This work was funded by The MITRE Corporation through the MITRE Innovation Program (Project 25MSR621-CA). The authors would like to thank Mark Maybury, Ph.D., Richard Games, Ph.D., James Patton, Ellen Mac Garrigle, Ph.D., Carl Picconatto, Ph.D., and Caroline Gary for their support and review of this work.

Bakteriyel ve peptidoglikan Yüzeyler 1. hazırlanması Not: Bütün hücre bakteri alt-tabakalar ve saflaştırılmış peptidoglikanlar mikroslayd difüzyon testi ile ve boya salım deneyinde, her iki enzim alt tabaka olarak kullanılır. Bu yüzeyler enzim reaksiyonları iletken öncesinde hazırlık gerektirir. Aşağıdaki protokol bunların hazırlanmasını tarif etmektedir. <ol><li> Tüm Bakteri Hücre Yüzey <ol><li> Bacillus subtilis 168 2 ml gecelik kültürü ile besleyici et suyu 500 mi inoküle bakteriyel hücre alt-tabakanın üretir (American Type Culture Collection ATCC 23857). Kültür bakteri kültürü ikiye katlanması ile elde edilen hızlı bir büyüme fazı olarak tanımlanan büyüme üstel bir faz ulaşana kadar (125 rpm) çalkalama ile 30 ° C&#39;de inkübe edin. Salmonella enterica subsp ekimi için. Enterica (ATCC 10708), (125 rpm) çalkalanarak 37 ° C&#39;de büyüme ortamı olarak besin sıvısı kullanır. </li&gt; <li> basınç 3 atmosfer altında, 121 ° C&#39;de 10 dakika süre ile otoklavlama sureti her kültürün ısı öldürür. </li><li> 5,000 x g&#39;de 20 dakika boyunca santrifüj ile ısı ile öldürülmüş bakteriyel substrat hasat edilir. Tip 1 su ile pelet üç kez yıkayın ve su az miktarda yeniden askıya. Bu çalışmada, 1200 ul yüzeylerde askıya. </li><li> Kısım 20 ° C&#39;de 1.5 ml mikrofüj tüplerine ve saklamak için bakteriyel hücre alt tabakalar 300 ul. </li></ol></li><li> Arıtılmış peptidoglikan Yüzey <ol><li> (Malzemeler ve Ekipmanları Tablosuna bakınız) hedef alt tabaka bakteriden 7-10 den peptidoglikan arındırmak ya da bir satıcıdan kazanır. aksesuar hücre duvarı polimerlerden ham peptidoglikan hazırlıkları arındırın. </li></ol></li></ol> 2. Nitel mikroslayd difüzyon deneyi [Lachica değişikliğe uğratılmış ve ark., 11] Not: mikroslayd difüzyon deneyidirbir numunedeki antimikrobiyal enzimin varlığını tespit etmek için olan bir metottur. Enzim bir agaroz matrisine ihtiva eden alt-tabaka ile yayılır zamanda enzim substratı hidroliz gibi, açıklığın bir bölge geliştirir. Aşağıdaki protokol niteliksel proteini antimikrobik varlığını tespit etmek için mikroslayd difüzyon deneyi hazırlanması ve performansı açıklanmaktadır. <ol><li> üreticinin protokolüne göre bir Bikinkoninik asit (BCA) Protein Deney Kiti kullanılarak değerlendirilebilir antimikrobiyal enzim konsantrasyonunun belirlenmesi. </li><li> bir enzim tampon olarak fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) kullanmaktadır; Bununla birlikte, deneysel olarak verilen enzim için tampon uygun olan belirler. </li><li> reaksiyon tampon olarak fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile antimikrobiyal enzim seri seyreltme gerçekleştirin. Bu mikroslayd difüzyon deneylerinde kullanılan seri seyreltme 0 ug, 10 ug, 100 ug, 1 ng, 10 ng, 100 ng, 1 ug, 1 nihai deney proteini kitleleri üretilebilirreaksiyon hacmi ortalama 0 mg. </li><li> Bireysel mikrofüj tüplerine, protein kitleleri koyun ve reaksiyon, kuyu mikroslayd ek hazırlık olarak PBS kullanılarak ul 20 protein seviyesini ayarlamak. </li><li> PBS, 50 ml agaroz 0.25 g eritilmesi ile% 0.5 agaroz çözeltisi olun. agaroz tamamen eriyene kadar kaynama noktasına çözelti ısıtılır. ağırlıkça eritme işlemi sırasında kaybolan su belirlemek ve çözüm geri ekleyin. </li><li> Agaroz çözeltiye, su içerisinde% 10 sodyum azid, 50 ul ekleyin ve bir su banyosu içinde 50 ° C&#39;ye kadar çözeltinin sıcaklığını ayarlamak. Sodyum azit mikroslayd difüzyon deneyinin inkübasyon sırasında bakteri büyümesini kirletici inhibe etmek için ilave edildi. canlı hücreler alt-tabaka olarak kullanılması halinde, agaroz çözeltisi sodyum azid sayın. </li><li> buz üzerinde ısı ile öldürülmüş bakteri substrat çözülme. </li><li> Yeniden askıya yaklaşık agaroz çözeltisi 12 ml bakteri alt-tabaka bir 2.0 MCF bulanıklığının eşleşenArland (Malzeme Tablo) standart eşdeğerlik. yaklaşık bulanıklık elde edilene kadar agaroz bakteriyel maddesinin eklenmesi, çözümlerle beyaz arka plan üzerinde siyah bir çizgi görselleştirerek çözümler bulanıklığı karşılaştırın. </li><li> Hemen, her mikroslayd (25 x 75 x 1 mm 3) agaroz-alt-tabaka çözeltisi 3 mL pipet. </li><li> slaytlar kuvvetlendirmek sonra bir mantar delici (4.8 mm çap) kullanarak her mikroslayd agaroz-alt tabakanın üç kuyu yumruk. ilgili kuyucuklara her biri ayarlanabilir bir protein seri seyreltme 20 ul ekle. </li><li> de bir negatif kontrol olarak PBS (20 ul) ya da sığır serum albümini (20 ul PBS içinde 5 ug) kullanın. Bir pozitif kontrol olarak, bu tür lizozim şekilde alt-tabaka için uygun bilinen bakteriyolitik enzimler kullanın. </li><li> 37 ° C&#39;de bir nem odasında slayt veya enzimin optimum aktivitesi sıcaklığı inkübe edin. inkübasyon süresi konsantrasyonuna bağlıdır veAntimikrobiyal enzimin spesifik aktivitesi. Tipik reaksiyon süresi, bir gece boyunca (yaklaşık 16 saat). </li><li> inkübasyondan sonra, yaklaşık 30 cm odak mesafe 60 mm lens ile dijital tek lensli refleks kamera kullanarak gelişmekte olan testinin dolaylı ışık ve yakalama görüntüler altında slaytlar uyun. Not: Verilen alt tabaka için protein antimikrobiyal Enzimatik aktivite enzim agaroz içine yayılır yanı etrafında oluşturan hidroliz net bir bölge gelişimi ile ilişkilidir. </li><li> enzimatik aktivitesini hak kazanmak için, her iyi etrafında oluşturan bölgelerin boyutlarını gözlemleyin. Düşük enzimatik aktivitesi niteliksel daha küçük bir bölgeye ilgili olsa da yüksek enzimatik etkinlik nitelik, daha büyük bir bölgesi ile ilgilidir. </li></ol> 3. Yüzey Etiketleme - Remazol Brillant Blue R Boya Etiketleme [Zhou 12 Modifiye] Not: boya salım deneyinde, alt-tabaka kovalent linke oland parlak mavi R boyası Remazol için. Aşağıdaki protokol, boyanmış enzim substratları hazırlanmasını tarif etmektedir. <ol><li> Tip I su 99 ml 1 g NaOH çözülmesiyle 250 mM sodyum hidroksit (NaOH) çözeltisi yapmak 200 mM Remazol Parlak Mavi R boyası (RBB) çözeltisi yapmak için kullanılır. </li><li> Taze 250 mM NaOH çözeltisi (adım 3.1) 98.75 ml ± 1 ml 1.25 g RBB eriterek 200 mM RBB çözüm olun. </li><li> RBB çözeltisi, 30 ml 0.5 g ıslak ağırlık konsantrasyonunda ısı ile öldürülmüş bakteriyel hücreler yeniden askıya. saflaştınldı peptidoglikan için, RBB çözeltisi, 30 ml 0.3 g ıslak ağırlık