Name: an efficient and high yield method for isolation of mouse dendritic cell subsets
Uploaded: 2016-04-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Efficient and High Yield Method for Isolation of Mouse Dendritic Cell Subsets at JoVE.com

çalışmalar AIDS Araştırma Einstein Kanser Merkezi&#39;nde (NIH / NCI CA013330) ve Merkezi (NIH / NIAID AI51519) tarafından desteklenen FACS çekirdek imkanları kullanılarak gerçekleştirilmiştir sitometri Bu çalışma, SAP Flow NIH / NIAID hibe AI45889 tarafından desteklenmiştir.

Hayvan deneyleri kurumsal hayvan bakımı ve kullanımı komitesi (IACUC) tarafından onaylanmış esaslara uygun olarak yapılır. sterilite gerektiren tüm işlemler bir biyogüvenlik kabini içinde yapılmaktadır. Farelerde B16.Flt3L Melanom 1. implantasyonu <ol><li> Kültür, 37 ° C&#39;de% 10 CO2 ile birlikte DMEM ortamı içinde 0.5 x 10 6 hücre / ml&#39;lik bir yoğunlukta T25 doku kültürü şişelerinde Flt-3 eksprese eden B16 melanoma hücre soyu. Hücreler ulaşana kadar ~% 90 izdiham (~ 20 saat) büyütün. </li><li> sindirim tripsin hücreleri hasat. Aspire hücre kültür ortamı ve PBS ile yapışık hücrelere yıkayın. % 0.05 tripsin 5 ml ilave edilir ve 37 ° C&#39;de 5 dakika inkübe edilir. Proteaz hazmı sönmesi için soğuk 20 ml bitmiş DMEM ortamı fetal dana serumu (FCS) ihtiva eden (4 ° C) ekleyin. hafifçe hücreleri kaldırın nazikçe yukarı ve aşağı pipetleme takip vurma. </li><li> 300 santrifüj hücreleri toplamak4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca x g. Hemasitometre veya otomatik hücre canlılığı sayacı kullanarak hücreleri sayın. PBS içinde 10 8 hücre / ml&#39;lik bir yoğunluğa yeniden süspanse edin. </li><li> Deri altına enjeksiyon ile tümör hücreleri ile implant fareleri (C57BL / 6 ya da başka bir histo suşu) hücre süspansiyonu, 100 ul (10 7 hücre) ile boyun tabanına Machholz ve ark., 19 tarafından tarif edildiği gibi. </li><li> organ için hayvanlar kurban edilmeden önce (12 gün - - çapı 10 mm, genellikle 7 2) tümör palpe veya görünür kadar büyümeye izin verin. </li></ol> Tümör taşıyan fareler ile Dalak Tek Hücre Süspansiyon 2. Hazırlık <ol><li> izofluran aşırı dozda (&gt;% 5 izofluran akış hızını ayarlamak ve durur nefes sonra poz en az 2 dakika devam) ile fareler anestezi. Ötenazi için kurumsal kurallarına göre servikal dislokasyon ile Flt-3 melanom tümör taşıyan fare Kurban. </li><li> diSteril makas 20 yardımı ile aseptik teknik kullanılarak,% 70 etanol ve hasat dalak ile cilt sinfect. </li><li> Biyogüvenlik kabini taşınması için steril bir Petri kabı içine dalak yerleştirin. steril koşullar altında burada tüm adımları uygulayın. </li><li> taze Petri kabı dalak aktarın ve RPMI ortamı ile yıkayın. Bir neşter kullanılarak küçük (~ 0.2 cm 2) parçalar halinde dalak kesin. kolajenaz / DNaz çözeltisinin 10 ml&#39;si ile 37 ° C&#39;de 30 dakika süreyle inkübe edilir. </li><li> 70 mikron hücre süzgecinden üzerine dalak dokusunun kısmen sindirilmiş süspansiyon dökün. 5 ml şırınga pistonu kullanarak süzgeçten ağı boyunca kalan doku parçaları sıkıştırın. </li><li> taze ortam 10 ml örgü filtre yıkayın ve filtreyi atın. pelet hücreleri 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 300 x g&#39;de süspansiyon santrifüjleyin. </li><li> Süpernatant aspire ve RBC parçalama tamponu 2 ml hücre pelletini. RT f inkübeya da 10 dakika. tam RPMI ortamında 10 ml ekleyerek RBC parçalama tamponu Quench. </li><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj ile pelet hücreleri. Uygun hacimde yeniden süspanse Fc Block antikoru (2.4G2) 20 ug / ml içeren bir hücre ayırma tamponu (örneğin, MACS) içinde 10 8 hücre / ml hücre yoğunluğu elde etmek için. </li></ol> Dalak Tek Hücre Süspansiyon gelen plasmasitoid DC&#39;ler, CD8α Pos DC&#39;lerin ve CD8α Neg DH&#39;lerin 3. saflaştırılması ., Tek bir hücre süspansiyonu dalak DC alt-izolasyonu, Şekil 1 &#39;de gösterildiği gibi, bir çok-aşamalı bir işlemdir 4 bir ısıyı sürdürmek için önceden soğutulmuş tampon ve bir buzlu su banyosu kullanılarak, tüm adımları - 8 ° C: Not. Protokol aşağıdaki bölümde tüm reajan hacimleri 10 8 hücre / ml), dalak hücre süspansiyonu 200 ul bir ilk giriş için hesaplanır. Bu kadar ölçeklendirilebilir veyaaşağı ve orantılı ilk adım (3.1.1 ve 3.2.1) diğer reaktif (her zaman 1 x 10 8 hücre / ml yoğunlukta) hücre süspansiyonu hacmini değiştirerek ihtiyaca dayalı. buna göre tüm sonraki adımda reaktif hacimlerini ayarlayın. Örneğin, 1, 8 x 10 / ml dalak hücre süspansiyonu 100 ul ile başlayan tüm adımlarda yarısı belirtilen reaktif hacimlerini kullanımı. <ol><li> Plasmasitoid DC&#39;ler izolasyonu (PDC) <ol><li> dalak hücre süspansiyonu 200 ul plazmasitoid DC İzolasyon kiti temin biyotin etiketli antikor kokteyli 300 ul ekle. </li><li> İyice karıştırın ve 15 dakika buzlu su banyosunda enkübe edilir. askıya hücreleri korumak için, ve bağlayıcı antikor maksimize etmek için tüpü her 3 dakikada dokunun. </li><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 300 x g santrifüj ile hücreler tampon sıralama 12 mi hücre ekleyin ve pelet. Süpernatant aspire bağlanmamış biotinlenmiş antikorlar kaldırmak için. </li><li> hücreyi yeniden süspansehücre sıralama tampon 500 ul pelet. anti-biyotin antikor eşlenik boncuklar 300 ul ekle. Adımı tekrarlayın 3.1.2 ve 3.1.3. </li><li> Süpernatant atılır ve hücre ayırma tamponu, 2 ml hücre pelletini. önceden soğutulmuş tamponlar kullanılarak oda