This work was funded by The MITRE Corporation through the MITRE Innovation Program (Project 25MSR621-CA). The authors would like to thank Mark Maybury, Ph.D., Richard Games, Ph.D., James Patton, Ellen Mac Garrigle, Ph.D., Carl Picconatto, Ph.D., and Caroline Gary for their support and review of this work.

Bakteriyel ve peptidoglikan Yüzeyler 1. hazırlanması Not: Bütün hücre bakteri alt-tabakalar ve saflaştırılmış peptidoglikanlar mikroslayd difüzyon testi ile ve boya salım deneyinde, her iki enzim alt tabaka olarak kullanılır. Bu yüzeyler enzim reaksiyonları iletken öncesinde hazırlık gerektirir. Aşağıdaki protokol bunların hazırlanmasını tarif etmektedir. <ol><li> Tüm Bakteri Hücre Yüzey <ol><li> Bacillus subtilis 168 2 ml gecelik kültürü ile besleyici et suyu 500 mi inoküle bakteriyel hücre alt-tabakanın üretir (American Type Culture Collection ATCC 23857). Kültür bakteri kültürü ikiye katlanması ile elde edilen hızlı bir büyüme fazı olarak tanımlanan büyüme üstel bir faz ulaşana kadar (125 rpm) çalkalama ile 30 ° C&#39;de inkübe edin. Salmonella enterica subsp ekimi için. Enterica (ATCC 10708), (125 rpm) çalkalanarak 37 ° C&#39;de büyüme ortamı olarak besin sıvısı kullanır. </li&gt; <li> basınç 3 atmosfer altında, 121 ° C&#39;de 10 dakika süre ile otoklavlama sureti her kültürün ısı öldürür. </li><li> 5,000 x g&#39;de 20 dakika boyunca santrifüj ile ısı ile öldürülmüş bakteriyel substrat hasat edilir. Tip 1 su ile pelet üç kez yıkayın ve su az miktarda yeniden askıya. Bu çalışmada, 1200 ul yüzeylerde askıya. </li><li> Kısım 20 ° C&#39;de 1.5 ml mikrofüj tüplerine ve saklamak için bakteriyel hücre alt tabakalar 300 ul. </li></ol></li><li> Arıtılmış peptidoglikan Yüzey <ol><li> (Malzemeler ve Ekipmanları Tablosuna bakınız) hedef alt tabaka bakteriden 7-10 den peptidoglikan arındırmak ya da bir satıcıdan kazanır. aksesuar hücre duvarı polimerlerden ham peptidoglikan hazırlıkları arındırın. </li></ol></li></ol> 2. Nitel mikroslayd difüzyon deneyi [Lachica değişikliğe uğratılmış ve ark., 11] Not: mikroslayd difüzyon deneyidirbir numunedeki antimikrobiyal enzimin varlığını tespit etmek için olan bir metottur. Enzim bir agaroz matrisine ihtiva eden alt-tabaka ile yayılır zamanda enzim substratı hidroliz gibi, açıklığın bir bölge geliştirir. Aşağıdaki protokol niteliksel proteini antimikrobik varlığını tespit etmek için mikroslayd difüzyon deneyi hazırlanması ve performansı açıklanmaktadır. <ol><li> üreticinin protokolüne göre bir Bikinkoninik asit (BCA) Protein Deney Kiti kullanılarak değerlendirilebilir antimikrobiyal enzim konsantrasyonunun belirlenmesi. </li><li> bir enzim tampon olarak fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) kullanmaktadır; Bununla birlikte, deneysel olarak verilen enzim için tampon uygun olan belirler. </li><li> reaksiyon tampon olarak fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile antimikrobiyal enzim seri seyreltme gerçekleştirin. Bu mikroslayd difüzyon deneylerinde kullanılan seri seyreltme 0 ug, 10 ug, 100 ug, 1 ng, 10 ng, 100 ng, 1 ug, 1 nihai deney proteini kitleleri üretilebilirreaksiyon hacmi ortalama 0 mg. </li><li> Bireysel mikrofüj tüplerine, protein kitleleri koyun ve reaksiyon, kuyu mikroslayd ek hazırlık olarak PBS kullanılarak ul 20 protein seviyesini ayarlamak. </li><li> PBS, 50 ml agaroz 0.25 g eritilmesi ile% 0.5 agaroz çözeltisi olun. agaroz tamamen eriyene kadar kaynama noktasına çözelti ısıtılır. ağırlıkça eritme işlemi sırasında kaybolan su belirlemek ve çözüm geri ekleyin. </li><li> Agaroz çözeltiye, su içerisinde% 10 sodyum azid, 50 ul ekleyin ve bir su banyosu içinde 50 ° C&#39;ye kadar çözeltinin sıcaklığını ayarlamak. Sodyum azit mikroslayd difüzyon deneyinin inkübasyon sırasında bakteri büyümesini kirletici inhibe etmek için ilave edildi. canlı hücreler alt-tabaka olarak kullanılması halinde, agaroz çözeltisi sodyum azid sayın. </li><li> buz üzerinde ısı ile öldürülmüş bakteri substrat çözülme. </li><li> Yeniden askıya yaklaşık agaroz çözeltisi 12 ml bakteri alt-tabaka bir 2.0 MCF bulanıklığının eşleşenArland (Malzeme Tablo) standart eşdeğerlik. yaklaşık bulanıklık elde edilene kadar agaroz bakteriyel maddesinin eklenmesi, çözümlerle beyaz arka plan üzerinde siyah bir çizgi görselleştirerek çözümler bulanıklığı karşılaştırın. </li><li> Hemen, her mikroslayd (25 x 75 x 1 mm 3) agaroz-alt-tabaka çözeltisi 3 mL pipet. </li><li> slaytlar kuvvetlendirmek sonra bir mantar delici (4.8 mm çap) kullanarak her mikroslayd agaroz-alt tabakanın üç kuyu yumruk. ilgili kuyucuklara her biri ayarlanabilir bir protein seri seyreltme 20 ul ekle. </li><li> de bir negatif kontrol olarak PBS (20 ul) ya da sığır serum albümini (20 ul PBS içinde 5 ug) kullanın. Bir pozitif kontrol olarak, bu tür lizozim şekilde alt-tabaka için uygun bilinen bakteriyolitik enzimler kullanın. </li><li> 37 ° C&#39;de bir nem odasında slayt veya enzimin optimum aktivitesi sıcaklığı inkübe edin. inkübasyon süresi konsantrasyonuna bağlıdır veAntimikrobiyal enzimin spesifik aktivitesi. Tipik reaksiyon süresi, bir gece boyunca (yaklaşık 16 saat). </li><li> inkübasyondan sonra, yaklaşık 30 cm odak mesafe 60 mm lens ile dijital tek lensli refleks kamera kullanarak gelişmekte olan testinin dolaylı ışık ve yakalama görüntüler altında slaytlar uyun. Not: Verilen alt tabaka için protein antimikrobiyal Enzimatik aktivite enzim agaroz içine yayılır yanı etrafında oluşturan hidroliz net bir bölge gelişimi ile ilişkilidir. </li><li> enzimatik aktivitesini hak kazanmak için, her iyi etrafında oluşturan bölgelerin boyutlarını gözlemleyin. Düşük enzimatik aktivitesi niteliksel daha küçük bir bölgeye ilgili olsa da yüksek enzimatik etkinlik nitelik, daha büyük bir bölgesi ile ilgilidir. </li></ol> 3. Yüzey Etiketleme - Remazol Brillant Blue R Boya Etiketleme [Zhou 12 Modifiye] Not: boya salım deneyinde, alt-tabaka kovalent linke oland parlak mavi R boyası Remazol için. Aşağıdaki protokol, boyanmış enzim substratları hazırlanmasını tarif etmektedir. <ol><li> Tip I su 99 ml 1 g NaOH çözülmesiyle 250 mM sodyum hidroksit (NaOH) çözeltisi yapmak 200 mM Remazol Parlak Mavi R boyası (RBB) çözeltisi yapmak için kullanılır. </li><li> Taze 250 mM NaOH çözeltisi (adım 3.1) 98.75 ml ± 1 ml 1.25 g RBB eriterek 200 mM RBB çözüm olun. </li><li> RBB çözeltisi, 30 ml 0.5 g ıslak ağırlık konsantrasyonunda ısı ile öldürülmüş bakteriyel hücreler yeniden askıya. saflaştınldı peptidoglikan için, RBB çözeltisi, 30 ml 0.3 g ıslak ağırlık konsantrasyonunda peptidoglikan yeniden askıya. </li><li> yumuşak bir karıştırma ile, 37 ° C&#39;de 6 saat süreyle dönüşlü bir platform üzerinde bir Erlenmeyer şişesi içinde, reaksiyon karışımının inkübe edin. </li><li> 4 ° C inkübatör Reaksiyon karışımı aktarın ve yumuşak karıştırma ile ilave bir 12 saat daha inkübe edilir. </li><li> İnkübasyondan sonra, 3000 x g&#39;de santrifüj ile boyanmış alt-tabakanın hasat30 dakika karıştırıldı. alt-tabaka pelet boya çözeltisini süzün. </li><li> ardından santrifüj Tip I su ile tekrar tekrar (yaklaşık 3-5 yıkama) boya etiketli hücreler veya peptidoglikan yıkanarak substrattan kovalent olmayan bir şekilde bağlanmış çözünebilir boya çıkarın. Her su ilavesi ile iyice pelet yeniden askıya. Not: ilişkisiz, çözünür boya artık santrifüj sonra suyla yıkayın görünür olduğunda. alt-tabaka bir ek yıkama verilmelidir. Son yıkama yüzer açık olacak ise alt tabaka, mavi kalacağını unutmayın. </li><li> daha sonra kullanılmak üzere -20 ° C&#39;de bir su az miktarda süspanse boyanmış substratlar saklayın. </li></ol> 4. Kantitatif Boya-release Deneyi Not: boya-release Deney sırasında reaksiyon süpernatant içine ürünleri boyalı enzimatik reaksiyon sürümlerde RBB-boyalı substrat hidrolizi. salınan boya miktarının kolorimetrik bir ölçümü amo gösterirBelirli bir enzimin numune içinde mevcut enzim etkinliğinin etkili olduğu akla. Kantitatif bir yöntem alt tabakalar üzerindeki farklı enzimlerin karşılaştırmasını sağlar ve enzimatik reaksiyonu (örneğin, sıcaklık, tuz ve pH) etkileyen çevresel koşulların varyasyona izin verir. Aşağıdaki protokol kantitatif protein antimikrobik enzimatik aktivitesini tespit etmek için, boya salimli bir tayinin hazırlanması ve performansı açıklanmaktadır. <ol><li> Boya salım analizi için hazırlık <ol><li> Dondurulmuş, boyanmış alt-tabaka, oda sıcaklığına dönmesi ve ampirik olarak verilen enzim için belirlenen deney tamponu (PBS) ile iki kere yıkayın izin verin. </li><li> yapılacak boya salma tahlilleri sayısına göre 200 ul reaksiyon hacmi çarpılarak gerekli olan alt-tabaka süspansiyonu hacmi hesaplanır. </li><li> (Optik yoğunluk elde edilene dek, 4.1.2 belirlenen deney tamponu hacmi, boyanmış alt-tabakanın eklenmesiyle alt-tabaka süspansiyonu hazırlamak2.0 OD) bir spektrofotometre kullanılarak 595 nm&#39;de elde edilmiştir. Konsantre çözeltinin 1 seyreltme: spektrofotometre fonksiyonel sınırlar dahilinde kalması için, 1 için 1.0 olarak 2.0 OD 595 ölçün. boş olarak deney tamponu kullanın. Not: Reaksiyon için alt-tabaka bulanıklığının yüksek verimli enzimlerin aktivite düzeylerinin eşleştirmek için 2.0 dışına kaldırılabilir. </li><li> Protein antimikrobik Askıda 1 mg / ml&#39;lik bir tahmini konsantrasyonda deney tamponu içinde değerlendirilmelidir. </li><li> imalatçının protokolüne göre bir BCA Protein Deney Kiti mikroplaka testi kullanılarak, protein örneğinin gerçek konsantrasyon tahlil edilecek belirler. mi deney tamponu kullanılarak 1 mg / hazır süspansiyonun konsantrasyonu ayarlayın. </li></ol></li><li> Bir Protein Antimikrobiyal için Optimal Kuluçka Şartları belirleme Boya-release Testi kullanarak <ol><li> 100 ng / ul stok proteini antimikrobiyal süspansiyon sulandırmak. Bu konsantrasyon af verirhacme (10 ul) başına protein 1 ug nominal reaksiyon kütlesi deney reaksiyona ilave edildi. </li><li> Termal aralığını belirlemek bakteriyolitik protein için değerlendirilmelidir. Bu deneylerde ısı aralığı 5 ° C, 15 ° C, 25 ° C, 35 ° C, 45 ° C, 55 ° C ve 65 ° C &#39;de yer. </li><li> 0.5 mi mikrofüj tüplerinde Reaksiyon tahlilleri gerçekleştirin. her bir termal bir durum için, hazırlanan alt-tabaka süspansiyonu 200 ul stok protein 10 ul ekle. </li><li> saatte bir kez ters çevirme ile karıştırılarak 8 saat, bir termal döngü içinde inkübe edin. </li><li> inkübasyondan