konsantrasyonunda peptidoglikan yeniden askıya. </li><li> yumuşak bir karıştırma ile, 37 ° C&#39;de 6 saat süreyle dönüşlü bir platform üzerinde bir Erlenmeyer şişesi içinde, reaksiyon karışımının inkübe edin. </li><li> 4 ° C inkübatör Reaksiyon karışımı aktarın ve yumuşak karıştırma ile ilave bir 12 saat daha inkübe edilir. </li><li> İnkübasyondan sonra, 3000 x g&#39;de santrifüj ile boyanmış alt-tabakanın hasat30 dakika karıştırıldı. alt-tabaka pelet boya çözeltisini süzün. </li><li> ardından santrifüj Tip I su ile tekrar tekrar (yaklaşık 3-5 yıkama) boya etiketli hücreler veya peptidoglikan yıkanarak substrattan kovalent olmayan bir şekilde bağlanmış çözünebilir boya çıkarın. Her su ilavesi ile iyice pelet yeniden askıya. Not: ilişkisiz, çözünür boya artık santrifüj sonra suyla yıkayın görünür olduğunda. alt-tabaka bir ek yıkama verilmelidir. Son yıkama yüzer açık olacak ise alt tabaka, mavi kalacağını unutmayın. </li><li> daha sonra kullanılmak üzere -20 ° C&#39;de bir su az miktarda süspanse boyanmış substratlar saklayın. </li></ol> 4. Kantitatif Boya-release Deneyi Not: boya-release Deney sırasında reaksiyon süpernatant içine ürünleri boyalı enzimatik reaksiyon sürümlerde RBB-boyalı substrat hidrolizi. salınan boya miktarının kolorimetrik bir ölçümü amo gösterirBelirli bir enzimin numune içinde mevcut enzim etkinliğinin etkili olduğu akla. Kantitatif bir yöntem alt tabakalar üzerindeki farklı enzimlerin karşılaştırmasını sağlar ve enzimatik reaksiyonu (örneğin, sıcaklık, tuz ve pH) etkileyen çevresel koşulların varyasyona izin verir. Aşağıdaki protokol kantitatif protein antimikrobik enzimatik aktivitesini tespit etmek için, boya salimli bir tayinin hazırlanması ve performansı açıklanmaktadır. <ol><li> Boya salım analizi için hazırlık <ol><li> Dondurulmuş, boyanmış alt-tabaka, oda sıcaklığına dönmesi ve ampirik olarak verilen enzim için belirlenen deney tamponu (PBS) ile iki kere yıkayın izin verin. </li><li> yapılacak boya salma tahlilleri sayısına göre 200 ul reaksiyon hacmi çarpılarak gerekli olan alt-tabaka süspansiyonu hacmi hesaplanır. </li><li> (Optik yoğunluk elde edilene dek, 4.1.2 belirlenen deney tamponu hacmi, boyanmış alt-tabakanın eklenmesiyle alt-tabaka süspansiyonu hazırlamak2.0 OD) bir spektrofotometre kullanılarak 595 nm&#39;de elde edilmiştir. Konsantre çözeltinin 1 seyreltme: spektrofotometre fonksiyonel sınırlar dahilinde kalması için, 1 için 1.0 olarak 2.0 OD 595 ölçün. boş olarak deney tamponu kullanın. Not: Reaksiyon için alt-tabaka bulanıklığının yüksek verimli enzimlerin aktivite düzeylerinin eşleştirmek için 2.0 dışına kaldırılabilir. </li><li> Protein antimikrobik Askıda 1 mg / ml&#39;lik bir tahmini konsantrasyonda deney tamponu içinde değerlendirilmelidir. </li><li> imalatçının protokolüne göre bir BCA Protein Deney Kiti mikroplaka testi kullanılarak, protein örneğinin gerçek konsantrasyon tahlil edilecek belirler. mi deney tamponu kullanılarak 1 mg / hazır süspansiyonun konsantrasyonu ayarlayın. </li></ol></li><li> Bir Protein Antimikrobiyal için Optimal Kuluçka Şartları belirleme Boya-release Testi kullanarak <ol><li> 100 ng / ul stok proteini antimikrobiyal süspansiyon sulandırmak. Bu konsantrasyon af verirhacme (10 ul) başına protein 1 ug nominal reaksiyon kütlesi deney reaksiyona ilave edildi. </li><li> Termal aralığını belirlemek bakteriyolitik protein için değerlendirilmelidir. Bu deneylerde ısı aralığı 5 ° C, 15 ° C, 25 ° C, 35 ° C, 45 ° C, 55 ° C ve 65 ° C &#39;de yer. </li><li> 0.5 mi mikrofüj tüplerinde Reaksiyon tahlilleri gerçekleştirin. her bir termal bir durum için, hazırlanan alt-tabaka süspansiyonu 200 ul stok protein 10 ul ekle. </li><li> saatte bir kez ters çevirme ile karıştırılarak 8 saat, bir termal döngü içinde inkübe edin. </li><li> inkübasyondan sonra, etanol 25 ul ekleyerek reaksiyonlar tutuklama. </li><li> 2 dakika boyunca 3000 x g&#39;de santrifüj ile Sindirilmemiş, çözünmeyen substrat çıkarın ve sindirilmemiş substratın pelet bozmak için dikkatli bir şekilde bir 96-gözlü düz dipli mikroplakanın her bir reaksiyon karışımı, reaksiyon yüzer 150 ul aktarın. </li><li> Protein Antimicrob enzimatik aktivitesini ölçmekçözünebilir RBB boya miktarının belirlenmesi ile verilen alt tabaka için ial enzimatik hidroliz sonrasında substrat ayrışmış. enzimatik aktivitesini ölçmek için, bir mikrolevha spektrofotometre kullanılarak 595 nm&#39;de süpernatanın absorbansı ölçülür. etiketli substrattan süpernatan salınan çözünebilir boya ile artan emme enzimatik aktivitesinin kantitatif ölçüsüdür. Not: absorbanstaki değişiklik aktivitesi birimi (AU) ile temsil edilir burada 595 nm&#39;de boya salimli Reaksiyon yüzen maddelerinin optik yoğunluğu bir 0.01 artış 1. Tüm sonuçlar. enzim hariç bütün reaksiyon bileşenleri ile kuluçkalanmıştır boş Reaksiyon, RBB-etiketli substrattan bağlı inkübasyondan bırakan herhangi bir boya çıkarma için kullanılır. Optimal enzimatik sıcaklık pik aktivite ünitesi ölçüm sağlar. </li><li> Tekrarlayın 4.2.7 ile 4.2.1 antimikrobiyal enzimi için en uygun tampon koşulları belirlemek için çeşitli inkübasyon tamponlar kullanarak adımları. these deneyler, PBS kullanın. </li></ol></li><li> Boya-release Testi kullanarak bir Protein Antimikrobiyal için Optimal inkübasyon Sıcaklığında minimal Aktif Konsantrasyon belirleme <ol><li> deney tamponu kullanılarak hazır antimikrobiyal bir protein süspansiyonu bir seri seyreltme gerçekleştirin. seyreltme serisi aralığı antimikrobiyal enzim aktivitesi ile değişecektir. Bu deneylerde kullanılan seri seyreltme 0 ug, 10 ug, 100 ug, 1 ng, 10 ng, 100 ng, 1 ug ve 10 ug son deney proteini miktarlarda üretilmektedir. </li><li> 48-gözlü düz tabanlı bir mikrolevhadaki her Reaksiyon deneyi gerçekleştirmek. Her bir deney koşulu için, hazırlanan alt-tabaka süspansiyonu 200 ul ilgili protein süspansiyonu 10 ul ekle. Reaksiyon tamponu kullanılarak 10 ul reaksiyona ilave protein çözeltisinin hacmi herhangi bir değişiklik yapın. </li><li> buharlaşma nedeniyle hacim değişimini önlemek için plaka sızdırmazlık film ile mikroplağı mühür. Belirlenen optimum olarak bir çalkalama inkübatörçalkalanarak 16 saat antimikrobiyal verilen protein için cubation sıcaklığı. </li><li> ardından her etanol 25 ul ekleyerek reaksiyonu, durdurur ve 2 dakika boyunca 3000 x g&#39;de santrifüj ile sindirilmemiş substrat çıkarın. </li><li> Sindirilmemiş substratın pelet bozmak için dikkatli bir şekilde bir 96-gözlü düz dipli mikroplakanın her bir reaksiyon karışımı, reaksiyon yüzer 150 ul aktarın. </li><li> enzimatik aktivitesini ölçmek için, bir mikrolevha spektrofotometre kullanılarak 595 nm&#39;de süpernatanın absorbansı ölçülür. enzim hariç bütün reaksiyon bileşenleri ile kuluçkalanmıştır boş Reaksiyon, RBB-etiketli substrattan bağlı inkübasyondan bırakan herhangi bir boya çıkarma için kullanılır. etiketli substrattan süpernatan salınan çözünebilir boya ile artan emme enzimatik aktivite için niceliksel ölçümünü sağlar. Not: absorbanstaki değişiklik aktivitesi birimi (AU), 1. Tüm sonuçlar ile temsil edilir595 nm &#39;de bir boya salimli Reaksiyon yüzen maddelerinin optik yoğunluğu bir 0.01 artış. