Kök hücrelerin ve soylarının indüklenebilir bir transgenik soy izleme fare çizgisi ile işaretlenmesi, beyindeki yetişkin kök hücrelerin in vivo aktivasyonunun, çoğalmasının, göçünün ve / veya farklılaşmasının mekansal ve zamansal analizine izin verir. Soy izleme, soy bağlılığı, müdahalelere yanıt ve çoklu potens hakkında yeni bilgiler ortaya çıkarabilir. Transgenik soy izleme yaklaşımlarının avantajları, belirli bir hücre soyunun izlenmesinin özgüllüğünü, hücre döngüsü veya farklılaşmasından bağımsız olarak floresan proteinin silinmez ekspresyonunu, doksisilin düşük toksisitesini, koşullu aktivasyonu ve immünoboyama ve immünofloresan dahil olmak üzere soy izi dokuları üzerinde yaygın aşağı akış analizleri ile kullanım kolaylığını içerir.
Yetişkin beynindeki plastisite ve hücrenin geniş anlamı nedeniyle, yetişkin kök hücrelerin karakterizasyonu ve analizi, nörodejeneratif hastalıkların, beyin plastisitesi üzerindeki metabolik etkilerin, yaşlanmanın ve diğer ilgili koşulların incelenmesi hakkında bilgi vermeye yardımcı olacaktır. Başlamak için, ılık oda sıcaklığına kaydırır ve 15 dakika boyunca buz gibi soğuk asetonla sabitler. Slaytları 1X durulama tamponunda beş dakika boyunca yıkayın, her adım arasında oda sıcaklığında dakikada 60 dönüşte çalkalayın.
Nükleer antijenlerin oda sıcaklığında 10 dakika boyunca% 0.3 Triton X-100 ile ayakta durması için geçirgenleştirin. Sitoplazmik antijenlerin oda sıcaklığında 10 dakika boyunca% 0.3 Tween-20 ile ayakta durması için geçirgenleştirin. 50 ila 100 mililitre 1x DAKO Antijen Retrieval Solution içindeki slaytları 10 dakika boyunca iki kez düşük dalgada dalgalandırarak antijen alımı gerçekleştirin.
Daha sonra, oda sıcaklığında beş dakika tamponla durulayın. Slaytları% 0.3 içinde inkübe edin% 70 etanol içinde% 70 etanol içinde tifojen siyahı oda sıcaklığında 20 dakika ve daha sonra durulama tamponu ile yıkayın. Doku etrafında hidrofobik bariyer çizin.
Bloke edici reaktif ile 37 santigrat derecede 20 dakika boyunca bloke edin. Ve dört santigrat derecede gece boyunca antikor seyrelticisinde seyreltilmiş birincil antikor ile inkübe edin. Slaytları oda sıcaklığında 10 dakika yıkayın.
Ertesi gün, Alexa Fluor sekonder antikorlarındaki bölümleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin. Daha sonra slaytları 10 dakika boyunca durulama tamponunda iki kez yıkayın. AlexaFluor 488'e konjuge edilmiş bir ila 500 anti-GFP antikorunun 100 mikrolitresinde beyin bölümlerini örtün ve endojen Fluor4'ü artırmak için gece boyunca dört santigrat derecede inkübe ederek izlenen hücreleri işaretleyin.
Ertesi gün, iki kez durulama tamponu ile yıkayın. Ve sonra beş dakika boyunca akan DI suyunda yıkayın. Beş dakika boyunca mililitre 4'6-diamidino-2-fenilindol başına 100 nanogram ile karşı boyama.
Daha sonra akan DI suyunda beş dakika yıkayın. Her doku bölümünün üzerine bir damla floresan güvenli montaj ortamı ekleyin ve 22 milimetre x 22 milimetrelik bir kapak kayması ile kapatın. Optimum sinyal sağlamak için montaj gününde görüntüleme önerilir.
Transkardiyal perfüzyonu takiben fiksasyon ve kesitlemeye başlamak için, dört santigrat derecede gecede% 4 PFA'da sabitlenmiş beyinler. Ve sonra tekrar oda sıcaklığında bir saat boyunca. Beyinleri oda sıcaklığında iki kez bir saat boyunca 1x PBS'de yıkayın.
Sagital beyin bloğunu kullanarak beyni bir milimetre kalınlığında bölümlere ayırın ve 1x PBS içeren beş mililitrelik mikro santrifüj tüplerine yerleştirin. Metanol ön işlemi için, oda sıcaklığında iki kez bir saat boyunca 1x PBS ile yıkayarak başlayın. Oda sıcaklığında bir saat boyunca% 50 metanol içinde yıkayın.
Oda sıcaklığında bir saat boyunca% 80 metanol içinde yıkayın. Oda sıcaklığında bir saat, iki kez% 100 metanol içinde yıkayın. Bir gecede %20 dimetil sülfoksit ve metanol içinde %5 hidrojen peroksit ve dört santigrat derecede metanol içeren ağartıcı numuneleri.
Ağartmadan sonra, numuneleri oda sıcaklığında iki kez bir saat boyunca metanol içinde yıkayın. Oda sıcaklığında iki kez% 20 dimetil sülfoksit ve metanol içinde bir saat yıkayın. Oda sıcaklığında bir saat boyunca% 80 metanol içinde yıkayın.