sonra, etanol 25 ul ekleyerek reaksiyonlar tutuklama. </li><li> 2 dakika boyunca 3000 x g&#39;de santrifüj ile Sindirilmemiş, çözünmeyen substrat çıkarın ve sindirilmemiş substratın pelet bozmak için dikkatli bir şekilde bir 96-gözlü düz dipli mikroplakanın her bir reaksiyon karışımı, reaksiyon yüzer 150 ul aktarın. </li><li> Protein Antimicrob enzimatik aktivitesini ölçmekçözünebilir RBB boya miktarının belirlenmesi ile verilen alt tabaka için ial enzimatik hidroliz sonrasında substrat ayrışmış. enzimatik aktivitesini ölçmek için, bir mikrolevha spektrofotometre kullanılarak 595 nm&#39;de süpernatanın absorbansı ölçülür. etiketli substrattan süpernatan salınan çözünebilir boya ile artan emme enzimatik aktivitesinin kantitatif ölçüsüdür. Not: absorbanstaki değişiklik aktivitesi birimi (AU) ile temsil edilir burada 595 nm&#39;de boya salimli Reaksiyon yüzen maddelerinin optik yoğunluğu bir 0.01 artış 1. Tüm sonuçlar. enzim hariç bütün reaksiyon bileşenleri ile kuluçkalanmıştır boş Reaksiyon, RBB-etiketli substrattan bağlı inkübasyondan bırakan herhangi bir boya çıkarma için kullanılır. Optimal enzimatik sıcaklık pik aktivite ünitesi ölçüm sağlar. </li><li> Tekrarlayın 4.2.7 ile 4.2.1 antimikrobiyal enzimi için en uygun tampon koşulları belirlemek için çeşitli inkübasyon tamponlar kullanarak adımları. these deneyler, PBS kullanın. </li></ol></li><li> Boya-release Testi kullanarak bir Protein Antimikrobiyal için Optimal inkübasyon Sıcaklığında minimal Aktif Konsantrasyon belirleme <ol><li> deney tamponu kullanılarak hazır antimikrobiyal bir protein süspansiyonu bir seri seyreltme gerçekleştirin. seyreltme serisi aralığı antimikrobiyal enzim aktivitesi ile değişecektir. Bu deneylerde kullanılan seri seyreltme 0 ug, 10 ug, 100 ug, 1 ng, 10 ng, 100 ng, 1 ug ve 10 ug son deney proteini miktarlarda üretilmektedir. </li><li> 48-gözlü düz tabanlı bir mikrolevhadaki her Reaksiyon deneyi gerçekleştirmek. Her bir deney koşulu için, hazırlanan alt-tabaka süspansiyonu 200 ul ilgili protein süspansiyonu 10 ul ekle. Reaksiyon tamponu kullanılarak 10 ul reaksiyona ilave protein çözeltisinin hacmi herhangi bir değişiklik yapın. </li><li> buharlaşma nedeniyle hacim değişimini önlemek için plaka sızdırmazlık film ile mikroplağı mühür. Belirlenen optimum olarak bir çalkalama inkübatörçalkalanarak 16 saat antimikrobiyal verilen protein için cubation sıcaklığı. </li><li> ardından her etanol 25 ul ekleyerek reaksiyonu, durdurur ve 2 dakika boyunca 3000 x g&#39;de santrifüj ile sindirilmemiş substrat çıkarın. </li><li> Sindirilmemiş substratın pelet bozmak için dikkatli bir şekilde bir 96-gözlü düz dipli mikroplakanın her bir reaksiyon karışımı, reaksiyon yüzer 150 ul aktarın. </li><li> enzimatik aktivitesini ölçmek için, bir mikrolevha spektrofotometre kullanılarak 595 nm&#39;de süpernatanın absorbansı ölçülür. enzim hariç bütün reaksiyon bileşenleri ile kuluçkalanmıştır boş Reaksiyon, RBB-etiketli substrattan bağlı inkübasyondan bırakan herhangi bir boya çıkarma için kullanılır. etiketli substrattan süpernatan salınan çözünebilir boya ile artan emme enzimatik aktivite için niceliksel ölçümünü sağlar. Not: absorbanstaki değişiklik aktivitesi birimi (AU), 1. Tüm sonuçlar ile temsil edilir595 nm &#39;de bir boya salimli Reaksiyon yüzen maddelerinin optik yoğunluğu bir 0.01 artış. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Anand, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+activity+of+marine+bacteria+associated+with+sponges+from+the+waters+off+the+coast+of+South+East+India%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Res%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial activity of marine bacteria associated with sponges from the waters off the coast of South East India.</a> Microbiol Res. 161, 252-262 (2006).</li>
<li>Tagg, J. R., Dajani, A. S., Wannamaker, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteriocins+of+gram-positive+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Bacteriol+Rev%22%5BJournal%5D)">Bacteriocins of gram-positive bacteria.</a> Bacteriol Rev. 40, 722-756 (1976).</li>
<li>Hibbing, M. E., Fuqua, C., Parsek, M. R., Peterson, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+competition%3A+surviving+and+thriving+in+the+microbial+jungle%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bacterial competition: surviving and thriving in the microbial jungle.</a> Nat Rev Microbiol. 8, 15-25 (2010).</li>
<li>Riley, M. A., Gordon, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ecological+role+of+bacteriocins+in+bacterial+competition%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The ecological role of bacteriocins in bacterial competition.</a> Trends Microbiol. 7, 129-133 (1999).</li>
<li>Tenover, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+antimicrobial+resistance+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Med%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of antimicrobial resistance in bacteria.</a> Am J Med. 119, S3-S10 (2006).</li>
<li>Farris, M. H., Steinberg, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitrecin+A%2C+an+endolysin-like+bacteriolytic+enzyme+from+a+newly+isolated+soil+streptomycete%5BTitle%5D)+AND+%22Lett+Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Mitrecin A, an endolysin-like bacteriolytic enzyme from a newly isolated soil streptomycete.</a> Lett Appl Microbiol. 58, 493-502 (2014).</li>
<li>Dehart, H. P., Heath, H. E., Heath, L. S., Leblanc, P. A., Sloan, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Lysostaphin+Endopeptidase+Resistance+Gene+%28epr%29+Specifies+Modification+of+Peptidoglycan+Cross+Bridges+in+Staphylococcus+simulans+and+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The Lysostaphin Endopeptidase Resistance Gene (epr) Specifies Modification of Peptidoglycan Cross Bridges in Staphylococcus simulans and Staphylococcus aureus.</a> Appl Environ Microbiol. 61, 2811(1995).</li>
<li>Srivastava, K. K., Siddique, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+chemical+composition+of+peptidoglycan+of+Listeria+monocytogenes%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Quantitative chemical composition of peptidoglycan of Listeria monocytogenes.</a> Infect Immun. 7, 700-703 (1973).</li>
<li>Heilmann, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+peptidoglycan+of+the+cell+walls+of+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">On the peptidoglycan of the cell walls of Pseudomonas aeruginosa.</a> Eur J Biochem. 31, 456-463 (1972).</li>
<li>Schumann, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSchumann%2C+P+%22Taxonomy+of+Prokaryotes%22">Taxonomy of Prokaryotes</a>. Rainey, F., Oren, A. 38, Academic Press. (2011).</li>
<li>Lachica, R. V., Genigeorgis, C., Hoeprich, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metachromatic+agar-diffusion+methods+for+detecting+staphylococcal+nuclease+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Metachromatic agar-diffusion methods for detecting staphylococcal nuclease activity.</a> Appl Microbiol. 21, 585-587 (1971).</li>
<li>Zhou, R., Chen, S., Recsei, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dye+release+assay+for+determination+of+lysostaphin+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A dye release assay for determination of lysostaphin activity.</a> Anal Biochem. 171, 141-144 (1988).</li>
<li>Osserman, E. F., Lawlor, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+and+urinary+lysozyme+%28muramidase%29+in+monocytic+and+monomyelocytic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Serum and urinary lysozyme (muramidase) in monocytic and monomyelocytic leukemia.</a> J Exp Med. 124, 921-952 (1966).</li>
<li>Mancini, G., Carbonara, A. O., Heremans, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunochemical+quantitation+of+antigens+by+single+radial+immunodiffusion%5BTitle%5D)+AND+%22Immunochemistry%22%5BJournal%5D)">Immunochemical quantitation of antigens by single radial immunodiffusion.</a> Immunochemistry. 2, 235-254 (1965).</li>
<li>Ito, Y., Yamada, H., Imoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorimetric+assay+for+lysozyme+using+Micrococcus+luteus+labeled+with+a+blue+dye%2C+Remazol+brilliant+blue+R%2C+as+a+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Pharm+Bull.+%28Tokyo%29%22%5BJournal%5D)">Colorimetric assay for lysozyme using Micrococcus luteus labeled with a blue dye, Remazol brilliant blue R, as a substrate.</a> Chem Pharm Bull. (Tokyo). 40, 1523-1526 (1992).</li>
<li>Hardt, M., Guo, Y., Henderson, G., Laine, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zymogram+with+Remazol+brilliant+blue-labeled+Micrococcus+lysodeikticus+cells+for+the+detection+of+lysozymes%3A+example+of+a+new+lysozyme+activity+in+Formosan+termite+defense+secretions%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Zymogram with Remazol brilliant blue-labeled Micrococcus lysodeikticus cells for the detection of lysozymes: example of a new lysozyme activity in Formosan termite defense secretions.</a> Anal Biochem. 312, 73-76 (2003).</li>
<li>Pettersson, B., Eriksson, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+standardized+spectrophotometric+assay+of+endoglycanase+activities+using+dyed%2C+amorphous+polysaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A standardized spectrophotometric assay of endoglycanase activities using dyed, amorphous polysaccharides.</a> Anal Biochem. 285, 220-224 (2000).</li>
<li>Gomez Ramirez, M., Rojas Avelizapa, L. I., Rojas Avelizapa, N. G., Cruz Camarillo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colloidal+chitin+stained+with+Remazol+Brilliant+Blue+R%2C+a+useful+substrate+to+select+chitinolytic+microorganisms+and+to+evaluate+chitinases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microbiol+Methods%22%5BJournal%5D)">Colloidal chitin stained with Remazol Brilliant Blue R, a useful substrate to select chitinolytic microorganisms and to evaluate chitinases.</a> J Microbiol Methods. 56, 213-219 (2004).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan ederim. MITRE Corporation, birden federal olarak finanse edilen araştırma ve geliştirme merkezleri (FFRDCs) faaliyet gösteren bir değil, kar amacı gütmeyen bir şirkettir.

