş rampa 95 ° C&#39;de inkübe edin. 45 ° C &#39;de PCR Pause. </li></ol></li><li> açıklandığı gibi buz üzerinde RNaz H reaksiyon karışımı kurmakTablo 1 &#39;de D, daha sonra 2 dakika boyunca 45 ° C&#39;de ısıtın. Not: Bir ana karışımı hazırlanmış olabilir. <ol><li> 45 ° C &#39;de PCR plakası tutarken plaka melezleştirme reaksiyonu, önceden ısıtılmış RNase H karışımı ekleyin. </li><li> 8 kez - Nazik pipetleme 6 ile iyice karıştırın. 30 dakika daha 45 ° C&#39;de inkübe edin. buz üzerine yerleştirin. </li></ol></li><li> Tablo 1 &#39;de tarif edildiği gibi buz üzerinde DNaz Reaksiyon karışımı ayarlama Not:. Bir ana karışımı hazırlanabilir. <ol><li> plaka RNaz H reaksiyonuna ekleme, girdap yavaşça ve iyice, sonra 1 dakika için oda sıcaklığında 280 x g&#39;de santrifüjlenir. 30 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> 5 ul 0.5 M EDTA ilave ederek DNase reaksiyonu durdurun. Vorteks yavaşça ve iyice, sonra 1 dakika için oda sıcaklığında 280 x g&#39;de santrifüjlenir. </li></ol></li><li> Bir 1.8x hacmi (144 ul) boncuk kullanılarak RNA boncuk (adım 1.3) kullanılarak Temizleme. nükleaz içermeyen su 11 ul Zehir. Not: Güvenli soğuk hava deposu, mağaza RN tükenmişBir numuneler -80 ° C Ç / N. </li></ol> 3. cDNA Sentezi (~ 6 saat) <ol><li> Karışım rRNA / 96 oyuklu bir plaka, PCR buz üzerinde rastgele primerler taşıyıcı tükenmiş RNA Tablo 1 &#39;de tarif edildiği gibi, girdap yavaşça ve iyice, sonra 1 dakika için oda sıcaklığında 280 x g&#39;de santrifüjlenir. <ol><li> bir PCR, 10 dakika boyunca 70 ° C&#39;ye kadar karışım ısıtılır. 5 dakika - hemen ısı denatürasyon sonra, 1 buz üzerinde RNA yerleştirin. RNA önce ilk iplikli tepki daha uzun 5 dakika boyunca (hatta buz üzerinde) durmasına izin vermeyin. </li></ol></li><li> Tablo 1 &#39;de tarif edildiği gibi buz üzerinde birinci sarmal sentezi, reaksiyon karışımı ayarlayın. Not: Bir ana-mix hazırlanmış olabilir. <ol><li> plaka RNA / rastgele primer karışımı ekleyin, girdap yavaşça ve iyice, sonra 1 dakika için oda sıcaklığında 280 x g&#39;de santrifüjlenir. 10 dakika boyunca 25 ° C&#39;de - 22 C&#39;de inkübe edilir. </li><li> 60 dakika boyunca bir hava kuluçka makinesi içinde 55 ° C&#39;de inkübe edin. Tepkimeyi sonlandırmak için buz üzerinde plaka koyun. DeğilE: Hava kuluçka kullanımı primerleri tavlama ve ilk şerit uzunlamasına başlar sırasında birinci dal reaksiyonu yavaş yavaş ısınmaya oluşturmak için tavsiye edilir. </li></ol></li><li> Tablo 1 &#39;de tarif edildiği gibi buz üzerinde ikinci sarmal sentezi, reaksiyon karışımı ayarlayın. Not: Bir ana-mix hazırlanmış olabilir. <ol><li> plaka birinci sarmal sentezi, reaksiyon ekleme, girdap yavaşça ve iyice, sonra 1 dakika için oda sıcaklığında 280 x g&#39;de santrifüjlenir. 16 ° C (25 ° C &#39;de kapağı tutmak) 2 saat süreyle inkübe edin. sıcaklığın 16 ° C&#39;nin üzerine çıkmasına izin vermeyin. </li><li> daha sonra 1 dakika için oda sıcaklığında 280 x g&#39;de santrifüj, yumuşak ve iyice karıştırın, 0.5 M EDTA, 5 ul ekleyerek reaksiyonu inaktive, buz üzerinde plaka koyun. </li></ol></li><li> boncuklar 1.8x hacmi (153 ul) kullanılarak DNA boncuk (protokolü için adım 1.3) ile Temizleme. Elüsyon tamponu 9 ul (EB) &#39;de Zehir. ölçümü için 1 ul kaydedin. subseque için cDNA 1 ng kullanımınt adımlar. cDNA konsantrasyonu tespit tagmentation için cDNA 4 ul kullanmak için çok düşük ise (adım 4.1). </li><li> Güvenli soğuk hava deposu, mağaza at cDNA çift sarmallı 4 ° CO / N veya -20 Uzun süreli depolama için ° C. </li></ol> 4. Kütüphane Hazırlık - DNA Kütüphane İnşaatı (~ 4 saat) <ol><li> Gerekirse, 96 oyuklu bir plakaya transfer cDNA 4 ul ve bir ikinci girişimde kalan cDNA kaydedin. </li><li> Tablo 1 &#39;de tarif edildiği gibi buz üzerinde tagmentation reaksiyonu ayarlayın. Not: Bir ana-mix hazırlanmış olabilir. arka plan ve genel maliyeti azaltmak için, tagmentation reaksiyonun toplam hacmi 20 ila 10 ul arasında azaltılır. CDNA, kısıtlayıcı bir faktör olduğu için, reaksiyonda kullanılan ATM (yani, transposome) miktarı, aynı zamanda entegrasyon sitelerinden sayısını azaltmak için azaltılır. <ol><li> 1 dakika boyunca (oda sıcaklığında) 280 xg&#39;de yavaşça ve iyice ve santrifüj plaka, girdap cDNA için tagmentation karışımı ekleyin.10 ° C&#39;de tutun 5 dakika boyunca 55 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Bir kez 10 ° C&#39;de hemen reaksiyonu sona erdirmek için nötralize Tagment tamponu (NT) 2.5 ul ekle. yukarı pipetleme karıştırın ve aşağı, sonra 1 dakika boyunca (oda sıcaklığında) 280 xg&#39;de santrifüj. </li><li> 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. </li></ol></li><li> Tablo 1 &#39;de tarif edildiği gibi buz üzerinde PCR amplifikasyon reaksiyonu ayarlayın. <ol><li> Vorteks yavaşça ve iyice, sonra 1 dakika için oda sıcaklığında 280 x g&#39;de santrifüjlenir. </li><li> Tablo 1 &#39;de tarif edilen koşullar kullanılarak ısıl PCR gerçekleştirin. Not: PCR 12 çevrim tagmented cDNA 1 ng önerilmektedir; Ancak, viral klinik örneklerin çoğu kez cDNA belirlenemeyen miktarda var. cDNA (&lt;1 ng) düşük miktarlar için, sıralama için yeterli bir kütüphane oluşturmak için PCR 18 döngü kadar kullanabilirsiniz. </li></ol></li><li> Kütüphane Hazırlık - temizleme ve sıralama için havuzu <ol><li> EB ile 50 ul örnek getirin. </li><li> ile Temizleme0.6x hacmi (30 ul) boncuk kullanılarak DNA boncukları (protokolü için adım 1.3). 15 ul EB Zehir. </li><li> Bölge analizinden astar dimerleri (~ 120 bp) hariç Bioanalyzer yazılımını 9 kullanarak bölge analizi (150 bp 1,000) yaparak kitaplığı (Şekil 3) konsantrasyonunu belirlemek. Not: Alternatif olarak, qPCR kütüphaneleri 10 ölçmek için kullanılabilir. </li><li> 1 nM ya da daha düşük mol konsantrasyonda Havuz kütüphaneleri. Kütüphane 1 nM altında ise bu kütüphanelerden dizi bilgileri yakalamak için havuz (diğer kütüphanelerin ~ 1x hacmi) için kütüphaneye küçük bir hacim kazandırmak. </li><li> Yukarıda belirtildiği gibi 0.7x DNA boncuklar ile temizleme havuzu (bkz: adım 2). 15 ul EB Zehir. Not: tanelerin hacmi havuzunda nihai hacmine bağlı olacaktır. </li><li> Havuz 9 analiz edin. Bölge analizi (150 bp 1,000) 9 yaparak molar konsantrasyonunu belirlemek. Not: Alternatif olarak, qPCR kütüphanesi havuz 10 &lt;ölçmek için kullanılabilir/ Sup&gt;. </li><li> Çift barkod 11 okur ile 101 bp oluşturmak için 22:00 kütüphane konsantrasyonda yük sequencer, paired-end okur. </li></ol></li></ol><img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54117/54117fig3.jpg" /> Ebola virüsü Klinik Örneklerden inşa 3. Kütüphaneler Şekil. 4 temsilci Ebola virüsü (EboV) kütüphanelerin Jel görüntüsünü. Kütüphane ve astar dimerleri Bölgeler gösterilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54117/54117fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

