Joseph W. Ndieyira Mühendislik ve Fizik Bilimleri Araştırma Konseyi (EPRSC), Nanoteknoloji Disiplinlerarası Araştırma Merkezi (IRC), Royal Society (SC) ve Biano danışmanlık (BNC) tarafından desteklenmiştir. Biz, Alejandra Donoso Barrera, Dejian Zhou, Manuel Vögtli, Matthew Batchelor, Matthew A. Cooper, Torsten Strunz, Trevor Rayment ve yararlı tartışmalar için Gabriel Aeppli teşekkür ederim.

1. Sundurmalar hazırlanması <ol><li> Teflon cımbız batırmayın konsol fişleri seçilen numarasını kullanarak 20 dakika taze hazırlanmış bir piranha çözüm (oranı 1:1 de H 2 SO 4 ve H 2 O 2) içine (100 mikron genişliğinde ve 0,9 mikron kalınlığında uzun 500 mikron, ölçüm her konsol) . </li><li> Yaklaşık 20 dakika piranha çözüm konsol cips çıkarın ve deiyonize su ile iyice yıkayın ve hemen bir taze hazırlanmış piranha çözüm içine aktardıktan sonra. Cips aksi takdirde sonraki adıma geçin kir noktalar içeriyorsa yukarıda adım 1.1 tekrarlayın. </li><li> Deiyonize su içinde kapsamlı bir temizlik sonra, saf etanol ile yıkayın ve su izlerini kaldırmak için 75 ° C de bir ocak konsol cips kurulayın. Kendi temizlik onaylamak için bir optik mikroskop kullanarak bunları kontrol edin. </li><li> Bir buharlaşma odasına temizlenir konsol cips aktarmak ve aşağı pompa, bir vakum elde etmek için hedef10 -7 mbar basıncı. </li><li> Kalın 20 nm altın ek bir katman önce yapışma tabakası gibi davranır ilk 2 nm titanyum her konsol dizi gerekli vakum basıncı elde sonra, kat bir tarafı. Kendi kalınlığı onaylamak için, doğrudan hedef kaynak üzerine yerleştirilen kuvars kristali monitör kullanın. </li><li> Açmadan önce vakum altında soğumasını 1-2 saat için odasında altın kaplamalı konsol sensör cips bırakın. </li><li> Kirlilikler herhangi bir biçimde önlemek için argon ile doldurulan bir vakum depolama kabına taze buharlaştınldı çipsi. </li></ol> 2. Konsol Chip fonksiyonlandırmalar <ol><li> İlk olarak, 250 mikron konsol adım büyüklüğüne göre 2 bir işlevsellik sahnede mikro-kılcal tüpler düzenlemek. </li><li> Daha sonra yüzey hedef moleküller, 2 mM tiol etanolik çözeltiler, örneğin, bakteriyel mucopeptides (D-Ala, D-Lac) enjekte edilir, ve bir &#39;içi özelT &#39;alkantiyol biyomoleküler adsorpsiyon karşı bilinen trietilen glikol (PEG) sonlanan. 16 kılcal boruların her kullanıcı önyargı önlemek için rastgele belirlendi karışık bir yüzey yakalama molekülü içermelidir. </li><li> Mikrokapilerler 20 dakika konsol için sonraki inkübe yüzey yakalama molekülleri içeren tiyol çözümleri ile dolu. Yüzey yakalama moleküllerinin çözümleri çapraz kontaminasyon önlemek veya en aza indirmek için her bir konsol sensör üzerine sınırlı emin olun. Bu proses doğru kullanılması halinde ise, bu sistematik reseptörleri olarak altın kaplanmış yüzeylerinde bakteriyel mukopeptid hedeflerin SAM&#39;lere izin oluşan kimyasal olarak aktif sensör içine taze hazırlanmış altın kaplamalı konsol değiştirmek gerekir. </li></ol> 3. Solüsyon preparasyonlarda <ol><li> Saf su (M 18.2 cm · direnç) ve karışım t 0.1 M mono-ve di-bazik sodyum fosfat tuzları çözülür7.4 pH değeri verim o. </li><li> Cam için ilaç moleküllerinin non-spesifik etkileşimler neden toplama etkilerini en aza indirmek için tamponlu çözümler PS80 0.002% ekleyin. </li><li> Kd hesaplanması sağlayacak istenen farklı konsantrasyonları ile taze tamponlu çözeltiler olan ilaçların seyreltin. </li><li> 0.2 mikron filtreler kullanılarak taze hazırlanmış ilaç çözeltileri filtre ve argon ile tasfiye işleminden önce oda sıcaklığında 5 dakika boyunca sonikasyon. </li><li> Bütün serum kullanarak tamponlu serum ilaç ile aynı işlemi tekrarlayın. Tam çözünürlük sağlamak için ek 5 dakika ile 15 dakika boyunca yavaşça karıştırın. </li></ol> 4. Yüzey Stres Algılama <ol><li> Bir sıvı akış hücresi odasına bir Fonksiyonlu konsol sensör çipi yükleyin. </li><li> Her bir sensörün serbest ucu üzerine lazer nokta hizalama ve 1 ° C ve sıvı haznesi ısıtılarak uyumunu teyit Tüm sekiz altın kaplamalı konsol sensör dizileri kapsamlı yapılmalıdırssive aşağı çünkü silikon ve altın genişleme oranlarındaki farklılıklar nedeniyle termik etkisi bükme. </li><li> Yaklaşık olarak 10 dakika için ısıtmadan sonra, konsollar daha 10 dakika boyunca soğumaya bırakın. </li><li> Bükme sinyallerinin görece standart sapma ≤% 5 daha sonra, başka süreç tekrar arzu edilen hizalama kabul olan bireysel konsol sensörleri arasında ise, en yüksek bükme sinyalleri de bükme varyasyon hesaplayın. </li><li> Daha sonra, tüm sekiz konsol en rezonans frekansları kendi yay sabitleri hesaplamak için ölçün. Bir çip içinde her konsol sensörü arasında sürekli yayın değişimi ≤ 1% sonra tutarlı mekanik özellikleri aksi konsol çip sensörünü değiştirin sahip olarak çip kabul ise. </li><li> Daha sonra, otomatik bir veri toplama LabView çok kullanılarak elde edilmelidir ise akış hücresi içinde bulunan sıvı değişimi elde etmek için bir altı yollu vana vasıtasıyla bir akışkan sistemi (Model Genie Plus) kullanmakftware. </li><li> Büküm verilerini konsol izlemek için aşağıdaki ölçüm protokolleri kullanın: i) bir temel kurmak için 5-30 dakika süren kontrolü ölçümü için ilaç olmadan tampon çözelti veya serum ya enjekte ii) 30-60 dakika için ilaç çözüm enjekte iii) bağlı ilaç kompleksi ayırmak için 10-60 dakika 10 mM HCl yıkama enjekte; iv) son olarak yüzey peptidler yeniden ve temel sinyal geri yüklemek için başka bir 5-30 dakika tampon çözeltisi kullanarak daha yıkama adım enjekte. Her zaman tüm sinyaller 30-180 ul / dk &#39;lık sabit bir sıvı akış hızı altında bir sıcaklık kontrollü kabin içinde 25 ° C arasında sabit bir sıcaklıkta elde edilir olduğundan emin olun. </li><li> Tüm sekiz konsol en mutlak bükme sinyalleri tek bir pozisyonu hassas dedektör ile optik ışın yöntemi çoğaltılmış seri zaman kullanarak izlenmelidir. </li><li> Ilacın her bir konsantrasyonu arasındaki bükme sinyalleri analiz edilmesi için, sonuçtaki diferansiyel bükümler diferansiyel bir gerilme dönüştürülürStoney denklemi kullanarak konsol üst ve alt taraf arasında s. </li></ol>