mikroslayd difüzyon deneyi ve boya-salınım testi tespit ve daha önce tanımlanmamış, protein antimikrobiyal karakterize etmek için avantaj sağlamaktadır. Bu hızlı ve hassas yöntemler büyük araştırma bilgi yatırım önce yararlı enzimler tanımlanması için bir organizma kaynağı kütüphanelerin yüksek verimli tarama sağlar. üst düzey hedef enzim tanımlanır gibi, tespit deneylerinin varyasyonları enzimi hızla tespit etmek veya enzim biyokimyasal özelliklerini belirlemek için kullanılabilir. Örneğin, bir çok basamaklı protein saflaştırma şemasının, mikroslayd difüzyon deneyi hızlı konusu enzimi ihtiva eden fraksiyonlar algılayabilir. Buna ek olarak, enzim reaksiyon Optima boya salım deneyinde Reaksiyon tampon ve kuluçkalama sıcaklıklarının değiştirilmesiyle belirlenebilir. mikroslayd difüzyon testinde tespiti için gerekli enzim olan kütle aralığı enzim karakterize eden bir fonksiyonudurampüller. Deneyin tarama sınırlamalar genellikle, boya-salım analizi daha enzimin yüksek miktarlarda kullanılmasını gerektirir. Bu çalışmada, boya salım analizi (Şekil 4) mikroslayd difüzyon deneyi (Şekil 1) tespit limitleri karşılaştırması mikroslayd difüzyon deneyi boya salım deneyinde daha az hassas bir teknik olduğunu gösterilen. Enzim konsantrasyonu bir endişe olmadığı zaman, mikroslayd tahlil düşük işgücü ve ekipman talepleri hedef yüzeylerde karşı protein Antimikrobiyal maddelerin üretimi için kütüphanelerin hızlı başlangıç ​​taranması için izin verir. daha fazla çaba ve ekipman gerektiren birlikte, boya salınım testi, belirli bir alt-tabaka için aynı ya da farklı enzimler, boya-salım deneyleri ile karşılaştırma yapmak kantitatif sonuçlar hasıl daha hassas ve tekrarlanabilir. iki yöntem kolayca çok özel enstrümantasyon gerek olmadan en mikrobiyolojik laboratuvarlarda yapılır. temsilcilerimiz içindemikroslayd difüzyon testinde tespit az miktarda 1 ug (veriler gösterilmemiştir) ise tive deneyler, kontrol enzimi, α-kimotripsin, boya salım deneyi kullanılarak 100 ng (Şekil 5) gibi düşük bir miktarda tespit edilmiştir. Antimikrobiyal enzimler için kalitatif tespitinde olarak kullanıma sunan, difüzyon deneyi varyasyonları bir dizi 11,13 bildirilmiştir. Bu deneyleri incelerken, mikroslayd difüzyon deneyi ilk ekran olarak nispeten yüksek hassasiyet ve tepki gözetilmesi kolaylığı için geliştirilmiştir. Proteini ile de yayılır şekilde agaroz bindirmeleri Staphylococcus aureus suşları tarafından nükleazlara üretimini tespit etmek için kullanılan edildiği Lachica ve ark., 11 çalışması, değişikliğe uğratılmış mikroslayd difüzyon deneyi radyal immünodifüzyon yöntemi 14 ile benzer biçimde çalıştırılır agaroz alt tabaka ihtiva etmektedir. radyal immunodiffuSistem agaroz içinde yayılma antijen ve antikor arasındaki bir kompleks oluşumu denge ulaştığında yon yöntemi immünopresipitasyon bölgenin genişleme durur. Bunun aksine, mikroslayd difüzyon deneyinin alt-tabaka, ilk başta açıklanan çevreleyen liziz bir sürekli genişleyen bölgede yayılan bir protein antimikrobik ile sindirilmiştir. enzim aktivitesi, kaybeder ya da alt-tabaka bitene kadar bölge artan çapı devam eder. liziz bölgesinin üretim oranı enzim, saflık ve böylece belirli bir etkinlik olarak hızlandı veya enzim konsantrasyonu de artar ilave edildi. Kantitatif ısı ile öldürülmüş B&#39;ye karşı protein antimikrobik enzimatik aktivitesini değerlendirmek için subtilis boya salınım testi seçildi. Remazol parlak mavi R boyası (RBB) kullanılarak kolorimetrik analizler yüzeyler protein antimikrobiyal eylemlerinde çok yönlü ve hassas değerlendirilmesine imkan -etiketlity. hali hazırda 595 nm&#39;de bir spektrofotometre ile ölçülebilir çözünebilen, mavi ürünlerin açıklamasında RBB-etiketli Substrat enzimatik hidrolizi. diğer protein antimikrobik enzimler karakterize etmek için geliştirilmiş RBB boya salım deneyinde çeşitli varyasyonları, diğer substratlar ile uygulama için, bu deneyde esnekliğini göstermektedir. Örneğin, bir bakteriyolitik lysostaphin etkisini belirlemede, Zhou ve ark., RBB-boyalı stafılokok hücreleri ve alt tabakalar 12 olarak stafilokokal peptidoglikan kullanılarak bir boya salım deneyi bildirilmiştir. Bu RBB boya salım deneyinde uygulanmasının bir modifikasyonunda, RBB-etiketli Micrococcus luteus alt-tabaka, örneğin bakteriyel enfeksiyon ve habis karsinom varlığında gibi hastalıkların teşhis etmek için bir hızlı ve hassas bir araç olarak kullanımı ve ekran için önerilmiştir hangi olabilir kan serumunda 15 insan lizozim ekspresyon düzeyleri ile korele edilebilir. Buna ek olarak, RBB-etiketli bakteriyel hücre substratları olduğu birLSO lizozim 16 tespit edilmesi için bir zimogram yöntemi kullanılmıştır. Bu enzim üretimi için hızlı bir arşiv taraması için izin boya salım deneyinde alçaltılmış saptama limiti, kolaylık ve tekrarlanabilirlik göstermektedir. Deneyin değişiklikler sıcaklık, pH, tuzluluk etkilerinin yanı sıra antimikrobiyal proteinlerin 6 aktivitesi diğer proteolitik enzimlerin etkilerini de dahil olmak üzere alt niceliksel biyokimyasal karakterizasyonu deneyleri, izin verir. Buna ek olarak, sayısal boya salınım testi, belirli bir alt-tabaka için çok sayıda enzimlerin aktivitelerini karşılaştırmak için kullanılabilir. RBB boya salma tahlili karakterizasyonu ve protein antimikrobik maddelerin tespitine ek olarak, polisakaritler karşı aktivitesi olan enzimler için yardımcı bildirmiştir. Pettersson ve Eriksson selüloz, ksilan, manan ve pusula amorf, RBB-boyanmış polisakarid boncuklar kullanılarak endoglycanase aktivitesi tespit etmek için bir deney rapor17&#39;sinde. Bu bulgular, bir genleşme Bacillus thuringiensis Bt-107 tarafından üretilen kitinaz enzimlerin saptanması için hassas bir yöntem RBB 18 ile etiketlenmiş kolloidal kitin kullanılarak geliştirilmiştir. Bu ve diğer çalışmalardan, RBB-boyanmış substratlar Ticari kaynaklar keratin, amilopektin, amiloz, glikojen, Laminarin, D-ksilan, azo-arpa glukan ve nişasta karşı da dahil olmak üzere glikolitik aktivitesi, saptanmasında kullanım için ortaya çıkmıştır. Bu çalışmada, kolorimetrik bir sonuç elde etmek için gereken RBB-etiketli substrat ve enzim hacmini azaltır, bir mikroplaka formatında boya salım deneyinde yararını göstermektedir. Şekil 4 ve Şekil 5 &#39;de gösterildiği üzere, mikro boya salma tahlili enzimatik etkinlik algılaması için mikroslayd difüzyon deneyi daha düşük bir belirleme sınırına içerir. yorumlama hızlı kullanımı ile ilgili olarak, emeğin korunması ve kolaylığı ile, mikrofonroslide difüzyon deneyi, antimikrobiyal aktivitenin varlığı hem de alt baş protein izolasyon ve arıtma aşamalarında antimikrobiyal proteinin varlığının gösterilmesi için başlangıç, yüksek verimli taramalara bir fayda sağlar. Bu iki testin kombinasyonu yeni protein antimikrobik ilk tarama ve son karakterizasyonu birbirini tamamlayan