<ol>
	<li>Stremlau, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+novel+rhabdoviruses+in+the+blood+of+healthy+individuals+from+West+Africa.">Discovery of novel rhabdoviruses in the blood of healthy individuals from West Africa.</a> PLoS Negl Trop Dis. 9, e0003631 (2015).</li><li>Gire, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+surveillance+elucidates+Ebola+virus+origin+and+transmission+during+the+2014+outbreak.">Genomic surveillance elucidates Ebola virus origin and transmission during the 2014 outbreak.</a> Science. 345, 1369-1372 (2014).</li><li>Morlan, J. D., Qu, K., Sinicropi, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+depletion+of+rRNA+enables+whole+transcriptome+profiling+of+archival+fixed+tissue.">Selective depletion of rRNA enables whole transcriptome profiling of archival fixed tissue.</a> PLoS One. 7, e42882 (2012).</li><li>Park, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ebola+Virus+Epidemiology,+Transmission,+and+Evolution+during+Seven+Months+in+Sierra+Leone.">Ebola Virus Epidemiology, Transmission, and Evolution during Seven Months in Sierra Leone.</a> Cell. 161, 1516-1526 (2015).</li><li>Andersen, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+Sequencing+Uncovers+Origins+and+Evolution+of+Lassa+Virus.">Clinical Sequencing Uncovers Origins and Evolution of Lassa Virus.</a> Cell. 162, 738-750 (2015).</li><li>Matranga, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+methods+for+unbiased+deep+sequencing+of+Lassa+and+Ebola+RNA+viruses+from+clinical+and+biological+samples.">Enhanced methods for unbiased deep sequencing of Lassa and Ebola RNA viruses from clinical and biological samples.</a> Genome Biol. 15, 519 (2014).</li><li>Tang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq+analysis+to+capture+the+transcriptome+landscape+of+a+single+cell.">RNA-Seq analysis to capture the transcriptome landscape of a single cell.</a> Nat Protoc. 5, 516-535 (2010).</li><li>Jiang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+spike-in+standards+for+RNA-seq+experiments.">Synthetic spike-in standards for RNA-seq experiments.</a> Genome Res. 21, 1543-1551 (2011).</li><li>. Kapa Biosystems Available from: <a target="_blank" href="https://www.kapabiosystems.com/product-applications/products/next-generation-sequencing-2/library-quantification/">https://www.kapabiosystems.com/product-applications/products/next-generation-sequencing-2/library-quantification/</a> (2015)</li><li>. Illumina Technologies Available from: <a target="_blank" href="https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/system_documentation/miseq/preparing-libraries-for-sequencing-on-miseq-15039740-d.pdf">https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/system_documentation/miseq/preparing-libraries-for-sequencing-on-miseq-15039740-d.pdf</a> (2015)</li><li>Kircher, M., Sawyer, S., Meyer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+indexing+overcomes+inaccuracies+in+multiplex+sequencing+on+the+Illumina+platform.">Double indexing overcomes inaccuracies in multiplex sequencing on the Illumina platform.</a> Nucleic Acids Res. 40, 3 (2012).</li><li>Trombley, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+panel+of+real-time+TaqMan+polymerase+chain+reaction+assays+for+detection+and+absolute+quantification+of+filoviruses,+arenaviruses,+and+New+World+hantaviruses.">Comprehensive panel of real-time TaqMan polymerase chain reaction assays for detection and absolute quantification of filoviruses, arenaviruses, and New World hantaviruses.</a> Am J Trop Med Hyg. 82, 954-960 (2010).</li><li>Hu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+high-resolution+analysis+of+blood+virome+and+host+cytokines+expression+profile+of+a+patient+with+fatal+H7N9+infection+by+massively+parallel+RNA+sequencing.">Serial high-resolution analysis of blood virome and host cytokines expression profile of a patient with fatal H7N9 infection by massively parallel RNA sequencing.</a> Clin Microbiol Infect. 21, 713 (2015).</li><li>Simon-Loriere, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+lineages+of+Ebola+virus+in+Guinea+during+the+2014+West+African+epidemic.">Distinct lineages of Ebola virus in Guinea during the 2014 West African epidemic.</a> Nature. 524, 102-104 (2015).</li><li>Folarin, O. A., Happi, A. N., Happi, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Empowering+African+genomics+for+infectious+disease+control.">Empowering African genomics for infectious disease control.</a> Genome Biol. 15, 515 (2014).</li><li>Blainey, P. C., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+MDA+for+enumeration+of+total+nucleic+acid+contamination.">Digital MDA for enumeration of total nucleic acid contamination.</a> Nucleic Acids Res. 39, 19 (2011).</li><li>Malboeuf, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+viral+RNA+genome+sequencing+of+ultra-low+copy+samples+by+sequence-independent+amplification.">Complete viral RNA genome sequencing of ultra-low copy samples by sequence-independent amplification.</a> Nucleic Acids Res. 41, 13 (2013).</li><li>Gonzalez, I. L., Sylvester, J. E., Smith, T. F., Stambolian, D., Schmickel, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosomal+RNA+gene+sequences+and+hominoid+phylogeny.">Ribosomal RNA gene sequences and hominoid phylogeny.</a> Mol Biol Evol. 7, 203-219 (1990).</li><li>Adiconis, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+RNA+sequencing+methods+for+degraded+or+low-input+samples.">Comparative analysis of RNA sequencing methods for degraded or low-input samples.</a> Nat Methods. 10, 623-629 (2013).</li></ol>

The authors have no competing financial interests.