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Anand, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+activity+of+marine+bacteria+associated+with+sponges+from+the+waters+off+the+coast+of+South+East+India.">Antimicrobial activity of marine bacteria associated with sponges from the waters off the coast of South East India.</a> Microbiol Res. 161, 252-262 (2006).</li><li>Tagg, J. R., Dajani, A. S., Wannamaker, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteriocins+of+gram-positive+bacteria.">Bacteriocins of gram-positive bacteria.</a> Bacteriol Rev. 40, 722-756 (1976).</li><li>Hibbing, M. E., Fuqua, C., Parsek, M. R., Peterson, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+competition:+surviving+and+thriving+in+the+microbial+jungle.">Bacterial competition: surviving and thriving in the microbial jungle.</a> Nat Rev Microbiol. 8, 15-25 (2010).</li><li>Riley, M. A., Gordon, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ecological+role+of+bacteriocins+in+bacterial+competition.">The ecological role of bacteriocins in bacterial competition.</a> Trends Microbiol. 7, 129-133 (1999).</li><li>Tenover, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+antimicrobial+resistance+in+bacteria.">Mechanisms of antimicrobial resistance in bacteria.</a> Am J Med. 119, S3-S10 (2006).</li><li>Farris, M. H., Steinberg, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitrecin+A,+an+endolysin-like+bacteriolytic+enzyme+from+a+newly+isolated+soil+streptomycete.">Mitrecin A, an endolysin-like bacteriolytic enzyme from a newly isolated soil streptomycete.</a> Lett Appl Microbiol. 58, 493-502 (2014).</li><li>Dehart, H. P., Heath, H. E., Heath, L. S., Leblanc, P. A., Sloan, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Lysostaphin+Endopeptidase+Resistance+Gene+(epr)+Specifies+Modification+of+Peptidoglycan+Cross+Bridges+in+Staphylococcus+simulans+and+Staphylococcus+aureus.">The Lysostaphin Endopeptidase Resistance Gene (epr) Specifies Modification of Peptidoglycan Cross Bridges in Staphylococcus simulans and Staphylococcus aureus.</a> Appl Environ Microbiol. 61, 2811 (1995).</li><li>Srivastava, K. K., Siddique, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+chemical+composition+of+peptidoglycan+of+Listeria+monocytogenes.">Quantitative chemical composition of peptidoglycan of Listeria monocytogenes.</a> Infect Immun. 7, 700-703 (1973).</li><li>Heilmann, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+peptidoglycan+of+the+cell+walls+of+Pseudomonas+aeruginosa.">On the peptidoglycan of the cell walls of Pseudomonas aeruginosa.</a> Eur J Biochem. 31, 456-463 (1972).</li><li>Schumann, P., Rainey, F., Oren, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Taxonomy of Prokaryotes. 38, (2011).</li><li>Lachica, R. V., Genigeorgis, C., Hoeprich, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metachromatic+agar-diffusion+methods+for+detecting+staphylococcal+nuclease+activity.">Metachromatic agar-diffusion methods for detecting staphylococcal nuclease activity.</a> Appl Microbiol. 21, 585-587 (1971).</li><li>Zhou, R., Chen, S., Recsei, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dye+release+assay+for+determination+of+lysostaphin+activity.">A dye release assay for determination of lysostaphin activity.</a> Anal Biochem. 171, 141-144 (1988).</li><li>Osserman, E. F., Lawlor, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+and+urinary+lysozyme+(muramidase)+in+monocytic+and+monomyelocytic+leukemia.">Serum and urinary lysozyme (muramidase) in monocytic and monomyelocytic leukemia.</a> J Exp Med. 124, 921-952 (1966).</li><li>Mancini, G., Carbonara, A. O., Heremans, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunochemical+quantitation+of+antigens+by+single+radial+immunodiffusion.">Immunochemical quantitation of antigens by single radial immunodiffusion.</a> Immunochemistry. 2, 235-254 (1965).</li><li>Ito, Y., Yamada, H., Imoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorimetric+assay+for+lysozyme+using+Micrococcus+luteus+labeled+with+a+blue+dye,+Remazol+brilliant+blue+R,+as+a+substrate.">Colorimetric assay for lysozyme using Micrococcus luteus labeled with a blue dye, Remazol brilliant blue R, as a substrate.</a> Chem Pharm Bull. (Tokyo). 40, 1523-1526 (1992).</li><li>Hardt, M., Guo, Y., Henderson, G., Laine, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zymogram+with+Remazol+brilliant+blue-labeled+Micrococcus+lysodeikticus+cells+for+the+detection+of+lysozymes:+example+of+a+new+lysozyme+activity+in+Formosan+termite+defense+secretions.">Zymogram with Remazol brilliant blue-labeled Micrococcus lysodeikticus cells for the detection of lysozymes: example of a new lysozyme activity in Formosan termite defense secretions.</a> Anal Biochem. 312, 73-76 (2003).</li><li>Pettersson, B., Eriksson, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+standardized+spectrophotometric+assay+of+endoglycanase+activities+using+dyed,+amorphous+polysaccharides.">A standardized spectrophotometric assay of endoglycanase activities using dyed, amorphous polysaccharides.</a> Anal Biochem. 285, 220-224 (2000).</li><li>Gomez Ramirez, M., Rojas Avelizapa, L. I., Rojas Avelizapa, N. G., Cruz Camarillo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colloidal+chitin+stained+with+Remazol+Brilliant+Blue+R,+a+useful+substrate+to+select+chitinolytic+microorganisms+and+to+evaluate+chitinases.">Colloidal chitin stained with Remazol Brilliant Blue R, a useful substrate to select chitinolytic microorganisms and to evaluate chitinases.</a> J Microbiol Methods. 56, 213-219 (2004).</li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan ederim. MITRE Corporation, birden federal olarak finanse edilen araştırma ve geliştirme merkezleri (FFRDCs) faaliyet gösteren bir değil, kar amacı gütmeyen bir şirkettir.