<ol>
	<li>Ndieyira, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanomechanical+detection+of+antibiotic-mucopeptide+binding+in+a+model+for+superbug+drug+resistance.">Nanomechanical detection of antibiotic-mucopeptide binding in a model for superbug drug resistance.</a> Nat. Nanotech. 3, 691-696 (2008).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+label-free+nanomechanical+detection+of+biomarker+transcripts+in+human+RNA.">Rapid and label-free nanomechanical detection of biomarker transcripts in human RNA.</a> Nat. Nanotech. 1, 214-220 (2006).</li><li>McKendry, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+label-free+biodetection+and+quantitative+DNA-binding+assays+on+a+nanomechanical+cantilever+array.">Multiple label-free biodetection and quantitative DNA-binding assays on a nanomechanical cantilever array.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 9783-9788 (2002).</li><li>Wu, G., Datar, R. H., Hansen, K. M., Thundat, T., Cote, R. J., Majumdar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioassay+of+prostate-specific+antigen+(PSA)+using+microcantilevers.">Bioassay of prostate-specific antigen (PSA) using microcantilevers.</a> Nat. Biotech. 19, 856-860 (2001).</li><li>Fritz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translating+biomolecular+recognition+into+nanomechanics.">Translating biomolecular recognition into nanomechanics.</a> Science. 288, 316-318 (2000).</li><li>Dwyer, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic-induced+bacterial+cell+death+exhibits+physiological+and+biochemical+hallmarks+of+apoptosis.">Antibiotic-induced bacterial cell death exhibits physiological and biochemical hallmarks of apoptosis.</a> Mol. Cell. 46, 561-572 (2012).</li><li>Kohanski, M. A., Dwyer, D. J., Wierzbowski, J., Cottarel, G., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mistranslation+of+membrane+proteins+and+two-component+system+activation+trigger+antibiotic-mediated+cell+death.">Mistranslation of membrane proteins and two-component system activation trigger antibiotic-mediated cell death.</a> Cell. 135, 679-690 (2008).</li><li>Kahne, D., Leimkuhler, C., Wei, L., Walsh, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycopeptide+and+lipoglycopeptide+antibiotics.">Glycopeptide and lipoglycopeptide antibiotics.</a> Chem. Revs. 105, 425-448 (2005).</li><li>Williams, D. H., Maguire, A. J., Tsuzuki, W., Westwell, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+the+origins+of+a+cooperative+binding+energy+of+dimerization.">An analysis of the origins of a cooperative binding energy of dimerization.</a> Science. 280, 711-714 (1998).</li><li>Bugg, T. D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular-basis+for+vancomycin+resistance+in+enterococcus+faecium+BM4147-+biosynthesis+of+a+depsipeptide+peptidoglycan+precursor+by+vancomycin+resistance+proteins+VanH+and+VanA.">Molecular-basis for vancomycin resistance in enterococcus faecium BM4147- biosynthesis of a depsipeptide peptidoglycan precursor by vancomycin resistance proteins VanH and VanA.</a> Biochem. 30, 10408-10415 (1991).</li><li>Neu, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crisis+in+antibiotic+resistance.">The crisis in antibiotic resistance.</a> Science. 257, 1064-1073 (1992).</li><li>Walsh, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+that+confer+antibacterial+drug+resistance.">Molecular mechanisms that confer antibacterial drug resistance.</a> Nature. 406, 775-781 (2000).</li><li>Xu, J., Li, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemistry+of+self-assembled+long-chain+alkanethiol+monolayers+on+gold.">The chemistry of self-assembled long-chain alkanethiol monolayers on gold.</a> J. Colloid Interface Sci. 176, 138-149 (1995).</li><li>Wink, T., van Zuilen, S. J., Bult, A., van Bennekom, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembled+monolayers+for+biosensors.">Self-assembled monolayers for biosensors.</a> Analyst. 122, 43-50 (1997).</li><li>Cho, Y. R., Entress, R. M., Williams, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+cell-wall+analogues+of+vancomycin-resistant+enterococci+using+solid+phase+peptide+synthesis.">Synthesis of cell-wall analogues of vancomycin-resistant enterococci using solid phase peptide synthesis.</a> Tetrahedron Lett. 38, 5229-5232 (1997).</li><li>Prime, K. L., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembled+organic+monolayers+-+model+systems+for+studying+adsorption+of+proteins+at+surfaces.">Self-assembled organic monolayers - model systems for studying adsorption of proteins at surfaces.</a> Science. 252, 1164-1167 (1991).</li><li>Rotschafer, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacokinetics+of+Vancomycin:+Observations+in+28+Patients+and+Dosage+Recommendations.">Pharmacokinetics of Vancomycin: Observations in 28 Patients and Dosage Recommendations.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 22, 391-394 (1982).</li><li>Cooper, M. A., Fiorini, M. T., Abell, C., Williams, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+vancomycin+group+antibiotics+to+D-alanine+and+D-lactate+presenting+self-assembled+monolayers.">Binding of vancomycin group antibiotics to D-alanine and D-lactate presenting self-assembled monolayers.</a> Bioorg. Med. Chem. 8, 2609-2616 (2000).</li><li>Rao, J., Yan, L., Xu, B., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+surface+plasmon+resonance+to+study+the+binding+of+vancomycin+and+its+dimer+to+self-assembled+monolayers+presenting+D-Ala-D-Ala.">Using surface plasmon resonance to study the binding of vancomycin and its dimer to self-assembled monolayers presenting D-Ala-D-Ala.</a> J. Am. Chem. Soc. 121, 2629-2630 (1999).</li><li>MacBeath, G., Schreiber, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Printing+Proteins+as+Microarrays+for+High-Throughput+Function+Determination.">Printing Proteins as Microarrays for High-Throughput Function Determination.</a> Science. 289, 1760-1763 (2000).</li><li>Baller, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cantilever+array-based+artificial+nose.">A cantilever array-based artificial nose.</a> Ultramicroscopy. 82, 1-9 (2000).</li><li>Burg, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Weighing+of+biomolecules,+single+cells+and+single+nanoparticles+in+fluid.">Weighing of biomolecules, single cells and single nanoparticles in fluid.</a> Nature. 446, 1066-1069 (2007).</li><li>Lahiri, J., Isaacs, L., Tien, J., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+strategy+for+the+generation+of+surfaces+presenting+ligands+for+studies+of+binding+based+on+an+active+ester+as+a+common+reactive+intermediate:+A+surface+plasmon+resonance+study.">A strategy for the generation of surfaces presenting ligands for studies of binding based on an active ester as a common reactive intermediate: A surface plasmon resonance study.</a> Anal. Chem. 71, 777-790 (1999).</li><li>Nugaeva, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromechanical+cantilever+array+sensors+for+selective+fungal+immobilization+and+fast+growth+detection.">Micromechanical cantilever array sensors for selective fungal immobilization and fast growth detection.</a> Biosens. Bioelectron. 21, 849-856 (2005).</li><li>Von Muhlen, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+biomarker+sensing+in+undiluted+serum+with+suspended+microchannel+resonators.">Label-free biomarker sensing in undiluted serum with suspended microchannel resonators.</a> Anal. Chem. 82, 1905-1910 (2010).</li><li>Godin, M., M, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+buoyant+mass+to+measure+the+growth+of+single+cells.">Using buoyant mass to measure the growth of single cells.</a> Nat. Methods. 7, 387-390 (2010).</li><li>Mertens, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+gas+trace+of+hydrofluoric+acid+using+microcantilever.">Detection of gas trace of hydrofluoric acid using microcantilever.</a> Sens. Actuators B Chem. 99, 58-65 (2004).</li><li>Porter, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+solidstate+sensor+platform+for+the+detection+of+hydrogen+cyanide+gas.">A solidstate sensor platform for the detection of hydrogen cyanide gas.</a> Sens. Actuator B Chem. 123, 313-317 (2007).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan edilir