sıcaklığında bu noktada tüm adımları. </li><li> manyetik stand LS sütun sıralama taze manyetik aktive hücre yerleştirin. Yıkama ve hücre ayırma tamponu, 5 ml ile kolon dengeye. </li><li> Sütun üzerine hücre süspansiyonu pipetle kolon yatağın yüzeyinin ortasına yavaşça uygulanması. akışı toplayın. </li><li> hücre sıralama 10 ml tampon ile kolon yıkayın. gerçekleşen bu akışa toplamak ve adım 3.1.7 geçen akış ile birleştirir. PDC (FT1) aracılığıyla bu sütun akışında zenginleştirilmiştir. </li><li> 2 ml hücre ayırma tamponu içinde 4 ° C, tekrar süspansiyon, 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj ile FT1 hücreleri pelet ve taze LS kolonu boyunca hücrelere geçme3.1.8 - adımları 3.1.6 tekrarlayarak. İki ardışık sütun bu kullanımı izole hücrelerin gelişmiş saflığını verir. </li><li> 2 ml tam RPMI ile 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj ve tekrar süspansiyon Pelet hücreleri. gerekli olana kadar buz üzerine yerleştirin. </li></ol></li><li> CD8α POS ve CD8α Neg DC&#39;lerin izolasyonu Not: Bu prosedürde ilk adım B, pDC, T ve NK hücrelerinin tükenmesi olduğunu. <ol><li> Bütün dalak hücresi süspansiyonuna (adım 2.8 &#39;de elde edilen 10 8 hücre / ml&#39;lik 1 mi) ile başlayarak, CD8α Pos DC yalıtımı kitinde verilen biyotin-konjuge antikor kokteyli 100 ul ilave edin. </li><li> İyice karıştırın ve 15 dakika buzlu su banyosunda enkübe edilir. hedef hücrelere biotin etiketli antikorların bağlanma maksimize etmek için tüp hafifçe her 3 dakikada dokunun. </li><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj ile hücreler tampon sıralama 12 mi hücre ekleyin ve pelet. aspire süperilişkisiz biotinlenmiş antikorlar kaldırmak için yüzen. </li><li> Hücre sıralama tampon 150 ul ve CD8α Pos DC yalıtımı kitinde verilen anti-biyotin boncuk 100 ul ekle. İyice karıştırın ve 15 dakika buzlu su banyosunda enkübe edilir. </li><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj ile hücreler tampon sıralama 10 mi hücre ekleyin ve pelet. </li><li> Yeniden süspanse 1 ml hücre ayırma tamponu içinde hücreler ve adımlar 3.1.8 boyunca 3.1.6 prosedüre uygun olarak taze bir LS kolonu üzerinden geçer. </li><li> 2 (FT2) aracılığıyla işaretlenmemiş akışını toplamak ve sütun bakiyenin atın. Bu etiketsiz fraksiyon CD8α Pos ve CD8α Neg DC&#39;ler için zenginleştirilmiştir. </li><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj ile FT2 hücreleri Pelet. </li><li> 1 ml hücre sıralama tampon hücreleri tekrar süspansiyon ve CD8α Pos DC izolasyon kiti sağlanan anti-CD8α konjuge manyetik boncuk 200 ul ekleyin. </li><li> temsilci3.2.6 arasındaki adımları 3.2.2 yemek. Sütunun geçen akış CD8α Neg DC&#39;ler için zenginleştirilmiş ve CD8α Pos DC&#39;ler için tükenmiştir. Bu 3 (FT3) akışı etiketli. </li><li> CD8α Pos DC&#39;ler sütununda muhafaza Zehir için, mıknatıstan sütunu kaldırmak hücre sıralama tampon 5 ml ekleyin ve LS kolonu ile temin edilen bir piston kullanarak kolon matrisi temizlemek. </li><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj ile pelet hücreleri. 1 ml hücre ayırma tamponu içinde aspire supernatant ve tekrar süspansiyon. akış atmak ve 3.2.11 gibi muhafaza hücreleri toplamak dışında, saflığını artırmak 3.1.8 için adımları 3.1.6 tekrarlayarak yeni bir LS sütun aracılığıyla yeniden yıkandı hücreleri çalıştırmak için. </li><li> ST3 süspansiyondan CD8α Neg DC&#39;ler arıtmak için, 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj ile FT3 pelet ve hücre ayırma tamponu, 300 ul süspansiyon haline getirin. </li><li> Anti-CD11c mag 100 ul ekleyinmanyetik boncuklar. İyice karıştırın ve 15 dakika buzlu su banyosunda enkübe edilir. </li><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj ile 10 mi hücre sıralama tamponu ve pelet hücreleri ekleyin. </li><li> Tekrarlayın 3.1.8 ile 3.1.5 adımları. CD8α Neg DH&#39;ler pozitif CD11c boncuklar ile seçilir ve kolona bağlanmıştır. akış yoluyla çıkarılabilir. </li><li> Saflaştırılmış CD8α Neg DCler toplamak için aşama 3.2.11 de tarif edildiği gibi kolon içinde alıkonur ve hücreler Zehir. </li></ol></li></ol> Antijen ve Hücre Transferi 4. Sıralı Yanan APC&#39;ler <ol><li> Arıtma, canlı ve ölü hücreleri ayırt etmek tripan mavisi dışlama 21. kullandıktan sonra canlı hücreleri saymak. </li><li> tercih edilen antijen ile inkübe hücreleri. 100 nM konsantrasyonda 13 de glycolipid antijen denilen alfa-galaktozil seramid (αGalCer) analogları kullanın. Tipik haliyle, çok düşük attac kullanılarak 10 6 canlı hücre / kuyuda tam RPMI levhahment U tabanlı, 96 oyuklu plakalar hücre eki en aza indirir. 4 saat - 1, 37 ° C&#39;de% 5 CO2 atmosferinde inkübe hücreleri. </li><li> hafifçe birkaç kez pipetleme Hasat hücreleri. kesme kuvvetlerinin hücre hasarı en aza indirmek için geniş delik pipet uçları kullanın. PBS ile kuyu yıkayın ve hücre hasat üst düzeye çıkarmak için bu yıkar havuz. </li><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de Pelet hücreleri ve PBS içinde arzu edilen bir yoğunluğa yeniden süspanse edin. Tipik olarak, alıcının, hayvan başına 200 ul 1.000.000 hücre enjekte edilir. konak hayvanların içine uygulanmadan önce canlılığı maksimize etmek hücreleri buz üzerinde tutun. </li><li> Intravenöz farelere ya yanal kuyruk damarı ya da retro-orbital venöz pleksus yoluyla 19 hücreleri enjekte edilir. 1 ml şırınga üzerinde 27 G iğne kullanın ve fare başına 0.1 ml maksimum hacim enjekte. </li></ol>