mikroslayd difüzyon deneyi ve boya-salınım testi tespit ve daha önce tanımlanmamış, protein antimikrobiyal karakterize etmek için avantaj sağlamaktadır. Bu hızlı ve hassas yöntemler büyük araştırma bilgi yatırım önce yararlı enzimler tanımlanması için bir organizma kaynağı kütüphanelerin yüksek verimli tarama sağlar. üst düzey hedef enzim tanımlanır gibi, tespit deneylerinin varyasyonları enzimi hızla tespit etmek veya enzim biyokimyasal özelliklerini belirlemek için kullanılabilir. Örneğin, bir çok basamaklı protein saflaştırma şemasının, mikroslayd difüzyon deneyi hızlı konusu enzimi ihtiva eden fraksiyonlar algılayabilir. Buna ek olarak, enzim reaksiyon Optima boya salım deneyinde Reaksiyon tampon ve kuluçkalama sıcaklıklarının değiştirilmesiyle belirlenebilir. mikroslayd difüzyon testinde tespiti için gerekli enzim olan kütle aralığı enzim karakterize eden bir fonksiyonudurampüller. Deneyin tarama sınırlamalar genellikle, boya-salım analizi daha enzimin yüksek miktarlarda kullanılmasını gerektirir. Bu çalışmada, boya salım analizi (Şekil 4) mikroslayd difüzyon deneyi (Şekil 1) tespit limitleri karşılaştırması mikroslayd difüzyon deneyi boya salım deneyinde daha az hassas bir teknik olduğunu gösterilen. Enzim konsantrasyonu bir endişe olmadığı zaman, mikroslayd tahlil düşük işgücü ve ekipman talepleri hedef yüzeylerde karşı protein Antimikrobiyal maddelerin üretimi için kütüphanelerin hızlı başlangıç ​​taranması için izin verir. daha fazla çaba ve ekipman gerektiren birlikte, boya salınım testi, belirli bir alt-tabaka için aynı ya da farklı enzimler, boya-salım deneyleri ile karşılaştırma yapmak kantitatif sonuçlar hasıl daha hassas ve tekrarlanabilir. iki yöntem kolayca çok özel enstrümantasyon gerek olmadan en mikrobiyolojik laboratuvarlarda yapılır. temsilcilerimiz içindemikroslayd difüzyon testinde tespit az miktarda 1 ug (veriler gösterilmemiştir) ise tive deneyler, kontrol enzimi, α-kimotripsin, boya salım deneyi kullanılarak 100 ng (Şekil 5) gibi düşük bir miktarda tespit edilmiştir. Antimikrobiyal enzimler için kalitatif tespitinde olarak kullanıma sunan, difüzyon deneyi varyasyonları bir dizi 11,13 bildirilmiştir. Bu deneyleri incelerken, mikroslayd difüzyon deneyi ilk ekran olarak nispeten yüksek hassasiyet ve tepki gözetilmesi kolaylığı için geliştirilmiştir. Proteini ile de yayılır şekilde agaroz bindirmeleri Staphylococcus aureus suşları tarafından nükleazlara üretimini tespit etmek için kullanılan edildiği Lachica ve ark., 11 çalışması, değişikliğe uğratılmış mikroslayd difüzyon deneyi radyal immünodifüzyon yöntemi 14 ile benzer biçimde çalıştırılır agaroz alt tabaka ihtiva etmektedir. radyal immunodiffuSistem agaroz içinde yayılma antijen ve antikor arasındaki bir kompleks oluşumu denge ulaştığında yon yöntemi immünopresipitasyon bölgenin genişleme durur. Bunun aksine, mikroslayd difüzyon deneyinin alt-tabaka, ilk başta açıklanan çevreleyen liziz bir sürekli genişleyen bölgede yayılan bir protein antimikrobik ile sindirilmiştir. enzim aktivitesi, kaybeder ya da alt-tabaka bitene kadar bölge artan çapı devam eder. liziz bölgesinin üretim oranı enzim, saflık ve böylece belirli bir etkinlik olarak hızlandı veya enzim konsantrasyonu de artar ilave edildi. Kantitatif ısı ile öldürülmüş B&#39;ye karşı protein antimikrobik enzimatik aktivitesini değerlendirmek için subtilis boya salınım testi seçildi. Remazol parlak mavi R boyası (RBB) kullanılarak kolorimetrik analizler yüzeyler protein antimikrobiyal eylemlerinde çok yönlü ve hassas değerlendirilmesine imkan -etiketlity. hali hazırda 595 nm&#39;de bir spektrofotometre ile ölçülebilir çözünebilen, mavi ürünlerin açıklamasında RBB-etiketli Substrat enzimatik hidrolizi. diğer protein antimikrobik enzimler karakterize etmek için geliştirilmiş RBB boya salım deneyinde çeşitli varyasyonları, diğer substratlar ile uygulama için, bu deneyde esnekliğini göstermektedir. Örneğin, bir bakteriyolitik lysostaphin etkisini belirlemede, Zhou ve ark., RBB-boyalı stafılokok hücreleri ve alt tabakalar 12 olarak stafilokokal peptidoglikan kullanılarak bir boya salım deneyi bildirilmiştir. Bu RBB boya salım deneyinde uygulanmasının bir modifikasyonunda, RBB-etiketli Micrococcus luteus alt-tabaka, örneğin bakteriyel enfeksiyon ve habis karsinom varlığında gibi hastalıkların teşhis etmek için bir hızlı ve hassas bir araç olarak kullanımı ve ekran için önerilmiştir hangi olabilir kan serumunda 15 insan lizozim ekspresyon düzeyleri ile korele edilebilir. Buna ek olarak, RBB-etiketli bakteriyel hücre substratları olduğu birLSO lizozim 16 tespit edilmesi için bir zimogram yöntemi kullanılmıştır. Bu enzim üretimi için hızlı bir arşiv taraması için izin boya salım deneyinde alçaltılmış saptama limiti, kolaylık ve tekrarlanabilirlik göstermektedir. Deneyin değişiklikler sıcaklık, pH, tuzluluk etkilerinin yanı sıra antimikrobiyal proteinlerin 6 aktivitesi diğer proteolitik enzimlerin etkilerini de dahil olmak üzere alt niceliksel biyokimyasal karakterizasyonu deneyleri, izin verir. Buna ek olarak, sayısal boya salınım testi, belirli bir alt-tabaka için çok sayıda enzimlerin aktivitelerini karşılaştırmak için kullanılabilir. RBB boya salma tahlili karakterizasyonu ve protein antimikrobik maddelerin tespitine ek olarak, polisakaritler karşı aktivitesi olan enzimler için yardımcı bildirmiştir. Pettersson ve Eriksson selüloz, ksilan, manan ve pusula amorf, RBB-boyanmış polisakarid boncuklar kullanılarak endoglycanase aktivitesi tespit etmek için bir deney rapor17&#39;sinde. Bu bulgular, bir genleşme Bacillus thuringiensis Bt-107 tarafından üretilen kitinaz enzimlerin saptanması için hassas bir yöntem RBB 18 ile etiketlenmiş kolloidal kitin kullanılarak geliştirilmiştir. Bu ve diğer çalışmalardan, RBB-boyanmış substratlar Ticari kaynaklar keratin, amilopektin, amiloz, glikojen, Laminarin, D-ksilan, azo-arpa glukan ve nişasta karşı da dahil olmak üzere glikolitik aktivitesi, saptanmasında kullanım için ortaya çıkmıştır. Bu çalışmada, kolorimetrik bir sonuç elde etmek için gereken RBB-etiketli substrat ve enzim hacmini azaltır, bir mikroplaka formatında boya salım deneyinde yararını göstermektedir. Şekil 4 ve Şekil 5 &#39;de gösterildiği üzere, mikro boya salma tahlili enzimatik etkinlik algılaması için mikroslayd difüzyon deneyi daha düşük bir belirleme sınırına içerir. yorumlama hızlı kullanımı ile ilgili olarak, emeğin korunması ve kolaylığı ile, mikrofonroslide difüzyon deneyi, antimikrobiyal aktivitenin varlığı hem de alt baş protein izolasyon ve arıtma aşamalarında antimikrobiyal proteinin varlığının gösterilmesi için başlangıç, yüksek verimli taramalara bir fayda sağlar. Bu iki testin kombinasyonu yeni protein antimikrobik ilk tarama ve son karakterizasyonu birbirini tamamlayan