Bu sonuçlar konsol dizi sensörler özellikle ilacın bağlama cebinden tek bir H-bağının silinmesi ile ilgili vankomisin direnci ilaç-hedef bağlayıcı etkileşimleri değişiklikleri algılamak ve ölçmek için hassas olduğunu göstermektedir. Daha önceki Yüzey Plazmon Rezonans (SPR) çalışmaları 18,19 ile anlaşarak Van bir nanomolar algılama hassasiyeti göstermek ve rutin klinik pratikte uygulanan konsol yöntemi doğrudan klinik konsantrasyonlarda kandaki ilaç molekülleri tespit ve sayısal olarak ortaya koymaktadır. Verilerimiz ayırıcı yüzey gerilimi, yani (i) belirli bir ilaç-bağlayıcı olayları hedef ve arasındaki mekanik bağlantı açıklayan (ii) geometrik terimi açıklayan bir kimyasal terimi kimyasal olarak tepkimeye giren bir ürün formu, denklem (1) ile tarif edilebilir olduğunu göstermektedir yüzey siteleri, ima bu küresel mekanik ayıracak bir yerel kimyasal etkileşimlerkonsol al etkileşimleri. Kimyasal terimi klasik Langmuir adsorpsiyon izotermi tarafından verilir iken, geometrik terimi, ecza-hedef indüklenen gerilim değişikliklerin bir percolative mekanizması ortaya koymaktadır. Nispeten geniş bir yüzey kısmını antibiyotik molekülleri tarafından işgal edildiğinde kritik eşik bilgisayar ~% 10 (Şekil 5), bu yüzey gerilimi gösteren, bükme ayırıcı konsol tespit etmek için gerekli olan toplu transduse edilmiştir. P ≥ pc, kimyasal dönüşüm yüzeyi siteler arasında mekanik bağlantı yavaş yavaş kurulur ve bu nanomechanical ağ düğümleri arasında sterik etkileşimler gibi kısa menzilli itici etkileşimleri tüm konsol aşağı bükme artan yol açmaktadır. Bizim nanomechanical sızma modeli gerçek bakteri eylem glikopeptid antibiyotik modunda önemli bir rol oynayabileceği düşünülmektedir edilir. Bu bulgular s konsol teknolojisi yüksek hassasiyet vurgulamakeylem antibiyotik &#39;modu tudying ve Superbug enfeksiyonların sorunları kontrol etmek için güçlü ilaçların keşfi bilgilendirmek ve etkinleştirmek için nano-ölçekte antibiyotik operasyonların anlayışı geliştirmek için ilaç eğitim için yeni bir araştırma aracı temsil eder. Tekrarlanabilir ve hassas ölçümler için konsol sistemi hazırlamak için, biz özellikle mikroakışkan hücre ve nicel nanomechanical tespitlerde sağlamak için standart çalışma prosedürleri örnek yükleme için, protokol hedeflere bir dizi ele var. Mevcut yöntemlere göre konsol teknolojinin önemi Özetle biz bu teknolojiyi daha 25 yıl önce önerilen iken, çünkü tıbbi ilgili hedefler dikkatli ve tekrarlayan ölçümlerin eksikliği kliniğe yolunda bulamadı olduğunu işaret etmektedir. Burada mekanik araştırmak için nanomechanical konsol kullanarak alaka kurmak prosedürleri ortayabakteriyel hücre duvarı ile ilgili hedefleri ve antibakteriyel direncini tespit etmek için antibiyotik etkisi ark. Geleneksel ilaç tarama yöntemleri, çoğunlukla, bir rekabetçi ya da enzimatik bağlanma deneyi ve protein ölçümleri 20 ile bağlantılı olarak, hedef bir analitin bağlayıcı ölçmek için bir raportör molekülün flüoresan ya da radyoaktif etiketleme bazı tip gerektirir. Biyomoleküllerin etiketleme sadece zaman alıcı ve pahalı ama etiketi de yanlış negatif yol, bağlanma yeri engelleyerek moleküler etkileşim engelleyebilir. Buna ek olarak, floresan bileşikler genellikle arka plan bağlayıcı ve yanlış pozitif yol açabilir hidrofobik vardır. Bu sınırlamaları nedeniyle, hemen her moleküler kompleks az Analiz geliştirilmesi ile taranmalıdır izin yeni etiket-ücretsiz teknikleri artan bir ilgi var. Şu anda en köklü etiket-serbest yüzey teknolojileri SPR ve Kuvars kristal mikroterazi (QCM) bulunmaktadır. SPR aksine ölçen inciE dielektrik sabiti, bir etiket - serbest konsol teknolojisi doğrudan yüzeyi reseptörlerine ligandların spesifik bağlanması yoluyla oluşturulan nanomechanical kuvvetleri ölçebilen bir ligand-reseptör etkileşimi tarafından oluşturulan yüzey gerilim tespit eder. Bu sensörlerin teklik teknoloji benzersiz çalışma uygun hale duyarlılıklarını SPR ve QCM içinde değil düzlem yüzey stres bir minutest bağlı değişikliği olarak bağlayıcı analit nedeniyle kitle değişiklik nedeniyle dielektrik özellikleri dayanmaz olduğunu klinik antibiyotik konsantrasyonu (3-27 uM), 17 ilaç moleküllerinin nanomekanik. Konsol, özellikle de büyük ölçüde ilaç endüstrisinin temelidir ve bu nedenle ilaç keşfi tamamlayıcı bir araç olarak hizmet verecek karmaşık ortamlarda dahil olmak üzere fizyolojik koşullar altında küçük molekül (örneğin DNA parçaları ve ilaçlar gibi) tespit için uygundur. Konsol teknolojisi başarıyla uygulanmıştırgenomik 3,5 alanları, gaz algılama 21, proteomik 22, ve uyuşturucu 1. Ayrıca, konsol düşük maliyetli silikon teknolojisi ve mikroimalat süreçleri ile uyumluluk nedeniyle kullanılarak imal edilir, konsol çoklu ilaç bileşik tarama ve daha yüksek verim bilgi açısından zengin bir tarama deneyleri için sensörler Büyük diziler içine gelişmiş hassasiyet ve paralelliğini için minyatür olabilir. Enstrümantasyon ve deneysel tasarım gelişmeler etkileşim geniş bir yelpazede dirençli enfeksiyonlar çoklu ilaç sorunları çözmek için superdrugs bir yeni nesil için arama ilerlemek için gerçek zamanlı olarak analiz olmasını sağlayacaktır. Protokol içinde kritik adımlar Sağlam ölçüm protokolleri gelişimi bu teknolojinin uygulamaları merkezidir. Tatmin edici niceliksel ecza-hedef karşılıklı ölçümler elde etmek için ve t antibiyotikler en düşük konsantrasyonunu belirlemek içinşapka protokol içinde serum, kritik adımlar ele alındı ​​tampon ya da kanda tespit edilebilir. İlk görev ayar ve konsol tespit özgüllük ve duyarlılık geliştirmek için yüzey yakalama kimyaları optimize içerir. Şüphesiz, yüzey stres iletimi kimyasal reaktif bölgeler arasında bağlantı kurmak için örtülü olması yüzeyin nispeten büyük bir kısmını gerektiren, kolektif bir olgudur. Biz temel yüzey peptidlerin yoğunluğu, kritik bir eşik değiştirerek ~ p ≥ 10%, kararlı olduğunu göstermek nerede bir peptid yoğunluk fonksiyonu ve aksi takdirde sıfır (Şekil 5) olarak yüzeye stres ölçeği. Bu deneyler hassas ölçümler için maksimum sinyal sapmaları sağlamak için konsol birlikte stresin tekdüzelik araştırmak için tasarlanmış olması önemlidir. Buna ek olarak, verimli yüzey yenilenme protokolleri böylece birden fazla çevrim ölçümleri sağlayan, yerde olmak ve her tes için maliyetleri azaltmak gerekirt. Thiolated hidrofobik uç kullanarak bir reseptör yüzey tasarımı yaparken, aralarındaki reseptör molekülü ve aralık yönünü molekülleri arasındaki Van-der-Waals etkileşimleri nedeniyle yoğun ambalaj kendinden montaj non-spesifik etkileşimler en aza indirmek için izin vermek önemlidir. Ayrıca, yakalama molekülleri algılayan matrisin bir kısmı kaplanmış altın yüzeyi ile doğrudan reaksiyona analitik çözelti moleküllerin yerleştirilmesi önlemek için hidrofilik olacak şekilde izin veren bir polietilen glikol (PEG) bağlayıcı içermelidir. PEG bağlayıcı molekülleri ayırıcılar sterik kısıtlamaları azaltmak ve bu nedenle çözüm analitleri ölçülebilir yüzey gerilimi değişimi ikna etmek için yüzey reseptörleri ile özellikle etkileşim izin verecek şekilde hareket etmelidir. Konsol dizi sensör yerinde referans ölçüm en az bir ile test ve gerçek zamanlı olarak görüntülenen sinyal bir diferansiyel sapma olduğunu, s referans konsol mutlak sapma çıkarılarak alınmalıdırkonsol Ensing. Bu nedenle, bir referans konsol, sıcaklık değişimleri, kırılma indeksi veya konsol işlevselleştirilmemiş alt etkileşimlerin değişiklikler gibi spesifik olmayan etkileşimleri için hesap için gereklidir. Bu sıvıların verimli değişimi ve çözüm malzeme yeterli bir sabit kütle transferi sağlar çünkü akış oranı (~ 30-150 ul / dak) optimizasyonu protokolü içinde kritik bir adım oluşturur. Bir sıvı hücrenin tasarım hızlı akış oranları için uygun hacim (5-80 ul) toplu taşıma sınırlamaları aşmak için mükemmel bir sıvı alışverişi sağlamak için izin vermelidir. Kinetik ölçümleri gerçekleştirilirken 23 akış hızı özellikle önemlidir. Büyük hacimli sıvı odaları gereksiz yere testinin fiyat artışları büyük örnek hacmi gereksinimleri, yol kontrol edilemeyen yüksek debi gerektirir. Daha önce ölçüm sıvı odasına farklı örnekleri enjekte etmek için yerçekimi akışı kullandık. Yerçekimi akış avantajı vardır o doein herhangi bir mekanik parça gerektirir ve bu nedenle de sisteme ilave gürültü getirmemektedir. Ancak, önemli bir dezavantaj sadece nispeten yüksek akış oranları (~ 200 ul / dk) güvenilir çalışır. Açıkçası, daha düşük bir akış hızı (≤ 1 ul / dak) birim zamanda sınırlı örnek hacmi gerektirir ama diğer taraftan tepkileri çok daha yavaş yapar ve dolayısıyla daha uzun temas süresi gerektirir. Bu giriş ve örnek çözümler, deney sırasında tüketildiği kadar azalır çıkış arasındaki yükseklik farkı bağlıdır gibi Ayrıca, yerçekimi akışı, akış hızı büyük fark vardır. Yerçekimi akış problemleri önlemek için, bir enjektör pompası kullanılabilir olmalıdır. Bir şırınga pompası kullanılarak bir avantajı, bu deneyler, daha kontrollü bir ortamda gerçekleştirilebilir sağlayan uzun bir süre boyunca sabit bir akış hızı sağlar olmasıdır. Protokolün Sınırlamalar Bir tekrar üretilebilir elde önemli bir sorunKonsol sensörler kullanılarak D belirli biyolojik algılama reseptör tabakanın özellikleri biyokimyasal olarak &quot;aktif&quot; ve her deney için tek biçimli olduğu sağlanmasında yatar. Deneysel Başarının sırrı yönlendirmek onların aktif yapısındaki reseptör moleküllerine bağlayıcı kimyaları ile standart bir temizlik ve immobilizasyon protokolü ile sensör çipi dikkatli bir ön bulunmaktadır. Mevcut kurulum, bazı dezavantajları tabi olabilir ve bazı durumlarda sorunlu olabilir küçük cam kılcal damarlar, kullanarak konsol diziler işlerlik. Bu cam kılcal iki ucu da açık olan ve bu nedenle örnek çözücüler kolayca buharlaşabilir. Fonksiyonlandırılması kademesinin sıcaklığı doğru bir şekilde kontrol edilmez, etanol gibi bir uçucu çözücü kullanıldığı zaman, örneğin, buharlaşma oranı farklı zamanlarda önemli ölçüde değişebilir. Bir konsol diğerine g inkübasyon süresi hafif varyasyon olasılığı vardıralgılama sıvı kılcal damarların içine ardışık yüklenecek olduğunu iven. Kılcal fonksiyonlandırma diğer sınırlayıcı faktör konsol her zaman tam olarak aynı şekilde kılcal damarlar içine yerleştirildiğinden emin olmak için yeteneğinin olmaması. Ayrıca, bazen çıkma sıvı örnekler çip gövde üzerine akabilir olarak çapraz kontaminasyonu önlemek için kılcal hafifçe dışarı çekilebilir gerekir. Biz kat konsol için alternatif yüzey kaplama işlemi olarak mürekkep püskürtmeli gözlemcisi kullanılarak bu sorunları çözebilir. Bu büyük diziler için ölçekleme imkanı ile örnek kaplama tam kontrolü sağlayacak ise, en yaygın dezavantajı konsol üzerine yatırılır küçük damla saniye içinde buharlaşması olabilir ve kontrollü bir nem ortamı gerektirir. Bu nedenle, inkübasyon süresi, bazı uygulamalar için uygun olabilir, kolayca ayarlanamaz. Bu örnek vo gibi faktörlerin ince etkileşimilume, inkübasyon süresi ve buharlaşma oranı işlevsellik örnek konsol maruz kalma üzerinde doğrudan etkisi vardır ve reseptör moleküler yoğunluğu herhangi bir küçük değişiklik konsol üzerinde büyük bir etkisi olacak gibi bakım konsol deneyleri için optimize edilmiş yüzey kimyaları sağlamak için alınması gereken yanıtı. Deneysel tasarım değişiklikleri (örneğin alternatif teknikleri ve malzemeleri) Konsol teknolojisinin gelecekteki gelişimi için tekrarlanabilir kaplama işlemi elde önemli bir sorun üstesinden gelmek için, farklı stratejiler mikroakışkan kanallarda entegre konsol kullanmak istiyorsunuz gereklidir. Fikir bu özel konsol cips kanalları ayrı ayrı ele alınmaktadır yerinde işlevsellik işlemleri online izin her konsol kendi kanalı içine yerleştirilir şekilde tasarlanmalıdır olduğunu. Bu deneysel tasarım değişiklikleri kaplama işlemi gerçekleştirmek için izin verecekçözücü maruz kalma tam inkübasyon süresi ve konsol cips yakalama moleküllerin otomatik immobilizasyon için debi tarafından izlenen bir kontrollü ve kapalı bir ortamda ed. Aynı kanal daha sonra tüm konsol aynı analit çözeltisine maruz kalabileceği, gerçek bağlama deneyleri için kullanılabilir. Konsol işlevsellik prosedürü yanı sıra, konsol okuma mekanizması da geliştirilmesi gerekir. Optik ışın saptırma yöntemi son derece hassas ve uzun yıllar Atomik Kuvvet Mikroskobu (AFM) teknolojisi başarıyla kullanılmaktadır. Bununla birlikte, serbest duran konsol sensör uygulamaları için optik okuma bazı dezavantajları vardır, örneğin bu tür kan gibi opak sıvılarda ölçüm izin vermez, lazerler bir dizi uyum zaman alıcı ve sıkıcı olabilir ve geçerli yapılandırma ayırt edemez eğerek ve dikey sapmaları arasında. Böylece cantilev gelecekteki gelişimier teknoloji genel sensör tasarımı (örneğin konsol geometri) ve alanları ve laboratuvar ortamlarında hem sağlam ölçüm protokolleri için konsol okuma yönlerini dikkate almak gerekir. Manalis ve arkadaşları 22 cihaz yüksek kalite faktörleri ile bir vakum ameliyat olmak için izin, konsol kiriş entegre edilmiş bir mikroakışkan kanal var içi boş konsol sensörler roman türleri geliştirdik. Bu modda, konsol mikro 22 olarak hareket ve bu nedenle bir nedenle yakalama molekülleri fiziksel olarak tutulmuş olabilir veya kovalent silikon doğrudan bağlı, genellikle SAMs veya silanlar ile, işlevsellik açısından iki taraf arasında asimetri olması artık gerekli değildir 24. Konsol aynı zamanda daha sonra biyokimyasal algılama için antikor 25 ile birleşmiş olan ince bir polimer tabakası ile modifiye edilebilir. Sorun Giderme Ortak bir prokonsol ölçümleri ile ilgili blem mikroakışkan akış hücresi içine hava kabarcıklarının giriştir. Bakım çip montaj sırasında hava kabarcıkları sıvı hücre içine tanıtıldı sağlamak için alınmalıdır. Sinyal sürüklenen de numunelerin sıcaklık farklılıkları nedeniyle başka bir yaygın bir sorundur. Konsol ölçümler yapılmaktadır önce stabilize etmek için dengelenmiş olmalıdır. Konsol cihaz tüm çözümleri aynı sıcaklıkta olmasını sağlamak için gibi tüm tamponlar, analit ve yenilenme çözümleri aynı odada saklanmalıdır. Şırınga pompası çok hassas ve son derece düşük akış oranları sağlar, ancak bu genel olarak konsol ölçümleri mekanik gürültü ile ilişkilidir. Bu sapma sinyalleri gereksiz gürültü önlemek için basit ve etkili bir gürültü düşürücü hazırlamak için önemlidir. Gürültü azaltıcı bir şırınga pompası ve t emer sıvı hücre arasında yer alan küçük bir sıvı haznesi oluşmaktadırpompadan o mekanik gürültü. Çünkü optik dedektörün hassas doğası, konsol ölçüm sistemi ideal optik okuma sistemi ile müdahale herhangi bir sokak ışıkları engellemek için kapalı bir kurulumunda çalıştırılmalıdır. Yıkama adımları, çok sayıda sensör çip süresi sınırlayıcı konsol üzerinde gerçekleştirilir, buna ek olarak, algılama tabakalarının kalitesi önemli ölçüde azaltabilir. Mastering sonra alternatif veya gelecekteki uygulamalar bu tekniği Bir amino-ya da karboksil grubu ile sonlanan SAM&#39;lere ile kaplanmış konsol pH sensörü olarak kullanılabilir. Fonksiyonel uç gruplarının protonlamak veya Proton çözeltinin pH değerine bağlı olarak, 24 bükmek için konsol açan bir yüzey yükü oluşturabilir. Konsol sensörler yaşam bakteri 1,6,7 ve hücre duvarının istikrarsızlık ile ilgili ilaç-hedef etkileşimleri izleyebilirsiniz, bu nedenle yardımcı olacaktır göz önüne alındığındaarama ve ilaca dirençli enfeksiyonları ile mücadele için antibiyotik, yeni nesil gelişimi için. Hassas terazi kütle ve tek hücre 26 büyüme oranları ölçmek için gelecekteki konsol olarak kullanılacak. Konsol teknolojisi farklı büyüme faktörleri veya ilaçlara hücresel yanıtların çalışma için yararlı olacaktır. Ayrıca, tıp ve nokta-of-bakım uygulamalarında hemen ilgisi birden fazla biyolojik hızlı algılama, için yeni bir araç sunacak. Çok yönlülük, küçük boyutlu, ve konsol sensörler sağlamlığı göz önüne alındığında, zararlı çevresel faktörlerin hassas bir monitör oluşturacak. Onlar zaten böyle hidroflorik asit 27 veya hidrojen siyanür 28 olarak çevreye laboratuar ve endüstriyel üretim birimleri, kaçıp zehirli ve zararlı gazlar saptanmasında duyarlılık göstermiştir.