<ol>
	<li>Steinman, R. M., Cohn, Z. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+novel+cell+type+in+peripheral+lymphoid+organs+of+mice.+I.+Morphology,+quantitation,+tissue+distribution.">Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice. I. Morphology, quantitation, tissue distribution.</a> J Exp Med. 137 (5), 1142-1162 (1973).</li><li>Banchereau, J., Steinman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+and+the+control+of+immunity.">Dendritic cells and the control of immunity.</a> Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).</li><li>Dudziak, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+antigen+processing+by+dendritic+cell+subsets+in+vivo.">Differential antigen processing by dendritic cell subsets in vivo.</a> Science. 315 (5808), 107-111 (2007).</li><li>Belz, G. T., Nutt, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+programming+of+the+dendritic+cell+network.">Transcriptional programming of the dendritic cell network.</a> Nat Rev Immunol. 12 (2), 101-113 (2012).</li><li>den Haan, J. M., Bevan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutive+versus+activation-dependent+cross-presentation+of+immune+complexes+by+CD8(+)+and+CD8(-)+dendritic+cells+in+vivo.">Constitutive versus activation-dependent cross-presentation of immune complexes by CD8(+) and CD8(-) dendritic cells in vivo.</a> J Exp Med. 196 (6), 817-827 (2002).</li><li>Carbone, F. R., Kurts, C., Bennett, S. R., Miller, J. F., Heath, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-presentation:+a+general+mechanism+for+CTL+immunity+and+tolerance.">Cross-presentation: a general mechanism for CTL immunity and tolerance.</a> Immunol Today. 19 (8), 368-373 (1998).</li><li>Yamazaki, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8++CD205++splenic+dendritic+cells+are+specialized+to+induce+Foxp3++regulatory+T+cells.">CD8+ CD205+ splenic dendritic cells are specialized to induce Foxp3+ regulatory T cells.</a> J Immunol. 181 (10), 6923-6933 (2008).</li><li>Mukherjee, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DEC-205-mediated+antigen+targeting+to+steady-state+dendritic+cells+induces+deletion+of+diabetogenic+CD8(+)+T+cells+independently+of+PD-1+and+PD-L1.">DEC-205-mediated antigen targeting to steady-state dendritic cells induces deletion of diabetogenic CD8(+) T cells independently of PD-1 and PD-L1.</a> Int Immunol. 25 (11), 651-660 (2013).</li><li>Melief, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mini-review:+Regulation+of+cytotoxic+T+lymphocyte+responses+by+dendritic+cells:+peaceful+coexistence+of+cross-priming+and+direct+priming.">Mini-review: Regulation of cytotoxic T lymphocyte responses by dendritic cells: peaceful coexistence of cross-priming and direct priming.</a> Eur J Immunol. 33 (10), 2645-2654 (2003).</li><li>Bendelac, A., Savage, P. B., Teyton, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+NKT+cells.">The biology of NKT cells.</a> Annu Rev Immunol. 25, 297-336 (2007).</li><li>Benlagha, K., Bendelac, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD1d-restricted+mouse+V+alpha+14+and+human+V+alpha+24+T+cells:+lymphocytes+of+innate+immunity.">CD1d-restricted mouse V alpha 14 and human V alpha 24 T cells: lymphocytes of innate immunity.</a> Semin Immunol. 12 (6), 537-542 (2000).</li><li>Brennan, P. J., Brigl, M., Brenner, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invariant+natural+killer+T+cells:+an+innate+activation+scheme+linked+to+diverse+effector+functions.">Invariant natural killer T cells: an innate activation scheme linked to diverse effector functions.</a> Nature reviews. Immunology. 13 (2), 101-117 (2013).</li><li>Arora, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+subset+of+dendritic+cells+controls+the+cytokine+bias+of+natural+killer+T+cell+responses+to+diverse+glycolipid+antigens.">A single subset of dendritic cells controls the cytokine bias of natural killer T cell responses to diverse glycolipid antigens.</a> Immunity. 40 (1), 105-116 (2014).</li><li>Semmling, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+cross-priming+through+CCL17-CCR4-mediated+attraction+of+CTLs+toward+NKT+cell-licensed+DCs.">Alternative cross-priming through CCL17-CCR4-mediated attraction of CTLs toward NKT cell-licensed DCs.</a> Nat Immunol. 11 (4), 313-320 (2010).</li><li>Duriancik, D. M., Hoag, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+identification+and+enumeration+of+dendritic+cell+populations+from+individual+mouse+spleen+and+Peyer's+patches+using+flow+cytometric+analysis.">The identification and enumeration of dendritic cell populations from individual mouse spleen and Peyer's patches using flow cytometric analysis.</a> Cytometry A. 75 (11), 951-959 (2009).</li><li>Karsunky, H., Merad, M., Cozzio, A., Weissman, I. L., Manz, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flt3+ligand+regulates+dendritic+cell+development+from+Flt3++lymphoid+and+myeloid-committed+progenitors+to+Flt3++dendritic+cells+in+vivo.">Flt3 ligand regulates dendritic cell development from Flt3+ lymphoid and myeloid-committed progenitors to Flt3+ dendritic cells in vivo.</a> J Exp Med. 198 (2), 305-313 (2003).</li><li>Mach, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+dendritic+cells+stimulated+in+vivo+by+tumors+engineered+to+secrete+granulocyte-macrophage+colony-stimulating+factor+or+Flt3-ligand.">Differences in dendritic cells stimulated in vivo by tumors engineered to secrete granulocyte-macrophage colony-stimulating factor or Flt3-ligand.</a> Cancer Res. 60 (12), 3239-3246 (2000).</li><li>Vremec, D., Segura, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+purification+of+large+numbers+of+antigen+presenting+dendritic+cells+from+mouse+spleen.">The purification of large numbers of antigen presenting dendritic cells from mouse spleen.</a> Methods Mol Biol. 960, 327-350 (2013).</li><li>Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manual+restraint+and+common+compound+administration+routes+in+mice+and+rats.">Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats.</a> J Vis Exp. (67), (2012).</li><li>Reeves, J. P., Reeves, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unit+1.9,+Removal+of+lymphoid+organs.">Unit 1.9, Removal of lymphoid organs.</a> Curr Protoc Immunol. , (2001).</li><li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appendix+3B,+Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability.">Appendix 3B, Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Curr Protoc Immunol. , (2001).</li><li>Vremec, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintaining+dendritic+cell+viability+in+culture.">Maintaining dendritic cell viability in culture.</a> Mol Immunol. 63 (2), 264-267 (2015).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Dendritik hücrelerin T hücre yanıtlarının prime dahil sunan hücreler büyük profesyonel antijen olarak kabul edilmektedir. Onların ana fonksiyonu T hücrelerine sunum için antijenleri alarak ve işleyerek doku mikro incelemektir. Belirli DC alt gruplarının işlevini incelemek için, bu normal fenotip ve fonksiyonlarını koruyan bir yaklaşım kullanarak yeterli sayıda izole edilmesi gerekir. Çoğu protokolleri naif farelerin spesifik DC alt kümesi izolasyonu güveniyor. Bu hücreler az olduğu için, izol...