Antimicrobial agents play an essential role in targeting a wide range of microorganisms such as viruses, fungi, and bacteria. The antimicrobial activities produced by various bacteria range in target specificity from broad-spectrum to species-specific, including clinically relevant bacterial pathogens 1. In nature, protein antimicrobial compounds like bacteriocins and lysins represent a microbial arsenal of tools for self-defense, replication, and nutrient acquisition 2,3. Serving as mediators of population dynamics within microbial communities, protein antimicrobials provide a competitive advantage to the producing organism over nonproducing, sensitive species 4. As recombinant enzymes and probiotics, these proteins also have an economic and societal importance as the need for new sources of pathogen control increases with each new expansion of antimicrobial resistance within the bacterial population 5.
The first evaluations of newly discovered protein antimicrobials include determining the basic physical characteristics that are inherent to the enzyme. Methods for rapid screening of potential antimicrobials allow selection of candidates with hydrolytic activities against the desired target substrates. The microslide diffusion assay and the quantitative dye-release assay allow for the use of a variety of substrates in the detection of enzymatic hydrolysis. For protein antimicrobial enzymes with activity against the bacterial cell wall, the versatility of these assays allow rapid and effective, qualitative and quantitative screening against viable bacterial cells (microslide assay only), heat-killed whole bacterial cell substrates, or purified peptidoglycan from the target bacterium. These assays have utility in antimicrobial enzyme discovery for use in fields such as alternative therapeutics, food supplements, and inhibitors of biofilm production.
The microslide diffusion assay and the dye-release assay are demonstrated methods for detection and characterization of novel protein antimicrobials. The microslide diffusion assay provides a relative (qualitative) estimate of antimicrobial activity and allows for minimal inference of enzyme concentration and activity. Using this method, activity is readily visualized as the development of a zone of lysis with the absence of activity resulting in a lack of zone formation. The rate of zone development and the zone diameter are indicative of the amount and purity of the enzyme present in the sample; however, this rate and the quality of the substrate clearing within the zone can also be affected by the presence of contaminants, the completeness of the hydrolysis reaction, and the type of substrate. Interfering contaminants can affect the rate of enzyme diffusion from the well, while incomplete hydrolysis or variation of the substrate type can result in a turbid zone of lysis 6.
The dye-release assay quantitatively assesses the amount of covalently-linked Remazol brilliant blue R dye products released into the reaction supernatant from the enzymatically hydrolyzed substrate. The method has only slight variability associated with a difference in substrate, thus allowing greater sensitivity for detection of hydrolysis as compared to the microslide diffusion assay. These properties allow the method to have utility in the characterization of biochemical properties of the enzyme and in the standardization of the assay for comparison between different antimicrobial enzymes.
In this protocol, we provide methods to perform the basic microslide diffusion assay and dye-release assay, while demonstrating the scale of detection limits and variability for each. The assays are used to perform basic evaluations of an unknown protein antimicrobial purified from the culture supernatant of an uncharacterized soil bacterial isolate. Observed activities against bacterial cell substrates within the assays allow comparison of reaction activities between a previously uncharacterized protein antimicrobial and &#945;-chymotrypsin, a control proteolytic enzymes. These protocols provide a foundation for the application of the two techniques that can be expanded and modified to accommodate varied applications.