Biyoloji ve tıp moleküler tanıma paradigma destekleyen büyük boşluklar. Farmakoloji, örneğin hedef bu transglycoslyation veya bakteriyel hücre duvarı peptidlerin çapraz katalize transpeptidasyon bir biyokimyasal sürecin önemli bir katılımcı hedefleyerek bir patolojik yolu ile müdahale etmektir. Ilaç tasarım bu nedenle mükemmel bir uyum başlatmak için spesifik bir bakteriyel yerleştirme Alanı hedef için uygun bir molekül tanımlayan düşürülür. Bu yaklaşımın başarısı taklit Klasik bir örnek peptidoglikan hücre duvarı, bir bakteri bir korunmuş yapısal özelliği hedef vankomisin (Van), olduğunu. Oluşmakta olan bir Gram-pozitif bakterinin, peptidoglikan matriks dizisi D-Ala adlandırılan burada C55 lipit bağlayıcı 8-10 ile gergin Lisin-D-Alanin-D-Alanin, sonlanan peptidler oluşur. Peptidoglikan öncüleri bu maruz peptidler için temel olansert çevresel güçlerine karşı bakteri hücrelerinin mekanik koruma ve daha önemlisi, bunların antibiyotik ilaçlar için ideal hedefler haline insan hücrelerinde bulunan değildir. Van özellikle orta güçte bir Van-peptid oluşturan bakteri hücre çeperinin peptidlerin C-ucuna bağlanır Şekil 1 &#39;de gösterildiği gibi, bir kompleks. Van ve maruz kalan peptidler blokları, etkili çapraz bağlama onları durdurma ve bu nedenle nanomechanically kopma 1,6 tarafından ölüme yol açan, bakteri hücre zayıflatır, hücre duvarları, 1 çapraz bağlanmasını katalize transpeptidases ve transglycosylases hareketlerini arasındaki bu etkileşim 7. Vankomisine dirençli enterokok (VRE) ortaya çıkışı artan bir sağlık sorunu 11 ve ENTEROKOKLARDA bakteriyel direnci bir amid lin en ince değişikliği nedeniyle ortaya çıkar çünkübir ester bağlantısı 8, bakterinin siler bağlayıcı cebin daha sonraki değişiklikten Van &#39;in yerleştirme sitesinden bir hidrojen bağı yüzeyindeki bu aldatıcı basit yapısal değişime açıklıklardan. Önemli olarak bu işlem tarafından Van-D-Lac, bağlama afinitesinde anlamlı bir azalma elde edilmiştir, burada D-Lac olarak adlandırılan, bir lisin-D-Alanin-D-laktat 10,12 vankomisin duyarlı Enterococcus (VSE) içinde pentapeptid terminal alaninin mevcut değiştirir enterokok enfeksiyonları 1, antibiyotiğe dirençli bakterilerin endişe verici büyüme karşı terapötik etkisiz büyüklüğü render Van üç emir bu nedenle dirençli bakteri ilaca karşı antibakteriyel maddelerin antibakteriyel aktivite veya daha güçlü ilaçların keşfi hızlandırmak ve geri yüklemek için yenilikçi yaklaşımların geliştirilmesi sürüyor enfeksiyonlar. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; serbest konsol kullanarak Bizim deneyler gibi hareket içine kimyasal enerjiyi hücreleri gibi sistemleri esinlenmiştir. Mekanik hareket, kimyasal enerjiyi çevirmek için konsol sensörleri kabiliyetleri, bunları gerçek zamanlı olarak bakteriyel hücre duvarı hedeflerin mekanik kesintileri izlenmesi için önemli avantajlar benzersiz problar yapar. Konsol sensörler herhangi bir muhabir &#39;etiketler&#39; gerektirir ve biyomoleküllerin bir tek adım reaksiyon hızla tespit edilir. Bunlar tamponlu çözümleri ve bütün serum gibi fizyolojik ortamlarda paralel olarak birden fazla ilaç ekran yapabilirsiniz. Buna ek olarak, konsol teknolojisi standart yarıiletken işleme yolları aracılığıyla üretim sayesinde, onlar binlerce yüksek verimli tarama için seri üretim ve paralelliğini için müsait olan, onları özellikle ilaç-hedef etkileşimleri tespit etmek için izin diferansiyel ölçümleri için yerinde referans kullandığı ve saatte ilaç. Seçe olarakular birden fazla konsol sensör dizileri vankomisine antibiyotik direnç eğitimi için faydalı araçlardır - vankomisine direnç aslında mekanik bir sorun 1,6,7 çünkü. Çözelti içinde bir model bakteriyel hücre duvarı hedef ve Van arasındaki reaksiyon, ecza-hedef bağlanma etkileşimleri bağlı klinik stres değişmeler izlenerek tespit edilebilir. Bir konsol bükme sinyal kendini gösteren yüzey reaksiyonlardan oluşturulan stres bir lazer ışını ile aydınlatıcı sensörleri ile optik olarak analiz edilir. Ayrıca konsol Sensör üzerinde bakteriyel yüzey hedef moleküllerin alıcı kaplama uyarlayarak, analitlerin bir un-sınırlı sayıda (Van), özel biyokimyasal etkileşimler yakın ve model bakteri hücre duvar matrisinin biyomekanik gerçek zamanlı olarak izlenir. Yanı sıra moleküler tanıma olay, def için konsol sensörler neden olabilir çeşitli faktörler vardırsıcaklık değişimleri, belirsiz bağlama ya da çözümün kırılma indeksi değişiklikleri - içerir lect,. , Spesifik olmayan sinyaller için hesap için ölçüm ve referans konsol hem de bükme sürekli belirli etkileşimleri analiz etmek izlenir nerede yerinde diferansiyel ölçümleri yapılmaktadır. Ayrıca, yüzey kimyaları ve geometrisine bağlı konsol sensörler tespit duyarlılığı p konsol tüm üst yüzey alanına yakalama molekülü tarafından işgal yüzey alanına oranı olarak tanımlanmaktadır yüzey yoğunluğu p (ayarlama ile geliştirilebilir X-ışını fotoelektron spektroskopisi (XPS) 1 ile belirlenen moleküllerinin toplam nüfusun kapsamındadır. İşte bu protokol bilgileri nasıl tamponlu çözelti içinde klinik olarak anlamlı konsantrasyonlarda bakteri hücre duvarı habercisi analogları (mucopeptides) için bağlayıcı vankomisin veya başka bir antibiyotik birnd kan serumu etiket içermeyen konsol teknolojisi kullanılarak tespit edilebilir. Kendi oluşturduğunuz bir mono tabakaları (SAMs) kolayca temiz altın 13,14 istikrarlı katmanları oluşturma eğilimindedir çünkü taze altın yüzeyler kullanılır. SAM&#39;lere genellikle diğer ucunda istenilen yakalama birimi serbest çözelti içinde analit hedef ile etkileşime izin verirken kovalent altın yüzey bağlanmış bir tiol grubunu, kısa moleküllerden oluşur. Tiyoller, özellikle farklı kimyasal uç gruplar ile çok sayıda tiyol bileşikleri, ticari olarak mevcuttur ya da kolaylıkla bir laboratuvarda sentezlenmiş olan verilen esnek bir sistem oluştururlar. Ancak, bakım bir tiol grubu ile molekülleri doğru uç grupları olması gerekir emin olmak için dikkat edilmelidir, bir protein ya da peptid birleşme, örneğin, amino grubu üzerinde gergin Tiyol bölgesinin karboksilik grubu ile reaksiyon için içeriye doğru dönük olmalıdır meydana yüzey. Burada, tiyoller b bakteriyel lipit II tripeptid mimetikleri ile doğrudan konjüge edilmiştiracterial hücre duvarı kullanılarak katı faz yöntem vasıtasıyla sentez ticari olarak temin edilebilen hedeflerin Wang-D-Ala ve Wang-D-Lac, reçineler ve standart Fmoc-koruyan grup kimyası 15 önceden yüklenmiş. Bu tanıma vankomisin odaklanmış olsa da, açıkça diğer antibiyotiklere uzatılabilir ve gerçekten ileri çalışmalar farklı özellikle biyokimya, farmakoloji alanlar ve kolayca kendi deneyleri için bu protokol benimsemeye malzeme bilimi araştırmacıları tarafından davet edilir.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Items</td>
			<td>Catalog Number </td>
			<td>Company</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scentris</td>
			<td></td>
			<td>Scentris, Veeco Instruments, Inc</td>
			<td>Not in production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Six-way valve</td>
			<td></td>
			<td>MVP, Hamilton, Reno, NV</td>
			<td>Enables multiple concentration injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EB Evaporator</td>
			<td></td>
			<td>BOC Edwards Auto 500, UK</td>
			<td>Electron beam is preferable because of deformation of cantilevers caused by thermal heating problems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Storage vessel</td>
			<td></td>
			<td>Agar Scientific, UK</td>
			<td>Keeps gold coated films fresh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillary</td>
			<td></td>
			<td>King Precision Glass, Claremont, CA, USA</td>
			<td>For capillary functionalization of the cantilever arrays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump</td>
			<td></td>
			<td>Model Genie Plus, Kent Scientific, Torrington, CT, USA</td>
			<td>Good for controlled flow rate of liquid samples in microfluidic channels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2-4.5 &#956;m Filters</td>
			<td>1511940001</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>For sample filtering</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cantilever chips</td>
			<td></td>
			<td>London Centre for Nanotechnology (LCN)</td>
			<td>Highly sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>10049-21-5</td>
			<td>Sigma-Aldrich, UK</td>
			<td>For making buffer solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>7558-79-4</td>
			<td>Sigma-Aldrich, UK</td>
			<td>For making buffer solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysorbate 80 (PS80) or Tween 80</td>
			<td>9005-65-6</td>
			<td>Sigma-Aldrich, UK</td>
			<td>Used in buffer solutions to prevent nonspecific interactions on glassware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DI water</td>
			<td></td>
			<td>Millipore Co., Billerica, MA, USA</td>
			<td>Used for making solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whole serum</td>
			<td>GEM-700-110-H</td>
			<td>Sera Laboratories International Ltd, UK</td>
			<td>Used in measurements that mimic physiological conditions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vancomycin (Van)</td>
			<td>1404-93-9</td>
			<td>Sigma-Aldrich, UK</td>
			<td>Drug used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid</td>
			<td>7664-93-9</td>
			<td>Sigma-Aldrich, UK</td>
			<td>Used for glassware cleaning procedures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide</td>
			<td>7722-84-1</td>
			<td>Sigma-Aldrich, UK</td>
			<td>Used for glassware cleaning procedures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Ala and D-Lac</td>
			<td></td>
			<td>London Centre for Nanotechnology (LCN)</td>
			<td>Surface receptors coated on the cantilever for detecting drug-target interactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabView</td>
			<td></td>
			<td>National Instruments Co., Austin, TX, USA</td>
			<td>Software used for instrumental interface to allow controlled measurements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nanomechanics of drug-target interactions and antibacterial resistance detection

