RSF has received funding from the European Union's - Seventh Framework Programme (FP7/2007-2013]) under grant agreement n&#176; 618432 &#8211; MC&#8212;Epi-Patho-Stem, as well as by the Israeli Science Foundation (218/14).

Etik Beyanı: Bu çalışmada hayvan bakımı ve kullanımında Oftalmik ve Vizyon Araştırma Hayvanların Kullanım ARVO tablosuna conformed bulundu. Tüm deneyler, yerel etik kurul tarafından onaylanmıştır. Fare ve Strain ifade bir Uygun Cre-recombinase seçin 1. <ol><li> Araştırılması için satın alma 26 ve hedeflenen dokuya bağlı olarak kullanılabilir Cre transgenik hatların çok çeşitli dışında, Cre rekombinaz gen, ilgi konusu doku için spesifik olan bir promoter tarafından kontrol edildiği bir transjenik fare suşu Cre seçin. Olgu zamansal kontrol gereklidir ise, indüklenebilir Cre satırını seçin. Not: Biz özellikle limbal ve kornea epitel kök / progenitör hücreler 24 etiket tamoksifen indüklenebilir K14-Cre ERT transgen seçti. Di Girolamo ve arkadaşları onların K1 için kornea ifade ile limbal özgüllük bildirdiği gibi, suşları arasında farklılıklar olabileceğini unutmayın4-Cre ERT 22. Indüklenebilir transgenik fareler Cre kullanarak bir avantajı çok yönlü zaman dilimlerinde de izleme soy uyarılmasını izin vermesidir. </li></ol> 2. Uygun Br Fare Gerinim seçin <ol><li> Araştırma sorusu ve mevcut Cre hat 16,18,20 bağlı olarak uygun Br kasetini seçin. <ol><li> Olmayan bir uyarılabilir Cre fare suşu kullanıldığında, sürekli bir DNA inversiyon / eksizyon izin ve böylece 16 (örneğin Br1.0 ya Br1.1 için) kör uçlu ürünlere neden olmayan bir Br kaseti seçin. </li></ol></li></ol> 3. İlgi Transgenik Hatları Çapraz <ol><li> Burada gösterilen protokolü için, hemizigot Yavrularda elde etmek için homozigot Cre ERT suşu (Cre ERT / Cre ERT) ile homozigot R26R-Konfeti zorlanma (Br2.1 / Br2.1) çapraz (Br2.1 / +; Cre / +) mono-allelik hepsi tek bir Br2.1 alel ihtiva olarak izleme soy ve hazır olduklarınıTek Cre alel. Not: bir iki Cre allel (Br2.1 / +; Cre / Cre) içerebilir fareler yaratacaktır etiketleme verimliliğini artırmak için, süre iki Br2.1 aleli (Br2.1 / Br2.1; Cre / +) olur (22 ayrıntılı olarak) renk kombinasyonları artar. </li></ol> 4. kre-rekombinazı İndüksiyon Not: Bu deneylerde Tamoksifen uygulanması limbal ve korneal bazal K14 pozitif kök / progenitor çekirdeği içine Cre rekombinazın ERT translokasyonunu teşvik etmek için, 3-4 günlük bir süre için, günlük intraperitoneal enjeksiyon ile gerçekleştirilmiştir epitel hücreleri. Aşağıdaki protokol dört fareden enjeksiyonu için kullanılabilir. Alternatif olarak, oküler yüzeye Tamoksifen topikal uygulama daha yüksek verim verir. Tamoksifen Çözelti bir haftaya kadar 4 ° C&#39;de karanlıkta muhafaza edilebilir. Kullanmadan önce çözüm ısıtın. <ol><li> Tamoksifen 100 mg tartılır ve mısır yağı, 5 ml kadar içeri çözülür20 mg / ml tamoksifen çözelti oluşturmak. </li><li> Intraperitonal 3-4 ardışık gün boyunca 8 haftalık farelere Tamoksifen (4 mg) çözeltisi 200 ul enjekte edilir. Not: Tamoksifen çözeltisi bir haftaya kadar 4 ° C&#39;de karanlıkta muhafaza edilebilir. Kullanmadan önce çözüm ısıtın. </li><li> Topikal uygulama için: Tamoksifen 60 mg ağırlığında ve 60 mg / ml tamoksifen çözelti oluşturmak için mısır yağı, 1 ml içinde çözülür. Vorteks ve 65 ° C&#39;de muhafaza edilen bir sallanan sulu banyo içindeki çözümü ayarlamak ° C kullanımda kadar banyosunda açık bırakın onu oluncaya kadar. <ol><li> Dikkatle fare her göz yüzeyine Tamoksifen çözeltisi 100 ul uygulayın. </li></ol></li></ol> Görüntüleme için 5. Doku Hazırlanması <ol><li> Izofluran kullanarak Kurban hayvanlar Tamoksifen enjeksiyonu ve col aşağıdaki uygun zaman noktalarında CO 2 inhalasyon ardından anestezi (refleksleri eksikliği tarafından uygun anesthetization onaylayın) (% 2 oksijen buharlaşmış)İlgili doku Öğr. <ol><li> Bu deneyler için, aşağıdaki zaman noktalarında, gözler enükleasyonu: 1, 4, 8, 12 ve 16 hafta sonra Tamoksifen enjeksiyon. Kavisli bir forseps kullanarak enükleasyon ulaşmak. Göz küresi, göz soket dışına pop neden göz kapaklarını basın. Optik siniri tutan göz küresi arkasında forseps yerleştirin. Yavaşça göz küresi çekin ve çıkartın. Not: Aşağıda tarif edildiği gibi, bu aşamada, dokular işaretli hücrelerin wholemount analiz için hazırlanabilir. Normal dondurulmuş doku bölümleri de PFA sabit ve aşağıda tarif edildiği gibi (bakınız bölüm 