Antimicrobial agents play an essential role in targeting a wide range of microorganisms such as viruses, fungi, and bacteria. The antimicrobial activities produced by various bacteria range in target specificity from broad-spectrum to species-specific, including clinically relevant bacterial pathogens 1. In nature, protein antimicrobial compounds like bacteriocins and lysins represent a microbial arsenal of tools for self-defense, replication, and nutrient acquisition 2,3. Serving as mediators of population dynamics within microbial communities, protein antimicrobials provide a competitive advantage to the producing organism over nonproducing, sensitive species 4. As recombinant enzymes and probiotics, these proteins also have an economic and societal importance as the need for new sources of pathogen control increases with each new expansion of antimicrobial resistance within the bacterial population 5.
The first evaluations of newly discovered protein antimicrobials include determining the basic physical characteristics that are inherent to the enzyme. Methods for rapid screening of potential antimicrobials allow selection of candidates with hydrolytic activities against the desired target substrates. The microslide diffusion assay and the quantitative dye-release assay allow for the use of a variety of substrates in the detection of enzymatic hydrolysis. For protein antimicrobial enzymes with activity against the bacterial cell wall, the versatility of these assays allow rapid and effective, qualitative and quantitative screening against viable bacterial cells (microslide assay only), heat-killed whole bacterial cell substrates, or purified peptidoglycan from the target bacterium. These assays have utility in antimicrobial enzyme discovery for use in fields such as alternative therapeutics, food supplements, and inhibitors of biofilm production.
The microslide diffusion assay and the dye-release assay are demonstrated methods for detection and characterization of novel protein antimicrobials. The microslide diffusion assay provides a relative (qualitative) estimate of antimicrobial activity and allows for minimal inference of enzyme concentration and activity. Using this method, activity is readily visualized as the development of a zone of lysis with the absence of activity resulting in a lack of zone formation. The rate of zone development and the zone diameter are indicative of the amount and purity of the enzyme present in the sample; however, this rate and the quality of the substrate clearing within the zone can also be affected by the presence of contaminants, the completeness of the hydrolysis reaction, and the type of substrate. Interfering contaminants can affect the rate of enzyme diffusion from the well, while incomplete hydrolysis or variation of the substrate type can result in a turbid zone of lysis 6.
The dye-release assay quantitatively assesses the amount of covalently-linked Remazol brilliant blue R dye products released into the reaction supernatant from the enzymatically hydrolyzed substrate. The method has only slight variability associated with a difference in substrate, thus allowing greater sensitivity for detection of hydrolysis as compared to the microslide diffusion assay. These properties allow the method to have utility in the characterization of biochemical properties of the enzyme and in the standardization of the assay for comparison between different antimicrobial enzymes.
In this protocol, we provide methods to perform the basic microslide diffusion assay and dye-release assay, while demonstrating the scale of detection limits and variability for each. The assays are used to perform basic evaluations of an unknown protein antimicrobial purified from the culture supernatant of an uncharacterized soil bacterial isolate. Observed activities against bacterial cell substrates within the assays allow comparison of reaction activities between a previously uncharacterized protein antimicrobial and &#945;-chymotrypsin, a control proteolytic enzymes. These protocols provide a foundation for the application of the two techniques that can be expanded and modified to accommodate varied applications.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>48-well flat-bottom microplate with low evaporation lid</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>3078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well flat-bottom microplate (Costar 3595)</td>
			<td>Corning, Inc.</td>
			<td>3595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>agarose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP162-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-chymotrypsin</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>215227205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacillus subtilis 168</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>23857</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1000 Touch Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cork borer</td>
			<td>Humboldt</td>
			<td>H-9661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lysozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McFarland equivalence standard (2.0)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>R20412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microslides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-38-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nutrient broth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S25959B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>peptidoglycan of Bacillus subtilis 168</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>69554-10MG-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate-buffered saline (1&#215;)</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>P0200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy HT microplate spectrophotometer</td>
			<td>BioTek Instruments, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Remazol brilliant blue R dye (RBB)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salmonella enterica subsp. enterica</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>10708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium azide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S227-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titer Tops pre-cut adhesive polyethylene film</td>
			<td>Diversified Biotechnology</td>
			<td>T-TOPS-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure distilled water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>agarose solution 
			50 ml PBS 
			0.25 g agarose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Add 10% sodium azide to the molten PBS/agarose solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nutrient broth medium 
			4 g nutrient broth 
			500 ml Type I water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250mM sodium hydroxide (NaOH) solution 
			1 g NaOH 
			99 ml Type I water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200mM Remazol brilliant blue R dye (RBB) 
			1.25 g RBB 
			98.75 ml 250 mM NaOH solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