Özetlenen yaklaşım sağlam, evrensel, hızlı sıralama sağlar ve 2014 mihrak 2,4 sırasında Ebola virüsü sıralanması için kullanılmıştır. tagmentation kütüphane yapımı seçici tükenmesi ve cDNA sentezi birleşerek, genel işlem süresi bir önceki bağdaştırıcı ligasyon yöntemleri ~ 2 gün kadar azaltılmıştır. Daha yakın zamanlarda, bu protokol büyük bir başarı 15,16 ile uluslararası işbirlikçileri ve diğerleri tarafından istihdam edildi ve yerel genomik tabanlı araştırmalar ve teşhis 17 desteklemek için Batı Afrika&#39;da laboratuarlara görevlendirilecek. Burada açıklanan protokol Viral RNA&#39;ya DİZİ kütüphaneleri için cDNA hazırlamak için rastgele primerler kullanılır. Önceki Viral RNA&#39;ya DİZİ yaklaşımlardan farklı olarak, hiçbir özel bir virüs ya da dalının için sekans verileri veya karmaşık ve zaman alıcı bir primer tasarımı hakkında önsel bir bilgi gerektirmektedir. yöntem, herhangi bir viral RNA numunesinin tatbik edilebilir. Örneğin, her iki Ebola viral içeriği oluşturmak için kullanılanve Lassa örnekleri 6. Protokolü ayrıca ana transcriptomic, metagenomic ve patojen bulma dizi projelerine 1 için de kullanılabilir. protokol kritik bir safha, Rnaz H sindirim, yüksek verimli viral örnekleri istenmeyen bir taşıyıcı ve konakçı RNA çıkarmak için düşük maliyetli bir yöntemdir hedeflenmektedir. protokol seçici tükenmesi adımı birçok bileşenleri kullanır ve beceri ve doğruluk gerektirir. Ekstra zaman ve bakım ilk kurulum sırasında alınmalıdır. çoğu klinik serum ve plazma numuneleri genellikle çok az nükleik asit malzeme var gibi, kirlenme ve örnek kaybı yaygındır. Bu protokolü kullanırken bu sorunları önlemek için, özel bakım alınmalıdır. İlk olarak, RNA ayrışma son derece duyarlı olduğu; Bu nedenle tüm alanları temiz ve nükleazlar arındırılmış olmalıdır. İkinci olarak, bu protokolde kullanılmak için müsait örnekleri belirlemek için, her iki ana RNA ve virüs için QRT-PCR miktarının 5,6 kullanılmalıdır </sus&gt;. Giriş karşılaştıran protokolden sıralama sonuçları, sıralama başarı ile miktarlar zaman (yani, tam viral montaj için yeterli veri nesil) en az 100 pg toplam RNA ve virüsün 1,000 kopya içeren örnekleri ile ilişkili. Nükleik asitlerin, çevresel kaynaklardan Üçüncü olarak, maruz kaçınılmalıdır. Burada özetlenen protokol güvenlik önlemleri için bir biyogüvenlik kabini ve çevre kirleticileri sınırlamak için yapılır. Ayrıca, bizim grup ve diğerleri ticari enzimler düşük girdi örneklerinde 6,18 bakteriyel nükleik asitlerin kirletici başka bir kaynak olabileceğini fark etmiş. Temiz bir çalışma alanı (örneğin PCR kaput, biyogüvenlik kabini) ve negatif kontrollerin kullanımı (örneğin, su veya tampon), sırasıyla hafifletmek ve kirlenmeyi izlemenize yardımcı olacaktır. numuneler için &lt;toplam RNA 100 ug, sadece poli (rA), taşıyıcı RNA değil, rRNA, malzeme kaybını sınırlarken, yüksek kaliteli dizileme sonuçları elde etmek için tükenmiş edilmelidir. çokpoli (rA), taşıyıcı cDNA sentezi önce çıkarılmalıdır, ancak düşük giriş örnekleri, cDNA amplifikasyon yöntemleri, 19 daha uygun olabilir. Ev sahibi rRNA tükenmesi dizileme kütüphaneleri viral içeriğinden zenginleştiren ve serum veya plazma, kemirgenler ve insan olmayan primatlar 5,6 dokuların çok tip dahil olmak üzere farklı Numune alım için de geçerlidir. 28S rRNA tükenmesi sonra kalan insan olmayan organizmalar, rRNA, insan ve diğer türler 6,20 arasında daha az korunmuş bir 28S düşündürmektedir hizalama okunur. Insan olmayan izolatlar, bu yöntem kullanılarak, belirli bir ana bilgisayar 3,21 ıraksak rRNA dizilerine tamamlayıcı DNA oligo ile tamamlamak için gerekli olabilir. Protokol tarafsız olduğu viral toplam kütüphanesi içeriğinin sadece küçük bir bölümünü temsil edebilir okur. rRNA en bol konak RNA türlerinin ve sadece rRNA küçük bir yüzdesini okur (olmasına rağmen0% 1), seçici yok olmasından sonra, tüm diğer konakçı RNA (örneğin mRNA) yok olmasından sonra kalır ve bir çok dizi örnek okur için hesap bulunur. Bu nedenle &quot;örnekleme&quot; (yani, oversequencing), ayrı ayrı kütüphaneler, viral düzeneği ve varyant aramalar için yeterli kapsama alanı elde etmek için gereklidir. Bizim çalışmaları için, biz dizisine ~ 20 milyon viral genomik ve ilişkili varyantların analizi için yeterli derinlik yanı sıra metagenomic içeriğin 2,5 olması numune başına okur girişimi. metagenomic ve patojen bulma çalışmaları için, konakçı DNA kirletici DNase sindirilerek kaldırılır dikkat etmek önemlidir. Bu nedenle DNA genomları ihtiva virüs ve diğer patojenleri sürecinde kaybolmuş olabilir, ancak RNA ara yine sıralı olabilir.

