Manuel dama tahtası dizi sinerji testi emek yoğun ve hata yatkın bir yöntemdir. Buna karşılık, otomatik mürekkep püskürtmeli yazıcı tabanlı dama tahtası yöntemimiz hızı, doğruluğu ve iş çıkışlığını önemli ölçüde artırır. Otomatik dama tahtası yöntemi, sinerjik kombinasyonlar için çok sayıda ilacın taranmasını mümkün kılarken, zaman öldürme yöntemi bu kombinasyonların etkinliğini doğrulayabilir ve daha fazla araştırabilir.
Yeni antibiyotik keşif direnç yayılmasına ayak uydurmak değildir, ancak sinerjik kombinasyonları soruşturma dirençli bakterileri tedavi etmek için mevcut ilaçların kurtarma için bir olasılık sunuyor. Biz antibakteriyel ile bu tekniği göstermek rağmen, aynı zamanda antimikrobiyallerin diğer sınıfları ile hatta kombinasyon ilaç veya bileşik test farklı türleri için kullanılabilir. Bu videoda, otomatik bir dama tahtası dizi yöntemi ve manuel zaman öldürme yöntemi ni gösteriyoruz.
Biz umut verici kombinasyonları belirlemek için ilk dama tahtası dizi çalışmaları gerçekleştirmek öneririz, daha sonra zaman öldürmek çalışmaları ile bu daha fazla araştırma. Başlamak için, kolistin ve minosikline antimikrobiyal stok çözümleri yapmak ve daha sonra eşlik eden metin protokolünde açıklandığı gibi stok çözümleri üzerinde kalite kontrolü gerçekleştirmek. Sonra, 12 milimetre-by-75-milimetre yuvarlak alt cam kültür tüpleri için% 0.9 sodyum klorür, tuzlu, yaklaşık bir mililitre ekleyin.
Bir gecede bir bakteri tabağından bir veya iki koloni seçin ve onları kültür tüplerine yerleştirin. Girdap tüpleryavaşça çözeltideki bakterileri askıya almak için. Bir McFarland okuyucu kullanarak bakteri konsantrasyonu kontrol edin.
0,5 McFarland bulanıklık okuma elde etmek için daha fazla tuzlu veya daha fazla bakteri ekleyerek konsantrasyonu ayarlayın. Daha sonra, 50 mililitrelik konik bir tüpte katyon ayarlı Mueller-Hinton suyu 30 mililitre süspansiyon 100 mikrolitre ekleyerek bakterileri 1-300 seyreltin mililitre başına beşinci koloni oluşturan birimler için beş kat 10 son hücre yoğunluğuna ulaşmak için. Şimdi, beraberindeki metin protokolü ile birlikte izleyerek baskı için antimikrobiyaller hazırlayın.
Protokolü kaydedin ve ardından sol üstteki Çalıştır düğmesine ve ardından Başlat düğmesine tıklayın. Plaka tutucuya 384 kuyuluk bir plaka yükleyin ve Load Plate 1 Synergy isteminin altına yüklendi'ye basın. Ardından, kaset yuvasına bir T8+kaset yerleştirin ve Yüklü bir T8+Kaset isteminin altına yükleyin.
İstenir edildiğinde, kasetüzerinde belirtilen rezervuarlara antibiyotik stok çözeltisi ekleyin. Her çözüm eklendikten sonra Dolgu düğmesine basın. D300 Dispenser her kuyuya uygun hacimlerde antibiyotik stoku ekledikten ve Run Completed kutusu göründükten sonra Kapat'ı tıklatın, plakayı çıkarın ve D300'u kapatın.
Daha sonra, steril bir reaktif rezervuar içine önceden hazırlanmış bakteriyel süspansiyon dökün. Dama tahtası dizisindeki tüm kuyulara süspansiyonun 50 mikrolitresini eklemek için çok kanallı bir pipet kullanın. Sonra, boş bir kuyuya bakteri olmadan katyon ayarlı Mueller-Hinton suyu 50 mikrolitre ekleyin.
Bu olumsuz kontrol iyi medyanın kısırlık onaylamak olacaktır. 35 derecelik bir ortam havakuluçkasında 16 ila 20 saat kuluçkaya yat. Testi analiz etmek için, eşlik eden metin protokolüile birlikte izleyin.
