Bu çalışma Araştırmacı Amerikan Kanser Derneği Hibeler (116.403-RSG-09-082-01-MGO) ve GS Wake Forest Üniversitesi Sağlık Bilimleri intramural fonları kısmen desteklenmiştir. DBS NCI eğitim bursu 5T32CA079448 tarafından desteklenmiştir.

1. ShRNA Oluşumlar üretimi <ol><li> Daha önce yayınlanan kriterlere 6 veya Ambion ve GenScript gelen &quot;siRNA Hedef Bulucu&quot; olarak web tabanlı bir algoritma sunucu kullanmak dayalı bir siRNA hedef dizisi (20-23 nükleotid) tanımlayın. </li><li> Tablo 1, Şekil 1 ve Örnek dizilerinin tasarımına bağlı oligonükleotidler sentezlenir. Oligonükleotidler P1 ve P2 (30 at 94 denatürasyon döngüleri ° C&#39;de 30 saniye süreyle, 60 ° tavlama 30 sn için C ve 30 saniye için 72 ° C&#39;da uzatılması) ve U6 veya H1 taşıyan plazmid kullanılarak PCR yapılması Bir şablon olarak promotör. Bir PCR saflaştırma kolonu kullanılarak PCR ürünü saflaştırmak. BamHI ve HindIII bunu sindirmek ve bir PCR saflaştırma kolonu kullanılarak sindirilir DNA arındırmak. Oligonükleotidler P3 ve P4 (2,5 50 mM Tris 100 ul içinde pmol / ul her birinin • HCI, pH 8.0) 5 dakika ve oda sıcaklığına kadar yavaşça serin için kaynatılarak. Tavlama Bir lentiviral vec sindirmekBöyle BamHI ve EcoRI ile, Şekil 2A açıklanan ve jel saflaştırma gerçekleştirmek biri olarak tor,. </li><li> Bir 01:10:10 molar oranlarında BamHI / EcoRI-sindirilmiş vektör, bir BamHI / HindIII-sindirilmiş PCR parçası ve tavlanmış oligonükleotidler bir çift (HindIII ve iki ucunda EcoRI siteleri oluşturan) ile bir 3-fragmanı ligasyon yürütmek (Şekil 1). </li><li> Yüksek verimli yetkili E. Transform bağlanan ürünle kullanarak coli DH5α hücreleri. Oligonükleotidler P5 (vektör içinde) ve P6 (H1 veya U6 yükselticisinde). 7 ile koloniler taranması </li><li> Ticari kit ile pozitif kolonilerden plazmid DNA hazırlayın ve BamHI / EcoRI sindirim ve DNA agaroz elektroforezi ucun varlığını doğrulamaktadır. Oligonükleotid P5 kullanarak organizatörü ve shRNA içeren Sıra bölge. </li><li> ShRNA ifadesi taşıyan lentivirüs DNA hazırlamak için plazmid DNA Midi-veya Maxi-hazırlık setleri (endotoksin ücretsiz tercih edilir) kullanınkaset. 260 nm&#39;de absorpsiyon olarak ölçülmesiyle DNA konsantrasyonunun belirlenmesi. 260 nm/280 nm oranı kullanılarak DNA&#39;nın saflık kontrol edin ve 1,8-2,0 aralığında düşüyor emin olun. Agaroz jel elektroforez ile lentivirüs plazmid bütünlüğünü kontrol edin. Transfeksiyon için DNA süper sarılmış olmalıdır. </li></ol> 2. Lentivirüs Transfeksiyon Önlemler: lentiviral vektörler (HIV-1) genomu ve replikasyonu beceriksiz virüs-1 insan bağışıklık elde edilmektedir. Bunlar yaygın hücre bölünmesi ve non-bölünmesi hem bulaştırmaktan özelliği nedeniyle gen aktarımının kullanılmıştır. Bununla birlikte, iki ana riskleri lentivirüs kullanılarak çalışmalarda bulunmaktadır. Replikasyon-yetkin lentivirüs üretilmesi için (1) potansiyel. Üçüncü nesil lentiviral sistemi kullanılması halinde, bu riskini büyük ölçüde azaltılabilir. Onkojenezi için (2) potansiyel. Yapılan ekler onkojenik ya da tümör bastırıcılarının bastırmak, bu riski daha da şiddetlenir.HIV tabanlı lentivirüs katılan araştırma faaliyetleri NIH (ve &quot;lentiviral Vektörler ile Araştırma Biyogüvenlik Önlemleri&quot; takip etmelidir <a href="http://oba.od.nih.gov/rdna_rac/rac_guidance_lentivirus.html" target="_blank">http://oba.od.nih.gov/rdna_rac/rac_guidance_lentivirus.html</a> ) ve Biyogüvenlik Komitesi bir onay gerektiren Bir araştırmacının kurumu. Lentiviral vektörleri kullanıldığı takdirde, genellikle, geliştirilmiş Biyogüvenlik seviyesi-2 (BSL-2) çevreleme laboratuar ayarı için gereklidir. <ol><li> Levha 4 x 10 cm tabaklar ve bir gece kültüre tam eden DMEM ortamı (DMEM% 10 fetal bovin serumu (FBS), 2 mM L-glutamin, 100 U / ml penisilin, 100 ug / ml streptomisin ile birlikte) ile birlikte 10 6 HEK 293T hücreleri 37 azından% 5 CO2 inkübatöründe ° C. I Serum Media (Invitrogen) İndirgenmiş önceden ısıtılmış Opti-MEM 5 ml ortamı yerini alır. </li><li> ShRNA içeren lentiviral vektör 10 mg, 5 mg üçüncü homo her: Çözüm A hazırlayıntirme lentivirüs ambalaj plazmid (yüksek saflıkta ile hazırlanan; üç ambalaj plazmid VSV-G şunlardır: rev için ve pMDLg / pRRE: bir zarf proteini, pRSV-Rev gag / lentivirüs paketleme için gerekli olan, pol için), 36 2M CaCI2 ve steril su ile 300 ul&#39;lik ul. </li><li> Salin Tamponlu 2 × 300 ul Hepes (281 mM NaCl, 100 mM HEPES, 1,5 mM Na 2 HPO 4, 0.5 N NaOH ile 7.12 &#39;e ayarlanır ve 0.22 um bir filtreden ile sterilize pH): Çözelti B hazırlayın. </li><li> Bir pipetle Çözüm B ile hava kabardığını yavas Bir Çözüm B içine Çözüm bırakın. 30 dk çevre sıcaklığında tüpü bırakın. </li><li> Yavaşça adım 2,1 hazırlanan HEK 293T hücre kültürü çanağı içine karıştırılmış çözümler A / B açılan ve 4-6 saat boyunca bir% 5 CO2 inkübatöründe 37 ° C&#39;de inkübe edilir. </li><li> Komple DMEM ortam 7 ml ortamı yerini alır. 24 saat sonra, tam DMEM ortamı ek bir 5 ml ilave edilir. Orta devam hasatkültür başka bir 24 saat sonra lentivirüs aining. </li><li> 10 dk için 1500 rpm, ortam sıcaklığında, orta dönerler. Bir 0.45 um bir filtreden kullanılarak Süpernatan filtre ve akış boyunca dönmeye 25.000 rpm&#39;de ultra-santrifüj ile lentivirüs içeren ortam (a SW28 rotor sallanan kova ile 125,000 x g eşittir Beckman ultrasantrifüjdeki XL-90), 4 ° C&#39;de 90 dakika süreyle. % 5 ağartıcı (nihai konsantrasyon) ile bir kap için supernatant boşaltacaktır. </li><li> Soğuk PBS 0.5-1.0 ml lentivirüs pelletini ve tüp başına 50-100 ul içine lentivirüs alikotları olun. -80 Onları saklayın ° C </li><li> Lentivirüs ve titresi bir real-time PCR protokolü 8 ile ticari kitler (örneğin Hücre Biolabs gelen QuickTiter lentivirüs kantitasyonu Takımı, Inc gibi) veya floresan mikroskobu veya akım sitometri kullanılarak eş-ifade floresan işaretleyici belirleyerek tespit edilebilir . Tipik olarak, bir 10 cm kültür çanak 0.5-1.0 hakkında üretebilir × 10 8 enfeksiyontious birim (IU). </li></ol> 3. Enfekte Hücre Enfeksiyon ve Karakterizasyonu <ol><li> Tohum hücreleri% 30-40 konfluent (yaklaşık 5-8 x 10 5 hücreler, hücre boyutuna bağlı olarak) bir 6-kuyulu plakalı içinde tam medyum 2 ml enfekte edilmesi. 