&quot;Büyük yıldızsı (Yunan dendron) hücre&quot; lenfoid organlara 1 bulunduğu gibi dendritik hücreler (DC) neredeyse kırk yıl önce keşfedildi. Birçok çalışma, DH&#39;ler etkili naif T hücreleri, 2 stimüle tek antijen sunan hücreler olduğunu göstermiştir. Bu hücrelerin önemli bir fonksiyonu, antijen molekülleri üzerine alımı ve antijenlerin sunumu ve verimli işlem ve bunların yüklenmesidir. fare dalağı içinde DH&#39;ler plazmasitoid geleneksel alt-grup halinde ayrılabilir. plazmasitoid DH&#39;ler CD11c düşük ekspresyon ve B220 ve GR-1&#39;in yüksek düzeyleri ile karakterize edilir. Onlar da yüzey işaretleyici mPDCA1 için pozitif ve reseptör 9 (TLR9) ligandların gibi ücretli cevaben interferon türü salgılar. Geleneksel DH&#39;ler CD11c ve MHC sınıf II ekspresyonu için yüksektir. Bunlar, CD4, CD8α, DEC205, CD fenotipik işaretleyiciler yüzey ekspresyonu göre üç farklı alt-grup halinde ayrılabilen11b ve (33D1 antikoru tarafından tanınan DCIR2) dendritik hücre inhibitör reseptör 2 proteinleri 3,4. CD8α Pos DH&#39;ler da CDC1 olarak bilinir, bu tür CD11b ve 33D1 olarak miyeloid belirteçler için DEC205 için olumlu, ama olumsuzdur. Ayrıca Cdc2 denilen CD8α Neg DC&#39;ler, 33D1, CD11b ve CD4 pozitif ama DEC205 yoksundur. Çift negatif alt kümesi (CD4 ve CD8α hem yani negatif) nadirdir ve DEC205 ve 33D1 için negatiftir. Bu en karakterize alt kümesi ve CD8α Neg DC daha az farklılaşmış formu olabilir. Çeşitli DC alt gruplarında Fenotipik farklılıklar da in vivo fonksiyonları uzanır. CD8α Neg DH&#39;ler yüksek fagositik ve esas olarak CD4 T hücrelerinin 3 MHC sınıf II ile ekzojen antijen mevcut olduğu düşünülmektedir. Bunun aksine, CD8α Pos DH&#39;ler MHC sınıf I çözünür protein antijeni için özel olanbir mekanizma çapraz sunum denir. Çapraz sunum sonucu bu DCler 5 aktivasyon durumuna bağlıdır, ve sitotoksik T hücrelerinin (CTL&#39;ler) veya düzenleyici T hücrelerinin 6 2,7 gelişimi genişlemesine neden olabilir ya da. Enfekte apoptotik hücrelerinden türetilen antijen sunumu kuvvetli bir CTL karşılığı 9 indükler ise, büyük ölçüde T-hücreleri, 8 silme anti-DEC205-antikor-aracılı teslim sonuçları kullanılarak CD8α Sıra DH&#39;lere antijenin hedefleme. Peptit antijenlerinin tanınması ek olarak, bir memeli bağışıklık sistemi lipid ve glikolipit antijenler tanımak gelişmiştir. Bu antijenler, çeşitli memelilerdeki çok benzer formlarda mevcut MHC sınıf I-benzeri hücre yüzeyi proteinleridir CD1 molekülleri tarafından sunulmaktadır. Farelerde, CD1d adlandırılan yüksek derecede korunmuş CD1 molekülünün tek tip glikolipit antijenler 10 sunumundan sorumludur. büyük<html> CD1d / glikolipid kompleksleri tanıyan T hücre popülasyonu değişmeyen NKT hücreleri (iNKT hücre) adı verilir. Bu hücreler, çeşitlilik 11 sınırlı TCRβ zincirleri ile eşleştirilmiş bir değişmeyen TCRα zinciri oluşan bir yarı-değişmez T hücresi reseptörü (TCR) ifade etmektedir. Çoğalmak ve aktive efektör T hücreleri olmak için ayırt etmek gerekir geleneksel T hücrelerinin aksine, iNKT hücreleri efektör nüfus olarak var ve glikolipid idaresi 12 sonra hızla yanıt başlar. fizyolojik olarak uygun yağ antigen sunan hücrelerin tanımlanması, aktif bir araştırma alanıdır ve bu tip B hücreleri, makrofajlar ve DCler olarak birkaç farklı hücre tipleri bu işlemi gerçekleştirmek için önerilmiştir. Bununla birlikte, DC&#39;lerin CD8α Pos grubu fare iNKT hücreleri 13 ve CD8 T hücreleri 14 glikolipid aracılı çapraz astarlama alımını ve lipid antijenlerin sunumu aracılık birincil hücre olduğu gösterilmiştir. farklı antijen sunan hücreler tarafından antijen oluşumunun verimliliğini karşılaştırmak için,&gt; &quot;ove_content, basit bir yaklaşım, bu tür hücre transfer deneyleri genellikle immünolojik çalışmalar yapılmaktadır naif ana Antigenin eşdeğer miktarlarda ile doldurulan. saflaştınlmış APC &#39;lerin farklı transfer etmektir. bu hücreler, toplam hücrelerin 15% 2&#39;sinden azını oluşturan lenfoid organlarda olduğu gibi nadir nüfusu var çünkü Ancak, ex vivo antijen tedavi DC&#39;ler transfer çalışmalarını gerçekleştirirken, zordur. donör hayvanlarda bu hücrelerin gelişimini arttırmak için bu nedenle gereklidir izole etme protokolleri şu etkinliğini geliştirmek için. Bilindiği gibi, PDC, CD8 Pos ve CD8 Neg DC alt kümeleri, ekspres fms bağlantılı reseptör tirosin kinaz 3 (Flt-3) oluşturulması için gerekli olan genel lenfoid ve ortak miyeloid progenitör. In vivo FLT-3 ligandı üzerine (Flt-3L) uygulama, emigratFlt-3, kemik iliği projenitör hücrelerin eksprese iyon periferal lemfoid organlarının artan tohum ve olgun DC döl 16 genişlemesi ile sonuçlanır artar. Flt-3 ifadesi B, T ve NK hücre farklılaşması yollara işlenmesi sırasında kaybolur. Bu nedenle, çok az değişiklikler Flt-3L uygulanması üzerine bu hücrelerde görülmektedir. DC popülasyonları benzer genişletme Flt-3L 17,18 sürekli sistemik düzeylerde temin edilmesi için basit ve ekonomik bir yöntem sağlar murin Flt-3L, salgılayan bir B16-melanom hücre hattı implantasyonu ile oluşturulan tümörleri taşıyan farelerde gözlenmiştir. Bu yaklaşımı kullanarak, bu şekilde büyük ölçüde daha sonraki deneyler için izole edilebilir, bu hücrelerin verimlerini büyük ölçüde artırmak, fare dalağı içinde normal DC alt-genişlemesini uyarmak için Flt-3L salgılayan B16 melanom hücreleri implantasyonundan göre bir protokol geliştirilmiştir . 14 gün deri altı im aşağıdaki - Biz sürekli 10 içinde bulmaktoplam dalak hücrelerinin% 60 - Flt-3 salgılayan tümör ekimi, fareler 40 oluşturacak DH&#39;lerin belirgin zenginleşme ile splenomegali gelişebilir. Bu dalaklarından farklı DC alt-gruplar yüksek saflıkta Standard Bu alt-spesifik fenotipik işaretleyiciler kullanan ticari olarak temin edilebilen hücre saflaştırma kitleri kullanılarak izole edilebilir.