Klinik kaynaklardan virüslerin Gelecek nesil dizileme iletimi ve enfeksiyonların epidemiyolojisi, yanı sıra teşhis yardım desteği romanı, aşı ve tedavi gelişimini bilgilendirebilir. rastgele primerler kullanılarak cDNA sentez farklı eş bulaşmaya genomları ya da yeni bir virüs 1,2 algılama ve montaj sağladı. diğer tarafsız yöntemlerinde olduğu gibi, istenmeyen kirletici birçok sıralama okur ve olumsuz sıralama sonuçlarını etkileyebilir işgal. Sunucu ve poli (rA) taşıyıcı RNA birçok mevcut viral örnek koleksiyonlarında mevcut kirletici maddelerdir. protokol tarafsız toplam RNA seq dayalı derin sıralama RNA virüsüdür genom verimli ve maliyet-etkin bir şekilde açıklamaktadır. Yöntem istenmeyen konak ribozomal ve taşıyıcı RNA kaldırmak için bir RNase H seçici tükenmesi adımı 3 kullanır. Zayıflatılması viral içeriğine (Şekil 1) için zenginleştirir ve dizi verileri kalitesini artırırKlinik örneklerden (Şekil 2). Ayrıca, tagmentation önemli ölçüde kütüphane oluşturma süresini azaltır protokol uygulanır. Bu yöntemler, hızlı bir şekilde Ebola ve Lassa virüsü genomlarının 2,4,5 büyük veri kümelerini üretmek için kullanılmış ve RNA virüslerinin geniş bir çalışma için kullanılabilir. Son olarak, bu yaklaşım, insan örnekleri ile sınırlı değildir; zayıflatılması yardımcı Lassa enfekte kemirgen ve insan olmayan primat hastalık modellerinde 5,6 toplanan doku örnekleri üzerinde gösterilmiştir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54117/54117fig1.jpg" /> Şekil 1. Toplam RNA İçerik Zenginleştirme Seçici tükenmesi kullanarak Lassa Virüsü İçerik yansıtır. Dokuz farklı klinik izole edilen rRNA tükenmesi üzerine genel içerik (RNA girişi) ve benzersiz Lassa virüsü (LASV) zenginleşmesine okur (Kütüphane içerik) başlatılıyor. Bu Şekil 6, modifiye edilmiş <em&gt;. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54117/54117fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54117/54117fig2.jpg" /> Şekil 2. Yüksek Kalitede Dizi Taşıyıcı RNA tükenmesi. Poli sıralama döngüsü (rA) başına medyan baz nitelikleri Lassa virüsü kitaplıkları (kırmızı) ve QC raporu 13 den kontrol (siyah kütüphanesinde gözlenen hiçbir taşıyıcı) Kontamine sonra. Hem 1 okumak ve eşleştirilmiş sonu 2 kitaplık BAM dosyasında birleştirilir okur ve kalite puanları her üssünde gösterilmiştir okuyun. Bu rakam 6&#39;dan modifiye edilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54117/54117fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> çıkarılan doğrudan kütüphanelerin viral RNA seq protokol detayları inşaatRNA klinik ve biyolojik örneklerden topladı. kişisel güvenliğini sağlamak için, tüm viral serum, plazma ve doku örnekleri RNA ekstraksiyonu öncesinde uygun tamponlar içinde inaktive edilmelidir. Bazı inaktivasyonu ve çıkarma kitleri, taşıyıcı poli (rA) RNA dahildir; Bu ilk RNase H zayıflatılması aşaması esnasında çıkarılır. tam iyileşme göre taşıyıcı RNA beklenen konsantrasyonu, 100 ng / ml. Protokolde, 110 ng / | il oligo dT RNA (1.1x taşıyıcı yoğunluğu) azalması için kullanılmaktadır. poli (rA), taşıyıcı numunede mevcut değilse, o zaman, oligo (dT) azalması önce ilave edilmemelidir. Aşağıdaki protokol (250 ul hacim kadar) PCR levha formatında 24 reaksiyonlar için tasarlanmıştır. Bu protokolün bir önceki sürümü Matranga, vd bildirildi. 6..

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="965">
	<tbody>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;width:376px;">96-Well PCR Plates</td>
			<td style="width:183px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">47743-953</td>
			<td style="width:289px;"></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">Strips of Eight Caps</td>
			<td>VWR</td>
			<td>47745-512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">Nuclease-free water</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9937</td>
			<td>50 ml bottle</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">TURBO DNase&#160;</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM2238</td>
			<td>post RNA extraction step, 2 U/&#181;L, buffer included</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">PCR cycler</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any PCR cyclers&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">Agencourt RNAClean XP SPRI beads&#160;</td>
			<td>Beckman Coulter Genomics</td>
			<td>A63987</td>
			<td>beads for RNA cleanup</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">Real Time qPCR system</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any system</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">DynaMag-96 Side Skirted Magnet</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">70% Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>prepare fresh</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">qRT-PCR primers</td>
			<td>IDT DNA</td>
			<td></td>
			<td>see Table 2</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">5M NaCl&#160;</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9760G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">1M Tris-HCl pH 7.4&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T2663-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">1M Tris-HCl pH 7.5&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15567-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">1M MgCl2&#160;</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9530G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">Linear acrylamide&#160;</td>
			<td>Ambion&#160;</td>
			<td>AM9520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">DNA oligos covering entire rRNA region</td>
			<td>IDT DNA</td>
			<td></td>
			<td>see Table 3, order lab-ready at 100 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">Oligo (dT)</td>
			<td>IDT DNA</td>
			<td></td>
			<td>40 nt long, desalted</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">Hybridase Thermostable RNase H&#160;</td>
			<td>Epicentre</td>
			<td>H39100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">RNase-free DNase Kit&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79254</td>
			<td>post selective depletion step</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">SUPERase-In RNase Inhibitor</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM2694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">Random Primers&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>48190-011</td>
			<td>mostly hexamers</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">10 mM dNTP mix</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0447L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">SuperScript III Reverse Transcriptase&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18080-093</td>
			<td>with first-strand buffer, DTT</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">Air Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any air incubator cyclers&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">NEBNext Second Strand Synthesis (dNTP-free) Reaction Buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B6117S</td>
			<td>10x</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">E. coli DNA Ligase&#160;</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0205L</td>
			<td>10 U/&#956;l</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">E. coli DNA Polymerase I&#160;</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0209L</td>
			<td>10 U/&#956;l</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">E. coli RNase H&#160;</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0297L</td>
			<td>2 U/&#956;l</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">0.5M EDTA</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">Agencourt AMPure XP SPRI beads</td>
			<td>Beckman Coulter Genomics</td>
			<td>A63881</td>
			<td>beads for DNA cleanup</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">Elution Buffer&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td></td>
			<td>10 mM Tris HCl, pH 8.5</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">Quant-iT dsDNA HS Assay Kit&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">Qubit fluorometer&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32857</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">Nextera XT DNA Sample Prep Kit&#160;</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-131-1096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">Nextera XT DNA Index Kit&#160;</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-131-1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">Tapestation 2200</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2965AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">High Sensitivity D1000 reagents</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-5585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">High Sensitivity D1000 ScreenTape</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-5584</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">BioAnalyzer 2100&#160;</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">High Sensitivity DNA reagents</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">Library Quantification Complete kit (Universal)</td>
			<td>Kapa Biosystems</td>
			<td>KK4824</td>
			<td>alternative to tapestation, bioanalyzer for library quantification</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

unbiased deep sequencing of rna viruses from clinical samples

Burada de novo meclisleri ve klinik ve biyolojik kaynaklardan toplanan viral genom içi konak varyant aramaları sağlayan yeni nesil RNA sıralama protokol özetlemektedir. yöntem tarafsız ve evrensel olduğu; Bu cDNA sentezi için, rastgele primerler kullanarak ve viral sekans içeriğine hiçbir ön bilgi gerektirir. dahil olmak üzere, poli (rA) taşıyıcı ve ribozomal RNA - - Viral RNA numunesinden kütüphane yapımı önce seçici RNase H tabanlı sindirim istenmeyen RNA tüketmek için kullanılır. Seçici tükenmesi veri kalitesini ve benzersiz sayısının viral RNA dizileme kütüphanelerde okur hem geliştirir. genel kütüphane oluşturma süresini azaltır Üstelik, bir transposaz dayalı &#39;tagmentation&#39; aşamalı protokol kullanılır. protokol hızlı derin sıralama sağladı 600&#39;ün üzerinde Lassa ve Ebola virüsü örnekleri dahil kan ve doku hem izolatları-ve diğer mikrobik genomik çalışmalar geniş çapta uygulanabilir tahsilatlar.