37 &#39;de bir gece kültüre hücreleri% 5 CO2 inkübatöründe ° C. </li><li> Taze aracı madde 1 ml 8 polybrene arasında ug / ml (Sigma, Katalog # H9268) ya da 5 mg / ml protamin (Sigma, Katalog # P4020) içeren ortam yerini alır. </li><li> Enfeksiyonu (İçişleri Bakanlığı) floresan işaretleyici ile lentivirüs kullanarak belirli bir hücre hattı için aralık 9 uygun bir çokluğu belirleyin. Hesaplamak ve ampirik olarak hücre hattı enfekte etme kullanılmak üzere lentivirüs miktarını belirler. Yavaşça plakasına lentivirüs bırakın ve yavaşça 10 saniye boyunca sallayın. </li><li> 6 saat boyunca bir% 5 CO2 inkübatöründe 37 ° C&#39;de inkübe edilir ve daha sonra plaka normal bir tam medyum ile orta yerini alır. </li><li> En az iki dekarys enfeksiyondan sonra, floresan işaretleri ve / ifade lentivirüs için floresan mikroskobu kullanarak hücrelerin kontrol ve antibiyotik direnç genleri ifade lentiviral vektörler için orta ilgili antibiyotik ekleyin. Bir vektör indüklenebilen için, böyle bir sistemin Tet-on (Şekil 2), kültür ortamı içinde hücreleri tetrasiklin serbest FBS ile hazırlanır. Hücreleri 2-3 gün, enfeksiyondan sonraki ayrıldı. ≥ 2 gün süre ile 1,5 mg / ml doksisiklin (Dox) ve olmadan temin ortamda kültüre onlar tarafından indüklenen geni test etmek için portatif bir hücre kısmı alır. </li><li> ≥ 2 gün Dox eklenmesinden sonra Western Blot, Real-Time PCR veya immun ≥ 2 gün sonra enfeksiyon, antibiyotik seçimine 2 gün sonra, veya (Tet-On indüklenebilir sistemi için) tarafından gen devirme kontrol edin. </li><li> Hedef gen kn etkilerini belirlemek için farklı yaklaşımlar (örn. hücre çoğalması deneyleri, yumuşak agar kültür çalışmaları, göç deneyleri, istila testleri ve tümör oluşumu çalışmaları gibi) yararlanınhücrelerin Malignitede ockdown. </li></ol> 4. Xenograftlarında Fare Model Çalışması <ol><li> Fare anesthetization ve farelerin enfeksiyonu önlemek için% 70 etanol enjeksiyonu için tüm yüzeyleri temizleyin. % 2 ile izofluran önce hücre aşılama için bir anestezi indüksiyonu odasında 10 dakika oksijen ile karıştırılır. Atimik çıplak farelerde (NCI-Frederick) uyuştur Bir burun konisi ile oksijen karışık izofluran% 1 ile anestezi koruyun. Mükemmel havalandırma ile bir odada bu adımı gerçekleştirin ve indüksiyon odasına izofluran tutucu filtreleri takın. </li><li> ShRNAs taşıyan hücreler yayar. Indüklenebilir vektörler Tet-On için tetrasiklin içermeyen aracı kullanın. Hücreler Trypsinize ve% 50 Matrigel içeren tam bir ortam içinde yeniden süspanse bunların. Bir ısıtma yüzeyi üzerine çıplak farelerin (30 ° C) konumlandırmak ve fare başına 1-2 enjeksiyon yerleri ile farelere hücrelerinin 200 ul (1-10 x 10 6, kanser hücrelerinin bağlı olarak) enjekte edilir. 25 ile şırınga kullanın.Subkutan enjeksiyonlar ve ortotopik enjeksiyonlar için 28-30 insülin iğnesi için 5 insülin iğnesi. </li><li> Kurucu shRNA vektörler için, hedef genin shRNA ve bir karıştırılmış shRNA eksprese eden hücrelerle enjekte farelerin 2 grupları kullanmaktadır. Tet-on indüklenebilen shRNA vektörler, hedef genin shRNA ve bir karıştırılmış shRNA, normal su ile sağlanan ve Dox (1.5 mg / ml), su (2 x 2 shRNAs tedaviler = 4 grubu) içeren taşıyan hücrelerin enjekte farelerin 4 gruplar için kullanır . Haftada iki kez Dox içeren su değiştirin. </li><li> Dijital kumpas, kumpas, haftalık veya iki haftada bir tümörlerin uzunluk ve genişlik izleyin ve formülü V = 1/2 (uzunluk x genişlik 2) 10 ile tümör hacim (V) hesaplar. Tümör hacmi kurumsal ACUC ana hatlarını (örneğin vücut ağırlığının% 10 gibi) aşmamaktadır olun. Bu kapsamlı ülserasyon veya nekroz, bariz infectio belirtisi gösterirse kurumsal ACUC tarafından onaylanmış bir protokol kullanarak herhangi bir fare Euthanizen, kontrolsüz kanama veya son evre hastalık. </li><li> Tümör büyümesi ve metastazı gibi Firefly lusiferaz gibi bir biyolüminesens işaretleyici 11, ifade inoküle tümör hücreleri için izlenebilir. Fare anesthetization ve farelerin enfeksiyonu önlemek için% 70 etanol ile görüntüleme için tüm yüzeyleri temizleyin. Adım 4,1 açıklandığı gibi fare uyuşturmak. Lusiferin (150 mg / kg) intraperitoneal olarak enjekte edilir. Böyle bir IVIS Görüntüleme Sistemi (kaliper Life Sciences, Inc) gibi ticari bir görüntüleme sistemi, bir dezenfekte görüntüleme haznesine farelere yerleştirin. Oksijen ile karıştırılır izofluran% 1 anestezi korumak için anestezi kolu açın. Mükemmel havalandırma ile bir odada bu adımı gerçekleştirin. </li><li> 5 dakika teşhir ederek ilk görüntü alın ve sinyal yoğunluğu kontrol edin. Arka plan karşı en iyi sinyal ile görüntüler elde etmek için pozlama süresini ayarlayın. Ampirik görüntüleme zamanı belirleyin, hangi genellikle subkutan tümörler için 1-5 dk. </li><li> Onaylanmış bir protokol ile fareler EuthanizeTümör boyutları yaklaşık 1.000 mm 3, ya da ACUC rehberlerinde belirtilen ulaşmak kurumsal ACUC tarafından. Tüketim xenograft tümörler, onları tartmak ve fotoğraf çekmek. Gen test etmek için tümör hücre morfolojisi belirlemek için patolojik analizleri gibi farklı çalışmalar için tümör örnekleri ve Western blot ve Real-Time PCR çalışmaları işleyin. </li></ol> 5.. Temsilcisi Sonuçlar Atimik çıplak farelerde; Bu protokol Firefly lusiferaz eksprese MDA-MB-231 hücreler (Kaliper Yaşam Bilimleri insan meme kanseri hücresi) xenograft tümör oluşumu YY1 Knockdown etkilerini incelemek için kullanılmıştır. İnsan YY1 of shRNA hedef dizisi &quot;AGC AGA AGC AGG TGC AGA T GGG&quot; edilir. Bir şifreli