6 ve 22) görüntülü hazırlanabilir. </li></ol></li><li> PBS ile doldurulmuş bir 60 mm çanak her göze yerleştirin. </li><li> Stereo-mikroskop altında kullanarak forseps aşağı bakacak kornea ile optik sinir yakınında göz tutun ve optik sinir, kas ve bağ dokusu kaldırmak ve gözün arka kısmında küçük bir kesi yapmak için bir neşter kullanabilirsiniz. </li><li> Yaylı makas kullanma dikkatle büyütmekObjektif dışarı pop ve forseps kullanarak iris kaldırmak icar kesti. </li><li> Bir neşter kullanılarak çevreye doğru merkezden başlayarak 4-5 radyal kesiler yaparak kornea düzleştirin. </li><li> Limbusun ötesinde aşırı periferik dokuyu kesmek için bir neşter kullanın. </li><li> Daha sonra kısa bir süre PBS ile yıkayın, 10 dakika boyunca% 4 PFA korneaları sabitleyin. </li><li> 10 dakika boyunca DAPI ile inkübe örnekleri ve kısaca PBS ile yıkayın. </li><li> Epitel tarafı yukarı bakacak şekilde cam slaytlar Dağı kornealar. Bir kapak camı ile kornea ve kapağın üstüne montaj medya bir damla yerleştirin. Slaytlar RT O / N kurumasını bekleyin. 4 ° C &#39;de slaytlar tutun. </li></ol> 6. Konfokal Mikroskopi ve Görüntüleme Analizi <ol><li> YFP / GFP / OBP emisyonlarının ayrılmasını sağlayan bir spektral konfokal sistemi kullanın. Set flüoresan uyarma ve Br&#39;dir kasetinin floresan proteinleri bağlı olarak emisyon dalga boylarında. Minimize haç amaçlayan her protein için en uygun dalgaboyu seçinuyarım. Farklı protein gelen sinyallerin sızıntısı en aza indirmek için, dar emisyon aralıkları seçin. <ol><li> Br2.1 kaset için bir başlangıç ​​noktası olarak floresan uyarma (eski) ve emisyon (em) arasında kurulan aşağıdaki kullanın: - CFP ex 405 nm / em 420-480 nm - DAPI ex 458 nm / em 470-500 nm, GFP - ex 488 nm / em 497-508 nm, YFP - ex 514 nm / em 529-540 nm ve RFP - ex 561 nm / em 575-615 nm. </li></ol></li><li> Yüksek çözünürlüklü geniş doku alanları görselleştirmek için, kiremit görüntüleme kazanır. Yani Şekil 2A-B, görüntünün 12 x 12 görüntülerin bir dizi alarak tüm kornea, gösterilen sonuçlar için, her alanda 4 floresan kanalları kullanarak 144 alanları (512 x 512) kazanır. Toplamda 576 görüntüleri toplamak ve daha sonra birleştirme. </li><li> Farklı derinliklerde ve doku yapılarına etiketlenmiş hücrelerin lokalizasyonu keşfetmek için, farklı ilgi bölgelerin Z-yığını görüntüler elde. Sipariş to görüntü korneanın tam derinliği, 3 mikron aralıklarla 8 optik bölümleri kazanır. Maksimum şiddeti göre resim çıkıntılar olarak da toplanmıştır bölümlerin Ortogonal incelemeler geleneksel görüntüleme yazılımları 24 kullanılarak inşa edilebilir. </li></ol> Tamoksifen İndüksiyon 7. Kornea Yaralanma Kombine <ol><li> Izofluran ile fareler (oksijen buharlaşmış% 2) anestezisi ve yönetimi analjezikler (10 mg / kg Carpofen, deri altından enjekte). Ayak tutam yanıtsızlık tarafından uygun anesthetization onaylayın. </li><li> Tamoksifen tozu, 1 g tartılır ve 200 mg / ml konsantrasyon solüsyonu elde etmek için, steril DMSO, 5 ml içinde çözülür. </li><li> Çözelti berrak hale gelinceye kadar bir su banyosu içinde 65 ° C&#39;ye kadar Tamoksifen çözeltisi ısıtın. Kullanılıncaya kadar banyosunda çözüm tutun. </li><li> Anestezi sırasında su kaybını önlemek için tedavi edilmeyen kontralateral göze göz merhemi sürün. Yeterli con kazanmış olan gözetimsiz kadar bir hayvan bırakmayınsternal yatma korumak için bilinç. Tamamen iyileşene kadar diğer farelerin şirkete yaralama göz geçirmiş fareler iade etmeyin. Fareler yakın yaralanmadan sonra izlenmelidir. Onların vücut ağırlığının% 10&#39;undan fazlasını kaybetmek durumda, kornea erozyonu veya rahatsızlık muzdarip, deney durdurulmalıdır. Tekrarlama analjezikler idaresi bütün deney boyunca her 24 saatte. </li><li> Buna bağlı bir iğne olmadan Steril bir şırıngayı kullanarak, topikal her fare tek gözün tüm kornea yüzeyinde 200 ul Tamoksifen çözümü uygulayın. Not: Sıvı çözelti, oda sıcaklığında göz yüzeyine hızlı bir şekilde katılaşır. Kornea hasarı etkisi yara şiddetine bağlıdır. Tamoksifen / DMSO çözeltisi bir uygulamasında sonra hiçbir yan etki farelerde gözlenmiştir. Tekrarlı uygulamalar durumunda kornea opasitesi gözlenebilir. </li><li> Mezhep (bkz doku hazırlama ve görüntüleme ile devamiyonlar 5 ve ilgili zaman noktalarında 6). Bir hafta sonrası yaralama (Şekil 2 ve 24) (evre 5.1 ayrıntılı olarak) Burada gösterilen sonuçlar, fareler kurban için. </li></ol>