açıklanan protokol eşsiz viral içerik zenginleştirici ise yüksek kaliteli dizileme nesil düşük giriş viral RNA örnekleri okur sağlar. Şekil 1 &#39;de gösterildiği gibi, bir protokol en az 18S rRNA (~ 100 pg toplam RNA)&#39; in en az bir milyon adet olan (sigara tükenmiş kontroller ile karşılaştırıldığında) Bütün numuneler, beş kat özgü Lassa virüsü içerik zenginleştirilmiş. Benzer şekilde, dizi başarısı, belirli bir örnek içinde virüs miktarı ile korelasyon gösterdi. Viral miktar için bir vekil, ~ en sık tam montajları oluşturulan 1.000 veya daha fazla virüs genom kopyaları içeren numune olarak QRT-PCR kullanılarak (veriler gösterilmemiştir). Ayrıca, poli (rA) taşıyıcının deliği (Şekil 2) okur temiz preparasyonlarda elde edilen ve daha iyi kalitede sıralama sağlanması kütüphanelerinde A ve T homopolimer dizileri azaltır. düşük giriş viral klinik örneklerden Final kütüphaneler genellikle 150 1000 bp geniş bir fragman uzunluğa sahip(Şekil 3). Sıralama sonra, havuz 12 içindeki kütüphaneleri arasında örnek yanlış tanımlanma problemleri ve karışma azaltmak için, sadece index 25 (S25) bir taban kalite puanı ile okur ve sıfır uyumsuzlukları demultiplexing sürecinde tutulur emin olun. Viral genom farklı virüs 2,4-6 özgü biyoenformatik boru hattı kullanılarak birleştirilebilir. Bu araçlar https://github.com/broadinstitute/viral-ngs ya da ticari bulut platformları 4 edinilebilir. <table border="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Adım 1.1: DNaz tepki </td><td></td></tr><tr><td> reaktif </td><td> Reaksiyon başına hacim (ul) </td></tr><tr><td> 10x DNaz tamponu </td><td> 7 </td></tr><tr><td> Nükleaz içermeyen su </td><td> 6 </td></tr><tr><td> Çıkarılan viral RNA&#39;nın </td><td> 55 </td></tr><tr><td> DNase (2 U / &amp; #181 L) </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Toplam ses </td><td> 70 </td></tr><tr><td> 5x hibridizasyon tamponu: 2.1 Adım </td><td></td></tr><tr><td> reaktif </td><td> 1 ml hacim (ul) </td></tr><tr><td> 5 M NaCI </td><td> 200 </td></tr><tr><td> 1 M Tris-HCl (pH 7.4) </td><td> 500 </td></tr><tr><td> Nükleaz içermeyen su </td><td> 300 </td></tr><tr><td> Toplam ses </td><td> 1000 </td></tr><tr><td> Adım 2.1: 10x RNaz H reaksiyon tamponu </td><td></td></tr><tr><td> reaktif </td><td> 1 ml hacim (ul) </td></tr><tr><td> 5 M NaCI </td><td> 200 </td></tr><tr><td> 1 M Tris-HCl (pH 7.5) </td><td> 500 </td></tr><tr><td> 1 M MgCI2 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> Nükleaz içermeyen su </td><td> 500 </td></tr><tr><td> Toplam ses </td><td> 1000 </td></tr><tr><td> Aşama 2.1: su wi sayılı lineer akrilamid </td><td></td></tr><tr><td> reaktif </td><td> 1 ml tampon için Volume (ul) </td></tr><tr><td> Nükleaz içermeyen su </td><td> 992 </td></tr><tr><td> Doğrusal akrilamid (5 mg / ml) </td><td> 8 </td></tr><tr><td> Toplam ses </td><td> 1000 </td></tr><tr><td colspan="2"> Aşama 2.2: zayıflatılması için bir melezleştirme tepkimesi </td></tr><tr><td> reaktif </td><td> Reaksiyon başına hacim (ul) </td></tr><tr><td> 5x hibridizasyon tampon </td><td> 2 </td></tr><tr><td> rRNA-tükenmesi oligo karışımı (100 uM) </td><td> 1.22 </td></tr><tr><td> Oligo (D) S (550 ng / | il), </td><td> 1 </td></tr><tr><td> DNaz ile muamele edilmiş toplam RNA, </td><td> 5 e kadar </td></tr><tr><td> Spike-RNA (Bu isteğe bağlıdır) </td><td> 0.5 </td></tr><tr><td> Su (lineer akrilamid ile) </td><td> 10 toplam getirmek </td></tr><tr><td> Toplam VOLUben mi </td><td> 10 </td></tr><tr><td colspan="2"> Adım 2.3: seçici tükenmesi için RNaz H tepki </td></tr><tr><td> reaktif </td><td> Reaksiyon başına hacim (ul) </td></tr><tr><td> 10x RNase H Reaksiyon Tamponu </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Su (lineer akrilamid ile) </td><td> 5 </td></tr><tr><td> Termo RNaz H (5 U / ul) </td><td> 3 </td></tr><tr><td> Toplam ses </td><td> 10 </td></tr><tr><td colspan="2"> Adım 2.4: DNaz reaksiyon sonrası seçici tükenmesi </td></tr><tr><td> reaktif </td><td> Reaksiyon başına hacim (ul) </td></tr><tr><td> 10x DNaz Tampon </td><td> 7.5 </td></tr><tr><td> Su (lineer akrilamid ile) </td><td> 44.5 </td></tr><tr><td> RNaz inhibitörü (20 U / ul) </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Rnaz içermeyen Dnaz I (2.72 U / ml) </td><td> 2 </td></tr&gt; <tr><td> Toplam hacim (Rnaz H reaksiyonu ile) </td><td> 75 </td></tr><tr><td colspan="2"> Adım 3.1: cDNA sentezi, rasgele primer melezleme </td></tr><tr><td> reaktif </td><td> Reaksiyon başına hacim (ul) </td></tr><tr><td> rRNA / taşıyıcı tükenmiş RNA </td><td> 10 </td></tr><tr><td> 3 ug rasgele primer </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Toplam ses </td><td> 11 </td></tr><tr><td> Aşama 3.2: Birinci sarmal cDNA sentez reaksiyonu </td><td></td></tr><tr><td> reaktif </td><td> Hacim (ul) </td></tr><tr><td> 5x İlk Strand Reaction Buffer </td><td> 4 </td></tr><tr><td> 0.1 M DTT </td><td> 2 </td></tr><tr><td> 10 mM dNTP karışımı </td><td> 1 </td></tr><tr><td> RNaz inhibitörü (20 U / ul) </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Ters transkriptaz (son ekleyin) </td><td> 1 </td></tr><tr><td> (Yukarıdaki RNA) ile toplam hacmi &lt;/ Td&gt; <td> 20 </td></tr><tr><td colspan="2"> Adım 3.3: İkinci iplik cDNA sentezi reaksiyonu </td></tr><tr><td> reaktif </td><td> Hacim (ul) </td></tr><tr><td> RNaz içermeyen su </td><td> 43 </td></tr><tr><td> 10x İkinci Strand Reaction Buffer </td><td> 8 </td></tr><tr><td> 10 mM dNTP karışımı </td><td> 3 </td></tr><tr><td> E. Coli DNA ligaz (10 U / ul) </td><td> 1 </td></tr><tr><td> E. coli DNA polimeraz I (10 U / ul) </td><td> 4 </td></tr><tr><td> E.coli RNaz H (2 U / ml) </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Toplam hacim (1 inci iplikçik reaksiyon) </td><td> 80 </td></tr><tr><td> Adım 4.2: Tagmentation reaksiyonu </td><td></td></tr><tr><td> reaktif </td><td> Hacim (ul) </td></tr><tr><td> Amplikon Tagment Mix (ATM) </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Tagment DNA Tampon (TD) </td&gt; <td> 5 </td></tr><tr><td> Toplam hacim (cDNA) </td><td> 10 </td></tr><tr><td> Kütüphane PCR reaksiyonu: 4.3 Adım </td><td></td></tr><tr><td> reaktif </td><td> Hacim (ul) </td></tr><tr><td> PCR Master Mix (YKY) </td><td> 7.5 </td></tr><tr><td> Endeks 1 astar (i7) </td><td> 2.5 </td></tr><tr><td> Endeks 2 primer (i5) </td><td> 2.5 </td></tr><tr><td> Toplam hacim (cDNA tagmented) ile </td><td> 25 </td></tr><tr><td> Aşama 4.3.2: Kütüphane PCR koşulları </td><td></td></tr><tr><td> 72 ° C, 3 dakika </td><td></td></tr><tr><td> 95 ° C, 30 saniye </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> 95 ° C&#39;de 18 devir-10 saniye, 55 ° C&#39;de 30 saniye, 30 saniye için 72 ° C &#39;de </td></tr><tr><td> 72 ° C, 5 dakika </td><td></td></tr><tr><td> 10 ° C, sonsuza </td><td></td></tr></tbody></table>Tablo 1:. Reaksiyon set-up ve tamponlar Adım adım tüm tamponlar ve reaksiyon karışımlarının içeriği ile tablolar. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> oligo Adı </td><td> Sıra (5 &#39;ila 3&#39;) </td></tr><tr><td> Ebola KGH FW </td><td> GTCGTTCCAACAATCGAGCG </td></tr><tr><td> Ebola KGH RV </td><td> CGTCCCGTAGCTTTRGCCAT </td></tr><tr><td> Ebola KULESH FW </td><td> TCTGACATGGATTACCACAAGATC </td></tr><tr><td> Ebola KULESH RV </td><td> GGATGACTCTTTGCCGAACAATC </td></tr><tr><td> Lassa SL FW </td><td> GTA AGC CCA OBEB GYA AAB CC </td></tr><tr><td> Lassa SL RV </td><td> AAG CCA CAG AAA RCT GGS AGC A </td></tr><tr><td> 18S rRNA FW </td><td> TCCTTTAACGAGGATCCATTGG </td></tr><tr><td> 18S rRNA RV </td><td> CGAGCTTTTTAACTGCAGCAACT </td></tr></tbody></tmümkün&gt; Tablo 2: QRT-PCR Astarlar Diziler ana bilgisayar (18S rRNA) ve viral (Ebola ve Lassa) içeriği ölçmek için kullanılan primerler.. &#39;KGH&#39; Ebola primerleri 2 test edildi Sierra Leone, içinde Kenema Devlet Hastanesi olduğunu. &#39;Kulesh&#39; primer 14 set tasarlanmış araştırmacı olduğunu. Tablo 3: Ribozomal RNA (rRNA) tükenmesi Oligo seçici tükenmesi adım 6 insan rRNA tamamlayıcı 195 50 nükleotid uzunluğunda diziler.. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54117/Table_3.xlsx" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Unbiased Deep Sequencing of RNA Viruses from Clinical Samples at JoVE.com