dizisi &quot;GGG ACT ACT KTHY TTA CGT CAT T&quot; bir de kontrol bilinen herhangi bir transkript önemli bir benzerlik yoktu (devam) shRNA için oluşturuldu. Bir örnek olarak YY1 ile indüklenebilen shRNA yapıları Tet-on yapmak için kullanılan oligonükleotidler,, Tablo 1 &#39;de gösterilmiştir. Sonuç olarak, iki lentiviral vektörler, PLU-Puro-Indu-YY1 shRNA ve PLU-Puro-Indu-devam shRNA, imal edilmiş ve Lentivirüs üretmek için kullanıldı. Bu tek tek tetrasiklin regülatörü (tetr) ve hem de ifade Firefly lusiferaz iki MDA-MB-231 hücre klonu (klon 1 ve 3) enfekte etme bu Lentivirüs kullanılır. Poliklonal hücre popülasyonlarının puromycin seçimden sonra elde edildi. Şekil 3A PLU-Puro-Indu-YY1 shRNA lentivirüs bulaşmış bu MDA-MB-231 hücrelerinde Dox bağlı YY1 devirme gösterir. Daha sonra bu indüklenebilir YY1 shRNA ve devam shRNA Lentivirüs tarafından ayrı ayrı ve enfekte YY1 tükenmesi MDA-MB-231 hücreler (Şekil 3B) invaziv düştüğü görülmüştür klon 3 poliklonal hücreler kullanılmaktadır. Indu-cont shRNA içeren hücreleri (Şekil 3C) bu etki görülmemiştir ise Western blot analizleri, indu-YY1 shRNA ile MDA-MB-231 hücrelerinde Dox bağlı YY1 susturulması doğruladı. Daha sonra kullanılan<html> xenograft fare modeli çalışması için bu hücreleri. Kontrol grupları ile karşılaştırıldığında, indu-YY1 shRNA ile MDA-MB-231 hücreler tarafından implante ve Dox içeren su ile birlikte farelerin (Şekil 4B biyolüminesans (Şekil 4A) tarafından görüntülenmiştir zaman, azaltılmış tümör oluşumunu gösterdi ve tümör ağırlıkları belirlenir ). Bu xenograft tümörlerde YY1 susturulması Şekil 4C gösterilen Western Blot çalışmaları ile doğrulandı. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/4129/4129fig1.jpg" /> Şekil 1.. Bir shRNA yapı ve shRNA transkripsiyon nesil için şematik diyagramı. Primerler P1 P6 için (örneğin dizileri için bkz. Tablo 1) gösterilmiştir. Pol III: RNA polimeraz III (d):. Sindirilmiş sonu. Çizim ölçekli değildir. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4129/4129fig1large.jpg" target="_blank">büyük resim görmek için buraya tıklayın</a> . 2 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/4129/4129fig2.jpg &quot;/&gt; Şekil 2. (A) &#39;a lentiviral vektör ve (B) mekanizması Tet-on gen suskunluğu için kullanılan promotör indüklenebilen H1. Şematik diyagramı Lentiviral vektör pLL3.7 14 dayanan yeniden inşa edildi. H1-Pr: H1 organizatörü; UBC-Pr: İnsan ubikuitin C promoter; Puro: puromycin; TRE: Tetrasiklin duyarlı elementi; Dox: doksisiklin. Tetr: tetrasiklin regülatörü. 5&#39;LTR, 3&#39;SIN-LTR ve WRE bir lentiviral vektör 14 temel bileşenleridir. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/4129/4129fig3.jpg" /> Şekil 3. Dox bağlı YY1 suskunluğu ve MDA-MB-231 hücrelerin invaziv üzerindeki etkisi. Elde edilen iki poliklonal hücre popülasyonlarının A. YY1 seviyeleri tetr-ifade PLU-Puro-Indu-YY1 shRNA lentivirüs bulaşmış ve Dox yokluğunda ve varlığında kültüre klonlar 1 ve 3. Indüklenebilir shRNAs ile MDA-MB-231 hücre B. Boyden odası testi. (* P &lt;0Diğer üç gruba karşı .05). Bu dört hücre popülasyonlarında YY1 ifade C. Temsilcisi Western blot. <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/4129/4129fig4.jpg" /> Şekil 4. MDA-MB-231 hücreler tarafından xenograft tümör oluşumuna neden olduğu YY1 susturulması Etkileri. Hücre implantasyonu (solda) ve 4 hafta (sağ) yazılan hücre aşılama az IVIS Görüntüleme Sistemi tarafından yakalanan temsilcisi bioluminescent görüntüleri A. şematik. 4 hafta B. Xenograftlarında tümör ağırlıkları. * P ≤ 0.05. C. Batı YY1 ve lekeler ve Dox yokluğunda ve varlığında indu-YY1 shRNA ile MDA-MB-231 hücre xenogreftler içinde β-aktin ifade. Üstüne Etiketler bireysel farelerin isimleridir. <table border="1"><tbody><tr><td> Oligonükleotid </td><td> Dizisi (5 &#39;- 3&#39;) </td><td> Kullanım ve konumu </td></tr><tr><td> P1 (Tet-On H1) </td><td> cagt GGATCC CGA ACG CTG ACG TCA TCA ACC C </td><td> PCR; H1 arttırıcının 5&#39;-ucunda </td></tr><tr><td> P1 (U6) </td><td> cagt GGATCC GAC GCC GCC ATC TCT AGG </td><td> PCR; U6 arttırıcının 5&#39;-ucunda </td></tr><tr><td> P2 (YY1 için H1 Tet-On ile) </td><td> cagc AAGCTT GAA ATC tgc acc tgc ttc tgc tcc c GGG ATC TCT ATC ACT GAT AGG GAA C </td><td> PCR; Tet-on indüklenebilen H1 arttırıcının 3&#39;-ucunda </td></tr><tr><td> P2 (U6 ile YY1 için) </td><td> cagc AAGCTT GAA ATC tgc acc tgc ttc tgc tcc c aaa caa GGC ttt TCT cca agg gat bir </td><td> PCR; U6 arttırıcının 3&#39;-ucunda </td></tr><tr><td> P3 (YY1 için) </td><td> AGC tt ATC tgc acc tgc ttc tgc tcc c ttttt g </td><td> P4 ile tavlanmış edilecek </td></tr><tr><td> P4 (YY1 için) </td><td> aattc aaaaa <strong&gt; ggg AGC aga AGC agg tgc aga ta </td><td> P3 tavlanmış edilecek </td></tr><tr><td> P5 (pLL3.7 için) </td><td> ggg tac AGT DHA ggg gaa aga ata g </td><td> PCR taranması için, P6 ile birlikte kullanılır </td></tr><tr><td> P6 (H1 Tet-On için) </td><td> GAT TTC CCA GAA CAC ATA KHK AC </td><td> P5 ile kullanılan PCR taraması için, </td></tr><tr><td> P6 (U6 için) </td><td> AGG GTG AGT TTC CTT TTG TGC TG </td><td> P5 ile kullanılan PCR taraması için, </td></tr></tbody></table> Tablo 1. ShRNA yapıları oluşturmak için kullanılan sentezlenmiş oligonükleotidler. P1 ve fare U6 ve Tet-On indüklenebilir insan H1 sahipleri için P6 dizileri sağlanmaktadır. İnsan YY1 GGG AGC AGA AGC AGG TGC AGA T. YY1 özgü dizileri vurgulanır bir shRNA hedef sırası ile bir örnek olarak kullanılır. YY1 iki P2 sekansları, sırasıyla iki arttırıcılar için tasarlanmıştır. Bünye U6 / YTet-On H1/YY1 Bu protokolde kullanılan iken Y1 shRNA, daha önce 15 tanımlanmıştır. P5 vektör spesifik ve pLL3.7 için 14 gösterilmektedir sekansıdır. Restriksiyon enzim dizileri dizileri PCR amplifikasyon sırasında sahiplerine tavlama için ise, altı çizili italik edilir.