Çözüm yüzeyi ve antibiyotik ilaçlar hareketsiz modeli bakteri hücre duvarı matriks arasındaki reaksiyonlar bir dönüştürücü olarak hareket konsol sensörü, benzeri görülmemiş bir duyarlılık ve özgüllük 1-5 biyokimyasal algılama uygulamalarında önemli bir potansiyel göstermiştir. Ilaç-hedef etkileşimleri konsol viraj neden, yüzey stres oluşturmak, ve bir lazer ile aydınlatılan zaman sinyal optik analiz edilebilir. Nano ölçekli hassasiyetle ölçülen yüzey stres değişim modeli bakteri hücre duvarının biyomekanik kesintileri gerçek zamanlı olarak izlenebilir hedeflemektedir sağlar. Önemli avantajlar sunan rağmen, birden fazla konsol sensör dizileri ilaç-hedef bağlayıcı etkileşimleri miktarının uygulanmıştır hiç. Burada, kantitatif stu için bakteri hücre duvar matrisinin taklit alkantiyol kendini monte mono tabakaları ile kaplı silikon birden fazla konsol dizilerin kullanımı ile ilgili rapordy antibiyotik bağlama etkileşimleri. Bakteri hücre duvar yapıları 1,6,7 mekaniği üzerinde vankomisin etkisini anlamak için. Biz bu dirsekli bükme iki bağımsız faktörler tarafından tanımlanabilir önermektedir yeni bir model geliştirilmiştir 1 i) olmak üzere klasik bir Langmuir adsorpsiyon izotermi tarafından verilen bir kimyasal faktörler, hangi biz termodinamik denge ayrışma sabiti hesaplar (Kd) ve ii) bir geometrik faktör, bakteriyel peptid reseptörleri konsol yüzeyinde dağıtılır nasıl aslında bir ölçü. Peptid reseptörleri (p) yüzey dağılımı geometrisi ve ligand yükleme bağımlılığını incelemek için kullanılır. Bu p bir eşik değerini ~% 10 algılama uygulamaları için kritik olduğu gösterilmiştir. Bu değerin üstünde eğilme stresi sinyalin ortaya, hemen hemen doğru orantılı olarak artar ise saptanabilir bir bükme sinyal olduğu aşağıda yerel bir kimyasal bağlanma Fac bir ürünüdürtor ve geometrik faktör tepki bölgelerin mekanik bağlantı ile kombine ve Superbug enfeksiyonları ile mücadele için güçlü ajanların tasarım için yeni bir paradigma sağlar.