Oda sıcaklığında bir saat boyunca% 50 metanol içinde yıkayın. PBS'de oda sıcaklığında iki kez bir saat yıkayın. PBS% 0.2Triton X-100'de oda sıcaklığında iki kez bir saat boyunca yıkayın.
Temizleme beyinlerinin immünoboyaması için, numuneleri 1x PBS,% 0.2 Triton X-100,% 20 DMSO,% 20 DMSO, 0.3 molar glisin, yörüngesel bir çalkalayıcıda gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe ederek başlayın. 1x PBS,% 0.2Triton X-100,% 10 DMSO,% 6 keçi serumunu yörüngesel bir çalkalayıcıda üç gün boyunca 37 santigrat derecede bloke edin. Numuneleri 1x PBS,% 0.2 Ara-20, mililitre başına 10 mikrogram halinde domuz mukozasından 10 mikrogram halinde 37 santigrat derecede iki kez bir saat boyunca yıkayın.
Daha sonra, iki gün boyunca yörüngesel bir çalkalayıcıda 37 santigrat derecede bir ila 500 konsantrasyonda tavşan anti GFP AlexaFluor 488 içeren 1x PBS,% 0.2 Ara-20,% mililitre başına 10 mikrogram heparin,% 5 DMSO,% 3 keçi serumunda inkübe edin. Numuneleri 1x PBS,% 0.2 Tween-20'de, mililitre heparin başına 10 mikrogram ile 37 santigrat derecede bir saat boyunca yörüngesel bir çalkalayıcıda üç kez ve daha sonra iki gün boyunca günde bir kez yıkayın. Numuneleri bir mililitre% 50 Tetrahidrofuran ve suda gece boyunca inkübe edin.
Numuneleri bir mililitre% 80 THF Tetrahidrofuran ve suda bir saat boyunca inkübe edin. Numuneleri% 100 Tetrahidrofuran'da bir saat boyunca iki kez inkübe edin. Numuneleri steril bir mendille kurutun ve şişenin dibine batana kadar diklorometan içinde inkübe edin.
60 dakikadan fazla kuluçkaya yatmayın. Numuneleri temizlenene kadar bir mililitre dibenzil eter içinde inkübe edin. Numuneleri görüntüye hazır olana kadar oda sıcaklığında dibenzil eter içinde saklayın.
İmmünoboyalı beyin bölümlerini görüntülemek için, çoklu antikorların birlikte ekspresyonunun doğrulanabileceği konfokal mikroskopi yoluyla slaytları analiz edin. HyD S hibrit dedektörlü bir Leica Stellaris beş mikroskop kullanıyoruz. Temizlenmiş beyinleri görüntülemek için, otomatik bir aşama ve otomatik döşeme işlevine sahip ters çevrilmiş bir konfokal mikroskop kullanın.
Temizlenmiş bir beyin bölümünü, dibenzil etere batırılmış bir cam alt kaba düz bir şekilde yerleştirerek başlayın. Farklı beyin bölgeleri ve çeşitli hücre tipleri arasında floresan yoğunluğunda gözle görülür bir fark, soy izlenen beyinlerde bir nabız kovalama periyodunu takiben gözlenmiştir. Koroid pleksustaki koroid epitel hücreleri, kalın bir hücre zarına ve çevredeki hücrelerden kolayca ayırt edilebilen Tert pozitif hücrelerden türediklerini gösteren güçlü yeşil floresan sinyaline sahipti.
Koroid pleksus stromasındaki diğer küçük hücre tipleri daha zayıf bir GFP sinyaline sahipti. Beyincikte, Bergmann glial hücreleri sepet hücrelerinden daha yüksek GFP seviyeleri ifade etti ve GFP ekspresyonundaki varyasyon da bireysel sepet hücreleri arasında mevcuttu. Koku alma ampulünün glomerüler tabakası içindeki fabrika duyusal nöron aksonları için, koku alma ampulünün glomerüler tabakasını dolduran yüksek seviyelerde GFP Koku duyusal nöron aksonları, aynı nöronlar GFP pozitif olsa bile, diğer beyin bölgelerinin çoğuna kıyasla yüksek seviyelerde membran domates veya kırmızı floresan ifade etti.
Buna karşılık, koroid pleksusta GFP pozitif hücreler düşük mdomates eksprese etti. Diğer beyin bölgelerinin çoğunda, domates sinyalleri çoğu hücre tipinde düşük seviyede ifade edilir ve endotel hücreleri, floresan sinyali beyin dokusunun kırmızı floresan arka planından belirgin bir şekilde öne çıkacak kadar parlak olan tek hücrelerden bazılarıdır. Hatırlanması gereken en önemli şey, temizlenmiş beyinlerdeki floresan sinyalinin diğer immün testlerin çoğundan daha hızlı kaybolmasıdır.
Numunelerinizi mümkün olan en kısa sürede ve yedi gün içinde görüntülemeyi unutmayın. Bunu takiben, beyin dilimlerinin veya berrak beyinlerin görüntülenmesi, belirteçlerin GFP sinyalleri ile renklendirilmesi ve Florans miktarımız yazılım programları kullanılarak gerçekleştirilebilir.