<ol>
	<li>Elbashir, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duplexes+of+21-nucleotide+RNAs+mediate+RNA+interference+in+cultured+mammalian+cells.">Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells.</a> Nature. 411, 494-498 (2001).</li><li>Sui, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+DNA+vector-based+RNAi+technology+to+suppress+gene+expression+in+mammalian+cells.">A DNA vector-based RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5515-5520 (2002).</li><li>Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+system+for+stable+expression+of+short+interfering+RNAs+in+mammalian+cells.">A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells.</a> Science. 296, 550-553 (2002).</li><li>Zhang, Q., Stovall, D. B., Inoue, K., Sui, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+oncogenic+role+of+Yin+Yang+1.">The oncogenic role of Yin Yang 1.</a> Crit. Rev. Oncog. 16, 163-197 (2011).</li><li>Wan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yin+Yang+1+plays+an+essential+role+in+breast+cancer+and+negatively+regulates+p27.">Yin Yang 1 plays an essential role in breast cancer and negatively regulates p27.</a> Am. J. Pathol. , (2012).</li><li>Sui, G., Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+silencing+by+a+DNA+vector-based+RNAi+technology.">Gene silencing by a DNA vector-based RNAi technology.</a> Methods in Molecular Biology. 309, 205-218 (2005).</li><li>Trower, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+PCR-based+colony+screening+protocol+for+cloned+inserts.">A rapid PCR-based colony screening protocol for cloned inserts.</a> Methods Mol. Biol. 58, 329-333 (1996).</li><li>Lizee, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+quantitative+reverse+transcriptase-polymerase+chain+reaction+as+a+method+for+determining+lentiviral+vector+titers+and+measuring+transgene+expression.">Real-time quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction as a method for determining lentiviral vector titers and measuring transgene expression.</a> Hum. Gene Ther. 14, 497-507 (2003).</li><li>Zhang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+significance+of+controlled+conditions+in+lentiviral+vector+titration+and+in+the+use+of+multiplicity+of+infection+(MOI)+for+predicting+gene+transfer+events.">The significance of controlled conditions in lentiviral vector titration and in the use of multiplicity of infection (MOI) for predicting gene transfer events.</a> Genet Vaccines Ther. 2, 6 (2004).</li><li>Geran, R. I., Greenberg, N. H., MacDonald, M. M., Schumacher, A. M., Abbott, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+for+screening+chemical+agents+and+natural+products+against+animal+tumors+and+other+biological+systems.">Protocols for screening chemical agents and natural products against animal tumors and other biological systems.</a> Cancer Chemother. Rep. 3, 1-103 (1972).</li><li>Massoud, T. F., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+imaging+in+living+subjects:+seeing+fundamental+biological+processes+in+a+new+light.">Molecular imaging in living subjects: seeing fundamental biological processes in a new light.</a> Genes Dev. 17, 545-580 (2003).</li><li>Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+efficiency+transformation+of+Escherichia+coli+with+plasmids.">High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids.</a> Gene. 96, 23-28 (1990).</li><li>Toledo, J. R., Prieto, Y., Oramas, N., Sanchez, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyethylenimine-based+transfection+method+as+a+simple+and+effective+way+to+produce+recombinant+lentiviral+vectors.">Polyethylenimine-based transfection method as a simple and effective way to produce recombinant lentiviral vectors.</a> Appl. Biochem. Biotechnol. 157, 538-544 (2009).</li><li>Rubinson, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lentivirus-based+system+to+functionally+silence+genes+in+primary+mammalian+cells,+stem+cells+and+transgenic+mice+by+RNA+interference.">A lentivirus-based system to functionally silence genes in primary mammalian cells, stem cells and transgenic mice by RNA interference.</a> Nat Genet. 33, 401-406 (2003).</li><li>Sui, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yin+Yang+1+is+a+negative+regulator+of+p53.">Yin Yang 1 is a negative regulator of p53.</a> Cell. 117, 859-872 (2004).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Bu protokol kullanılarak bir gen shRNA sökülebilen ve in vivo olarak tümör hücresi büyümesinin bioluminescent görüntüleme kullanılarak biyolojik etkisini canlandırmak için bir yöntem açıklanmaktadır. Bir shRNA hedef sitesi (BamHI, HindIII ve EcoRI) kullanılan üç sınırlandırma bölgeleri herhangi bir içermemelidir on klonlama sonrasında için. Nadir bir senaryo bu siteleri arasında herhangi bir mevcut olduğu zaman, ilave bir kısıtlama enzimiyle yapı üreten yerini almak ü...