<table><tbody><tr><td>0.05% Trypsin-EDTA&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies, Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CDS019936-250MG</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase D&amp;nbsp;</td><td>Roche Diagnostics</td><td>11088858001</td><td></td></tr><tr><td>DNase I (dry powder)</td><td>QIAGEN</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>200 proof ethanol&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>9-6705-004-220</td><td>Used to prepare 70% ethanol</td></tr><tr><td>RBC lysis buffer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R7757</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 medium with L-glutamine&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies, Gibco</td><td>11875-119</td><td></td></tr><tr><td>DMEM medium with L-glutamine&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies, Gibco</td><td>11995-073</td><td></td></tr><tr><td>200 mM L-glutamine&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>MEM non-essential amino acids&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies, Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>MEM essential amino acids&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>11130-051&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-mercaptoethanol&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies, Invitrogen</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Sodium pyruvate&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Life Technologies, Invitrogen</td><td>15630</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; and Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; free pH 7.2)</td><td>Life Technologies, Invitrogen</td><td>20012-050</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s PBS (DPBS with Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; and Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;)</td><td>Life Technologies, Gibco</td><td>14040-182</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M Ethylenediaminetetraacetate (EDTA) solution&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA)&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Fetal calf serum</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11050&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/streptomycin&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies, Invitrogen</td><td>15140-163</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue (dry powder)&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6146-5G&amp;nbsp;</td><td>Prepare 0.08% with PBS</td></tr><tr><td>Plasmacytoid Dendritic Cell Isolation Kit II, mouse</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-092-786</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic beads conjugated with anti-mouse CD11c&amp;nbsp;</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-152-001</td><td></td></tr><tr><td>CD8&amp;alpha;&lt;sup&gt;Pos&lt;/sup&gt; mouse DC isolation kit&amp;nbsp;</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-091-169</td><td></td></tr><tr><td>Fc-gamma receptor blocking antibody (Clone 2.4G2)</td><td>BD Biosciences</td><td>553141</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse CD11c-FITC&amp;nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>553801</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse CD8&amp;alpha;-PerCP&amp;nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>553036</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse B220-PE&amp;nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>553090</td><td></td></tr><tr><td>1 ml syringes&amp;nbsp;</td><td>BD</td><td>26048</td><td></td></tr><tr><td>23 G1 needle&amp;nbsp;</td><td>BD</td><td>305145</td><td></td></tr><tr><td>100 mm Petri dishes&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>875712</td><td></td></tr><tr><td>Surgical instruments&amp;nbsp;</td><td>Kent Scientific</td><td>INSMOUSEKIT</td><td></td></tr><tr><td>Cell strainer (70 &amp;micro;m)</td><td>BD</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Large Petri plates&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum filtration system (500 ml (0.22 &amp;micro;m))</td><td>Corning</td><td>431097</td><td></td></tr><tr><td>LS columns&amp;nbsp;</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic stand MACS separator&amp;nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>Wide-bore 200 &amp;mu;l pipette tips&amp;nbsp;</td><td>PerkinElmer</td><td>111623</td><td></td></tr><tr><td>Corning ultra-low attachment 96-well plates&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>CLS3474-24EA</td><td></td></tr><tr><td>6-8 week old female C57BL/6 mice&amp;nbsp;</td><td>Jackson Research Laboratories, Jax</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Murine B16.Flt3L melanoma cell line</td><td></td><td></td><td>described by Mach &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt;, 2000</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Serum free DMEM and RPMI media&lt;/strong&gt;&lt;br/&gt;500 ml DMEM with L-glutamine, or 500 ml RPMI-1640 with L-glutamine&lt;br/&gt;5 ml MEM nonessential amino acids (100x, 10&amp;nbsp;mM)&lt;br/&gt; 5 ml HEPES Buffer (1 M)&lt;br/&gt;5 ml L-glutamine (200&amp;nbsp;mM)&lt;br/&gt; 0.5 ml 2-mercaptoethanol (5.5 x 10&lt;sup&gt;-2&lt;/sup&gt; M)</td><td></td><td></td><td>Mix all the ingredients in a biosafety cabinet with either DMEM or RPMI media depending on your need. Filter sterilize the media by passing through a 0.22 &amp;micro;m vacuum filtration system.</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Complete RPMI and DMEM media&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td>Add 50 ml of heat inactivated fetal calf serum to serum free RPMI or DMEM media to obtain complete media.</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;MACS buffer&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td>Add 2 ml of 0.5 M EDTA and 10 ml of heat inactivated fetal calf serum to 500 ml of Phosphate-buffered saline (PBS, Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; and Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; Free, pH 7.2) and 2&amp;nbsp;&amp;micro;g/ml 2.4G2 (Fc-Block antibody).</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;FACS staining buffer&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td>Dissolve sodium azide to 0.05% (0.25 g per 500 ml) in MACS buffer to obtain FACS staining buffer</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;10x Collagenase D and DNase 1 stock solution&lt;/strong&gt;&lt;br/&gt;
Dissolve 1 g of collagenase D and 0.2 ml of DNase 1 stock (1 mg/ml, 100x) in 20 ml of PBS containing Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; and Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; to obtain a solution of approximately 1,000-2,000 Units of collagenase activity per ml.</td><td></td><td></td><td>This 10x stock solution can be prepared ahead of time and stored at -20 &amp;deg;C for several weeks. Dilute 1 ml of this with 9 ml of serum free RPMI immediately before use.</td></tr></tbody></table>