<ol>
	<li>Buckingham, M. E., Meilhac, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracing+cells+for+tracking+cell+lineage+and+clonal+behavior.">Tracing cells for tracking cell lineage and clonal behavior.</a> Dev Cell. 21, 394-409 (2011).</li><li>Kretzschmar, K., Watt, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+tracing.">Lineage tracing.</a> Cell. 148, 33-45 (2012).</li><li>Blanpain, C., Simons, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unravelling+stem+cell+dynamics+by+lineage+tracing.">Unravelling stem cell dynamics by lineage tracing.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 14, 489-502 (2013).</li><li>Beck, B., Blanpain, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unravelling+cancer+stem+cell+potential.">Unravelling cancer stem cell potential.</a> Nat Rev Cancer. 13, 727-738 (2013).</li><li>Serbedzija, G. N., Bronner-Fraser, M., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+vital+dye+analysis+of+the+timing+and+pathways+of+avian+trunk+neural+crest+cell+migration.">A vital dye analysis of the timing and pathways of avian trunk neural crest cell migration.</a> Development. 106, 809-816 (1989).</li><li>Eagleson, G. W., Harris, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+the+presumptive+brain+regions+in+the+neural+plate+of+Xenopus+laevis.">Mapping of the presumptive brain regions in the neural plate of Xenopus laevis.</a> J Neurobiol. 21, 427-440 (1990).</li><li>Cotsarelis, G., Cheng, S. Z., Dong, G., Sun, T. T., Lavker, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Existence+of+slow-cycling+limbal+epithelial+basal+cells+that+can+be+preferentially+stimulated+to+proliferate:+implications+on+epithelial+stem+cells.">Existence of slow-cycling limbal epithelial basal cells that can be preferentially stimulated to proliferate: implications on epithelial stem cells.</a> Cell. 57, 201-209 (1989).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+haematopoietic+stem+cell+niche+and+control+of+the+niche+size.">Identification of the haematopoietic stem cell niche and control of the niche size.</a> Nature. 425, 836-841 (2003).</li><li>Snippert, H. J., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+adult+stem+cells.">Tracking adult stem cells.</a> EMBO Rep. 12, 113-122 (2011).</li><li>Snippert, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lgr6+marks+stem+cells+in+the+hair+follicle+that+generate+all+cell+lineages+of+the+skin.">Lgr6 marks stem cells in the hair follicle that generate all cell lineages of the skin.</a> Science. 327, 1385-1389 (2010).</li><li>Morris, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+and+profiling+adult+hair+follicle+stem+cells.">Capturing and profiling adult hair follicle stem cells.</a> Nat Biotechnol. 22, 411-417 (2004).</li><li>Barker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lgr5(+ve)+stem+cells+drive+self-renewal+in+the+stomach+and+build+long-lived+gastric+units+in+vitro.">Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro.</a> Cell Stem Cell. 6, 25-36 (2010).</li><li>Jaks, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lgr5+marks+cycling,+yet+long-lived,+hair+follicle+stem+cells.">Lgr5 marks cycling, yet long-lived, hair follicle stem cells.</a> Nat Genet. 40, 1291-1299 (2008).</li><li>Rinkevich, Y., Lindau, P., Ueno, H., Longaker, M. T., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germ-layer+and+lineage-restricted+stem/progenitors+regenerate+the+mouse+digit+tip.">Germ-layer and lineage-restricted stem/progenitors regenerate the mouse digit tip.</a> Nature. 476, 409-413 (2011).</li><li>Rios, A. C., Fu, N. Y., Lindeman, G. J., Visvader, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+identification+of+bipotent+stem+cells+in+the+mammary+gland.">In situ identification of bipotent stem cells in the mammary gland.</a> Nature. 506, 322-327 (2014).</li><li>Livet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+strategies+for+combinatorial+expression+of+fluorescent+proteins+in+the+nervous+system.">Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system.</a> Nature. 450, 56-62 (2007).</li><li>Tao, J., Polumbo, C., Reidy, K., Sweetwyne, M., Susztak, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multicolor+podocyte+reporter+highlights+heterogeneous+podocyte+changes+in+focal+segmental+glomerulosclerosis.">A multicolor podocyte reporter highlights heterogeneous podocyte changes in focal segmental glomerulosclerosis.</a> Kidney Int. 85, 972-980 (2014).</li><li>Weissman, T. A., Sanes, J. R., Lichtman, J. W., Livet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+and+imaging+multicolor+Brainbow+mice.">Generating and imaging multicolor Brainbow mice.</a> Cold Spring Harb Protoc. , 763-769 (2011).</li><li>Weissman, T. A., Pan, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brainbow:+new+resources+and+emerging+biological+applications+for+multicolor+genetic+labeling+and+analysis.">Brainbow: new resources and emerging biological applications for multicolor genetic labeling and analysis.</a> Genetics. 199, 293-306 (2015).</li><li>Cai, D., Cohen, K. B., Luo, T., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+tools+for+the+Brainbow+toolbox.">Improved tools for the Brainbow toolbox.</a> Nat Methods. 10, 540-547 (2013).</li><li>Snippert, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+crypt+homeostasis+results+from+neutral+competition+between+symmetrically+dividing+Lgr5+stem+cells.">Intestinal crypt homeostasis results from neutral competition between symmetrically dividing Lgr5 stem cells.</a> Cell. 143, 134-144 (2010).</li><li>Di Girolamo, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracing+the+fate+of+limbal+epithelial+progenitor+cells+in+the+murine+cornea.">Tracing the fate of limbal epithelial progenitor cells in the murine cornea.</a> Stem Cells. 33, 157-169 (2015).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paneth+cells+constitute+the+niche+for+Lgr5+stem+cells+in+intestinal+crypts.">Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts.</a> Nature. 469, 415-418 (2011).</li><li>Amitai-Lange, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+tracing+of+stem+and+progenitor+cells+of+the+murine+corneal+epithelium.">Lineage tracing of stem and progenitor cells of the murine corneal epithelium.</a> Stem Cells. 33, 230-239 (2015).</li><li>Schepers, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+tracing+reveals+Lgr5++stem+cell+activity+in+mouse+intestinal+adenomas.">Lineage tracing reveals Lgr5+ stem cell activity in mouse intestinal adenomas.</a> Science. 337, 730-735 (2012).</li><li>Feil, S., Valtcheva, N., Feil, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+Cre+mice.">Inducible Cre mice.</a> Methods Mol Biol. 530, 343-363 (2009).</li><li>Collinson, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+analysis+of+patterns+of+growth,+stem+cell+activity,+and+cell+movement+during+the+development+and+maintenance+of+the+murine+corneal+epithelium.">Clonal analysis of patterns of growth, stem cell activity, and cell movement during the development and maintenance of the murine corneal epithelium.</a> Dev Dyn. 224, 432-440 (2002).</li><li>Buck, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+centripetal+migration+of+normal+corneal+epithelial+cells+in+the+mouse.">Measurement of centripetal migration of normal corneal epithelial cells in the mouse.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 26, 1296-1299 (1985).</li><li>Nagasaki, T., Zhao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centripetal+movement+of+corneal+epithelial+cells+in+the+normal+adult+mouse.">Centripetal movement of corneal epithelial cells in the normal adult mouse.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 44, 558-566 (2003).</li><li>Majo, F., Rochat, A., Nicolas, M., Jaoude, G. A., Barrandon, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligopotent+stem+cells+are+distributed+throughout+the+mammalian+ocular+surface.">Oligopotent stem cells are distributed throughout the mammalian ocular surface.</a> Nature. 456, 250-254 (2008).</li><li>Pan, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrabow:+multispectral+cell+labeling+for+cell+tracing+and+lineage+analysis+in+zebrafish.">Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish.</a> Development. 140, 2835-2846 (2013).</li><li>Chung, K., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLARITY+for+mapping+the+nervous+system.">CLARITY for mapping the nervous system.</a> Nat Methods. 10, 508-513 (2013).</li><li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues.">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nat Protoc. 9, 1682-1697 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Köken izleme deneyler yıllardır gerçekleştirilmiştir. Son teknolojik gelişmeler ve Confetti fare suşlarının ortaya çıkması araştırma için yeni yollar açtı. Günümüzde, ticari olarak temin edilebilen araştırmacılar dokuya-özgü Cre hatları nakavt fareler ve transjenik farelerin çok sayıda yararlanabilir. Bu sağlam ve güvenilir veri sağlarken, zahmetli uygulama kaçınarak, temel uzmanlık bilimsel sorulara yanıt için çok yönlü deneysel sistemler tasarlamak için bir fırsat sağlar. R26R-Konfeti fareler verimli izleme ve canlı bir organizmada hücrelerin yapısını ve davranışlarını incelemek için şık bir araçtır. Sistem kurmak kolaydır ve, embriyogenez sırasında tek hücre non-invaziv soy izleme izin verir kök hücre yenilenmesini homeostazında altında, ya da yaralanma, enflamasyon ve kanser gibi farklı koşullarda. Elde veriler sağlam descript sağlarölçülebilir bir şekilde hedeflenen hücrelerin konumunun, klonal hücre genişlemesi ve hücre göçü hayatta kalma, iyonu. Bir kritik bir adım güvenilir bir kesin gelişim aşamasında etkin doku spesifik etiketleme izin verebilir uygun genetik fare zorlanma seçmek olacaktır. Bu sistemin bir sınırlama canlı bir organizmaya izlenmesi için, doku erişilebilir ve şeffaf olmasıdır. Benzer şekilde, bir canlı hayvan içinde kalın bir doku izlemenin yalnızca iki foton veya çoklu foton mikroskobu ile kolaylaştırılabilir. Ancak, hücre izleme postmortem doku bölümleri mevcuttur ve CLARITY yöntemiyle 32,33 ile şeffaf olmak dönüştürülmüştür sonra belki sağlam doku incelenebilir. Dikkate alınması gereken bir başka sınırlama, aynı fluorofor ifade komşu hücreler, büyük olasılıkla aynı klonal soy ait olsa da, bu rastgele kişi aynı flüoresan gen ifade bağımsız hücre kökenli türetilebilir da mümkündür olmasıdır. Bu possibiliÇok sayıda renk kombinasyonları izin birden Br allelleri kullanırken ty çok olası hale gelir. Gelecekte, genlerin ve sağlık ve patoloji kendi mutasyonların çalışma izin verecektir mevcut genetik araçlar (yani, nakavt, knockin ve transgenik fare modelleri) ile Confetti sistemini birleştirerek. Aynı şekilde, soy hücre kaderinin kararları sinyal yolları katılımı üzerine yeni anlayışlar getirecektir farklı sistem pertürbasyonlar (yani, hücre yıkımını niş, lazer aracılı hücre ablasyon, ilaç tedavisi kök) kapsamında izleme. Sonuçta, floresan ve biyoışıldama etiketleme kombinasyon kullanımı, kenar mikroskopi sinyal yollarının ve kesme genetik gazetecilere araştırmacılara onların kendi doğal ortamında çevredeki nasıl tepki tek hücre öğrenmek için sağlam bir sistem sağlayacaktır.