RNA ve protein analizler ve hücre kültürü için kullanılan genel laboratuar ekipmanı ek olarak, aşağıdaki malzemeleri ve ayraçlar, bu protokolü için gereklidir. <table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td></tr><tr><td> Biyogüvenlik Seviyesi 2 çevreleme için uygun Biyogüvenlik Kabini </td></tr><tr><td> PCR PCR </td></tr><tr><td> Ultrasantrifüjdeki </td></tr><tr><td> Izofluran temizleyiciler ile anestezi indüksiyonu odası </td></tr><tr><td> Dijital kumpas </td></tr><tr><td> IVIS görüntüleme sistemi </td></tr><tr><td> Son derece yetkin DH5a E. coli </td></tr><tr><td> EcoRI, BamHI, ve HindIII sınırlama enzimleri </td></tr><tr><td> T4 DNA ligaz </td></tr><tr><td> Üçüncü nesil lentivirüs ambalaj plazmidler VSV-G, pRSV-Rev ve pMDLg / pRRE </td></tr></tbody></table> Malzeme Listesi

dna vector-based rna interference to study gene function in cancer

RNA müdahalesi (RNAi) özellikle aşağılayıcı hedef mRNA tarafından gen ekspresyonunu inhibe. Gen suskunluğu 1 çift zincirli küçük parazit RNA (siRNA) keşfinden beri, RNAi gen fonksiyonu çalışmalarında güçlü bir araştırma aracı haline gelmiştir. Genetik delesyon ile karşılaştırıldığında, RNAi-aracılı gen suskunluğu gibi bu gerçekleştirildiği ile kolaylıkla ve en hücre serileri için uygunluğu gibi birçok avantajı, sahiptir. Çoklu çalışmalar kanser araştırma RNAi teknolojinin uygulamaları göstermiştir. Özellikle, U6 veya H1 promotör tarafından tahrik küçük firkete RNA (shRNA) üretmek için DNA vektörü tabanlı teknolojinin geliştirilmesi mümkün 2,3 susturulmasında uzun vadeli gen ve indüklenebilir yapmıştır. Böyle lentivirüs gibi genetiği viral vektörlerin, birlikte kullanımı stabil shRNA ifade için genomik DNA&#39;ya shRNA teslimat ve / veya entegrasyon yüksek verimlilik kolaylaştırır. Bir detaile tarifd prosedürü shRNA, lentivirüs üretimi, hücre enfeksiyonu, ve bir fare xenograft modeli kullanılarak fonksiyonel çalışmalar ifade vektörlerinin lentiviral inşaat dahil geni fonksiyonu, belirlemek için DNA vektörü bazlı RNAi teknolojisi kullanılarak. Çeşitli stratejiler shRNA yapıları oluşturmak bildirilmiştir. Protokol PCR büyütmesi ve bir 3-fragmanı ligasyon kullanıldığı doğrudan ve verimli bir şekilde üretmek için kullanılabilir burada açıklanan shRNA-içeren bir shRNA kodlama sekansı için herhangi bir ek nükleotid bitişik çıkmadan lentiviral yapıları. Bu stratejinin yarattığı shRNA ifade kasetleri restriksiyon enzimleri tarafından kesilebilir olduğundan, bunlar kolaylıkla farklı floresan veya antibiyotik işaretleri ile diğer vektörlere taşınmış olabilir. En çok ticari transfeksiyon reaktifler lentivirüs üretiminde kullanılabilir. Ancak, bu raporda, biz% 90 transfeksiyon verim üzerinde elde edebilirsiniz kalsiyum fosfat kullanarak ekonomik bir yöntem sağlamak293T hücreler. Bünye shRNA ifade vektörlerinin karşılaştırıldığında, indüklenebilir shRNA sistemi hücre çoğalması için gerekli bir gen aşağı vurma özellikle uygundur. Biz Yin Yang 1 (YY1), meme kanseri 4,5 potansiyel bir onkogeninin gen susturulması göstermek, bir Tet-On indüklenebilir shRNA sistemi ve tümör oluşumu üzerindeki etkileri. Lentivirüs kullanarak Araştırma İnceleme ve bir araştırmacının kurumu Biyogüvenlik Komitesi tarafından bir biyogüvenlik protokolü onayı gerektirir. Hayvan modelleri kullanılarak Araştırma İnceleme ve bir araştırmacının kurumu Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (ACUC) tarafından bir hayvan protokolünün onaylanması gerekiyor.