Tek bir H-bağı silme benzeri görülmemiş bir hassasiyet ile nano ölçekli hassas kullanılarak ölçülür stres değişiklik, gerçek zamanlı (Şekil 2a-d) model bakteri hücre duvarı biyomekanik kesintileri izlemek için yararlanılır. Van için ilaç algılama hassasiyet sınırı seri ~ -9 bir ortalama ± sebebiyet veren en düşük tespit konsantrasyon olarak 10 nM (~ 15 ng / ml) ortaya, 1.000 mcM gelen ≤ 10 nM için adımlar yılında konsantrasyonları seyreltilmesi ile araştırıldı 2 ayırıcı bükme sinyallerini (Şekil 2c) olarak nm. Fizyolojik bir ortam altında antibiyotik tespit yeteneği daha 3-27 uM 17 arasında klinik açıdan uygun bir konsantrasyon aralığında, serum araştırılmıştır. Aynı koşullar altında tüm konsol arasında serum içinde 7 uM, Van (% 90 dana fetus serum ve% 10 sodyum fosfat tamponu pH 7.4) için diferansiyel sinyalinin enjekte edilmesi üzerineSerum Dala oldu 105 ± 4 nm DLac kaplı konsol için, herhangi bir bükme (Şekil 3) olarak bulundu. DAla, kaplanmış (vankomisin duyarlı) konsollar için gözlenen önemli ölçüde eğilme sinyalleri güçlü bir ecza-hedef bağlanma etkileşimlerine neden olur. Ancak DLac kaplı (Vankomisin dirençli) konsol, vankomisin bağlayıcı cebinde 10,12 olarak oksijen yalnız çifti ve düşük NH bağının zemin-devlet itme varlığı için daha az neden ilaç-hedef bağlayıcı etkileşimlerin zayıflaması katkıda ya da konsol özellikle düşük vankomisin konsantrasyonları (Şekil 3) için, bükme. Ancak, yüksek vankomisin konsantrasyonu için, biz DLac için ölçülebilir bükme sinyallerini gözleyin. Ayrıca, deney tasarımı in situ referans için önemli olduğu tüm caDAla, ve DLac ile kaplanmış ntilevers eş zamanlı gerçek zamanlı olarak aynı analite maruz kalır. Kimya ve geometri kesin rolü anlamak için, çözücü etkileşimleri ve yüzey mekanik arasındaki ilişki açıklayan bir model 1 tasarlanmış. Bu yüzey gerilimi üretir: <img alt="Denklem 1" src="/files/ftp_upload/50719/50719eq1.jpg" /> p&gt; pc ve aksi takdirde sıfır (1) için Denklemindeki ilk terim (1) ilaç-hedef bağlayıcı olaylar için muhasebe ve ikinci dönem stresli ağ oluşumu büyük ölçekli mekanik sonuçları açıklayan güç hukuk biçimidir, Langmuir Adsorpsiyon İzoterm olduğunu. Tüm erişilebilir bağlanma yerleri işgal olduğunda sabit bir maksimum yüzey stres karşılık gelir ve K d yüzeyinde denge ayrışma eksileri olduğunukonsol üzerinde Tant. Şekil 4 &#39;de gösterildiği gibi, ölçülen diferansiyel analizi açığa stres sinyalleri üzerine bindirilmiş denklemin küresel formda (1) bir sonucu olan, bir ~ 29.7 ± 1.0 ve 14.1 ± 3.0 mN / m, ve Kd ~ 1.0 ± 0.3 veya 800 ± 310 yüzey gerilimi bir ölçüye karşılık gelir, bir erişilebilir tüm bağlanma bölgelerini işgal D-Ala ya da DLac peptidler için uM. Konsol daha iyi bir hassasiyet antibiyotik konsantrasyonu (Şekil 5), sırasıyla, 10, 100, sabit ve 250 uM P bir fonksiyonu olarak stres veri izleme sırasında sistematik peptid yoğunlukları p değiştirilerek ayarlanmıştır. Peptid yoğunlukları p sabit iken ~% 100 işlemi Van konsantrasyonlarının bir fonksiyonu olarak stres ile yinelenmiştir. &lt;img alt = &quot;Şekil 1&quot; fo: içerik-width = &quot;5in&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/50719/50719fig1.jpg&quot; /&gt; Şekil 1. Antibiyotik yüzey bağlama etkileşimleri konsol algılama. ecza-hedef karşılıklı etkileşimlerinin nanomechanically tespit edildiği bir konsol sensör dizisi ve mod a) şematik gösterimi. b), bir ilaç molekülünün (Van) ve bakteriyel mukopeptid analog (D-Ala veya D-Lac) arasındaki kimyasal bağlanma etkileşimi. c) mutasyona uğramış bir vankomisin duyarlı bakterilerin (VSE) bağlayıcı cebinde H-bağı tek silerek vankomisin direnç kazanır hangi. mekanizması <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50719/50719fig1large.jpg" target="_blank">büyük rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 2," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50719/50719fig2.jpg" /&gt; Şekil 2. Gerçek zamanlı olarak modeli bakteri hücre duvarı biyomekanik kesintileri izleme. a) D-Ala, D-Lac ve fosfat tamponu ve 250 mcM vankomisin PEG kaplı konsol mutlak bükme sinyalleri. PEG diferansiyel referans sinyalleri, siyah çizgiler olarak gösterilmiştir. B) D-Ala ve fosfat tamponu ve 250 uM vankomisin D-Lac kaplı konsol, zamanın bir fonksiyonu olarak doza bağımlı bir sinyalin c.) Ayırıcı konsol sapma Diferansiyel sinyaller bükme bir olarak sırasıyla 10 nM (sarı hat), 100 nM (kırmızı çizgi) ve 1000 nM (koyu kırmızı çizgi) sırasına göre vankomisin konsantrasyonları varlığında. d) üç diferansiyel konsol sapma sinyalleri D-Ala kaplı konsol sensörleri 10 varlığında, zamanın bir fonksiyonu olaraknM vankomisin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50719/50719fig2large.jpg" target="_blank">büyük rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 3," fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50719/50719fig3.jpg" /> Şekil 3,. D-Ala ve buzağı fetal serum 7 mcM vankomisin varlığında D-Lac kaplı konsol için gerçek zamanlı olarak modeli bakteri hücre duvarı biyomekanik kesintileri takibi. <img alt="Şekil 4," fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50719/50719fig4.jpg" /> Şekil 4. Ilaç-hedef etkileşimlerinin nanomekanik incelenmesi. D-Ala (siyah daireler) ve D-Lac (kırmızı daireler) vankomisin bir fonksiyonu olarak kaplı konsol için ölçülen diferansiyel yüzey stres yanıtı gösteren Arsaçözüm konsantrasyonu [Van]. Veriler, denklem (1) (kalın çizgiler) tarafından tarif edilmiştir. 1 <img alt="Şekil 5," fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50719/50719fig5.jpg" /> Şekil 5,. Karışık mono tabakaları ile reseptör yükleme ve geometri bağımlılığı araştırılması ile reseptör-ligand etkileşimleri nanomekanik Algılama duyarlılığının Optimizasyonu. Sabit vankomisin konsantrasyonlarının varlığında, bir D-Ala fonksiyonu yüzey kaplaması, s konsol sensörlerin ölçülen diferansiyel yüzey gerilimi yanıtları 10 mcM (siyah çizgi), 100 mcM (kırmızı çizgi) ve 250 mcM (yeşil hat) de çözüm.