Embriyo gelişimi sırasında, doku ve organ morfogenez hücre proliferasyonu, hücre göçü ve soy tarifnamede 1-4 cinsinden tanımlanabilir kesin bir program sayesinde yer almaktadır. Bu biyolojik süreçler de hücre yenilenmesini kök gerektirir yetişkin doku homeostazını, muhafaza katılmaktadırlar. Lineage izleme, kimlik ve hücre popülasyonunun belirli bir tip soyu takibi, embriyojenezi okuyan ve hücre homeostazı kök için önemli bir araç sunmaktadır. Gerçekten de, giderek araştırmanın pek çok alanında kullanılmaktadır. Özellikle, soy izleme homeostasis ve kanser gelişiminde kökeni ve kök hücrelerin kaderini belirlemede önemli bir araç haline geldi. Hücre izolasyonu ve in vitro kültürü veya transplantati içinde aksine minimal deneysel müdahale ile hücre sağlam doku veya organizmanın bağlamında nasıl davranacağını hakkında önemli bilgiler sağlayabilir Bunun nedeniBu istenmeyen önyargı neden olabilir. Geleneksel olarak, hücrelerin plazma zarına dahil, lipid çözünür karbosiyanin boya olarak, soy izleme için kullanıldı. Deneylerde bu tür başarılı gelişim biyolojisi 5,6 önemli keşifler ve şekilli seminal kavramlara yol açmıştır rağmen, hedeflenen hücrelerin özgünlüğünü kontrol etmek için zorluk, hücre davranışı üzerindeki boyanın istenmeyen etkisi ve seyreltme dahil bazı sınırlamalar var zaman etiketi. Nükleotid analog etiketleme yaklaşımları muhtemelen kök hücreleri 7,8 sakin koşullarda uygun &quot;etiket istinat hücreler&quot; yavaş bisiklet varlığını belgeleyen sağlamıştır. Bu tekniğin sınırlı bir süre boyunca çoğalma kinetiği dayalı yavaş bisiklet hücrelerinin varlığını göstermek olabilir Bununla birlikte, bu kök hücrelerin işlevselliğini ilgili önemli anlayışlar temin edemedik. Optimal soy izleme metduğu işaretli hücrenin kendi döl veya komşularının özelliklerine etiketleme etkisini en aza indirmek gerekir. Ayrıca, bir sahne ve zamana bağlı bir şekilde de yanı sıra tek bir hücre (klonal) şekilde ilgi hücre popülasyonu etiketlemek yeteneğine sahip, yani etiketleme indüksiyon kontrole sahip yararlı olacaktır. Etiket zamanla muhafaza ve komşu hücrelere transfer değil olacağını, böylece kurucu hücrenin tüm soyu aktarılır İstikrarlı ve geri dönüşümsüz etiketleme yöntemi çok önemlidir. Daha yakın zamanlarda, hücre etiketleme genetik yaklaşımlar geliştirilmiştir. Bu sistemlerde, hücre spesifik promotörler, yeşil fluoresan protein ya da Β-galaktosidaz raportör genler gibi muhabir 9-13 genlerinin ifadesinin loxP-çevrili barikat çıkarın ve izin vermek için, Cre rekombinazın ifadesinin tetiklemek için kullanılabilir. Bu yaklaşım, sadece hücreler ve onların döl takibini mümkün kılan, aynı zamanda hücre izinolation ve moleküler karakterizasyonu. Tek hücre düzeyinde hücre takibi, tek bir floresan haberci genin ifadesinin indüksiyonu yoluyla mümkün hale geldi. Bu sistemin önemli bir sınırlama hücrelerinin çok düşük bir yüzde, ayrı ve tek tek klonlar izlemek mümkündür etiketli tek bir gerçektir. Renkli gazetecilere kullanılabilecek bu sınırlamayı aşmak için. Renkli etiketleme kullanırken, aynı niş komşu hücrelerin diferansiyel kaderin izleme verimli 14-17 elde edilebilir. Son zamanlarda, Brainbow (Br) alel çeşitli Cre / lox sistemi kullanılarak birden çok flüoresan raportör genlerin stokastik ifadesine imkan tanır, soy izleme deneyleri için geliştirilmiştir. Cre / lox sistemi algılar ve loxP sitelerinin gibi özel DNA dizilerine bağlanan Cre rekombinaz enzimin oluşur. Aşağıdaki Cre rekombinazın bağlanması site spesifik rekombinasyon oluşur loxP çıkarılması çevrili dizileri yolaçan neden olanFarklı floresan proteinleri rastgele ifadedeki g (mekanizması, aşağıda tarif edilmiştir) hazırlandı. Br hatlarının çeşitli (Değerlendirmeler 16,18,19 bakınız) kullanım için mevcuttur. Br suşları arasında büyük farklar 2 (Br 2,0), 3 (Br1.0) 4 (Br1.1, Br2.1) flüoresan genler arasında değişen, kaset dahil flüoresan genlerin sayısı (i) farklılıklar, , (ii) karşılıklı yönlendirilmiş lox mevkisi varlığı kullanılan lox mevkisi (iii) tipi, ve (iv) sentezleme veya floresan gen ekspresyonunun sessizlik önce Cre aktivasyonuna gen inversiyon (Br2.0-2.1) izin vermek. Yeni kurulan Br3 nöronların renkli görüntüleme için geliştirilmiş bir yöntem sunmaktadır. Bu transkript ana özelliklerinden biri en iyi nöronal eşit bir boyama 20 süreçleri sağlayan ışığa farnesillenmiş floresan proteinleri, bir dizi yeni içermesidir. Önemlisi, Br kasetlerinin farklı sürümleri Thy1 pr nöronal özgü içerebiliromoter veya ubiquitously CAG (CMV) promoteri dile getirdi. Br transgenik farelerin bazıları tek Br transgen içerebilirken Son olarak, diğerleri, böylece, her hücrede eksprese edilecek renk kombinasyonları olasılıklarının muazzam sayıda üretilmesini sağlayan, birden fazla transgen kopya içerebilir (örneğin 16). Çalışmamızda, biz Br 2.1 kaset 21 içeren R26R-Konfeti fare kullanıldı. Br2.1 benzersiz Cre-aracılı DNA inversiyon nedeniyle loxP sitelerinin (Şekil 1) karşılıklı doğrultuda değil, sadece eksizyon izin verecek şekilde tasarlanmıştır. Böylece, renk değişikliğine yol bu inversiyon / eksizyon olayları sürece Cre 16 mevcut olduğu gibi devam edebilirsiniz. Bu nedenle, bir indüklenebilir zamansal Cre sentezleme sistemi güvenilir hücre izleme Br2.1 kullanmak için gereklidir. Şekilde gösterildiği gibi,. 1, Br2.1 loxP-çevrili Neo R -casse ardından her yerde bulunan bir CAG promotörünü içerirbir transkripsiyon birlikte gösterim olarak hareket tte, iki tandem konumlandırılmış san bir yeşil için 4 flüoresan raportör genlerin kodlama (GFP), (YFP), kırmızı (RFP) ve mavi (CFP) floresan proteinleri takip eder. Resim floresans Cre aktivasyonu öncesinde ifade edilir. Cre rekombinazın indüksiyonu, belirli bir hücre içinde 4 floresan proteinleri bir rastgele ekspresyonunu sağlayan Neo-R kasetinin giderilmesini de sağlar. İkinci bölüm loxP-çevrili RFP ve ters CFP içerirken ilk parça, loxP-çevrili GFP ve ters YFP içerir. Bu DNA segmentleri sürekli sürece, Cre rekombinaz mevcut olduğu, (ters yönlenmede olduğunda loxP kullanılarak) ters veya çıkarılabilir. Bu nedenle, geçici ve kontrollü Cre transgen kullanılmalıdır. YFP ekspresyonunu ve RFP sitoplazmiktir, GFP, nükleer ve CFP hücre membranına bağlanır: Br2.1 kaseti sinyal konumuna bağlı örtüşen emisyonlar arasında ayırt etmeye yönelik mükemmel bir sistem sağlar. GFPve RFP emisyon kolayca geleneksel fluoresan mikroskobu ile ayrılır. YFP / GFP / CFP emisyon ayırmak amacıyla, bir spektral konfokal görüntüleme sistemi gereklidir. Toplamda, Br2.1 kaset hedeflenen her hücrede dört takım farklı floresan genlerin rastgele indüklenebilir ve doku spesifik ifadesini verir. Renk kombinasyonları daha büyük bir sayı gerektiğinde Aslında, bir bu şekilde her hücre için 2 renkli etiketleri sentezlenmesi ve 10 olası renk kombinasyonların sayısını artırmak sonuçlanan Br2.1 2 alellerini içeren homozigot fareler üretebilir Kasetin birden çok kopyası genomları 16 entegre çünkü 22. Br fare suşlarının bazı olası renk kombinasyonları çok daha büyük bir sayısının ifadesini mümkün kılar. Bununla birlikte, çoğu durumda, tek bir Br2.1 alel tarafından temin edilen, dört renk kombinasyonları yeterlidir. Burada sağlanan protokol izlenerek, tek bir spectr nispeten basit bir düzeneği kullanılarak, bu yöntem kurabilirKalibrasyon için çok az, eğer herhangi bir ihtiyacı ile al mikroskopi. Burada korneal epitelyumun soyu takip deneyler için, tek bir Br2.1 alel ihtiva R26R-Konfeti farelerin kullanım için uyarlanabilir bir protokol sağlar. Bu transgenik fare suşu kolon 21,23 ve kornea epitel kök hücrelerin 22,24 kökeni ve kaderi çalışmak için kullanılır olmuştur, ve fokal segmental glomerüloskleroz böbrek Podosit vasıflandırılması için bağırsak kanserine 25 kök hücre aktivitesinin varlığı (FSGS) 17.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>R26RConfetti transgenic mice homozygous for the Brainbow 2.1 cassette.</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>strain #013731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K14CreERT2 mice</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>strain #005107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tamoxifen</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isoflurane USP Terrell</td>
			<td>Piramal Critical Care</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carprieve 30</td>
			<td>b.wt</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td>used at concentration of 4&#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immu Mount</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>9990402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 510 Meta laser scanning confocal system hooked to an inverted motorized microscope (Axiovert 200M) equipped with a motorized stage .</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>The spectral overlap between GFP, YFP and CFG requires the use of spectral imaging which allows the separation of the emission spectra of the fluorescent proteins. Here we use the Zeiss LSM 510 Meta spectral confocal microscope. The Meta detector included in this system has 32 detector elements each collecting emission from a 10-nanometer waveband. This technique termed &#34;spectral fingerprinting&#34; enables the user to set the most adequate limits for waveband filtering. There is a variety of spectral confocal systems that can be used, including Leica SP5(ref #21), SP8, Zeiss LSM 780 (ref #22).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen 2009 Imaging Software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duratears-eye ointment</td>
			<td>Alcon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a method for lineage tracing of corneal cells using multi-color fluorescent reporter mice