<table><tbody><tr><td>48-well flat-bottom microplate with low evaporation lid</td><td>Becton Dickinson</td><td>3078</td><td></td></tr><tr><td>96-well flat-bottom microplate (Costar 3595)</td><td>Corning, Inc.</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>agarose</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP162-100</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-chymotrypsin</td><td>MP Biomedicals</td><td>215227205</td><td></td></tr><tr><td>Bacillus subtilis 168</td><td>American Type Culture Collection</td><td>23857</td><td></td></tr><tr><td>C1000 Touch Thermal Cycler</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>cork borer</td><td>Humboldt</td><td>H-9661</td><td></td></tr><tr><td>lysozyme</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6876-1G</td><td></td></tr><tr><td>McFarland equivalence standard (2.0)</td><td>Fisher Scientific</td><td>R20412</td><td></td></tr><tr><td>microslides</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-38-103</td><td></td></tr><tr><td>nutrient broth</td><td>Fisher Scientific</td><td>S25959B</td><td></td></tr><tr><td>peptidoglycan of &lt;em&gt;Bacillus subtilis&lt;/em&gt; 168</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>69554-10MG-F</td><td></td></tr><tr><td>phosphate-buffered saline (1x)</td><td>Teknova</td><td>P0200</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td><td>Life Technologies</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>Synergy HT microplate spectrophotometer</td><td>BioTek Instruments, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Remazol brilliant blue R dye (RBB)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8001</td><td></td></tr><tr><td>Salmonella enterica subsp. enterica</td><td>American Type Culture Collection</td><td>10708</td><td></td></tr><tr><td>sodium azide</td><td>Fisher Scientific</td><td>S227-100</td><td></td></tr><tr><td>sodium hydroxide (NaOH)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318-500</td><td></td></tr><tr><td>Titer Tops pre-cut adhesive polyethylene film</td><td>Diversified Biotechnology</td><td>T-TOPS-50</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure distilled water</td><td>Invitrogen</td><td>10977-015</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Solution&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>agarose solution&lt;br/&gt; 50 ml PBS&lt;br/&gt; 0.25 g agarose</td><td></td><td></td><td>Add 10% sodium azide to the molten PBS/agarose solution</td></tr><tr><td>nutrient broth medium&lt;br/&gt; 4 g nutrient broth&lt;br/&gt; 500 ml Type I water</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>250 mM sodium hydroxide (NaOH) solution&lt;br/&gt; 1 g NaOH&lt;br/&gt; 99 ml Type I water</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 mM Remazol brilliant blue R dye (RBB)&lt;br/&gt; 1.25 g RBB&lt;br/&gt; 98.75 ml 250 mM NaOH solution</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

qualitative and quantitative assays for detection and characterization of protein antimicrobials

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods to screen for target enzymes prior to investing greater research effort and resources. The goal of this protocol is to demonstrate two complementary assays for conducting these initial evaluations. The microslide diffusion assay provides an initial or simple detection screen to enable the qualitative and rapid assessment of proteolytic activity against an array of both viable and heat-killed bacterial target substrates. As a counterpart, the increased sensitivity and reproducibility of the dye-release assay provides a quantitative platform for evaluating and comparing environmental influences affecting the hydrolytic activity of protein antimicrobials. The ability to label specific heat-killed cell culture substrates with Remazol brilliant blue R dye expands this capability to tailor the dye-release assay to characterize enzymatic activity of interest.