qualitative and quantitative assays for detection and characterization of protein antimicrobials

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods to screen for target enzymes prior to investing greater research effort and resources. The goal of this protocol is to demonstrate two complementary assays for conducting these initial evaluations. The microslide diffusion assay provides an initial or simple detection screen to enable the qualitative and rapid assessment of proteolytic activity against an array of both viable and heat-killed bacterial target substrates. As a counterpart, the increased sensitivity and reproducibility of the dye-release assay provides a quantitative platform for evaluating and comparing environmental influences affecting the hydrolytic activity of protein antimicrobials. The ability to label specific heat-killed cell culture substrates with Remazol brilliant blue R dye expands this capability to tailor the dye-release assay to characterize enzymatic activity of interest.

mikroslayd difüzyon deneyi ve kantitatif boya-salınım testi tarama ve yeni bir protein antimikrobik ilk soruşturma ölçmek için etkili yöntemlerdir. Her deney avantajları ve sınırlamaları vardır; bağlantılı olarak gerçekleştirilen, ancak, bunlar, hızlı ilk tarama ve bir antimikrobiyal temel özelliklerini sağlar. mikroslayd difüzyon deneyi etkin protein antimikrobiyal üreten mikrop kütüphanelerinin hızlı taranması için izin verir. Enzim konsantrasyonu seviyeleri endişe, algılama kısıtlamaları duyarlılığı reaksiyonu, daha boya salım deneyinde eklenecek enzimin daha büyük bir miktarda gerektiren deneyi sınırlayabilir. Şekil 1 &#39;de gösterildiği gibi, tahlilin niteliksel özellikler gözlemci her bir mesafede bulunan göreli enzim miktarları karşılaştırma sağlar. Şekil 1A gösterilen lizis gelişmekte olan bölgesi, içinde (25 enzim ug), bölgenin öncü, alt tabakanın bulanık veya eksik parçalanma görüntüler ise de en yakın bölge daha eksiksiz bir alt tabaka lizis gösterir. Bu olgu, ön kenarda difüzyon enzimin azalan konsantrasyonunun bir ürünü, bölge çapının doğru ölçüm zorlaştırmaktadır. Şekil 1 &#39;de görülen oyuklar B (15 ug), C (10 ug), D (5 ug), D (1.0 ug), ve F (0.1 ug) ve tam lizis bölgesinin çapı yok olmasına dağıtır enzimin düşük miktarda ilişkilendirilmesi. Durum F (0.1 ug) için, agaroz içinde enzim konsantrasyonu bu alt-tabakanın hidrolize, agaroz içinde hareket ederken yayılan enzim görüntülenmiştir sağlayacak sınırının altındadır. Mikroslayd difüzyon deneyi de saflaştırılmış Bacillus subtilis peptidleri kullanılarak çalıştırıldıalt-tabaka olarak doglycan (Şekil 2). Bölge nedeniyle eşit agaroz askıya peptidoglikan isteksizliği bütün hücre Salmonella enterica ile gözlenen daha az tanımlanmış olmasına rağmen, bilinmeyen antimikrobiyal enzimi ile peptidoglikan hidroliz açıktır. boya salım deneyi enzim reaksiyonu etkileyen çevresel faktörlerin bir alt saptama sınırı ve varyasyon sağlayan, mikroslayd difüzyon deneyi daha hassas ve çok yönlü bir testtir. Örnek deneyler, sıcaklık antimikrobik enzim için optimum sıcaklık saptanması için değiştirilmiştir, 35 ° C PBS içinde (Şekil 3) olarak belirlendi. Bu, en uygun mavi renk (Şekil 3B) ve 595 nm (Şekil 3A) absorbans ölçümlerinden elde edilen aktivite birimleri temsil edildiği gibi fazla miktarda Reaksiyon süpernatanları açıkça görülmektedir.boya salım deneyinde çok yönlülüğü araştırmacının hızlı bir şekilde belirli bir enzim için uygun kuluçkalama koşulları belirlemek için sıcaklık, aynı zamanda, reaksiyon tampon ve tampon bileşenleri sadece değişmesini sağlar. Bilinmiyor antimikrobik enzim (Şekil 4) ve α-kimotripsin kontrol enzimi (Şekil 5) arasında aktivite düzeyi RBB-etiketli Bacillus subtilis ısı ile öldürülmüş alt-tabakaya karşı PBS içinde 35 ° C&#39;de belirlenen uygun inkübasyon sıcaklığında ölçüldü. Şekil 4 ve Şekil 5 ile ilgili sonuçların karşılaştırılması bilinmiyor antimikrobiyal enzim B. neredeyse iki katı bir afiniteye sahip olduğunu göstermektedir subtilis alt-tabaka. Buna ek olarak, α-kimotripsin kontrol tamamen ısı ile öldürülmüş B. sindirmek vermedi oyuk içindeki subtilis alt-tabaka (veriler gösterilmemiştir). α-kimotripsin kontrol aktivitesi plaka başlarau 0.3 ug bilinmiyor antimikrobik enzim (Şekil 4 ve Şekil 5) Tüm enzim miktarları arasında aktivitesi birim olarak sürekli artış ile karşılaştırıldığında. Bu bilinmeyen enzim daha büyük bir kalıcı etkinliğe sahip olduğunu veya B içindeki enzime uygun yarılma bölgeleri daha fazla sayıda olduğu gösterebilir subtilis alt-tabaka. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/53819/53819fig1.jpg" /> Şekil 1:. Salmonella enterica Tüm Hücre alt-tabakaya karşı Enzim Aktivitesi mikroslayd difüzyon deneyi niteliksel ısı ile öldürülmüş Salmonella enterica subsp karşı bilinmeyen bir protein antimikrobik etkinliğini değerlendirmek için kullanılan enterica (ATCC 10708).. ilgili kuyucuklara ilave edildi, fosfat tamponlu salin (PBS) içinde süspansiyon haline bilinmiyor antimikrobik protein kütlelerislaytlar dahil 25 mikrogram (iyi A) ug (kuyu B), 10 ug 15 (iyi C), 5 mg (iyi D), 1 ug (iyi E) ve 0.1 ug (iyi F). Sadece PBS deneylerinin negatif kontroller kullanılmıştır. Lizis Bölgeleri 6 saat inkübasyondan sonra görüntülendi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53819/53819fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/53819/53819fig2.jpg" /> Şekil 2:. Enzim Aktivitesi Bacillus subtilis karşı peptidoglikan Hücre duvarı mikroslayd difüzyon deneyi niteliksel Bacillus subtilis 168 peptidoglikan karşı bilinmeyen bir protein antimikrobik etkinliğini değerlendirmek için kullanıldı. PBS 20 ul, bilinmeyen bir antimikrobik 10 ug içinde süspansiyon haline de bir mikroskopta ilave edildi. Sadece PBS negatif olarak kullanılmıştırtahlil (kuyu B) kontrolü. Lizis zon 37 ° C&#39;de 6 saatlik inkübasyondan sonra görüntülendi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53819/53819fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/53819/53819fig3.jpg" /> Şekil 3: a. Protein optimal reaksiyon sıcaklığı Antimikrobiyal boya salım deneyinde çok yönlülüğü ilgi 6 enzim aktivitesi üzerindeki etkilerini belirlemek üzere inkübasyon sıcaklığı ve tamponlar gibi fiziksel ve kimyasal parametreler, farklılaştınlabilmektedir. Bu şekilde gösterildiği gibi, bilinmeyen bir protein, antimikrobik (1 ug) aktivitesi inkübasyon bir sıcaklık aralığı altında RBB-etiketli ısı ile öldürülmüş, Bacillus subtilis karşı PBS içinde değerlendirilmiştir. Aktivite birimleri (AU) (A), RBB-b absorpsiyon olarak görüntülenirHidroliz Bir mikrolevha spektrofotometre kullanılarak 595 nm&#39;de ölçülmüştür sonra ound ürün yüzer bırakıldı. her bir sıcaklık koşulu da eklenmiş bir enzim ile reaksiyonları çeşitli sıcaklıklarda inkübasyon sonucunda salınan boya etkisini çıkarmak için kullanıldı. Her inkübasyon sıcaklığına karşılık gelen reaksiyon süpernatanları absorbans ölçümü (B) öncesinde görüntülendi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53819/53819fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/53819/53819fig4.jpg" /> Şekil 4: a. Protein faaliyet sahası Antimikrobiyal bilinmeyen bir protein antimikrobiyal için aktivite aralığı 0, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, ve 1000 ng gece boyunca inkubasyon sonrası aktivite birimleri olarak ölçülmüştür BCA prot ile ölçülenEin deney (A). Bu reaksiyonlar için, RBB-etiketli B. subtilis için yüzey enzim (1.000 ng) en yüksek miktar ile reaksiyonu tamamen Reaksiyon inkübasyon süresi içinde mevcut bulunan tüm alt-tabakanın hidrolize etmedi sağlamak için 595 nm &#39;de 5.0 bir optik yoğunluk elde yükseltilmiştir. ilave enzimsiz kontrol reaksiyonları tek inkübe kaynaklanan salınan boya etkisini çıkarmak için kullanıldı. Her enzim miktarına karşılık gelen reaksiyon süpernatanları absorbans ölçümleri (B) öncesinde görüntülendi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53819/53819fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/53819/53819fig5.jpg" /> Şekil 5:. Α-kimotripsin için α-kimotripsin aktivitesi aralığı için Etkinlik Aralığı activ olarak ölçüldügecede inkubasyon sonrası lık birim 0, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, ve enzim (A) 1000 ng. Bu reaksiyonlar için, RBB-etiketli B. subtilis için yüzey enzim (1.000 ng) en yüksek miktar ile reaksiyonu tamamen Reaksiyon inkübasyon süresi içinde mevcut bulunan tüm alt-tabakanın hidrolize etmedi sağlamak için 595 nm &#39;de 5.0 bir optik yoğunluk elde yükseltilmiştir. ilave enzimsiz kontrol reaksiyonları tek inkübe kaynaklanan salınan boya etkisini çıkarmak için kullanıldı. Her enzim miktarına karşılık gelen reaksiyon süpernatanları absorbans ölçümleri (B) öncesinde görüntülendi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53819/53819fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials at JoVE.com

Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

Nitel ve Nicel Saptanması için Tahliller ve Protein Antimikrobiyal karakterizasyonu

Here, we present protocols to rapidly screen and characterize enzymes for antimicrobial activity. The microslide diffusion assay and the dye-release assay utilize target bacterial substrates for qualitative and quantitative enzymatic activity evaluation.

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods ...

qualitative-quantitative-assays-for-detection-characterization

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

18.4K Görüntüleme.  The MITRE Corporation. Here, we present protocols to rapidly screen and characterize enzymes for antimicrobial activity. The microslide diffusion assay and the dye-release assay utilize target bacterial substrates for qualitative and quantitative enzymatic activity evaluation.

Video: Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in situ hybridization (FISH) for rapid culture-independent detection of Salmonella spp. Cell-charged tapes can also be placed face-down on selective agar for solid-phase enrichment prior to detection. Alternatively, low-volume liquid enrichments (liquid surface miniculture) can be performed on the surface of the tape in non-selective broth, followed by FISH and analysis via flow cytometry. To begin, sterile adhesive tape is brought into contact with fresh produce, gentle pressure is applied, and the tape is removed, physically extracting microbes present on these surfaces. Tapes are mounted sticky-side up onto glass microscope slides and the sampled cells are fixed with 10% formalin (30 min) and dehydrated using a graded ethanol series (50, 80, and 95%; 3 min each concentration). Next, cell-charged tapes are spotted with buffer containing a Salmonella-targeted DNA probe cocktail and hybridized for 15 - 30 min at 55&deg;C, followed by a brief rinse in a washing buffer to remove unbound probe. Adherent, FISH-labeled cells are then counterstained with the DNA dye 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) and results are viewed using fluorescence microscopy. For solid-phase enrichment, cell-charged tapes are placed face-down on a suitable selective agar surface and incubated to allow in situ growth of Salmonella microcolonies, followed by FISH and microscopy as described above. For liquid surface miniculture, cell-charged tapes are placed sticky side up and a silicone perfusion chamber is applied so that the tape and microscope slide form the bottom of a water-tight chamber into which a small volume (&le; 500 &mu;L) of Trypticase Soy Broth (TSB) is introduced. The inlet ports are sealed and the chambers are incubated at 35 - 37&deg;C, allowing growth-based amplification of tape-extracted microbes. Following incubation, inlet ports are unsealed, cells are detached and mixed with vigorous back and forth pipetting, harvested via centrifugation and fixed in 10% neutral buffered formalin. Finally, samples are hybridized and examined via flow cytometry to reveal the presence of Salmonella spp. As described here, our "tape-FISH" approach can provide simple and rapid sampling and detection of Salmonella on tomato surfaces. We have also used this approach for sampling other types of fresh produce, including spinach and jalape&ntilde;o peppers.

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple adhesive-tape-based approach for sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by rapid whole cell detection of Salmonella using fluorescence in situ hybridization (FISH).