Lineage tracing experiments define the origin, fate and behavior of cells in a specific tissue or organism. This technique has been successfully applied for many decades, revealing seminal findings in developmental biology. More recently, it was adopted by stem cell biologists to identify and track different stem cell populations with minimal experimental intervention. The recent developments in mouse genetics, the availability of a large number of mouse strains, and the advancements in fluorescent microscopy allow the straightforward design of powerful lineage tracing systems for various tissues with basic expertise, using commercially available tools. We have recently taken advantage of this powerful methodology to explore the origin and fate of stem cells at the ocular surface using R26R-Confetti mouse. This model offers a multi-color genetic system, for the expression of 4 fluorescent genes in a random manner. Here we describe the principles of this methodology and provide an adaptable protocol for designing lineage tracing experiments; specifically for the corneal epithelium as well as for other tissues.

Son zamanlarda, biz kök hücre ve kornea epitelinin 24 progenitör hücrelerin köken, hayatta kalma ve göç belirlenmesi amaçlanmıştır. Biriken deliller kornea epitel limbal niş, kornea periferinde bir halka şeklinde bölgede münhasıran bulunan kök hücreler tarafından yenilenir dogma destekler. Bu teori, in vitro ve in vivo verilerin ve başarılı öncü limbal kök hücre tedavisi 27-29 temelini sağlanan klinik kanıtlarla desteklenmektedir. Ancak, bu konu son derece bağlı fare limbus korneal yenileme 30 katılmaz önerdi limbal aşılama deneyleri dayalı bir çalışmaya son yıllarda tartışılan kaldı. Bu ilginç hipotezi test etmek için, R26R-Konfeti fareler yapıldı kullanarak soy izleme deneyleri 120 gün 24 için kararlı hal koşulları altında limbal ve kornea epitel kök / progenitör hücrelerin kaderini takip etmek.Gözler enüklee ve düz monte kornealar 10 ve 120 gün Tamoksifen enjeksiyon sonrası spektral konfokal lazer tarama floresan mikroskop ile analiz edilmiştir. Beklendiği gibi kornea merkezine doğru limbus uzanan 1-4 ay sonra (Şekil 2B ve 24), uzunlamasına çizgiler yavaş geliştirilmiş olup, küçük flöresanlı hücre kümeleri ara sıra, 10 gün sonra aynı oküler yüzey boyunca gözlenmiştir. Bu sonuç kornea kornea merkezine doğru limbustan göç hücreleri tarafından yeniden düşündürmektedir. Sonra, yaralama koşullarda kornea rejenerasyon incelenmiştir. Etkin hücre izleme indüklerken koşullar altında yaralama K14 pozitif limbal / kornea hücrelerin kaderini test etmek için, biz, topikal uygulamaya bağlı kornea yaralanması neden dimetil sülfoksitte Tamoksifen (DMSO), eritilir. Tek bir topikal uygulaması (Şekil 2C), mo uygulandı Bu şekilde biz hafif yaralama ikna etmek için başardı<html> Ek DMSO yalnız tedavi Tamoxifen indüksiyon veya DMSO yalnız topikal Tamoksifen indüksiyon öncesinde 2 ardışık günlerde uygulanan ağır yara gün önce uygulandı ise yaralama yükünü azaltır. Yavaş geliştirilen ve durağan hal koşulları altında 4 ay içinde kornea merkezine ulaştığı ince limbal çizgili aksine, yaralanmadan sonra hücre göçü hızlıydı. Dikkate değer, uzun ve kalın çizgili limbal zaten 7 gün içinde bu koşullar altında geliştirilmiştir. İlginç bir şekilde, renk çeşitliliği, bazen çok az (Şekil 2B) idi. Bizim ellerde, bazen, özellikle kırmızı kan hücrelerinin spesifik fluorophores karşı önyargılı olabilir renk çeşitliliği gösteren tüm kornea tespit edilmiştir. Br1.0L 31 ve Br2.1 21&#39;de daha önce bildirildiği gibi, istenmeyen bu eğilim doz tepki deneyleri ile kalibre edilebilir. les / ftp_upload / 53370 / 53370fig1.jpg &quot;/&gt; R26R-Konfeti yapısının Şekil 1. şematik gösterimi. (A) R26R-konfeti yapı yüksek ekspresyon düzeyleri için bir CAG destekçisi içeren bir loxP (siyah üçgen) Neo R -roadblock ve Rosa26 lokus 16,21 at Brainbow2.1 kaseti -flanked. Brainbow2.1 kaset, iki baş-kuyruk loxP-flanked dimerlerini içerir. Bir dimer nükleer lokalize yeşil floresan proteini (GFP) ve bir geri odaklı sitoplazmik sarı floresan proteini (- olması yoluna götürdü ters çevrilmiş yönlenme belirlenmiş YFP) oluşur. 16 - İkinci dimer sitoplazmik RFP ve bir ters dönük, zara bağlı mavi floresan proteinin (PFC ters çevrilmiş yönlenme belirlenmiş CFP) içerir. (B - E) Cre-rekombinaz aktivasyonu üzerine, farklı eksizyon ve inversiyon olaylar meydana gelebilir; Olası sonuçlar exemplifi vardırB ed - E. Cre aktivite ve böylece gen taşınma ve / veya inversiyon ve dört floresan proteinleri birinin rastgele ifadesi sonuçlar giden kasetin stokastik yeniden düzenlenmesine neden olur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53370/53370fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/53370/53370fig2.jpg" /> Şekil 2. Homeostaz ve yaralanma altında izleme Kornea soyu. R26R-confetti / protokol ayrıntılı olarak K14-Cre farenin 4 mg Tamoksifen enjekte edilmiştir. (- B A) puan sonrası belirtilen süre içinde endüksiyon kornealar görüntülenmiştir basık. Cre indüksiyonu ile birleştiğinde Kornea yaralama DMSO içinde çözülmüş Tamoksifen topik uygulama ile elde edilmiştir (Cı - D). Mozaik görüntüler eldespektral konfokal mikroskopi fayans kanallı gösterilmektedir (A - D). Homeostazındaki yavaş göç hücrelerin radyal limbal çizgili limbus ve kornea merkezi arasında uzanıyordu. Bu şeritler 4-5 ay (B) içinde kornea merkezine ulaşan yavaş gelişti. Kornea hücre kümeleri de (beyaz oklar, B) belirgindi. Buna karşılık, büyük limbal çizgiler yaralama koşullarında (C) altında, tek bir hafta içinde ortaya çıktı. Kırmızı hücrelerin (D) doğru renk çeşitliliğinin önyargı bir örnek. Limbal-kornea sınır kesik çizgi ile açıklamalı. Ölçek çubuğu 500 mikron olduğunu. Kısaltmalar: CFP, mavi floresan proteini; GFP, yeşil flüoresan proteini; RFP, kırmızı floresan proteini; YFP, sarı floresan protein. Bu rakam 24 modifiye edilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53370/53370fig2large.jpg" target="_blank">Büyük halini görmek için tıklayınız</a>Bu rakam.