mikroslayd difüzyon deneyi ve kantitatif boya-salınım testi tarama ve yeni bir protein antimikrobik ilk soruşturma ölçmek için etkili yöntemlerdir. Her deney avantajları ve sınırlamaları vardır; bağlantılı olarak gerçekleştirilen, ancak, bunlar, hızlı ilk tarama ve bir antimikrobiyal temel özelliklerini sağlar. mikroslayd difüzyon deneyi etkin protein antimikrobiyal üreten mikrop kütüphanelerinin hızlı taranması için izin verir. Enzim konsantrasyonu seviyeleri endişe, algılama kısıtlamaları duyarlılığı reaksiyonu, daha boya salım deneyinde eklenecek enzimin daha büyük bir miktarda gerektiren deneyi sınırlayabilir. Şekil 1 &#39;de gösterildiği gibi, tahlilin niteliksel özellikler gözlemci her bir mesafede bulunan göreli enzim miktarları karşılaştırma sağlar. Şekil 1A gösterilen lizis gelişmekte olan bölgesi, içinde (25 enzim ug), bölgenin öncü, alt tabakanın bulanık veya eksik parçalanma görüntüler ise de en yakın bölge daha eksiksiz bir alt tabaka lizis gösterir. Bu olgu, ön kenarda difüzyon enzimin azalan konsantrasyonunun bir ürünü, bölge çapının doğru ölçüm zorlaştırmaktadır. Şekil 1 &#39;de görülen oyuklar B (15 ug), C (10 ug), D (5 ug), D (1.0 ug), ve F (0.1 ug) ve tam lizis bölgesinin çapı yok olmasına dağıtır enzimin düşük miktarda ilişkilendirilmesi. Durum F (0.1 ug) için, agaroz içinde enzim konsantrasyonu bu alt-tabakanın hidrolize, agaroz içinde hareket ederken yayılan enzim görüntülenmiştir sağlayacak sınırının altındadır. Mikroslayd difüzyon deneyi de saflaştırılmış Bacillus subtilis peptidleri kullanılarak çalıştırıldıalt-tabaka olarak doglycan (Şekil 2). Bölge nedeniyle eşit agaroz askıya peptidoglikan isteksizliği bütün hücre Salmonella enterica ile gözlenen daha az tanımlanmış olmasına rağmen, bilinmeyen antimikrobiyal enzimi ile peptidoglikan hidroliz açıktır. boya salım deneyi enzim reaksiyonu etkileyen çevresel faktörlerin bir alt saptama sınırı ve varyasyon sağlayan, mikroslayd difüzyon deneyi daha hassas ve çok yönlü bir testtir. Örnek deneyler, sıcaklık antimikrobik enzim için optimum sıcaklık saptanması için değiştirilmiştir, 35 ° C PBS içinde (Şekil 3) olarak belirlendi. Bu, en uygun mavi renk (Şekil 3B) ve 595 nm (Şekil 3A) absorbans ölçümlerinden elde edilen aktivite birimleri temsil edildiği gibi fazla miktarda Reaksiyon süpernatanları açıkça görülmektedir.boya salım deneyinde çok yönlülüğü araştırmacının hızlı bir şekilde belirli bir enzim için uygun kuluçkalama koşulları belirlemek için sıcaklık, aynı zamanda, reaksiyon tampon ve tampon bileşenleri sadece değişmesini sağlar. Bilinmiyor antimikrobik enzim (Şekil 4) ve α-kimotripsin kontrol enzimi (Şekil 5) arasında aktivite düzeyi RBB-etiketli Bacillus subtilis ısı ile öldürülmüş alt-tabakaya karşı PBS içinde 35 ° C&#39;de belirlenen uygun inkübasyon sıcaklığında ölçüldü. Şekil 4 ve Şekil 5 ile ilgili sonuçların karşılaştırılması bilinmiyor antimikrobiyal enzim B. neredeyse iki katı bir afiniteye sahip olduğunu göstermektedir subtilis alt-tabaka. Buna ek olarak, α-kimotripsin kontrol tamamen ısı ile öldürülmüş B. sindirmek vermedi oyuk içindeki subtilis alt-tabaka (veriler gösterilmemiştir). α-kimotripsin kontrol aktivitesi plaka başlarau 0.3 ug bilinmiyor antimikrobik enzim (Şekil 4 ve Şekil 5) Tüm enzim miktarları arasında aktivitesi birim olarak sürekli artış ile karşılaştırıldığında. Bu bilinmeyen enzim daha büyük bir kalıcı etkinliğe sahip olduğunu veya B içindeki enzime uygun yarılma bölgeleri daha fazla sayıda olduğu gösterebilir subtilis alt-tabaka. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/53819/53819fig1.jpg" /> Şekil 1:. Salmonella enterica Tüm Hücre alt-tabakaya karşı Enzim Aktivitesi mikroslayd difüzyon deneyi niteliksel ısı ile öldürülmüş Salmonella enterica subsp karşı bilinmeyen bir protein antimikrobik etkinliğini değerlendirmek için kullanılan enterica (ATCC 10708).. ilgili kuyucuklara ilave edildi, fosfat tamponlu salin (PBS) içinde süspansiyon haline bilinmiyor antimikrobik protein kütlelerislaytlar dahil 25 mikrogram (iyi A) ug (kuyu B), 10 ug 15 (iyi C), 5 mg (iyi D), 1 ug (iyi E) ve 0.1 ug (iyi F). Sadece PBS deneylerinin negatif kontroller kullanılmıştır. Lizis Bölgeleri 6 saat inkübasyondan sonra görüntülendi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53819/53819fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/53819/53819fig2.jpg" /> Şekil 2:. Enzim Aktivitesi Bacillus subtilis karşı peptidoglikan Hücre duvarı mikroslayd difüzyon deneyi niteliksel Bacillus subtilis 168 peptidoglikan karşı bilinmeyen bir protein antimikrobik etkinliğini değerlendirmek için kullanıldı. PBS 20 ul, bilinmeyen bir antimikrobik 10 ug içinde süspansiyon haline de bir mikroskopta ilave edildi. Sadece PBS negatif olarak kullanılmıştırtahlil (kuyu B) kontrolü. Lizis zon 37 ° C&#39;de 6 saatlik inkübasyondan sonra görüntülendi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53819/53819fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/53819/53819fig3.jpg" /> Şekil 3: a. Protein optimal reaksiyon sıcaklığı Antimikrobiyal boya salım deneyinde çok yönlülüğü ilgi 6 enzim aktivitesi üzerindeki etkilerini belirlemek üzere inkübasyon sıcaklığı ve tamponlar gibi fiziksel ve kimyasal parametreler, farklılaştınlabilmektedir. Bu şekilde gösterildiği gibi, bilinmeyen bir protein, antimikrobik (1 ug) aktivitesi inkübasyon bir sıcaklık aralığı altında RBB-etiketli ısı ile öldürülmüş, Bacillus subtilis karşı PBS içinde değerlendirilmiştir. Aktivite birimleri (AU) (A), RBB-b absorpsiyon olarak görüntülenirHidroliz Bir mikrolevha spektrofotometre kullanılarak 595 nm&#39;de ölçülmüştür sonra ound ürün yüzer bırakıldı. her bir sıcaklık koşulu da eklenmiş bir enzim ile reaksiyonları çeşitli sıcaklıklarda inkübasyon sonucunda salınan boya etkisini çıkarmak için kullanıldı. Her inkübasyon sıcaklığına karşılık gelen reaksiyon süpernatanları absorbans ölçümü (B) öncesinde görüntülendi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53819/53819fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/53819/53819fig4.jpg" /> Şekil 4: a. Protein faaliyet sahası Antimikrobiyal bilinmeyen bir protein antimikrobiyal için aktivite aralığı 0, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, ve 1000 ng gece boyunca inkubasyon sonrası aktivite birimleri olarak ölçülmüştür BCA prot ile ölçülenEin deney (A). Bu reaksiyonlar için, RBB-etiketli B. subtilis için yüzey enzim (1.000 ng) en yüksek miktar ile reaksiyonu tamamen Reaksiyon inkübasyon süresi içinde mevcut bulunan tüm alt-tabakanın hidrolize etmedi sağlamak için 595 nm &#39;de 5.0 bir optik yoğunluk elde yükseltilmiştir. ilave enzimsiz kontrol reaksiyonları tek inkübe kaynaklanan salınan boya etkisini çıkarmak için kullanıldı. Her enzim miktarına karşılık gelen reaksiyon süpernatanları absorbans ölçümleri (B) öncesinde görüntülendi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53819/53819fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/53819/53819fig5.jpg" /> Şekil 5:. Α-kimotripsin için α-kimotripsin aktivitesi aralığı için Etkinlik Aralığı activ olarak ölçüldügecede inkubasyon sonrası lık birim 0, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, ve enzim (A) 1000 ng. Bu reaksiyonlar için, RBB-etiketli B. subtilis için yüzey enzim (1.000 ng) en yüksek miktar ile reaksiyonu tamamen Reaksiyon inkübasyon süresi içinde mevcut bulunan tüm alt-tabakanın hidrolize etmedi sağlamak için 595 nm &#39;de 5.0 bir optik yoğunluk elde yükseltilmiştir. ilave enzimsiz kontrol reaksiyonları tek inkübe kaynaklanan salınan boya etkisini çıkarmak için kullanıldı. Her enzim miktarına karşılık gelen reaksiyon süpernatanları absorbans ölçümleri (B) öncesinde görüntülendi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53819/53819fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials at JoVE.com

Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

Nitel ve Nicel Saptanması için Tahliller ve Protein Antimikrobiyal karakterizasyonu

Here, we present protocols to rapidly screen and characterize enzymes for antimicrobial activity. The microslide diffusion assay and the dye-release assay utilize target bacterial substrates for qualitative and quantitative enzymatic activity evaluation.

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods ...

qualitative-quantitative-assays-for-detection-characterization

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

18.5K Görüntüleme.  The MITRE Corporation. Here, we present protocols to rapidly screen and characterize enzymes for antimicrobial activity. The microslide diffusion assay and the dye-release assay utilize target bacterial substrates for qualitative and quantitative enzymatic activity evaluation.

Video: Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

An HS-MRM Assay for the Quantification of Host-cell Proteins in Protein Biopharmaceuticals by Liquid Chromatography Ion Mobility QTOF Mass Spectrometry

The analysis of low-level (1-100 ppm) protein impurities (e.g., host-cell proteins (HCPs)) in protein biotherapeutics is a challenging assay requiring high sensitivity and a wide dynamic range. Mass spectrometry-based quantification assays for proteins typically involve protein digestion followed by the selective reaction monitoring/multiple reaction monitoring (SRM/MRM) quantification of peptides using a low-resolution (Rs ~1,000) tandem quadrupole mass spectrometer. One of the limitations of this approach is the interference phenomenon observed when the peptide of interest has the "same" precursor and fragment mass (in terms of m/z values) as other co-eluting peptides present in the sample (within a 1-Da window). To avoid this phenomenon, we propose an alternative mass spectrometric approach, a high selectivity (HS) MRM assay that combines the ion mobility separation of peptide precursors with the high-resolution (Rs ~30,000) MS detection of peptide fragments. We explored the capabilities of this approach to quantify low-abundance peptide standards spiked in a monoclonal antibody (mAb) digest and demonstrated that it has the sensitivity and dynamic range (at least 3 orders of magnitude) typically achieved in HCP analysis. All six peptide standards were detected at concentrations as low as 0.1 nM (1 femtomole loaded on a 2.1-mm ID chromatographic column) in the presence of a high-abundance peptide background (2 &#181;g of a mAb digest loaded on-column). When considering the MW of rabbit phosphorylase (97.2 kDa), from which the spiked peptides were derived, the LOQ of this assay is lower than 50 ppm. Relative standard deviations (RSD) of peak areas (n = 4 replicates) were less than 15% across the entire concentration range investigated (0.1-100 nM or 1-1,000 ppm) in this study.

Here, we describe a chromatographic assay coupled with the ion mobility separation of peptide precursors followed by the high-resolution (~30,000) MS-detection of peptide fragments for the quantification of spiked peptide standards in a monoclonal antibody digest.

Bir HS-MRM tahlil için Protein Biyofarmasötikler sıvı Kromatografi iyon hareketlilik QTOF kütle spektrometresi tarafından Host-hücre proteinleri miktar

The analysis of low-level (1-100 ppm) protein impurities (e.g., host-cell proteins (HCPs)) in protein biotherapeutics is a challenging assay requiring ...