Yapışkan bant tabanlı Örnekleme ve Floresans kombinasyonu In situ</emHızlı Algılama> Hibridizasyon Salmonella Taze üretin

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Protocol for Recombinant RBD-based SARS Vaccines: Protein Preparation, Animal Vaccination and Neutralization Detection

Based on their safety profile and ability to induce potent immune responses against infections, subunit vaccines have been used as candidates for a wide variety of pathogens 1-3. Since the mammalian cell system is capable of post-translational modification, thus forming properly folded and glycosylated proteins, recombinant proteins expressed in mammalian cells have shown the greatest potential to maintain high antigenicity and immunogenicity 4-6.
Although no new cases of SARS have been reported since 2004, future outbreaks are a constant threat; therefore, the development of vaccines against SARS-CoV is a prudent preventive step and should be carried out. The RBD of SARS-CoV S protein plays important roles in receptor binding and induction of specific neutralizing antibodies against virus infection 7-9. Therefore, in this protocol, we describe novel methods for developing a RBD-based subunit vaccine against SARS. Briefly, the recombinant RBD protein (rRBD) was expressed in culture supernatant of mammalian 293T cells to obtain a correctly folded protein with proper conformation and high immunogenicity 6. The transfection of the recombinant plasmid encoding RBD to the cells was then performed using a calcium phosphate transfection method 6,10 with some modifications. Compared with the lipid transfection method 11,12, this modified calcium phosphate transfection method is cheaper, easier to handle, and has the potential to reach high efficacy once a transfection complex with suitable size and shape is formed 13,14. Finally, a SARS pseudovirus neutralization assay was introduced in the protocol and used to detect the neutralizing activity of sera of mice vaccinated with rRBD protein. This assay is relatively safe, does not involve an infectious SARS-CoV, and can be performed without the requirement of a biosafety-3 laboratory 15.
The protocol described here can also be used to design and study recombinant subunit vaccines against other viruses with class I fusion proteins, for example, HIV, respiratory syncytial virus (RSV), Ebola virus, influenza virus, as well as Nipah and Handra viruses. In addition, the methods for generating a pseudovirus and subsequently establishing a pseudovirus neutralization assay can be applied to all these viruses.

This protocol describes a general procedure for studying recombinant receptor-binding domain (RBD)-based subunit vaccines against SARS. It includes methods for transfection and expression of RBD protein in 293T cells, immunization of mice with RBD and detection of neutralization activity of mouse sera using an established SARS pseudovirus neutralization assay.

Rekombinant RBD tabanlı SARS Aşılar için Protokol: Protein hazırlanması, Hayvan Aşılama ve Nötralizasyon Algılama

Based on their safety profile and ability to induce potent immune responses against infections, subunit vaccines have been used as candidates for a wide ...

Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle and the induction of protective immune responses1,2. As the main target for neutralizing antibodies, HA is currently used as the influenza vaccine potency marker and is measured by single radial immunodiffusion (SRID)3. However, the dependence of SRID on the availability of the corresponding subtype-specific antisera causes a minimum of 2-3 months delay for the release of every new vaccine. Moreover, despite evidence that NA also induces protective immunity4, the amount of NA in influenza vaccines is not yet standardized due to a lack of appropriate reagents or analytical method5. Thus, simple alternative methods capable of quantifying HA and NA antigens are desirable for rapid release and better quality control of influenza vaccines.
Universally conserved regions in all available influenza A HA and NA sequences were identified by bioinformatics analyses6-7. One sequence (designated as Uni-1) was identified in the only universally conserved epitope of HA, the fusion peptide6, while two conserved sequences were identified in neuraminidases, one close to the enzymatic active site (designated as HCA-2) and the other close to the N-terminus (designated as HCA-3)7. Peptides with these amino acid sequences were synthesized and used to immunize rabbits for the production of antibodies. The antibody against the Uni-1 epitope of HA was able to bind to 13 subtypes of influenza A HA (H1-H13) while the antibodies against the HCA-2 and HCA-3 regions of NA were capable of binding all 9 NA subtypes. All antibodies showed remarkable specificity against the viral sequences as evidenced by the observation that no cross-reactivity to allantoic proteins was detected. These universal antibodies were then used to develop slot blot assays to quantify HA and NA in influenza A vaccines without the need for specific antisera7,8. Vaccine samples were applied onto a PVDF membrane using a slot blot apparatus along with reference standards diluted to various concentrations. For the detection of HA, samples and standard were first diluted in Tris-buffered saline (TBS) containing 4M urea while for the measurement of NA they were diluted in TBS containing 0.01% Zwittergent as these conditions significantly improved the detection sensitivity. Following the detection of the HA and NA antigens by immunoblotting with their respective universal antibodies, signal intensities were quantified by densitometry. Amounts of HA and NA in the vaccines were then calculated using a standard curve established with the signal intensities of the various concentrations of the references used. 
Given that these antibodies bind to universal epitopes in HA or NA, interested investigators could use them as research tools in immunoassays other than the slot blot only.

A simple slot blot method was developed for the quantification of influenza viral hemagglutinin and neuraminidase using universal antibodies targeting their most conserved sequences identified through bioinformatics analyses. This innovative approach may provide a useful alternative to quantitative determination of all viral hemagglutinin and neuraminidase.

Tüm Influenza Kantitatif Analiz Basit Slot Blot Tahliller Evrensel Antikorlar kullanarak Viral Hemagglutinins ve nöraminidaz yazın

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus

To identify potential antivirals against BTV, we have developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based assay was the first assay developed to evaluate whether a compound showed any antiviral efficacy and have been used to screen large compound library. Meanwhile, cytotoxicity of antivirals could also be evaluated using the CPE-based assay. The dose-response assay was designed to determine the range of efficacy for the selected antiviral, i.e. 50% inhibitory concentration (IC50) or effective concentration (EC50), as well as its range of cytotoxicity (CC50). The ToA assay was employed for the initial MoA study to determine the underlying mechanism of the novel antivirals during BTV viral lifecycle or the possible effect on host cellular machinery. These assays are vital for the evaluation of antiviral efficacy in cell culture system, and have been used for our recent researches leading to the identification of a number of novel antivirals against BTV.

Three assays, including the cytopathic effect (CPE)-based assay, dose-response assay and Time-of-Addition (ToA) assay have been developed, optimized, validated and utilized to identify novel antivirals against Bluetongue virus (BTV), as well as to determine the possible Mechanism-of-Action (MoA) for newly identified antivirals.

Bluetongue Virüs karşı Roman Antiviraller belirlenmesi için Tahliller

To identify potential antivirals against BTV, we have  developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based  assay was the first ...

Methods for Quantitative Detection of Antibody-induced Complement Activation on Red Blood Cells

Antibodies against red blood cells (RBCs) can lead to complement activation resulting in an accelerated clearance via complement receptors in the liver (extravascular hemolysis) or leading to intravascular lysis of RBCs. Alloantibodies (e.g. ABO) or autoantibodies to RBC antigens (as seen in autoimmune hemolytic anemia, AIHA) leading to complement activation are potentially harmful and can be - especially when leading to intravascular lysis - fatal1. Currently, complement activation due to (auto)-antibodies on RBCs is assessed in vitro by using the Coombs test reflecting complement deposition on RBC or by a nonquantitative hemolytic assay reflecting RBC lysis1-4. However, to assess the efficacy of complement inhibitors, it is mandatory to have quantitative techniques. Here we describe two such techniques. First, an assay to detect C3 and C4 deposition on red blood cells that is induced by antibodies in patient serum is presented. For this, FACS analysis is used with fluorescently labeled anti-C3 or anti-C4 antibodies. Next, a quantitative hemolytic assay is described. In this assay, complement-mediated hemolysis induced by patient serum is measured making use of spectrophotometric&#160;detection of the released hemoglobin. Both of these assays are very reproducible and quantitative, facilitating studies of antibody-induced complement activation.

Here we describe two assays for measuring complement activation induced by antibodies against red blood cells. The major advantage over the current assays is their quantitative and easy-to-interpret nature.

Kırmızı kan hücreleri üzerinde antikor kaynaklı kompleman aktivasyon sayısal tespiti için Yöntemler

Antibodies against red blood cells (RBCs) can lead to complement activation resulting in an accelerated clearance via complement receptors in the liver ...

Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens

Eimeria species parasites, protozoa which cause the enteric disease coccidiosis, pose a serious threat to the production and welfare of chickens. In the absence of effective control clinical coccidiosis can be devastating. Resistance to the chemoprophylactics frequently used to control Eimeria is common and sub-clinical infection is widespread, influencing feed conversion ratios and susceptibility to other pathogens such as Clostridium perfringens. Despite the availability of polymerase chain reaction (PCR)-based tools, diagnosis of Eimeria infection still relies almost entirely on traditional approaches such as lesion scoring and oocyst morphology, but neither is straightforward. Limitations of the existing molecular tools include the requirement for specialist equipment and difficulties accessing DNA as template. In response a simple field DNA preparation protocol and a panel of species-specific loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assays have been developed for the seven Eimeria recognised to infect the chicken. We now provide a detailed protocol describing the preparation of genomic DNA from intestinal tissue collected post-mortem, followed by setup and readout of the LAMP assays. Eimeria species-specific LAMP can be used to monitor parasite occurrence, assessing the efficacy of a farm&#8217;s anticoccidial strategy, and to diagnose sub-clinical infection or clinical disease with particular value when expert surveillance is unavailable.

Loop-mediated Isothermal Amplification LAMP Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens

Diagnosis of Eimeria infection in chickens remains demanding. Parasite morphology- and host pathology-led approaches are commonly inconclusive, while molecular approaches based on PCR have proven demanding in cost and expertise. The aim of this protocol is to establish loop-mediated isothermal amplification (LAMP) as a straightforward molecular diagnostic for eimerian infection.

Türler özgü Algılama Loop-aracılı İzotermal Amplifikasyon (LAMP) Tahliller<em&gt; Eimeria</em&gt; Tavuklar bulaştırmak ki

Eimeria species parasites, protozoa which cause the enteric disease coccidiosis, pose a serious threat to the production and welfare of chickens. In the ...

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins towards the immune synapse to assure a stable binding and signal exchange. Classical confocal, TIRF, or super-resolution microscopy have been used to study the immune synapse. Since these methods require manual image acquisition and time-consuming quantification, the imaging of rare events is challenging. Here, we describe a workflow that enables the morphological analysis of tens of thousands of cells. Immune synapses are induced between primary human T cells in pan-leukocyte preparations and Staphylococcus aureus enterotoxin B (SEB)-loaded Raji cells as APCs. Image acquisition is performed with imaging flow cytometry, also called In-Flow microscopy, which combines features of a flow cytometer and a fluorescence microscope. A complete gating strategy for identifying T cell/APC couples and analyzing the immune synapses is provided. As this workflow allows the analysis of immune synapses in unpurified pan-leukocyte preparations and hence requires only a small volume of blood (i.e., 1 mL), it can be applied to samples from patients. Importantly, several samples can be prepared, measured, and analyzed in parallel.

Here, we describe a complete workflow for the qualitative and quantitative analysis of immune synapses between primary human T cells and antigen-presenting cells. The method is based on imaging flow cytometry, which allows the acquisition and evaluation of several thousand cell images within a relatively short period of time.

Akış Sitometresi Imaging kullanılarak insan sisteminde bağışıklık Synapse nitel ve nicel analiz

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...

Isolation of Peritoneum-derived Mast Cells and Their Functional Characterization with Ca2+-imaging and Degranulation Assays

Mast cells (MCs), as a part of the immune system, play a key role in defending the host against several pathogens and in the initiation of the allergic immune response. The activation of MCs via the cross-linking of surface IgE bound to high affinity IgE receptor (Fc&#949;RI), as well as through the stimulation of several other receptors, initiates the rise of the free intracellular Ca2+ level ([Ca2+]i) that promotes the release of inflammatory and allergic mediators. The identification of molecular constituents involved in these signaling pathways is crucial for understanding the regulation of MC function. In this article, we describe a protocol for the isolation of murine connective tissue type MCs by peritoneal lavage and cultivation of peritoneal MCs (PMCs). Cultures of MCs from various knockout mouse models by this methodology represent a useful approach to the identification of proteins involved in MC signaling pathways. In addition, we also describe a protocol for single cell Fura-2 imaging as an important technique for the quantification of Ca2+ signaling in MCs. Fluorescence-based monitoring of [Ca2+]i is a reliable and commonly used approach to study Ca2+ signaling events, including store-operated calcium entry, which is of utmost importance for MC activation. For the analysis of MC degranulation, we describe a &#946;-hexosaminidase release assay. The amount of &#946;-hexosaminidase released into the culture medium is considered as a degranulation marker for all three different secretory subsets described in MCs. &#946;-hexosaminidase can easily be quantified by its reaction with a colorigenic substrate in a microtiter plate colorimetric assay. This highly reproducible technique is cost-effective and requires no specialized equipment. Overall, the provided protocol demonstrates a high yield of MCs expressing typical MC surface markers, displaying typical morphological and phenotypic features of MCs, and demonstrating highly reproducible responses to secretagogues in Ca2+-imaging and degranulation assays.

Isolation of Peritoneum-derived Mast Cells and Their Functional Characterization with Ca2+-imaging and Degranulation Assays

Here, we present a protocol to isolate and cultivate murine peritoneal mast cells. We also describe two protocols for their functional characterization: a fluorescent imaging of intracellular free Ca2+ concentration and a degranulation assay based on colorimetric quantification of the released &#946;-hexosaminidase.

Yalıtım Karın zarını kaynaklı Mast hücreleri ve onların fonksiyonel karakterizasyonu ile Ca2 +-görüntüleme ve Degranulation deneyleri

Mast cells (MCs), as a part of the immune system, play a key role in defending the host against several pathogens and in the initiation of the allergic ...

Electrochemiluminescence Assays for Human Islet Autoantibodies

Pinpointing islet autoantibodies associated with type 1 diabetes (T1D) leads the way to project and deter this disease in the general population. A novel ECL assay is a nonradioactive fluid phase assay for islet autoantibodies with higher sensitivity and specificity than the current 'gold' standard radio-binding assay (RBA). ECL assays can more precisely define the onset of presymptomatic T1D by distinguishing the high-risk, high-affinity autoantibodies from the low-risk, low-affinity autoantibodies generated in RBAs, and conventional enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA). The antigen protein used in this ECL assay is labeled with Sulfo-tag and Biotin, respectively. Each ECL autoantibody assay that uses a particular antigen protein needs an optimization step before it can be used for laboratory application. This step is especially vital in determining the requirements for serum acid treatments, concentrations, and ratios of the two different antigens labeled with Sulfo-tag and Biotin. To perform the assay, serum samples are mixed with Sulfo-tag-conjugated and biotinylated capture antigen protein in phosphate buffered solution (PBS), containing 5% Bovine Serum Albumin (BSA). Afterwards, the samples are incubated overnight at 4 &#176;C. The same day, a streptavidin-coated plate is prepared with blocker buffer and incubated overnight at 4 &#176;C. On the second day, wash the streptavidin plate and transfer the serum-antigen mixture onto the plate. Place the plate on the plate shaker, set it at low speed, and incubate at room temperature for 1 h. Subsequently, the plate is washed again, and reader buffer is added. The plate is then counted on the plate reader machine. The results are conveyed through an index, which is generated from internal standard positive and negative control serum samples.

Here, we presented the methods to detect human islet autoantibodies using electrochemiluminescence (ECL) assays. The protocol, used to predict type 1 diabetes, can be expanded upon to detect autoantibodies for other autoimmune diseases.

Electrochemiluminescence deneyleri için insan adacık otoantikorlar

Pinpointing islet autoantibodies associated with type 1 diabetes (T1D) leads the way to project and deter this disease in the general population. A novel ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella spp./Shigella spp. The gold standard method for the detection of Salmonella spp./Shigella spp. is direct culture but this is labor-intensive and time-consuming. Here, we describe a high-throughput platform for Salmonella spp./Shigella spp. screening, using real-time polymerase chain reaction (PCR) combined with guided culture. There are two major stages: real-time PCR and the guided culture. For the first stage (real-time PCR), we explain each step of the method: sample collection, pre-enrichment, DNA extraction and real-time PCR. If the real-time PCR result is positive, then the second stage (guided culture) is performed: selective culture, biochemical identification and serological characterization. We also illustrate representative results generated from it. The protocol described here would be a valuable platform for the rapid, specific, sensitive and high-throughput screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Salmonella spp./Shigella spp. are common pathogens attributed to diarrhea. Here, we describe a high-throughput platform for the screening of Salmonella spp./Shigella spp. using real-time PCR combined with guided culture.

Salmonella spp. testi ile taranması için yüksek üretilen iş platformu /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...