Unbiased Deep Sequencing of RNA Viruses from Clinical Samples

This protocol describes a rapid and broadly applicable method for unbiased RNA-sequencing of viral samples from human clinical isolates.

Klinik Örneklerden RNA Virüs tarafsız Derin Sıralama

Here we outline a next-generation RNA sequencing protocol that enables de novo assemblies and intra-host variant calls of viral genomes collected from ...

unbiased-deep-sequencing-of-rna-viruses-from-clinical-samples

Research

JoVE Journal

Medicine

16.8K Görüntüleme.  Broad Institute of MIT and Harvard. This protocol describes a rapid and broadly applicable method for unbiased RNA-sequencing of viral samples from human clinical isolates.

Video: Unbiased Deep Sequencing of RNA Viruses from Clinical Samples

Isolation and Functional Characterization of Human Ventricular Cardiomyocytes from Fresh Surgical Samples

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and membrane ion currents. Those changes are likely&#160;to be responsible for the increased arrhythmogenic risk and the contractile alterations leading to systolic and diastolic dysfunction in cardiac patients. However, most information on the alterations of myocyte function in cardiac diseases has come from animal models.
Here we describe and validate a protocol to isolate viable myocytes from small surgical samples of ventricular myocardium from patients undergoing cardiac surgery operations. The protocol is described in detail. Electrophysiological and intracellular calcium measurements are reported to demonstrate the feasibility of a number of single cell measurements in human ventricular cardiomyocytes obtained with this method.
The protocol reported here can be useful for future investigations of the cellular and molecular basis of functional alterations of the human heart in the presence of different cardiac diseases. Further, this method can be used to identify novel therapeutic targets at cellular level and to test the effectiveness of new compounds on human cardiomyocytes, with direct translational value.

Current knowledge on the cellular basis of cardiac diseases mostly relies on studies on animal models. Here we describe and validate a novel method to obtain single viable cardiomyocytes from small surgical samples of human ventricular myocardium. Human ventricular myocytes can be used for electrophysiological studies and drug testing.

Taze Cerrahi Örneklerden İzolasyon ve İnsan Ventriküler kardiyomiyositlerin Fonksiyonel Karakterizasyonu

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and ...

Tıp

Isolation of Cancer Stem Cells From Human Prostate Cancer Samples

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly isolated from human tissues and serially propagated in immunodeficient mice, typically through antibody labeling of subpopulations of cells and fractionation by flow cytometry. However, the unique clinical features of prostate cancer have considerably limited the study of prostate CSCs from fresh human tumor samples. We recently reported the isolation of prostate CSCs directly from human tissues by virtue of their HLA class I (HLAI)-negative phenotype. Prostate cancer cells are harvested from surgical specimens and mechanically dissociated. A cell suspension is generated and labeled with fluorescently conjugated HLAI and stromal antibodies. Subpopulations of HLAI-negative cells are finally isolated using a flow cytometer. The principal limitation of this protocol is the frequently microscopic and multifocal nature of primary cancer in prostatectomy specimens. Nonetheless, isolated live prostate CSCs are suitable for molecular characterization and functional validation by transplantation in immunodeficient mice.