an efficient and high yield method for isolation of mouse dendritic cell subsets

Dendritik hücreler (DC), elde etme işlemi ve T-hücresi-aracılı bağışıklık başlatma molekülleri antijen antijenler sunmak için başta sorumlu profesyonel antijen sunan hücrelerdir. Dendritik hücreler çeşitli fenotipik ve fonksiyonel heterojen alt kümeleri ayrılabilir. Dalak dendritik hücrelerin üç önemli alt grupları, CD8α Pos ve CD8α Neg hücreleri plasmasitoid vardır. plazmasitoid DCler tip I interferon doğal üreticileri ve anti-viral T hücre bağışıklık için önemlidir. CD8α Neg DC alt MHC sınıf II antijen sunumu için özel olan ve merkezi bir CD4 T hücrelerini priming yer almaktadır. CD8α Pos DH&#39;ler eksojen antijenler ve CD8 T hücresi priming çapraz sunumu için öncelikle sorumludur. CD8α Pos DC&#39;ler özel bir T cel için CD1d moleküller glycolipid antijenlerin sunumu en verimli olduğu ortaya konmuşturdeğişmeyen doğal öldürücü T (iNKT) hücreleri olarak bilinen l nüfus. FLT-3 ligand uygulanması sonuçta murin modellerinde periferal lemfoid organlarda, dendritik hücrelerin genişlemesi ile sonuçlanır kemik iliğinden dendritik hücre progenitörlerinin göç sıklığını artırmaktadır. Farklı DC alt gruplarının in vivo yeterliliğini karşılaştırma hücre transferi deneylerinde kullanılmak için fonksiyonel dendritik hücrelerin çok sayıda saflaştırmak için bu model adapte edilmiştir.