Watch this Scientific Journal Video about Nanomechanics of Drug-target Interactions and Antibacterial Resistance Detection at JoVE.com

Nanomechanics of Drug-target Interactions and Antibacterial Resistance Detection

Antibiyotiklere kazanılmış dayanıklılık, önemli bir halk sağlık sorunu olduğunu ve şu anda insan yaşamı için en büyük tehditlerden biri olarak DSÖ tarafından sıralanır. Burada dirençli bakterilerin ilaca karşı yeni ve güçlü ajanların keşfi için kritik antibakteriyel direnç ölçmek için konsol teknoloji kullanımı açıklanmaktadır.

İlaç-hedef Etkileşimleri ve Antibakteriyel Direnç Algılama Nanomekaniğe

The cantilever sensor, which acts as a transducer of reactions between model bacterial cell wall matrix immobilized on its surface and antibiotic drugs in ...

nanomechanics-drug-target-interactions-antibacterial-resistance

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

14.1K Görüntüleme.  University College London. Antibiyotiklere kazanılmış dayanıklılık, önemli bir halk sağlık sorunu olduğunu ve şu anda insan yaşamı için en büyük tehditlerden biri olarak DSÖ tarafından sıralanır. Burada dirençli bakterilerin ilaca karşı yeni ve güçlü ajanların keşfi için kritik antibakteriyel direnç ölçmek için konsol teknoloji kullanımı açıklanmaktadır.

Video: Nanomechanics of Drug-target Interactions and Antibacterial Resistance Detection

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in situ hybridization (FISH) for rapid culture-independent detection of Salmonella spp. Cell-charged tapes can also be placed face-down on selective agar for solid-phase enrichment prior to detection. Alternatively, low-volume liquid enrichments (liquid surface miniculture) can be performed on the surface of the tape in non-selective broth, followed by FISH and analysis via flow cytometry. To begin, sterile adhesive tape is brought into contact with fresh produce, gentle pressure is applied, and the tape is removed, physically extracting microbes present on these surfaces. Tapes are mounted sticky-side up onto glass microscope slides and the sampled cells are fixed with 10% formalin (30 min) and dehydrated using a graded ethanol series (50, 80, and 95%; 3 min each concentration). Next, cell-charged tapes are spotted with buffer containing a Salmonella-targeted DNA probe cocktail and hybridized for 15 - 30 min at 55&deg;C, followed by a brief rinse in a washing buffer to remove unbound probe. Adherent, FISH-labeled cells are then counterstained with the DNA dye 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) and results are viewed using fluorescence microscopy. For solid-phase enrichment, cell-charged tapes are placed face-down on a suitable selective agar surface and incubated to allow in situ growth of Salmonella microcolonies, followed by FISH and microscopy as described above. For liquid surface miniculture, cell-charged tapes are placed sticky side up and a silicone perfusion chamber is applied so that the tape and microscope slide form the bottom of a water-tight chamber into which a small volume (&le; 500 &mu;L) of Trypticase Soy Broth (TSB) is introduced. The inlet ports are sealed and the chambers are incubated at 35 - 37&deg;C, allowing growth-based amplification of tape-extracted microbes. Following incubation, inlet ports are unsealed, cells are detached and mixed with vigorous back and forth pipetting, harvested via centrifugation and fixed in 10% neutral buffered formalin. Finally, samples are hybridized and examined via flow cytometry to reveal the presence of Salmonella spp. As described here, our "tape-FISH" approach can provide simple and rapid sampling and detection of Salmonella on tomato surfaces. We have also used this approach for sampling other types of fresh produce, including spinach and jalape&ntilde;o peppers.

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple adhesive-tape-based approach for sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by rapid whole cell detection of Salmonella using fluorescence in situ hybridization (FISH).

Yapışkan bant tabanlı Örnekleme ve Floresans kombinasyonu In situ</emHızlı Algılama> Hibridizasyon Salmonella Taze üretin

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Amplifying and Quantifying HIV-1 RNA in HIV Infected Individuals with Viral Loads Below the Limit of Detection by Standard Clinical Assays

Amplifying viral genes and quantifying HIV-1 RNA in HIV-1 infected individuals with viral loads below the limit of detection by standard assays (below 50-75 copies/ml) is necessary to gain insight to viral dynamics and virus host interactions in patients who naturally control the infection and those who are on combination antiretroviral therapy (cART). 
Here we describe how to amplify viral genomes by single genome sequencing (the SGS protocol) 13, 19 and how to accurately quantify HIV-1 RNA in patients with low viral loads (the single-copy assay (SCA) protocol) 12, 20. 
The single-copy assay is a real-time PCR assay with sensitivity depending on the volume of plasma being assayed. If a single virus genome is detected in 7 ml of plasma, then the RNA copy number is reported to be 0.3 copies/ml. The assay has an internal control testing for the efficiency of RNA extraction, and controls for possible amplification from DNA or contamination. Patient samples are measured in triplicate.
The single-genome sequencing assay (SGS), now widely used and considered to be non-labor intensive 3, 7, 12, 14, 15,is a limiting dilution assay, in which endpoint diluted cDNA product is spread over a 96-well plate. According to a Poisson distribution, when less than 1/3 of the wells give product, there is an 80% chance of the PCR product being resultant of amplification from a single cDNA molecule. SGS has the advantage over cloning of not being subjected to resampling and not being biased by PCR-introduced recombination 19. However, the amplification success of SCA and SGS depend on primer design. Both assays were developed for HIV-1 subtype B, but can be adapted for other subtypes and other regions of the genome by changing primers, probes, and standards.

Quantifying levels of HIV-1 RNA in plasma and sequencing single HIV-1 genomes from individuals with viral loads below the limit of detection (50-75 copies/ml) is difficult. Here we describe how to extract and quantify plasma viral RNA using a real time PCR assay that reliably measures HIV-1 RNA down to 0.3 copies/ml and how to amplify viral genomes by single genome sequencing, from samples with very low viral loads.

Standart Klinik Tahliller Algılama Sınırı Aşağıda Viral Yükler HIV enfekte kişilerde kuvvetlendirme ve HIV-1 RNA miktarının

Amplifying viral genes and quantifying HIV-1 RNA in HIV-1 infected individuals with viral loads below the limit of detection by standard assays (below ...

One-day Workflow Scheme for Bacterial Pathogen Detection and Antimicrobial Resistance Testing from Blood Cultures

Bloodstream infections are associated with high mortality rates because of the probable manifestation of sepsis, severe sepsis and septic shock1. Therefore, rapid administration of adequate antibiotic therapy is of foremost importance in the treatment of bloodstream infections. The critical element in this process is timing, heavily dependent on the results of bacterial identification and antibiotic susceptibility testing. Both of these parameters are routinely obtained by culture-based testing, which is time-consuming and takes on average 24-48 hours2, 4. The aim of the study was to develop DNA-based assays for rapid identification of bloodstream infections, as well as rapid antimicrobial susceptibility testing. The first assay is a eubacterial 16S rDNA-based real-time PCR assay complemented with species- or genus-specific probes5. Using these probes, Gram-negative bacteria including Pseudomonas spp., Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli as well as Gram-positive bacteria including Staphylococcus spp., Staphylococcus aureus, Enterococcus spp., Streptococcus spp., and Streptococcus pneumoniae could be distinguished. Using this multiprobe assay, a first identification of the causative micro-organism was given after 2 h.
Secondly, we developed a semi-molecular assay for antibiotic susceptibility testing of S. aureus, Enterococcus spp. and (facultative) aerobe Gram-negative rods6. This assay was based on a study in which PCR was used to measure the growth of bacteria7. Bacteria harvested directly from blood cultures are incubated for 6 h with a selection of antibiotics, and following a Sybr Green-based real-time PCR assay determines inhibition of growth. The combination of these two methods could direct the choice of a suitable antibiotic therapy on the same day (Figure 1). In conclusion, molecular analysis of both identification and antibiotic susceptibility offers a faster alternative for pathogen detection and could improve the diagnosis of bloodstream infections.

The design of a straightforward one-day workflow scheme for bacterial pathogen diagnostics enables the rapid recognition of bloodstream infections. The inclusion of eight clinically relevant bacterial targets and their antibiotic resistance profiles offers the clinician an initial insight on the same day, which can lead to more adequate therapy.

Kan örneklerinden Bakteriyel Patojen Algılama ve Antimikrobiyal Direnç Testi için bir günlük iş akışı şeması

Bloodstream infections are associated with high mortality rates because of the probable manifestation of sepsis, severe sepsis and septic shock1. ...

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable method of analysis by flow cytometry to study nanoparticle interaction with immune cells. Primary immune cells can be easily purified from human or mouse tissues by antibody-mediated magnetic isolation. In the first instance, the different cell populations running in a flow cytometer can be distinguished by the forward-scattered light (FSC), which is proportional to cell size, and the side-scattered light (SSC), related to cell internal complexity. Furthermore, fluorescently labeled antibodies against specific cell surface receptors permit the identification of several subpopulations within the same sample. Often, all these features vary when cells are boosted by external stimuli that change their physiological and morphological state. Here, 50 nm FITC-SiO2 nanoparticles are used as a model to identify the internalization of nanostructured materials in human blood immune cells. The cell fluorescence and side-scattered light increase after incubation with nanoparticles allowed us to define time and concentration dependence of nanoparticle-cell interaction. Moreover, such protocol can be extended to investigate Rhodamine-SiO2 nanoparticle interaction with primary microglia, the central nervous system resident immune cells, isolated from mutant mice that specifically express the Green Fluorescent Protein (GFP) in the monocyte/macrophage lineage. Finally, flow cytometry data related to nanoparticle internalization into the cells have been confirmed by confocal microscopy.