Zaman öldürme sinerji testi için, metin protokolünde açıklandığı gibi antimikrobiyal stok çözümlerini yeniden hazırlayın. Sonra, steril tuzlu test organizmanın 0.5 McFarland süspansiyon olun. Paslanmaz çelik kapaklı 25 ila 150 milimetrelik cam yuvarlak alt kültür tüpünde 5 mililitre CAMHB'ye 0,5 McFarland süspansiyonunun 100 mikrolitresini ekleyin ve yavaşça karıştırın.
Steril bir aşılama döngüsü kullanarak, izolasyon bir kan agar plaka üzerine seyreltilmiş süspansiyon bir damla çizgi, ve inoculum saflığını onaylamak için ortam havasında 35 santigrat derece plaka kuluçka. Tüpün kapanmasını değiştirin ve logaritma fazı büyümesine ulaşına kadar ortam havasında 35 santigrat derecelik bir çalkalayıcıüzerinde bir test tüpü rafına yerleştirin. İlk kültür kuluçka iken, beş otoklavcam kültür tüpleri katyon ayarlı Mueller-Hinton suyu 10 mililitre ekleyin.
Bir zaman öldürmek sinerji çalışması için, en az bir ilaç bireysel olarak büyüme eğrisi etkilemez bir konsantrasyonda olmalıdır. Bu sinerji çalışma dan önce bireysel ilaç konsantrasyonlarının etkileri nin değerlendirilmesi ile belirlenebilir. İlk tüpe, mililitre başına bir mikrogramlık son kolistin konsantrasyonu elde etmek için mililitre başına 10 mikrolitre kolistin stoğunu ekleyin, çünkü bu örnekte kullanılan gerinime karşı etkisiz bir konsantrasyondur.
İkinci tüp için, mililitre başına bir mikrogram son konsantrasyonelde etmek için bir miligram başına mililitre minosikline stok 10 mikrolitre ekleyin. Bu konsantrasyon, bu örnekte kullanılan suşa karşı da etkisizdir. Üçüncü tüpiçin, bir miligram başına mililitre minosikline stok 10 mikrolitre ve bir miligram-mililitre kolistin stok 10 mikrolitre ekleyin.
Bu, birinci ve ikinci tüplerde kullanılan kolistin ve minosikline ile aynıdır. Dördüncü ve beşinci tüplerde antibiyotik eklemeyin. Bu büyüme kontrolü ve negatif kontrol tüpleri, sırasıyla olacaktır.
Daha sonra, seri seyreltmeler için iki mililitrelik kuyulara sahip 96 derin kuyulu polipropilen plakayı, çok kanallı bir pipetle 1'den 4'e kadar olan sütunların B ile H'ye 900 mikrolitre steril tuzlu luk ekleyerek hazırlayın. Kültür logaritmik büyüme aşamasında olduğunda, shaker gelen kültür tüp kaldırmak ve yavaşça girdap. Süspansiyonun bir mililitresini 12'ye 75 milimetrelik cam kültür tüpüne aktarın ve yoğunluğu bir McFarland okuyucusuyla kontrol edin.
Yoğunluk 1.0 McFarland'dan azsa tüpü çalkalayıcıya geri döndürün ve daha uzun süre kuluçkaya yatırın. 1.0 McFarland'dan büyükse, tüpe katyonla ayarlanmış Mueller-Hinton suyu ekleyin, girdap yavaşça ve süspansiyon 1.0 McFarland olana kadar yeniden örneklenin. Başlangıç inokülü hazırlanırken kültürün logaritmik büyüme aşamasında olması önemlidir.
Bir organizmanın bu aşamaya ne zaman ulaştığını belirlemek için bir büyüme eğrisi oluşturabilirsiniz. Daha sonra, 1.0 McFarland süspansiyon100 mikrolitre ekleyin tüpler bir ile dört arasında, ve yavaşça girdap. Karıştırmadan hemen sonra ve bir, iki, dört, altı ve 24 saat, her kültür tüpünden 150 mikrolitrelik aliquot'u çıkararak tüpü yatırArak çıkarın, böylece aliquot çekilmesi sırasında steril pipet ucu tüpe değil, sadece steril pipet şaftına girsin.
Daha önce hazırlanmış 96 derin kuyu plakasının ilk satırında ardışık kuyulara sırasıyla aliquots ekleyin. Tüpleri, her zaman noktasında aliquots çıkardıktan hemen sonra 35 derecelik bir santigrat ortam hava kuluçka makinesi bir shaker bir test tüpü rafa dönün. Çok kanallı bir pipet kullanarak, plakanın A satırından 100 mikrolitre çıkarın ve 900 mikrolitre salin içeren B satırına ekleyerek bir ila 10 seyreltme oluşturur.