The isolation of cancer stem cells (CSCs) directly from human tissues is requisite for their biological characterization. This manuscript describes a methodology for the isolation of prostate CSCs from human tissues, while also providing tips on troubleshooting difficult steps.

İnsan Prostat Kanseri Örneklerinden Kanser Kök Hücreleri İzolasyon

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly ...

Controlling Parkinson's Disease With Adaptive Deep Brain Stimulation

Adaptive deep brain stimulation (aDBS) has the potential to improve the treatment of Parkinson&#39;s disease by optimizing stimulation in real time according to fluctuating disease and medication state. In the present realization of adaptive DBS we record and stimulate from the DBS electrodes implanted in the subthalamic nucleus of patients with Parkinson&#39;s disease in the early post-operative period. Local field potentials are analogue filtered between 3 and 47 Hz before being passed to a data acquisition unit where they are digitally filtered again around the patient specific beta peak, rectified and smoothed to give an online reading of the beta amplitude. A threshold for beta amplitude is set heuristically, which, if crossed, passes a trigger signal to the stimulator. The stimulator then ramps up stimulation to a pre-determined clinically effective voltage over 250 msec and continues to stimulate until the beta amplitude again falls down below threshold. Stimulation continues in this manner with brief episodes of ramped DBS during periods of heightened beta power.
Clinical efficacy is assessed after a minimum period of stabilization (5 min) through the unblinded and blinded video assessment of motor function using a selection of scores from the Unified Parkinson&#39;s Rating Scale (UPDRS). Recent work has demonstrated a reduction in power consumption with aDBS as well as an improvement in clinical scores compared to conventional DBS. Chronic aDBS could now be trialed in Parkinsonism.

Adaptive deep brain stimulation (aDBS) is effective for Parkinson&#8217;s disease, improving symptoms and reducing power consumption compared to conventional deep brain stimulation (cDBS). In aDBS we track a local field potential biomarker (beta oscillatory amplitude) in real time and use this to control the timing of stimulation.

Adaptif Derin Beyin Stimülasyonu İle Parkinson Hastalığı kontrol

Adaptive deep brain stimulation (aDBS) has the potential to improve the treatment of Parkinson&#39;s disease by optimizing stimulation in real time ...

Handling of the Cotton Rat in Studies for the Pre-clinical Evaluation of Oncolytic Viruses

Oncolytic viruses are a novel anticancer therapy with the ability to target tumor cells, while leaving healthy cells intact. For this strategy to be successful, recent studies have shown that involvement of the host immune system is essential. Therefore, oncolytic virotherapy should be evaluated within the context of an immunocompetent model. Furthermore, the study of antitumor therapies in tolerized animal models may better recapitulate results seen in clinical trials. Cotton rats, commonly used to study respiratory viruses, are an attractive model to study oncolytic virotherapy as syngeneic models of mammary carcinoma and osteosarcoma are well established. However, there is a lack of published information on the proper handling procedure for these highly excitable rodents. The handling and capture approach outlined minimizes animal stress to facilitate experimentation. This technique hinges upon the ability of the researcher to keep calm during handling and perform procedures in a timely fashion. Finally, we describe how to prepare cotton rat mammary tumor cells for consistent subcutaneous tumor formation, and how to perform intratumoral and intraperitoneal injections. These methods can be applied to a wide range of studies furthering the development of the cotton rat as a relevant pre-clinical model to study antitumor therapy.

Cotton rats are extremely excitable and have a strong flight-or-fight response. A handling method optimized to reduce the stress of the animals is described which will make cotton rats more accessible as a preclinical model.

Oncolytic virüs klinik öncesi Değerlendirme Çalışmaları Pamuk Rat Taşıma

Oncolytic viruses are a novel anticancer therapy with the ability to target tumor cells, while leaving healthy cells intact.  For this strategy to be ...

VDJ-Seq: Deep Sequencing Analysis of Rearranged Immunoglobulin Heavy Chain Gene to Reveal Clonal Evolution Patterns of B Cell Lymphoma

Understanding tumor clonality is critical to understanding the mechanisms involved in tumorigenesis and disease progression. In addition, understanding the clonal composition changes that occur within a tumor in response to certain micro-environment or treatments may lead to the design of more sophisticated and effective approaches to eradicate tumor cells. However, tracking tumor clonal sub-populations has been challenging due to the lack of distinguishable markers. To address this problem, a VDJ-seq protocol was created to trace the clonal evolution patterns of diffuse large B cell lymphoma (DLBCL) relapse by exploiting VDJ recombination and somatic hypermutation (SHM), two unique features of B cell lymphomas.
In this protocol, Next-Generation sequencing (NGS) libraries with indexing potential were constructed from amplified rearranged immunoglobulin heavy chain (IgH) VDJ region from pairs of primary diagnosis and relapse DLBCL samples. On average more than half million VDJ sequences per sample were obtained after sequencing, which contain both VDJ rearrangement and SHM information. In addition, customized bioinformatics pipelines were developed to fully utilize sequence information for the characterization of IgH-VDJ repertoire within these samples. Furthermore, the pipeline allows the reconstruction and comparison of the clonal architecture of individual tumors, which enables the examination of the clonal heterogeneity within the diagnosis tumors and deduction of clonal evolution patterns between diagnosis and relapse tumor pairs. When applying this analysis to several diagnosis-relapse pairs, we uncovered key evidence that multiple distinctive tumor evolutionary patterns could lead to DLBCL relapse. Additionally, this approach can be expanded into other clinical aspects, such as identification of minimal residual disease, monitoring relapse progress and treatment response, and investigation of immune repertoires in non-lymphoma contexts.

This protocol describes an approach to interrogate the recombined immunoglobulin heavy chain VDJ regions of lymphomas by deep-sequencing and retrieve VDJ rearrangement and somatic hypermutation status to delineate clonal architecture of individual tumor. Comparing clonal architecture between paired diagnosis and relapse samples reveals lymphoma relapse clonal evolution modes.

VDJ-Seq: B Hücreli Lenfoma klonal Evrim Patterns Reveal Rearranged İmmünglobulin Ağır Zincir Gen Derin Sıralama Analizi

Understanding tumor clonality is critical to understanding the mechanisms involved in tumorigenesis and disease progression. In addition, understanding ...

Using Saccadometry with Deep Brain Stimulation to Study Normal and Pathological Brain Function

The oculomotor system involves a large number of brain areas including parts of the basal ganglia, and various neurodegenerative diseases including Parkinson's and Huntington's can disrupt it. People with Parkinson's disease, for example, tend to have increased saccadic latencies. Consequently, the quantitative measurement of saccadic eye movements has received considerable attention as a potential biomarker for neurodegenerative conditions. A lot more can be learned about the brain in both health and disease by observing what happens to eye movements when the function of specific brain areas is perturbed. Deep brain stimulation is a surgical intervention used for the management of a range of neurological conditions including Parkinson's disease, in which stimulating electrodes are placed in specific brain areas including several sites in the basal ganglia. Eye movement measurements can then be made with the stimulator systems both off and on and the results compared. With suitable experimental design, this approach can be used to study the pathophysiology of the disease being treated, the mechanism by which DBS exerts it beneficial effects, and even aspects of normal neurophysiology.