Watch this Scientific Journal Video about A Method for Lineage Tracing of Corneal Cells Using Multi-color Fluorescent Reporter Mice at JoVE.com

A Method for Lineage Tracing of Corneal Cells Using Multi-color Fluorescent Reporter Mice

In this article we describe the principles for designing and performing a multi-color lineage tracing experiment using R26R-Confetti mice. We provide a specific protocol for tracking corneal epithelial cells which can be modified for other tissues of interest.

Çok renkli Floresan Reporter Fare kullanma Kornea Hücre Lineage İzleme Bir Yöntem

Lineage tracing experiments define the origin, fate and behavior of cells in a specific tissue or organism. This technique has been successfully applied ...

a-method-for-lineage-tracing-corneal-cells-using-multi-color

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

17.3K Görüntüleme.  Israel Institute of Technology. In this article we describe the principles for designing and performing a multi-color lineage tracing experiment using R26R-Confetti mice. We provide a specific protocol for tracking corneal epithelial cells which can be modified for other tissues of interest.

Video: A Method for Lineage Tracing of Corneal Cells Using Multi-color Fluorescent Reporter Mice

Efficient Generation of hiPSC Neural Lineage Specific Knockin Reporters Using the CRISPR/Cas9 and Cas9 Double Nickase System

Gene targeting is a critical approach for characterizing gene functions in modern biomedical research. However, the efficiency of gene targeting in human cells has been low, which prevents the generation of human cell lines at a desired rate. The past two years have witnessed a rapid progression on improving efficiency of genetic manipulation by genome editing tools such as the CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (CRISPR-associated) system. This manuscript describes a protocol for generating lineage specific human induced pluripotent stem cell (hiPSC) reporters using CRISPR/Cas system assisted homologous recombination. Procedures for obtaining necessary components for making neural lineage reporter lines using the CRISPR/Cas system, focusing on construction of targeting vectors and single guide RNAs, are described. This protocol can be extended to platform establishment and mutation correction in hiPSCs.

Genome editing tools such as the CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (CRISPR-associated) system have greatly improved gene targeting efficiency in human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). This manuscript describes a protocol for generating lineage specific hiPSC reporter using CRISPR/Cas system assisted homologous recombination.

HiPSC Sinir Lineage Özgül Knockin Muhabirleri Verimli Nesil kullanma CRISPR / Cas9 ve Cas9 Çift Nickase Sistemi

Gene targeting is a critical approach for characterizing gene functions in modern biomedical research. However, the efficiency of gene targeting in human ...