Kimya

Nanomechanics of Drug-target Interactions and Antibacterial Resistance Detection

The cantilever sensor, which acts as a transducer of reactions between model bacterial cell wall matrix immobilized on its surface and antibiotic drugs in solution, has shown considerable potential in biochemical sensing applications with unprecedented sensitivity and specificity1-5. The drug-target interactions generate surface stress, causing the cantilever to bend, and the signal can be analyzed optically when it is illuminated by a laser. The change in surface stress measured with nano-scale precision allows disruptions of the biomechanics of model bacterial cell wall targets to be tracked in real time. Despite offering considerable advantages, multiple cantilever sensor arrays have never been applied in quantifying drug-target binding interactions.
Here, we report on the use of silicon multiple cantilever arrays coated with alkanethiol self-assembled monolayers mimicking bacterial cell wall matrix to quantitatively study antibiotic binding interactions. To understand the impact of vancomycin on the mechanics of bacterial cell wall structures1,6,7.&#160;We developed a new model1 which proposes that cantilever bending can be described by two independent factors; i) namely a chemical factor, which is given by a classical Langmuir adsorption isotherm, from which we calculate the thermodynamic equilibrium dissociation constant (Kd) and ii) a geometrical factor, essentially a measure of how bacterial peptide receptors are distributed on the cantilever surface. The surface distribution of peptide receptors (p) is used to investigate the dependence of geometry and ligand loading. It is shown that a threshold value of p ~10% is critical to sensing applications. Below which there is no detectable bending signal while above this value, the bending signal increases almost linearly,&#160;revealing that stress is a product of a local chemical binding factor and a geometrical factor combined by the mechanical connectivity of reacted regions and provides a new paradigm for design of powerful agents to combat superbug infections.

Acquired resistance to antibiotics is a major public healthcare problem and is presently ranked by the WHO as one of the greatest threats to human life. Here we describe the use of cantilever technology to quantify antibacterial resistance, critical to the discovery of novel and powerful agents against multidrug resistant bacteria.

İlaç-hedef Etkileşimleri ve Antibakteriyel Direnç Algılama Nanomekaniğe

The cantilever sensor, which acts as a transducer of reactions between model bacterial cell wall matrix immobilized on its surface and antibiotic drugs in ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Isolation and Identification of Waterborne Antibiotic-Resistant Bacteria and Molecular Characterization of their Antibiotic Resistance Genes

The development and spread of antibiotic resistance (AR) through microbiota associated with freshwater bodies is a major global health concern. In the present study, freshwater samples were collected and analyzed with respect to the total bacterial diversity and AR genes (ARGs) using both conventional culture-based techniques and a high-throughput culture-independent metagenomic approach. This paper presents a systematic protocol for the enumeration of the total and antibiotic-resistant culturable bacteria from freshwater samples and the determination of phenotypic and genotypic resistance in the culturable isolates. Further, we report the use of whole metagenomic analysis of the total metagenomic DNA extracted from the freshwater sample for the identification of the overall bacterial diversity, including non-culturable bacteria, and the identification of the total pool of different ARGs (resistome) in the water body. Following these detailed protocols, we observed a high antibiotic-resistant bacteria load in the range of 9.6 &#215; 105-1.2 &#215; 109 CFU/mL. Most isolates were resistant to the multiple tested antibiotics, including cefotaxime, ampicillin, levofloxacin, chloramphenicol, ceftriaxone, gentamicin, neomycin, trimethoprim, and ciprofloxacin, with multiple antibiotic resistance (MAR) indexes of &#8805;0.2, indicating high levels of resistance in the isolates. The 16S rRNA sequencing identified potential human pathogens, such as Klebsiella pneumoniae,&#160;and opportunistic bacteria, such as Comamonas spp., Micrococcus spp., Arthrobacter spp., and Aeromonas spp. The molecular characterization of the isolates showed the presence of various ARGs, such as blaTEM, blaCTX-M (&#946;-lactams), aadA, aac (6&#39;)-Ib (aminoglycosides), and dfr1 (trimethoprims), which was also confirmed by the whole metagenomic DNA analysis. A high prevalence of other ARGs encoding for antibiotic efflux pumps-mtrA, macB, mdtA, acrD, &#946;-lactamases-SMB-1, VIM-20, ccrA, ampC, blaZ, the&#160;chloramphenicol acetyltransferase gene catB10, and&#160;the rifampicin resistance gene rphB-was also detected in the metagenomic DNA. With the help of the protocols discussed in this study, we confirmed the presence of waterborne MAR bacteria with diverse AR phenotypic and genotypic traits. Thus, whole metagenomic DNA analysis can be used as a complementary technique to conventional culture-based techniques to determine the overall AR status of a water body.

Here, we present a detailed protocol for the isolation and identification of antibiotic-resistant bacteria from water and the molecular characterization of their antibiotic resistance genes (ARGs). The use of culture-based and non-culture-based (metagenomic analysis) techniques provides complete information about the total bacterial diversity and the total pool of different ARGs present in freshwaters from Mumbai, India.

Su Kaynaklı Antibiyotiğe Dirençli Bakterilerin İzolasyonu ve Tanımlanması ve Antibiyotik Direnç Genlerinin Moleküler Karakterizasyonu

The development and spread of antibiotic resistance (AR) through microbiota associated with freshwater bodies is a major global health concern. In the ...

Çevre

High Throughput, Real-time, Dual-readout Testing of Intracellular Antimicrobial Activity and Eukaryotic Cell Cytotoxicity

Traditional measures of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity rely on endpoint assays. Such endpoint assays require several additional experimental steps prior to readout, such as cell lysis, colony forming unit determination, or reagent addition. When performing thousands of assays, for example, during high-throughput screening, the downstream effort required for these types of assays is considerable. Therefore, to facilitate high-throughput antimicrobial discovery, we developed a real-time assay to simultaneously identify inhibitors of intracellular bacterial growth and assess eukaryotic cell cytotoxicity. Specifically, real-time intracellular bacterial growth detection was enabled by marking bacterial screening strains with either a bacterial lux operon (1st generation assay) or fluorescent protein reporters (2nd generation, orthogonal assay). A non-toxic, cell membrane-impermeant, nucleic acid-binding dye was also added during initial infection of macrophages. These dyes are excluded from viable cells. However, non-viable host cells lose membrane integrity permitting entry and fluorescent labeling of nuclear DNA (deoxyribonucleic acid). Notably, DNA binding is associated with a large increase in fluorescent quantum yield that provides a solution-based readout of host cell death. We have used this combined assay to perform a high-throughput screen in microplate format, and to assess intracellular growth and cytotoxicity by microscopy. Notably, antimicrobials may demonstrate synergy in which the combined effect of two or more antimicrobials when applied together is greater than when applied separately. Testing for in vitro synergy against intracellular pathogens is normally a prodigious task as combinatorial permutations of antibiotics at different concentrations must be assessed. However, we found that our real-time assay combined with automated, digital dispensing technology permitted facile synergy testing. Using these approaches, we were able to systematically survey action of a large number of antimicrobials alone and in combination against the intracellular pathogen, Legionella pneumophila.

A high throughput, real-time assay was developed to simultaneously identify (1) eukaryotic cell-penetrant antimicrobials targeting an intracellular bacterial pathogen, and (2) assess eukaryotic cell cytotoxicity. A variation on the same technology was thereafter combined with digital dispensing technology to enable facile, high-resolution, dose-response, and two- and three-dimensional synergy studies.

Yüksek Verimli, gerçek zamanlı, Hücre içi Antimikrobiyal Aktiviteleri Çift okuma Test ve Ökaryotik Hücre Sitotoksisite

Traditional measures of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity rely on endpoint assays. Such endpoint assays require ...

Use of the Soft-agar Overlay Technique to Screen for Bacterially Produced Inhibitory Compounds

The soft-agar overlay technique was originally developed over 70 years ago and has been widely used in several areas of microbiological research, including work with bacteriophages and bacteriocins, proteinaceous antibacterial agents. This approach is relatively inexpensive, with minimal resource requirements. This technique consists of spotting supernatant from a donor strain (potentially harboring a toxic compound(s)) onto a solidified soft agar overlay that is seeded with a bacterial test strain (potentially sensitive to the toxic compound(s)). We utilized this technique to screen a library of Pseudomonas syringae strains for intraspecific killing. By combining this approach with a precipitation step and targeted gene deletions, multiple toxic compounds produced by the same strain can be differentiated. The two antagonistic agents commonly recovered using this technique are bacteriophages and bacteriocins. These two agents can be differentiated using two simple additional tests. Performing a serial dilution on a supernatant containing bacteriophage will result in individual plaques becoming less in number with greater dilution, whereas serial dilution of a supernatant containing bacteriocin will result a clearing zone that becomes uniformly more turbid with greater dilution. Additionally, a bacteriophage will produce a clearing zone when spotted onto a fresh soft agar overlay seeded with the same strain, whereas a bacteriocin will not produce a clearing zone when transferred to a fresh soft agar lawn, owing to the dilution of the bacteriocin.