Bu prosedürün sonucu implante melanoma hücreleri tarafından ifade fare Flt-3L DC alt kümeleri genişletilmesi dayanmaktadır. B16.Flt3L tümör C57BL / 6 fareden türetildi ve red nedeniyle tesis haline tümörün başarısızlığı önlemek için bu suş kökenli, hayvanlara implante edilmiş olmalıdır. Bazı durumlarda, yollar veya ilgi reseptörleri sinyal bilinen kusurları ile DC&#39;ler elde etmek için genetik olarak modifiye edilmiş fareler kullanmak arzu edilebilir. Tü...

Watch this Scientific Journal Video about An Efficient and High Yield Method for Isolation of Mouse Dendritic Cell Subsets at JoVE.com

An Efficient and High Yield Method for Isolation of Mouse Dendritic Cell Subsets

Distinct dendritic cell subsets exist as rare populations in lymphoid organs, and therefore are challenging to isolate in sufficient numbers and purity for immunological experiments. Here we describe a high efficiency, high yield method for isolation of all of the currently known major subsets of mouse splenic dendritic cells.

Fare Dendritik Hücre Alt Grupları İzolasyonunda bir Verimli ve Yüksek Verim Yöntem

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen ...

an-efficient-high-yield-method-for-isolation-mouse-dendritic-cell

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

15.1K Görüntüleme.  Albert Einstein College of Medicine. Distinct dendritic cell subsets exist as rare populations in lymphoid organs, and therefore are challenging to isolate in sufficient numbers and purity for immunological experiments. Here we describe a high efficiency, high yield method for isolation of all of the currently known major subsets of mouse splenic dendritic cells.

Video: An Efficient and High Yield Method for Isolation of Mouse Dendritic Cell Subsets

Isolation Protocol of Mouse Monocyte-derived Dendritic Cells and Their Subsequent In Vitro Activation with Tumor Immune Complexes

Dendritic cells (DC) are heterogeneous cell populations that differ in their cell membrane markers, migration patterns and distribution, and in their antigen presentation and T cell activation capacities. Since most vaccinations of experimental tumor models require millions of DC, they are widely isolated from the bone marrow or spleen. However, these DC significantly differ from blood and tumor DC in their responses to immune complexes (IC), and presumably to other Syk-coupled lectin receptors. Importantly, given the sensitivity of DC to danger-associated molecules, the presence of endotoxins or antibodies that crosslink activation receptors in one of the isolating steps could result in the priming of DC and thus affect the parameters, or at least the dosage, required to activate them. Therefore, here we describe a detailed protocol for isolating MoDC from blood and tumors while avoiding their premature activation. In addition, a protocol is provided for MoDC activation with tumor IC, and their subsequent analyses.

Isolation Protocol of Mouse Monocyte-derived Dendritic Cells and Their Subsequent In Vitro Activation with Tumor Immune Complexes

Monocyte-derived DC (MoDC) can sense minor amounts of danger-associated molecules and are therefore easily primed. We provide a detailed protocol for the isolation of MoDC from blood and tumors and their activation with immune complexes while highlighting key precautions that should be considered in order to avoid their premature activation.

Yalıtım Protokolü fare monosit kaynaklı dendritik hücreler ve onların sonraki Vitro harekete geçirmek ile tümör bağışıklık kompleksleri

Dendritic cells (DC) are heterogeneous cell populations that differ in their cell membrane markers, migration patterns and distribution, and in their ...

Kanser Araştırmaları

Isolation of CD4+ T cells from Mouse Lymph Nodes Using Miltenyi MACS Purification

Isolation of cells from the primary source is a necessary step in many more complex protocols. Miltenyi offers kits to isolate cells from several organisms including humans, non-human primates, rat and, as we describe here, mice. Magnetic bead-based cell separation allows for either positive selection (or cell depletion) as well as negative selection. Here, we demonstrate negative selection of untouched or na ve CD4+ helper T cells. Using this standard protocol we typically purify cells that are &#8805; 96% pure CD4+/CD3+. This protocol is used in conjunction with the protocol Dissection and 2-Photon Imaging of Peripheral Lymph Nodes in Mice published in issue 7 of JoVE, for purification of T cells and other cell types to adoptively transfer for imaging purposes. Although we did not demonstrate FACS analysis in this protocol video, it is highly recommended to check the overall purity of isolated cells using the appropriate antibodies via FACS. In addition, we demonstrate the non-sterile method of T cell isolation. If sterile cells are needed for your particular end-user application, be sure to do all of the demonstrated procedures in the tissue culture hood under standard sterile conditions. Thank you for watching and good luck with your own experiments!

Isolation of lymphocytes using the Miltenyi MACs kit is a reliable way to purify cells from whole lymphoid tissue homogenates. Cells purified using the Miltenyi system are typically &#8805; 96% pure. Here, we demonstrate the steps taken to isolate CD4+ T cells, one of the many kits offered by Miltenyi.

CD4 İzolasyon Miltenyi MACS Arıtma Fare lenf düğümleri + T hücreleri

Isolation of cells from the primary source is a necessary step in many more complex protocols. Miltenyi offers kits to isolate cells from several ...