Gelişim Biyolojisi

Alginate Encapsulation of Pluripotent Stem Cells Using a Co-axial Nozzle

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening. However, the development of a mass culture system would be required for using PS cells in these applications. Suspension culture is one promising culture method for the mass production of PS cells, although some issues such as controlling aggregation and limiting shear stress from the culture medium are still unsolved. In order to solve these problems, we developed a method of calcium alginate (Alg-Ca) encapsulation using a co-axial nozzle. This method can control the size of the capsules easily by co-flowing N2 gas. The controllable capsule diameter must be larger than 500 &#181;m because too high a flow rate of N2 gas causes the breakdown of droplets and thus heterogeneous-sized capsules. Moreover, a low concentration of Alg-Na and CaCl2 causes non-spherical capsules. Although an Alg-Ca capsule without a coating of Alg-PLL easily dissolves enabling the collection of cells, they can also potentially leak out from capsules lacking an Alg-PLL coating. Indeed, an alginate-PLL coating can prevent cellular leakage but is also hard to break. This technology can be used to research the stem cell niche as well as the mass production of PS cells because encapsulation can modify the micro-environment surrounding cells including the extracellular matrix and the concentration of secreted factors.

We established a method of encapsulating pluripotent stem cells (PS cells) into alginate hydrogel capsules using a co-axial nozzle. This prevents cells from aggregating excessively and limits the shear stress experienced by cells in suspension culture. The technique is applicable to the mass production of PS cells as well as research on stem cell niche.

Bir Koaksiyel Memesini kullanma Pluripotent Kök Hücre Aljinat Encapsulation

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening.  However, the ...

Method of Studying Palatal Fusion using Static Organ Culture

Cleft lip and palate are among the most common of all birth defects. The secondary palate forms from mesenchymal shelves covered with epithelium that adheres to form the midline epithelial seam (MES). The theories suggest that MES cells follow an epithelial to mesenchymal transition (EMT), apoptosis and migration, making a fused palate 1. Complete disintegration of the MES is the final essential phase of palatal confluence with surrounding mesenchymal cells. We provide a method for palate organ culture. The developed in vitro protocol allows the study of the biological and molecular processes during fusion. The applications of this technique are numerous, including evaluating responses to exogenous chemical agents, effects of regulatory and growth factors and specific proteins. Palatal organ culture has a number of advantages including manipulation at different stages of development that is not possible using in vivo studies.

Studies of palate development are motivated by the incidence of cleft palate, a birth defect that imposes a tremendous health burden and can leave lasting disfigurement. We demonstrate here a technique to culture palatal shelves that can be used to study different signaling pathways involved in palatal development and fusion.

Statik Organ Kültürü kullanarak Palatal Fusion incelenmesi yöntemi

Cleft lip and palate are among the most common of all birth defects. The secondary palate forms from mesenchymal shelves covered with epithelium that ...

Co-localization of Cell Lineage Markers and the Tomato Signal

The cell lineage tracing system has been used predominantly in developmental biology studies. The use of Cre recombinase allows for the activation of the reporter in a specific cell line and all progeny. Here, we used the cell lineage tracing technique to demonstrate that chondrocytes directly transform into osteoblasts and osteocytes during long bone and mandibular condyle development using two kinds of Cre, Col10a1-Cre and Aggrecan-CreERT2 (Agg-CreERT2), crossed with Rosa26tdTomato. Both Col10 and aggrecan are well-recognized markers for chondrocytes.
On this basis, we developed a new method-cell lineage tracing in conjunction with fluorescent immunohistochemistry-to define cell fate by analyzing the expression of specific cell markers. Runx2 (a marker for early-stage osteogenic cells) and Dentin matrix protein1 (DMP1; a marker for late-stage osteogenic cells) were used to identify chondrocyte-derived bone cells and their differentiation status. This combination not only broadens the application of cell lineage tracing, but also simplifies the generation of compound mice. More importantly, the number, location, and differentiation statuses of parent cell progeny are displayed simultaneously, providing more information than cell lineage tracing alone. In conclusion, the co-application of cell lineage tracing techniques and immunofluorescence is a powerful tool for investigating cell biology in vivo.

We developed two sets of tracing combinations in Rosa26tdtomato (ubiquitously expressed in all cells)/Cre (specifically expressed in chondrocytes) mice: one with 2.3Col1a1-GFP (specific to osteoblasts) and one with immunofluorescence (specific to bone cells). The data demonstrate the direct transformation of chondrocytes into bone cells.

Hücre Lineage belirteçlerinin Eş-lokalizasyonu ve Domates Sinyali

The cell lineage tracing system has been used predominantly in developmental biology studies. The use of Cre recombinase allows for the activation of the ...

Cell Lineage Analyses and Gene Function Studies Using Twin-spot MARCM

Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) is a positive mosaic labeling system that has been widely applied in Drosophila neurobiological studies to depict intricate morphologies and to manipulate the function of genes in subsets of neurons within otherwise unmarked and unperturbed organisms. Genetic mosaics generated in the MARCM system are mediated through site-specific recombination between homologous chromosomes within dividing precursor cells to produce both marked (MARCM clones) and unmarked daughter cells during mitosis. An extension of the MARCM method, called twin-spot MARCM (tsMARCM), labels both of the twin cells derived from a common progenitor with two distinct colors. This technique was developed to enable the retrieval of useful information from both hemi-lineages. By comprehensively analyzing different pairs of tsMARCM clones, the tsMARCM system permits high-resolution neural lineage mapping to reveal the exact birth-order of the labeled neurons produced from common progenitor cells. Furthermore, the tsMARCM system also extends gene function studies by permitting the phenotypic analysis of identical neurons of different animals. Here, we describe how to apply the tsMARCM system to facilitate studies of neural development in Drosophila.

Here, we present a protocol for a mosaic labeling technique that permits the visualization of neurons derived from a common progenitor cell in two distinct colors. This facilitates neural lineage analysis with the capability of birth-dating individual neurons and studying gene function in the same neurons of different individuals.

Çift nokta MARCM kullanılması Hücre Lineage Analizleri ve Gen Fonksiyonu Çalışmaları

Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) is a positive mosaic labeling system that has been widely applied in Drosophila neurobiological ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality microscopic images is not entirely dependent upon the quality of the microscope, but also upon the methods of tissue processing, which often involve multiple critical actions or steps. Furthermore, mesenchymal cell types in the skin and other tissues represent a new challenge for tissue preparation and imaging. Here, we present a complete process, from tissue harvest to microscopy. Our technique, called &#34;horizontal whole mount,&#34; is one that novices can quickly become proficient in and that allows for antigen preservation and detection in 60-300 &#181;m-thick sections cut with a cryostat. Sections of this thickness provide enhanced visualization of tissue microarchitecture in a three-dimensional environment. In addition, the protocol preserves mesenchymal cells in a manner that enhances image quality when compared to standard cryostat or paraffin sections, thereby increasing the efficacy and reliability of immunostaining. We believe that this protocol will benefit all laboratories that visualize skin, and possibly other tissues and organs.

This work presents a novel processing and imaging protocol for thick, three-dimensional tissue cross-section analysis that enables the full exploitation of confocal imaging modalities. This protocol preserves antigenicity and represents a robust system to analyze skin histology and potentially other tissue types.