Watch this Scientific Journal Video about DNA Vector-based RNA Interference to Study Gene Function in Cancer at JoVE.com

DNA Vector-based RNA Interference to Study Gene Function in Cancer

RNA müdahalesi (RNAi) gen nakavt üzerinden pek çok avantajı sahip ve geniş gen işlevsel çalışmalarda bir araç olarak kullanılmıştır. DNA vektör tabanlı RNAi teknolojisi buluşu uzun vadeli ve olası indüklenebilir gen Knockdown yaptı, hem de gen susturulması fizibilite arttı<em&gt; In vivo</em&gt;.

Kanser gen Fonksiyon Eğitim için DNA vektör tabanlı RNA Girişim

RNA interference (RNAi) inhibits gene expression by specifically degrading target mRNAs. Since the discovery of double-stranded small interference RNA ...

dna-vector-based-rna-interference-to-study-gene-function-in-cancer

Research

JoVE Journal

Medicine

20.4K Görüntüleme.  Wake Forest University School of Medicine. RNA müdahalesi (RNAi) gen nakavt üzerinden pek çok avantajı sahip ve geniş gen işlevsel çalışmalarda bir araç olarak kullanılmıştır. DNA vektör tabanlı RNAi teknolojisi buluşu uzun vadeli ve olası indüklenebilir gen Knockdown yaptı, hem de gen susturulması fizibilite arttı In vivo.

Video: DNA Vector-based RNA Interference to Study Gene Function in Cancer

In Vivo Canine Muscle Function Assay

We describe a minimally-invasive and reproducible method to measure canine pelvic limb muscle strength and muscle response to repeated eccentric 
contractions. The pelvic limb of an anesthetized dog is immobilized in a stereotactic frame to align the tibia at a right angle to the femur. Adhesive wrap affixes the 
paw to a pedal mounted on the shaft of a servomotor to measure torque. Percutaneous nerve stimulation activates pelvic limb muscles of the paw to either push (extend) or 
pull (flex) against the pedal to generate isometric torque. Percutaneous tibial nerve stimulation activates tibiotarsal extensor muscles. Repeated eccentric (lengthening) 
contractions are induced in the tibiotarsal flexor muscles by percutaneous peroneal nerve stimulation. The eccentric protocol consists of an initial isometric contraction 
followed by a forced stretch imposed by the servomotor. The rotation effectively lengthens the muscle while it contracts, e.g., an eccentric contraction. During 
stimulation flexor muscles are subjected to an 800 msec isometric and 200 msec eccentric contraction. This procedure is repeated every 5 sec. To avoid fatigue, 4 min rest 
follows every 10 contractions with a total of 30 contractions performed.

In Vivo Canine Muscle Function Assay

We describe a minimally-invasive and painless method to measure canine hindlimb muscle strength and muscle response to repeated eccentric contractions.

Vivo Köpek Kas Fonksiyon Testi

We describe a minimally-invasive and reproducible method to measure canine pelvic limb muscle strength and muscle response to repeated eccentric 
...

Tıp

Establishment and Propagation of Human Retinoblastoma Tumors in Immune Deficient Mice

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited time. These cultured tumorspheres may exhibit markedly different cellular phenotypes when compared to the original tumors. Demonstration that cultured cells have the capability of forming new tumors is important to ensure that cultured cells model the biology of the original tumor. 
Here we present a protocol for propagating human retinoblastoma tumors in vivo using Rag2-/- immune deficient mice. Cultured human retinoblastoma tumorspheres of low passage or cells obtained from freshly harvested human retinoblastoma tumors injected directly into the vitreous cavity of murine eyes form tumors within 2-4 weeks. These tumors can be harvested and either further passaged into murine eyes in vivo or grown as tumorspheres in vitro. Propagation has been successfully carried out for at least three passages thus establishing a continuing source of human retinoblastoma tissue for further experimentation. 
Wesley S. Bond and Lalita Wadhwa are co-first authors.

A method is described to propagate human retinoblastoma tumors in mice. Tumor cells are directly injected into the eyes of immune deficient mice. Secondary tumors have been successfully established using both cells directly harvested from human tumors and cultured tumorspheres.

Bağışıklık Eksik Fare Kuruluş ve İnsan Retinoblastom Tümörler yayılımı

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited ...