Analysis of nanoparticle interaction with defined subpopulations of immune cells by flow cytometry.

Sitometrisi ile Primer İmmün hücre alt Floresan Nanoparçacık Etkileşimleri Algılama

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify new compounds that can inhibit infection by the common drug resistant HIV-1 strains with minimal toxicity. Here we describe an efficient assay that can be used to rapidly determine the cellular cytotoxicity and efficacy of a compound against WT and mutant viral strains.
The desired target cell line is seeded in a 96-well plate and, after a 24 hr incubation, serially dilutions of the compounds to be tested are added. No further manipulations are necessary for cellular cytotoxicity assays; for anti HIV assays a predetermined amount of either a WT or drug resistant HIV-1 vector that expresses luciferase is added to the cells. Cytotoxicity is measured by using an ATP dependent luminescence assay and the impact of the compounds on infectivity is measured by determining the amount of luciferase in the presence or the absence of the putative inhibitors.
This screening assay takes 4 days to complete and multiple compounds can be screened in parallel. Compounds are screened in triplicate and the data are normalized to the infectivity/ATP levels in absence of target compounds. This technique provides a quick and accurate measurement of the efficacy and toxicity of potential anti HIV compounds.

Here we describe cellular cytotoxicity and single round infectivity assays that allow for the rapid and accurate screening of compounds to determine their cellular cytotoxicity (CC50) and IC50 values against WT and drug resistant HIV-1.

HIV ters transkriptaz ve integraz inhibitörleri hızlı taranması

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic cooperation, competition, or predation. The study of biofilms is important in many biological fields, including environmental science, food production, and medicine. However, few studies have focused on such bacterial biofilms, partially due to the difficulty of investigating them. Most of the methods for qualitative and quantitative biofilm analyses described in the literature are only suitable for biofilms forming on abiotic surfaces or on homogeneous and thin biotic surfaces, such as a monolayer of epithelial cells.
While laser scanning confocal microscopy (LSCM) is often used to analyze in situ and in vivo biofilms, this technology becomes very challenging when applied to bacterial biofilms on fungal hyphae, due to the thickness and the three dimensions of the hyphal networks. To overcome this shortcoming, we developed a protocol combining microscopy with a method to limit the accumulation of hyphal layers in fungal colonies. Using this method, we were able to investigate the development of bacterial biofilms on fungal hyphae at multiple scales using both LSCM and scanning electron microscopy (SEM). This report describes the protocol, including microorganism cultures, bacterial biofilm formation conditions, biofilm staining, and LSCM and SEM visualizations.

This protocol describes a new method to grow and qualitatively analyze bacterial biofilms on fungal hyphae by confocal and electron microscopy.

Yeni Bir Yöntem Filamentli Mantar kolonileri ile ilgili Bakteriyel Biyofilmler Niteliksel Çok ölçekli Analizi için kullanılması Eşodaklı ve Elektron Mikroskobu

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic ...

A Robust Pneumonia Model in Immunocompetent Rodents to Evaluate Antibacterial Efficacy against S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa or A. baumannii

Efficacy of candidate antibacterial treatments must be demonstrated in animal models of infection as part of the discovery and development process, preferably in models which mimic the intended clinical indication. A method for inducing robust lung infections in immunocompetent rats and mice is described which allows for the assessment of treatments in a model of serious pneumonia caused by S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, K. pneumoniae or A. baumannii. Animals are anesthetized, and an agar-based inoculum is deposited deep into the lung via nonsurgical intratracheal intubation. The resulting infection is consistent, reproducible, and stable for at least 48 h and up to 96 h for most isolates. Studies with marketed antibacterials have demonstrated good correlation between in vivo efficacy and in vitro susceptibility, and concordance between pharmacokinetic/pharmacodynamic targets determined in this model and clinically accepted targets has been observed. Although there is an initial time investment when learning the technique, it can be performed quickly and efficiently once proficiency is achieved. Benefits of the model include elimination of the neutropenic requirement, increased robustness and reproducibility, ability to study more pathogens and isolates, improved flexibility in study design and establishment of a challenging infection in an immunocompetent host.

A Robust Pneumonia Model in Immunocompetent Rodents to Evaluate Antibacterial Efficacy against S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa or  A. baumannii

A method for establishing lung infections in immunocompetent rodents is described. With proficiency, this method can be performed quickly and easily to induce stable infection with many isolates of S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, K. pneumoniae and A. baumannii.

Immünkompetan Kemirgenler bir Sağlam Pnömoni Modeli karşı antibakteriyel etkinliğini değerlendirmektir<i&gt; S. pneumoniae</i&gt;<i&gt; H. influenza</i&gt;<i&gt; K. pneumoniae</i&gt;<em&gt; P. aeruginosa</em&gt; ya da<em&gt; A. baumannii</em

Efficacy of candidate antibacterial treatments must be demonstrated in animal models of infection as part of the discovery and development process, ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella spp./Shigella spp. The gold standard method for the detection of Salmonella spp./Shigella spp. is direct culture but this is labor-intensive and time-consuming. Here, we describe a high-throughput platform for Salmonella spp./Shigella spp. screening, using real-time polymerase chain reaction (PCR) combined with guided culture. There are two major stages: real-time PCR and the guided culture. For the first stage (real-time PCR), we explain each step of the method: sample collection, pre-enrichment, DNA extraction and real-time PCR. If the real-time PCR result is positive, then the second stage (guided culture) is performed: selective culture, biochemical identification and serological characterization. We also illustrate representative results generated from it. The protocol described here would be a valuable platform for the rapid, specific, sensitive and high-throughput screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Salmonella spp./Shigella spp. are common pathogens attributed to diarrhea. Here, we describe a high-throughput platform for the screening of Salmonella spp./Shigella spp. using real-time PCR combined with guided culture.

Salmonella spp. testi ile taranması için yüksek üretilen iş platformu /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

Antibiotic Dereplication Using the Antibiotic Resistance Platform

One of the main challenges in the search for new antibiotics from natural product extracts is the re-discovery of common compounds. To address this challenge, dereplication, which is the process of identifying known compounds, is performed on samples of interest. Methods for dereplication such as analytical separation followed by mass spectrometry are time-consuming and resource-intensive. To improve the dereplication process, we have developed the antibiotic resistance platform (ARP). The ARP is a library of approximately 100 antibiotic resistance genes that have been individually cloned into Escherichia coli. This strain collection has many applications, including a cost-effective and facile method for antibiotic dereplication. The process involves the fermentation of antibiotic-producing microbes on the surface of rectangular Petri dishes containing solid medium, thereby allowing for the secretion and diffusion of secondary metabolites through the medium. After a 6 day fermentation period, the microbial biomass is removed, and a thin agar-overlay is added to the Petri dish to create a smooth surface and enable the growth of the E. coli indicator strains. Our collection of ARP strains is then pinned onto the surface of the antibiotic-containing Petri dish. The plate is next incubated overnight to allow for E. coli growth on the surface of the overlay. Only strains containing resistance to a specific antibiotic (or class) grow on this surface enabling rapid identification of the produced compound. This method has been successfully used for the identification of producers of known antibiotics and as a means to identify those producing novel compounds.

We describe a platform that utilizes a library of isogenic antibiotic resistant Escherichia coli for the dereplication of antibiotics. The identity of an antibiotic produced by bacteria or fungi can be deduced by the growth of E. coli expressing its respective resistance gene. This platform is economically effective and time-efficient.

Antibiyotik Direnci Platformu Kullanarak Antibiyotik Dereplication

One of the main challenges in the search for new antibiotics from natural product extracts is the re-discovery of common compounds. To address this ...

Visualization of Bacterial Resistance using Fluorescent Antibiotic Probes

Fluorescent antibiotics are multipurpose research tools that are readily used for the study of antimicrobial resistance, due to their significant advantage over other methods. To prepare these probes, azide derivatives of antibiotics are synthesized, then coupled with alkyne-fluorophores using azide-alkyne dipolar cycloaddition by click chemistry. Following purification, the antibiotic activity of the fluorescent antibiotic is tested by minimum inhibitory concentration assessment. In order to study bacterial accumulation, either spectrophotometry or flow cytometry may be used, allowing for much simpler analysis than methods relying on radioactive antibiotic derivatives. Furthermore, confocal microscopy can be used to examine localization within the bacteria, affording valuable information about mode of action and changes that occur in resistant species. The use of fluorescent antibiotic probes in the study of antimicrobial resistance is a powerful method with much potential for future expansion.

Fluorescently tagged antibiotics are powerful tools that can be used to study multiple aspects of antimicrobial resistance. This article describes the preparation of fluorescently tagged antibiotics and their application to studying antibiotic resistance in bacteria. Probes can be used to study mechanisms of bacterial resistance (e.g., efflux) by spectrophotometry, flow cytometry, and microscopy.