Yatay Dağ Dağı: Derinin kalın, üç boyutlu doku kesitleri için yeni bir İşleme ve Görüntüleme Protokolü

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause disease when disrupted. Scientists have developed clever techniques to investigate characteristics and natural dynamics of these cells within intact tissue by expressing fluorescent proteins in subsets of cells. However, at times, experiments require more selected visualization of cells within the tissue, sometimes at the single-cell or population-of-cells manner. To achieve this and visualize single cells within a population of cells, scientists have utilized single-cell photoconversion of fluorescent proteins. To demonstrate this technique, we show here how to direct UV light to an Eos-expressing cell of interest in an intact, living zebrafish. We then image those photoconverted Eos+ cells 24 h later to determine how they changed in the tissue. We describe two techniques: single cell photoconversion and photoconversions of populations of cell. These techniques can be used to visualize cell-cell interactions, cell-fate and differentiation, and cell migrations, making it a technique that is applicable in numerous biological questions.

Here, we present a protocol to show how cell photoconversion is achieved through UV exposure to specific areas expressing the fluorescent protein, Eos, in living animals.

Yaşam sağlam Zebra balığı tek hücreli Photoconversion

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Tracing Gene Expression Through Detection of &#946;-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

The Escherichia coli LacZ gene, encoding &#946;-galactosidase, is largely used as a reporter for gene expression and as a tracer in cell lineage studies. The classical histochemical reaction is based on the hydrolysis of the substrate X-gal in combination with ferric and ferrous ions, which produces an insoluble blue precipitate that is easy to visualize. Therefore, &#946;-galactosidase activity serves as a marker for the expression pattern of the gene of interest as the development proceeds. Here we describe the standard protocol for the detection of &#946;-galactosidase activity in early whole mouse embryos and the subsequent method for paraffin sectioning and counterstaining. Additionally, a procedure for clarifying whole embryos is provided to better visualize X-gal staining in deeper regions of the embryo. Consistent results are obtained by performing this procedure, although optimization of reaction conditions is needed to minimize background activity. Limitations in the assay should be also considered, particularly regarding the size of the embryo in whole mount staining. Our protocol provides a sensitive and a reliable method for &#946;-galactosidase detection during the mouse development that can be further applied to the cryostat sections as well as whole organs. Thus, the dynamic gene expression patterns throughout development can be easily analyzed by using this protocol in whole embryos, but also detailed expression at the cellular level can be assessed after paraffin sectioning.

Here we describe the standard protocol for the detection of &#946;-galactosidase activity in early whole mouse embryos and the method for paraffin sectioning and counterstaining. This is an easy and quick procedure to monitor gene expression during development that can also be applied to tissue sections, organs or cultured cells.

Tüm fare embriyo etkinliğinde β-galaktozidaz tespiti yoluyla Gen ifadesinin izleme

The Escherichia coli LacZ gene, encoding &#946;-galactosidase, is largely used as a reporter for gene expression and as a tracer in cell lineage studies. ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give rise to multiple cell types, including the myotome (MYO), sclerotome (SCL), dermatome (D), and syndetome (SYN), which in turn develop into skeletal muscle, axial skeleton, dorsal dermis, and axial tendon/ligament, respectively. Therefore, the generation of SMs and their derivatives from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) is critical to obtain pluripotent stem cells (PSCs) for application in regenerative medicine and for disease research in the field of orthopedic surgery. Although the induction protocols for MYO and SCL from PSCs have been previously reported by several researchers, no study has yet demonstrated the induction of SYN and D from iPSCs. Therefore, efficient induction of fully competent SMs remains a major challenge. Here, we recapitulate human SM patterning with human iPSCs in vitro by mimicking the signaling environment during chick/mouse SM development, and report on methods of systematic induction of SM derivatives (MYO, SCL, D, and SYN) from human iPSCs under chemically defined conditions through the presomitic mesoderm (PSM) and SM states. Knowledge regarding chick/mouse&#160;SM development was successfully applied to the induction of SMs with human iPSCs. This method could be a novel tool for studying human somitogenesis and patterning without the use of embryos and for cell-based therapy and disease modeling.

We present here a protocol for the differentiation of human induced pluripotent stem cells into each somite derivative (myotome, sclerotome, dermatome, and syndetome) in chemically defined conditions, which has applications in future disease modeling and cell-based therapies in orthopedic surgery.

Somite türevleri indüklenen insan nesil Vitro Pluripotent kök hücreler

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Three-dimensional Angiogenesis Assay System using Co-culture Spheroids Formed by Endothelial Colony Forming Cells and Mesenchymal Stem Cells

Studies in the field of angiogenesis have been aggressively growing in the last few decades with the recognition that angiogenesis is a hallmark of more than 50 different pathological conditions, such as rheumatoid arthritis, oculopathy, cardiovascular diseases, and tumor metastasis. During angiogenesis drug development, it is crucial to use in vitro assay systems with appropriate cell types and proper conditions to reflect the physiologic angiogenesis process. To overcome limitations of current in vitro angiogenesis assay systems using mainly endothelial cells, we developed a 3-dimensional (3D) co-culture spheroid sprouting assay system. Co-culture spheroids were produced by two human vascular cell precursors, endothelial colony forming cells (ECFCs) and mesenchymal stem cells (MSCs) with a ratio of 5 to 1. ECFCs+MSCs spheroids were embedded into type I collagen matrix to mimic the in vivo extracellular environment. A real-time cell recorder was utilized to continuously observe the progression of angiogenic sprouting from spheroids for 24 h. Live cell fluorescent labeling technique was also applied to tract the localization of each cell type during sprout formation. Angiogenic potential was quantified by counting the number of sprouts and measuring the cumulative length of sprouts generated from the individual spheroids. Five randomly-selected spheroids were analyzed per experimental group. Comparison experiments demonstrated that ECFCs+MSCs spheroids showed greater sprout number and cumulative sprout length compared with ECFCs-only spheroids. Bevacizumab, an FDA-approved angiogenesis inhibitor, was tested with the newly-developed co-culture spheroid assay system to verify its potential to screen anti-angiogenic drugs. The IC50 value for ECFCs+MSCs spheroids compared to the ECFCs-only spheroids was closer to the effective plasma concentration of bevacizumab obtained from the xenograft tumor mouse model. The present study suggests that the 3D ECFCs+MSCs spheroid angiogenesis assay system is relevant to physiologic angiogenesis, and can predict an effective plasma concentration in advance of animal experiments.

Three-dimensional co-culture spheroid angiogenesis assay system is designed to mimic the physiologic angiogenesis. Co-culture spheroids are formed by two human vascular cell precursors, ECFCs and MSCs, and embedded in collagen gel. The new system is effective for evaluating angiogenic modulators, and provides more relevant information to the in vivo study.

Endotel Kolonisi Oluşturan Hücreler ve Mezenkimal Kök Hücreler tarafından Oluşturulan Eş Kültür Sfaoidler Kullanılarak Üç Boyutlu Anjiyogenez Tsay Sistemi

Studies in the field of angiogenesis have been aggressively growing in the last few decades with the recognition that angiogenesis is a hallmark of more ...