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

Recurrence of breast cancer often follows a long latent period in which there are no signs of cancer, and metastases may not become clinically apparent until many years after removal of the primary tumor and adjuvant therapy. A likely explanation of this phenomenon is that tumor cells have seeded metastatic sites, are resistant to conventional therapies, and remain dormant for long periods of time 1-4.
The existence of dormant cancer cells at secondary sites has been described previously as quiescent solitary cells that neither proliferate nor undergo apoptosis 5-7. Moreover, these solitary cells has been shown to disseminate from the primary tumor at an early stage of disease progression 8-10 and reside growth-arrested in the patients' bone marrow, blood and lymph nodes 1,4,11. Therefore, understanding mechanisms that regulate dormancy or the switch to a proliferative state is critical for discovering novel targets and interventions to prevent disease recurrence. However, unraveling the mechanisms regulating the switch from tumor dormancy to metastatic growth has been hampered by the lack of available model systems.
in vivo and ex vivo model systems to study metastatic progression of tumor cells have been described previously 1,12-14. However these model systems have not provided in real time and in a high throughput manner mechanistic insights into what triggers the emergence of solitary dormant tumor cells to proliferate as metastatic disease. We have recently developed a 3D in vitro system to model the in vivo growth characteristics of cells that exhibit either dormant (D2.OR, MCF7, K7M2-AS.46) or proliferative (D2A1, MDA-MB-231, K7M2) metastatic behavior in vivo . We demonstrated that tumor cells that exhibit dormancy in vivo at a metastatic site remain quiescent when cultured in a 3-dimension (3D) basement membrane extract (BME), whereas cells highly metastatic in vivo readily proliferate in 3D culture after variable, but relatively short periods of quiescence. Importantly by utilizing the 3D in vitro model system we demonstrated for the first time that the ECM composition plays an important role in regulating whether dormant tumor cells will switch to a proliferative state and have confirmed this in in vivo studies15-17. Hence, the model system described in this report provides an in vitro method to model tumor dormancy and study the transition to proliferative growth induced by the microenvironment.

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

A modified 3-D in vitro system is presented in which growth characteristics of several tumor cell lines in reconstituted basement membrane correlate with the dormant or proliferative behavior of the tumor cells at a metastatic secondary site in vivo.

Bir In Vitro</emMetastatik Büyüme Tümör Dormansi ve Switch Eğitim> Sistem

Recurrence of breast cancer often follows a long latent period in which there are no signs of cancer, and metastases may not become clinically apparent ...

Biomarkers in an Animal Model for Revealing Neural, Hematologic, and Behavioral Correlates of PTSD

Identification of biomarkers representing the evolution of the pathophysiology of Post Traumatic Stress Disorder (PTSD) is vitally important, not only for objective diagnosis but also for the evaluation of therapeutic efficacy and resilience to trauma. Ongoing research is directed at identifying molecular biomarkers for PTSD, including traumatic stress induced proteins, transcriptomes, genomic variances and genetic modulators, using biologic samples from subjects' blood, saliva, urine, and postmortem brain tissues. However, the correlation of these biomarker molecules in peripheral or postmortem samples to altered brain functions associated with psychiatric symptoms in PTSD remains unresolved. Here, we present an animal model of PTSD in which both peripheral blood and central brain biomarkers, as well as behavioral phenotype, can be collected and measured, thus providing the needed correlation of the central biomarkers of PTSD, which are mechanistic and pathognomonic but cannot be collected from people, with the peripheral biomarkers and behavioral phenotypes, which can.
Our animal model of PTSD employs restraint and tail shocks repeated for three continuous days - the inescapable tail-shock model (ITS) in rats. This ITS model mimics the pathophysiology of PTSD 17, 7, 4, 10. We and others have verified that the ITS model induces behavioral and neurobiological alterations similar to those found in PTSD subjects 17, 7, 10, 9. Specifically, these stressed rats exhibit (1) a delayed and exaggerated startle response appearing several days after stressor cessation, which given the compressed time scale of the rat's life compared to a humans, corresponds to the one to three months delay of symptoms in PTSD patients (DSM-IV-TR PTSD Criterian D/E 13), (2) enhanced plasma corticosterone (CORT) for several days, indicating compromise of the hypothalamopituitary axis (HPA), and (3) retarded body weight gain after stressor cessation, indicating dysfunction of metabolic regulation.
The experimental paradigms employed for this model are: (1) a learned helplessness paradigm in the rat assayed by measurement of acoustic startle response (ASR) and a charting of body mass; (2) microdissection of the rat brain into regions and nuclei; (3) enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for blood levels of CORT; (4) a gene expression microarray plus related bioinformatics tools 18. This microarray, dubbed rMNChip, focuses on mitochondrial and mitochondria-related nuclear genes in the rat so as to specifically address the neuronal bioenergetics hypothesized to be involved in PTSD.

We describe a rat model of post traumatic stress disorder (PTSD) that reveals the persistent alterations in neuroendocrine function and the delayed long-term, exaggerated fear response, characteristic of PTSD patients. The animal model and methods described here are useful for correlating biomarkers in brain nuclei, which are mechanistic but cannot be measured in patients, with biomarkers in peripheral white blood cells, which can.

TSSB, Nöral Hematolojik ve Davranış Bağlantılı Revealing için Hayvan Modelinde Biyobelirteçler

Identification of biomarkers representing the evolution of the pathophysiology of Post Traumatic Stress Disorder (PTSD) is vitally important, not only for ...

An Orthotopic Bladder Cancer Model for Gene Delivery Studies

Bladder cancer is the second most common cancer of the urogenital tract and novel therapeutic approaches that can reduce recurrence and progression are needed. The tumor microenvironment can significantly influence tumor development and therapy response. It is therefore often desirable to grow tumor cells in the organ from which they originated. This protocol describes an orthotopic model of bladder cancer, in which MB49 murine bladder carcinoma cells are instilled into the bladder via catheterization. Successful tumor cell implantation in this model requires disruption of the protective glycosaminoglycan layer, which can be accomplished by physical or chemical means. In our protocol the bladder is treated with trypsin prior to cell instillation. Catheterization of the bladder can also be used to deliver therapeutics once the tumors are established. This protocol describes the delivery of an adenoviral construct that expresses a luciferase reporter gene. While our protocol has been optimized for short-term studies and focuses on gene delivery, the methodology of mouse bladder catheterization has broad applications.

Implantation of cancer cells into the organ of origin can serve as a useful preclinical model to evaluate novel therapies. MB49 bladder carcinoma cells can be grown within the bladder following intravesical instillation. This protocol demonstrates catheterization of the mouse bladder for the purpose of tumor implantation and adenoviral delivery.

Gene Teslim Çalışmaları Ortotopik Mesane Kanseri Modeli

Bladder cancer is the second most common cancer of the urogenital tract and novel therapeutic approaches that can reduce recurrence and progression are ...