This paper describes the use of quantitative measurement of eye movements in conjunction with stimulation of focal areas of the deep brain in order to study physiology, pathophysiology, and the mechanisms of deep brain stimulation.

Derin Beyin Uyarım ile Saccadometry kullanarak normal ve patolojik beyin fonksiyonlarını incelemek için

The oculomotor system involves a large number of brain areas including parts of the basal ganglia, and various neurodegenerative diseases including ...

Transarterial Administration of Oncolytic Viruses for Locoregional Therapy of Orthotopic HCC in Rats

Hepatocellular carcinoma (HCC) is a disease with limited treatment options and poor prognosis. In recent years, oncolytic virotherapies have proven themselves to be potentially powerful tools to fight malignancy. Due to the unique dual blood supply in the liver, it is possible to apply therapies locally to orthotopic liver tumors, which are predominantly fed by arterial blood flow. We have previously demonstrated that hepatic arterial delivery of oncolytic viruses results in safe and efficient transduction efficiency of multifocal HCC lesions, resulting in significant prolongation of survival in immune competent rats. This procedure closely mimics the application of transarterial embolization in patients, which is the standard palliative care provided to many HCC patients. The ability to administer tumor therapies through the hepatic artery in rats allows for a highly sophisticated preclinical model for evaluating novel viral vectors under development. Here we describe the detailed protocol for microdissection of the hepatic artery for infusion of oncolytic virus vectors to treat orthotopic HCC.

Oncolytic virotherapies are under development as novel therapeutics for the treatment of hepatocellular carcinoma (HCC). Here we describe a method for locoregional therapy of HCC via hepatic arterial administration of oncolytic virus.

Sıçanlarda Ortotopik HCC Lokorejyonel Tedavisi için oncolytic virüs transarteryel İdaresi

Hepatocellular carcinoma (HCC) is a disease with limited treatment options and poor prognosis.  In recent years, oncolytic virotherapies have proven ...

Sampling Strategies and Processing of Biobank Tissue Samples from Porcine Biomedical Models

In translational medical research, porcine models have steadily become more popular. Considering the high value of individual animals, particularly of genetically modified pig models, and the often-limited number of available animals of these models, establishment of (biobank) collections of adequately processed tissue samples suited for a broad spectrum of subsequent analyses methods, including analyses not specified at the time point of sampling, represent meaningful approaches to take full advantage of the translational value of the model. With respect to the peculiarities of porcine anatomy, comprehensive guidelines have recently been established for standardized generation of representative, high-quality samples from different porcine organs and tissues. These guidelines are essential prerequisites for the reproducibility of results and their comparability between different studies and investigators. The recording of basic data, such as organ weights and volumes, the determination of the sampling locations and of the numbers of tissue samples to be generated, as well as their orientation, size, processing and trimming directions, are relevant factors determining the generalizability and usability of the specimen for molecular, qualitative, and quantitative morphological analyses. Here, an illustrative, practical, step-by-step demonstration of the most important techniques for generation of representative, multi-purpose biobank specimen from porcine tissues is presented. The methods described here include determination of organ/tissue volumes and densities, the application of a volume-weighted systematic random sampling procedure for parenchymal organs by point-counting, determination of the extent of tissue shrinkage related to histological embedding of samples, and generation of randomly oriented samples for quantitative stereological analyses, such as isotropic uniform random (IUR) sections generated by the &#34;Orientator&#34; and &#34;Isector&#34; methods, and vertical uniform random (VUR) sections.

The practical application and performance of methods for generation of representative tissue samples of porcine animal models for a broad spectrum of downstream analyses in biobank projects are demonstrated, including volumetry, systematic random sampling, and differential processing of tissue samples for qualitative and quantitative morphologic and molecular analyses types.

Örnekleme stratejileri ve Biobank doku örnekleri domuz Biyomedikal modellerinden işlenmesi

In translational medical research, porcine models have steadily become more popular. Considering the high value of individual animals, particularly of ...

Characterizing Exon Skipping Efficiency in DMD Patient Samples in Clinical Trials of Antisense Oligonucleotides

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a degenerative muscle disease that causes progressive loss of muscle mass, leading to premature death. The mutations often cause a distorted reading frame and premature stop codons, resulting in an almost total lack of dystrophin protein. The reading frame can be corrected using antisense oligonucleotides (AONs) that induce exon skipping. The morpholino AON viltolarsen (code name: NS-065/NCNP-01) has been shown to induce exon 53 skipping, restoring the reading frame for patients with exon 52 deletions. We recently administered NS-065/NCNP-01 intravenously to DMD patients in an exploratory investigator-initiated, first-in-human trial of NS-065/NCNP-01. In this methods article, we present the molecular characterization of dystrophin expression using Sanger sequencing, RT-PCR, and western blotting in the clinical trial. The characterization of dystrophin expression was fundamental in the study for showing the efficacy since no functional outcome tests were performed.

Here, we present the molecular characterization of dystrophin 38 expression using Sanger sequencing, RT-PCR, and western blotting in the clinical trial.

Antisense Oligonükleotidlerin Klinik Çalışmalarında DMD Hasta Örneklerinde Exon Atlama Etkinliğinin Karakterize Edilmesi

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a degenerative muscle disease that causes progressive loss of muscle mass, leading to premature death. The mutations ...

Isolation of Viable Adipocytes and Stromal Vascular Fraction from Human Visceral Adipose Tissue Suitable for RNA Analysis and Macrophage Phenotyping

Visceral adipose tissue (VAT) is an active metabolic organ composed mainly of mature adipocytes and stromal vascular fraction (SVF) cells, which release different bioactive molecules that control metabolic, hormonal, and immune processes; currently, it is unclear how these processes are regulated within the adipose tissue. Therefore, the development of methods evaluating the contribution of each cell population to the pathophysiology of adipose tissue is crucial. This protocol describes the isolation steps and provides the necessary troubleshooting guidelines for efficient isolation of viable mature adipocytes and SVF from human VAT biopsies in a single process, using a collagenase enzymatic digestion technique. Moreover, the protocol is also optimized to identify macrophage subsets and perform mature adipocyte RNA isolation for gene expression studies, which allows performing studies dissecting the interaction between these cell populations. Briefly, VAT biopsies are washed, minced mechanically, and digested to generate a single-cell suspension. After centrifugation, mature adipocytes are isolated by flotation from the SVF pellet. The RNA extraction protocol ensures a high yield of total RNA (including miRNAs) from adipocytes for downstream expression assays. Simultaneously, SVF cells are used to characterize macrophage subsets (pro- and anti-inflammatory phenotype) through flow cytometry analysis.

This protocol provides an efficient collagenase digestion method for isolation of viable adipocytes and stromal vascular fraction-SVF cells from human visceral fat in a single process, including methodology to obtain high-quality RNA from adipocytes and phenotypification of SVF-macrophages through staining of multiple membrane-bound markers for analysis by flow cytometry.

İnsan Viseral Yağ Dokusundan Canlı Adiposit ve Stromal Vasküler Fraksiyonun RNA Analizi ve Makrofaj Fenotiplemesine Uygun İzolasyonu

Visceral adipose tissue (VAT) is an active metabolic organ composed mainly of mature adipocytes and stromal vascular fraction (SVF) cells, which release ...