Pipet çözeltisi yukarı ve aşağı dört ila beş kez karıştırmak ve sonra ipuçlarını atın. İlk olarak, etiket Mueller-Hinton agar plakaları antibiyotik koşulları ve seyreltme ile kaplanacak. Daha sonra, ekstra uzun uçlu çok kanallı bir pipet kullanarak, damla plaka yöntemini kullanarak koloni sayıları için seyreltilmiş numuneleri plakalayın.
Birinci sütundaki her kuyudan 10 mikrolitre çıkarın ve uygun şekilde etiketlenmiş plakaya bir satır halinde dikkatlice dağıtın. Tüm satırlar plakalara dağıtılana kadar devam edin. Buna ek olarak, 24 saatlik zaman diliminde, negatif kontrol tüpünden doğrudan alınan 10 mikrolitrelik bir damlayı sterilite için test etmek için bunun için ayrılmış noktaya yerleştirin.
Sonra, tüm plakaları ters çevirin ve onları bir gecede 35 santigrat derecede ortam havasında kuluçkaya yatırın. Daha sonra, her alandaki koloni lerin sayısını sayın ve hücre yoğunluğunu hesaplayın. Çift sayma veya eksik kolonileri önlemek için plakanın ters inde ince uçlu kalıcı işaretli kolonileri işaretleyin.
Her seyreltme serisi için, üç ila 30 kolonileri ile damla tanımlayın. Bu damlalarda kolonileri sayın ve seyreltme faktörü ile birlikte sayısı kaydedin. Burada gösterilen bir dama tahtası dizi sinerji deneyi olan mililitre başına sıfır ile 32 mikrogram konsantrasyonlarında minosikline mililitre başına sıfır ila 16 mikrogram konsantrasyonlarında kolistin ile kombine edildi ve E.coli bir suş karşı test bir ızgara.
07'nin altındaki OD600 değerlerine sahip kuyular büyümeyi temsil etmez ve gölgeli kırmızıdır, yukarıda veya 07'ye eşit OD600 değerlerine sahip kuyular büyümeyi temsil eder ve gölgeli yeşildir. Her ilaç için, minimum inhibitör konsantrasyonu bakteri büyümesini inhibe ilaç en düşük konsantrasyonudur. Minosikline için, bu mililitre başına 32 mikrogram, ve kolistin için, mililitre başına sekiz mikrogram.
Gölgeleme burada tutulur, ancak büyümenin inhibe edildiği kuyular içindeki değerler kesirli inhibitör konsantrasyonu veya FIC, indeks değerleri ile değiştirilir. Her kuyuda, her ilacın FIC indeksi ilacın minimum inhibitör konsantrasyonu ile bu iyi antibiyotik konsantrasyonu bölerek hesaplanır. Sinerji için kesme olarak kabul edilir 0,5, daha az veya eşit bir FIC indeksi olan wells, kırık bir çizgi kenarlığı ile gösterilir ve en düşük FIC dizini ile kuyu kalınlır.
Minimum FIC değeri sinerjik aralıkta olduğundan, kombinasyon sinerjik olarak kabul edilir. Büyümenin inhibe edildiği minimum FIC indeksi 0,5'ten büyük olduğundan, sinerji göstermeyen bir durum örneği burada gösterilmiştir. Son olarak, bu örnekte, antibiyotik yüksek konsantrasyonlarda komşu kuyularda bakteri üreme varlığına rağmen, inhibe bakteriyel büyümeyi temsil eden birkaç atlanan kuyular oluştu.
Bir dama panosu dizisinde birden fazla atlanan iyi oluştuysa, sonuçlar atılmalıdır ve tahkikat yinelenmelidir. Zaman öldürme sinerji testinin sonuçlarını gösteren bir grafik örneği burada sunulmuştur. Zaman öldürme sinerji sinerji sinin yorumlanması yla ilgili ayrıntılar için lütfen eşlik eden metin protokolüne bakın.
Sinerjik kombinasyonların aktivitesi hakkında daha fazla bilgi farmakokinetik ve farmakodinamik değerlendirmeleri ve hayvan modelleri ile in vivo çalışmalar yoluyla elde edilebilir. Bakterilerle çalışırken her zaman kişisel koruyucu ekipman kullanımı da dahil olmak üzere uygun güvenlik prosedürlerini uygulayın. Aerosol ler üretiyor veya yüksek riskli patojenler kullanıyorsanız, tüm işleri biyogüvenlik kabininde gerçekleştirin.