Noninvasive Intratracheal Intubation to Study the Pathology and Physiology of Mouse Lung

The use of a model that mimics the condition of lung diseases in humans is critical for studying the pathophysiology and/or etiology of a particular disease and for developing therapeutic intervention. With the increasing availability of knockout and transgenic derivatives, together with a vast amount of genetic information, mice provide one of the best models to study the molecular mechanisms underlying the pathology and physiology of lung diseases. Inhalation, intranasal instillation, intratracheal instillation, and intratracheal intubation are the most widely used techniques by a number of investigators to administer materials of interest to mouse lungs. There are pros and cons for each technique depending on the goals of a study. Here a noninvasive intratracheal intubation method that can directly deliver exogenous materials to mouse lungs is presented. This technique was applied to administer bleomycin to mouse lungs as a model to study pulmonary fibrosis.

The use of a model that mimics the condition of lung diseases in humans is critical for studying the pathophysiology and/or etiology of a particular disease and for developing therapeutic intervention. Here a noninvasive intratracheal intubation method that can directly deliver exogenous materials to mouse lungs is presented.

Noninvaziv Entübasyon Fare Akciğer Patolojisi ve Fizyolojisi Eğitim için

The use of a model that mimics the condition of lung diseases in humans is critical for studying the pathophysiology and/or etiology of a particular ...

Three Dimensional Cultures: A Tool To Study Normal Acinar Architecture vs. Malignant Transformation Of Breast Cells

Invasive breast carcinomas are a group of malignant epithelial tumors characterized by the invasion of adjacent tissues and propensity to metastasize. The interplay of signals between cancer cells and their microenvironment exerts a powerful influence on breast cancer growth and biological behavior1. However, most of these signals from the extracellular matrix are lost or their relevance is understudied when cells are grown in two dimensional culture (2D) as a monolayer. In recent years, three dimensional (3D) culture on a reconstituted basement membrane has emerged as a method of choice to recapitulate the tissue architecture of benign and malignant breast cells. Cells grown in 3D retain the important cues from the extracellular matrix and provide a physiologically relevant ex&#160;vivo system2,3. Of note, there is growing evidence suggesting that cells behave differently when grown in 3D as compared to 2D4. 3D culture can be effectively used as a means to differentiate the malignant phenotype from the benign breast phenotype and for underpinning the cellular and molecular signaling involved3. One of the distinguishing characteristics of benign epithelial cells is that they are polarized so that the apical cytoplasm is towards the lumen and the basal cytoplasm rests on the basement membrane. This apico-basal polarity is lost in invasive breast carcinomas, which are characterized by cellular disorganization and formation of anastomosing and branching tubules that haphazardly infiltrates the surrounding stroma. These histopathological differences between benign gland and invasive carcinoma can be reproduced in 3D6,7. Using the appropriate read-outs like the quantitation of single round acinar structures, or differential expression of validated molecular markers for cell proliferation, polarity and apoptosis in combination with other molecular and cell biology techniques, 3D culture can provide an important tool to better understand the cellular changes during malignant transformation and for delineating the responsible signaling.

Three dimensional culture of mammary epithelial cells on a reconstituted basement membrane is a useful method to recapitulate the in vivo architecture of the benign breast, and to differentiate the malignant phenotype from the benign breast phenotype. Importantly, this system can be applied to study invasive carcinomas in other tissues.

Üç Boyutlu Kültürler: Meme hücrelerinin malign Dönüşüm vs Normal Asiner Mimari Eğitim için Bir Aracı

Invasive breast carcinomas are a group of malignant epithelial tumors characterized by the invasion of adjacent tissues and propensity to metastasize. The ...

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial cells tend to lose hormone receptor expression. Widely used hormone receptor positive breast cancer cell lines are of limited relevance to the in vivo situation. Here, we describe an ex vivo model to study hormone action in the human breast. Fresh human breast tissue specimens from surgical discard material such as reduction mammoplasties or mammectomies are mechanically and enzymatically digested to obtain tissue fragments containing ducts and lobules and multiple stromal cell types. These tissue microstructures kept in basal medium without growth factors preserve their intercellular contacts, the tissue architecture, and remain hormone responsive for several days. They are readily processed for RNA and protein extraction, histological analysis or stored in freezing medium. Fluorescence activated cell sorting (FACS) can be used to enrich for specific cell populations. This protocol provides a straightforward, standard approach for translational studies with highly complex, varied human specimens.

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

We have developed a novel ex vivo model to study hormone action in the human breast. It is based on tissue microstructures isolated from surgical breast tissue specimens which preserve tissue architecture, intercellular interactions, and paracrine signaling.

Bir<em&gt; Ex vivo</em&gt; Model İnsan Meme Hormon Eylem Eğitim için

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial ...

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of women are alive 5 years after diagnosis. The omentum is a preferred site of HGSC metastasis formation. Despite the clinical importance of this microenvironment, the contribution of omental adipose tissue to ovarian cancer progression remains understudied. Omental adipose is unusual in that it contains structures known as milky spots, which are comprised of B, T, and NK cells, macrophages, and progenitor cells surrounding dense nests of vasculature. Milky spots play a key role in the physiologic functions of the omentum, which are required for peritoneal homeostasis. We have shown that milky spots also promote ovarian cancer metastatic colonization of peritoneal adipose, a key step in the development of peritoneal metastases. Here we describe the approaches we developed to evaluate and quantify milky spots in peritoneal adipose and study their functional contribution to ovarian cancer cell metastatic colonization of omental tissues both in vivo and ex vivo. These approaches are generalizable to additional mouse models and cell lines, thus enabling the study of ovarian cancer metastasis formation from initial localization of cells to milky spot structures to the development of widespread peritoneal metastases.

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

We outline a protocol that implements both in vivo and ex vivo approaches to study ovarian cancer colonization of peritoneal adipose tissues, particularly the omentum. Furthermore, we present a protocol to quantitate and analyze immune cell-structures in the omentum known as milky spots, which promote metastases of peritoneal adipose.

Vivo ve Ex Vivo Periton yağ içinde Samanyolu Nokta Yapıların Yumurtalık Kanseri Metastatik Kolonizasyon Eğitim Yaklaşımlar içinde

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.