We describe a simple method for screening bacterial cultures for the production of compounds inhibitory towards other bacteria.

Yumuşak agar üst tabaka tekniği kullanımı bakteriyel olarak üretilmiş önleyici bileşiklerin taranması için

The soft-agar overlay technique was originally developed over 70 years ago and has been widely used in several areas of microbiological research, ...

A Protein Microarray Assay for Serological Determination of Antigen-specific Antibody Responses Following Clostridium difficile Infection

We provide a detailed overview of a novel high-throughput protein microarray assay for the determination of anti-Clostridium difficile antibody levels in human sera and in separate preparations of polyclonal intravenous immunoglobulin (IVIg). The protocol describes the methodological steps involved in sample preparation, printing of arrays, assay procedure, and data analysis. In addition, this protocol could be further developed to incorporate diverse clinical samples including plasma and cell culture supernatants. We show how protein microarray can be used to determine a combination of isotype (IgG, IgA, IgM), subclass (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2), and strain-specific antibodies to highly purified whole C. difficile toxins A and B (toxinotype 0, strain VPI 10463, ribotype 087), toxin B from a C. difficile toxin-B-only expressing strain (CCUG 20309), a precursor form of a B fragment of binary toxin, pCDTb, ribotype-specific whole surface layer proteins (SLPs; 001, 002, 027), and control proteins (tetanus toxoid and Candida albicans). During the experiment, microarrays are probed with sera from individuals with C. difficile infection (CDI), individuals with cystic fibrosis (CF) without diarrhea, healthy controls (HC), and from individuals pre- and post-IVIg therapy for the treatment of CDI, combined immunodeficiency disorder, and chronic inflammatory demyelinating polyradiculopathy. We encounter significant differences in toxin neutralization efficacies and multi-isotype specific antibody levels between patient groups, commercial preparations of IVIg, and sera before and following IVIg administration. Also, there is a significant correlation between microarray and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for antitoxin IgG levels in serum samples. These results suggest that microarray could become a promising tool for profiling antibody responses to C.difficile antigens in vaccinated or infected humans. With further refinement of antigen panels and a reduction in production costs, we anticipate that microarray technology may help optimize and select the most clinically useful immunotherapies for C. difficile infection in a patient-specific manner.

A Protein Microarray Assay for Serological Determination of Antigen-specific Antibody Responses Following Clostridium difficile Infection

This article describes a simple protein microarray method for profiling humoral immune responses to a 7-plex panel of highly purified Clostridium difficile antigens in human sera. The protocol can be extended for the determination of specific antibody responses in preparations of polyclonal intravenous immunoglobulin.

Bir Protein Mikroarray tahlil antijen spesifik antikor yanıt aşağıdaki Clostridium difficile enfeksiyon serolojik belirlenmesi için

We provide a detailed overview of a novel high-throughput protein microarray assay for the determination of anti-Clostridium difficile antibody levels in ...

Antimicrobial Synergy Testing by the Inkjet Printer-assisted Automated Checkerboard Array and the Manual Time-kill Method

As rates of multidrug-resistant (MDR) pathogens continue to rise, outpacing the development of new antimicrobials, novel approaches to treatment of MDR bacteria are increasingly becoming a necessity. One such approach is combination therapy, in which two or more antibiotics are used together to treat an infection against which one or both of the drugs may be ineffective alone. When two drugs, in combination, exert a greater than additive effect, they are considered synergistic. In vitro investigation of synergistic activity is an important first step in evaluating the possible efficacy of drug combinations. Two main in vitro synergy testing methods have been developed: the checkerboard array and the time-kill study. In this paper, we present an automated checkerboard array method that makes use of inkjet printing technology to increase the efficiency and accuracy of this technique, as well as a standard manual time-kill synergy method. The automated checkerboard array can serve as a high-throughput screening assay, while the manual time-kill study provides additional, complementary data on synergistic activity and killing.
The checkerboard array is a modification of standard minimum inhibitory concentration (MIC) testing, in which bacteria are incubated with antibiotics at different concentration combinations and evaluated for growth inhibition after overnight incubation. Manual performance of the checkerboard array requires a laborious and error-prone series of calculations and dilutions. In the automated method presented here, the calculation and dispensing of required antibiotic stock solution volumes are automated through the use of inkjet printer technology. In the time-kill synergy assay, bacteria are incubated with the antibiotics of interest, both together and individually, and sampled at intervals over the course of 24 h for quantitative culture. The results can determine whether a combination is synergistic and whether it is bactericidal, and provide data on inhibition and killing of bacteria over time.

Antimicrobial synergy testing is used to evaluate the effect of two or more antibiotics used in combination and is typically performed by one of two methods: the checkerboard array or the time-kill assay. Here, we present an automated, inkjet printer-assisted checkerboard array synergy technique and a classic time-kill synergy study.

Antimikrobiyal sinerji mürekkep püskürtmeli yazıcı yoluyla tarafından test otomatik Dama Tahtası dizi ve el ile zaman-kill yöntem

As rates of multidrug-resistant (MDR) pathogens continue to rise, outpacing the development of new antimicrobials, novel approaches to treatment of MDR ...

<meta charset="utf8"></head><body>Mycobacterium abscessus için Çift Raportör Kullanarak Yüksek Verimli Tarama Testi

Assay Development for High-Throughput Drug Screening Against Mycobacteria

Mycobacterium abscessus (Mab) infections are challenging to treat due to high intrinsic drug resistance, comparable to multidrug-resistant tuberculosis. Treatments are extremely ineffective and based on a multi-drug regimen, resulting in low patient compliance. Consequently, the scientific community is urged to identify new and effective drugs to treat these infections. One of the strategies employed to this end is drug repurposing - the process of identifying new therapeutic opportunities for existing drugs in the market, circumventing the time required to establish pharmacokinetic and safety profiles of new drugs. With most studies on drug development against Mab relying on traditional and time-consuming methods, an assay for high-throughput drug screening was developed against mycobacteria using an in house developed double-reporter strain of Mab. Using liquid-handling robotics, automated microscopy, and analysis, alongside in house developed double reporter strains, bacterial viability can be rapidly measured using two different readouts, luminescence and fluorescence, without adding reagents or performing any extra steps. This reduces time and variability between assays, a major advantage for high-throughput screenings. The described protocol was validated by screening a library of 1280 compounds. The obtained results were corroborated by the literature, with efficient detection of active compounds. Thus, this work fulfilled the aim of supplying the field with a new tool to help fight this extremely drug-resistant bacteria.

<meta charset="utf8"></head><body>Yazar Spotlight: M. abscessus Tedavilerinin Etkili Keşfi için Ölçeklenebilir İlaç Tarama Protokolü

This study developed an assay for high-throughput screening against Mycobacterium abscessus with a&#160;recently created double reporter strain, using fluorescence and luminescence to assess bacterial viability quickly. This protocol will be relevant for researchers aiming to screen new drugs against this drug-resistant bacteria.

Mikobakterilere Karşı Yüksek Verimli İlaç Taraması için Test Geliştirme

Mycobacterium abscessus (Mab) infections are challenging to treat due to high intrinsic drug resistance, comparable to multidrug-resistant tuberculosis. ...

Nitel ve Nicel Saptanması için Tahliller ve Protein Antimikrobiyal karakterizasyonu

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bir HS-MRM tahlil için Protein Biyofarmasötikler sıvı Kromatografi iyon hareketlilik QTOF kütle spektrometresi tarafından Host-hücre proteinleri miktar

İlaç-hedef Etkileşimleri ve Antibakteriyel Direnç Algılama Nanomekaniğe

Su Kaynaklı Antibiyotiğe Dirençli Bakterilerin İzolasyonu ve Tanımlanması ve Antibiyotik Direnç Genlerinin Moleküler Karakterizasyonu

Yüksek Verimli, gerçek zamanlı, Hücre içi Antimikrobiyal Aktiviteleri Çift okuma Test ve Ökaryotik Hücre Sitotoksisite

Yumuşak agar üst tabaka tekniği kullanımı bakteriyel olarak üretilmiş önleyici bileşiklerin taranması için

Bir Protein Mikroarray tahlil antijen spesifik antikor yanıt aşağıdaki Clostridium difficile enfeksiyon serolojik belirlenmesi için

Antimikrobiyal sinerji mürekkep püskürtmeli yazıcı yoluyla tarafından test otomatik Dama Tahtası dizi ve el ile zaman-kill yöntem

Mikobakterilere Karşı Yüksek Verimli İlaç Taraması için Test Geliştirme

Mikobakterilere Karşı Yüksek Verimli İlaç Taraması için Test Geliştirme

Mikobakterilere Karşı Yüksek Verimli İlaç Taraması için Test Geliştirme