Biyoloji

Isolation of Mouse Lung Dendritic Cells

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the respiratory tract. At least three main subsets of lung dendritic cells have been described in mice: conventional DC (cDC) 4, plasmacytoid DC (pDC) 5 and the IFN-producing killer DC (IKDC) 6,7. The cDC subset is the most prominent DC subset in the lung 8. 
The common marker known to identify DC subsets is CD11c, a type I transmembrane integrin (&beta;2) that is also expressed on monocytes, macrophages, neutrophils and some B cells 9. In some tissues, using CD11c as a marker to identify mouse DC is valid, as in spleen, where most CD11c+ cells represent the cDC subset which expresses high levels of the major histocompatibility complex class II (MHC-II). However, the lung is a more heterogeneous tissue where beside DC subsets, there is a high percentage of a distinct cell population that expresses high levels of CD11c bout low levels of MHC-II. Based on its characterization and mostly on its expression of F4&#47;80, an splenic macrophage marker, the CD11chiMHC-IIlo lung cell population has been identified as pulmonary macrophages 10 and more recently, as a potential DC precursor 11. 
In contrast to mouse pDC, the study of the specific role of cDC in the pulmonary immune response has been limited due to the lack of a specific marker that could help in the isolation of these cells. Therefore, in this work, we describe a procedure to isolate highly purified mouse lung cDC. The isolation of pulmonary DC subsets represents a very useful tool to gain insights into the function of these cells in response to respiratory pathogens as well as environmental factors that can trigger the host immune response in the lung.

A highly purified preparation of mouse lung dendritic cells is described. Specific emphasis is given to the isolation of conventional dendritic cell subset.

Fare Akciğer Dendritik Hücrelerinin İzolasyonu

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine

Within the intestine reside unique populations of innate and adaptive immune cells that are involved in promoting tolerance towards commensal flora and food antigens while concomitantly remaining poised to mount inflammatory responses toward invasive pathogens1,2. Antigen presenting cells, particularly DCs and macrophages, play critical roles in maintaining intestinal immune homeostasis via their ability to sense and appropriately respond to the microbiota3-14. Efficient isolation of intestinal DCs and macrophages is a critical step in characterizing the phenotype and function of these cells. While many effective methods of isolating intestinal immune cells, including DCs and macrophages, have been described6,10,15-24, many rely upon long digestions times that may negatively influence cell surface antigen expression, cell viability, and/or cell yield. Here, we detail a methodology for the rapid isolation of large numbers of viable, intestinal DCs and macrophages. Phenotypic characterization of intestinal DCs and macrophages is carried out by directly staining isolated intestinal cells with specific fluorescence-labeled monoclonal antibodies for multi-color flow cytometric analysis. Furthermore, highly pure DC and macrophage populations are isolated for functional studies utilizing CD11c and CD11b magnetic-activated cell sorting beads followed by cell sorting.

Here, we detail a methodology for the rapid isolation of mouse intestinal dendritic cells (DCs) and macrophages. Phenotypic characterization of intestinal DCs and macrophages is performed using multi-color flow cytometric analysis while magnetic bead enrichment followed by cell sorting is used to yield highly pure populations for functional studies.

Fare Barsak ayrı dendritik hücreler ve makrofajlar İzolasyonu ve Karakterizasyonu

Within the intestine reside unique populations of innate and adaptive immune cells that are involved in promoting tolerance towards commensal flora and ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen presenting cell (APC) types found in a normal thymus and it is well established that they play distinct roles during thymic selection. These cells are localized in distinct microenvironments in the thymus and each APC type makes up only a minor population of cells. To further understand the biology of these cell types, characterization of these cell populations is highly desirable but due to their low frequency, isolation of any of these cell types requires an efficient and reproducible procedure. This protocol details a method to obtain cells suitable for characterization of diverse cellular properties. Thymic tissue is mechanically disrupted and after different steps of enzymatic digestion, the resulting cell suspension is enriched using a Percoll density centrifugation step. For isolation of myeloid DC (CD11c+), cells from the low-density fraction (LDF) are immunoselected by magnetic cell sorting. Enrichment of TEC populations (mTEC, cTEC) is achieved by depletion of hematopoietic (CD45hi) cells from the low-density Percoll cell fraction allowing their subsequent isolation via fluorescence activated cell sorting (FACS) using specific cell markers. The isolated cells can be used for different downstream applications.

This protocol details a method to isolate antigen presenting cells from human thymus via different steps of enzymatic digestion of the tissue followed by density centrifugation of the single cell suspension and finally magnetic and/or FACS sorting of the cell populations of interest.

İnsan Thymus ile myeloid dendritik hücreleri ve epitel hücreleri İzolasyonu

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Isolation of Dendritic Cells from the Human Female Reproductive Tract for Phenotypical and Functional Studies

The characterization of the human dendritic cells (DCs) resident in mucosal tissues is challenging due to the difficulty in obtaining samples, and the low numbers of DCs present per tissue. Yet, as the phenotype and function of DCs is modified by the tissue environment, it is necessary to analyze tissue resident DC populations, since blood derived DCs incompletely reflect the complexities of DCs in tissues. Here we present a protocol to isolate DCs from the human female reproductive tract (FRT) using hysterectomy specimens that allows both phenotypical and functional analyses. The protocol consists of tissue digestion to generate a single cell mixed cell suspension, followed by positive magnetic bead selection. Our tissue digestion protocol does not cleave surface markers, which allows phenotypical and functional analysis of DCs in the steady state, without overnight incubation or cell activation. This protocol can be adapted for the isolation of other immune cell types or isolation of DCs from other tissues.

We describe here a method to isolate and purify dendritic cells from different anatomical compartments in the human female reproductive tract for the evaluation of their phenotypical and functional characteristics. This method can be adapted to isolate other immune cells or dendritic cells from other mucosal tissues.

İnsan dişi üreme yolu dendritik hücreler yalıtım Phenotypical ve fonksiyonel çalışmaları için

The characterization of the human dendritic cells (DCs) resident in mucosal tissues is challenging due to the difficulty in obtaining samples, and the low ...

Isolation and Adoptive Transfer of High Salt Treated Antigen-presenting Dendritic Cells

Excess dietary salt intake contributes to inflammation and plays a vital role in the development of hypertension. We previously found that antigen-presenting dendritic cells (DCs) can sense elevated extracellular sodium leading to the activation of the NADPH oxidase and formation of isolevuglandin (IsoLG)-protein adducts. These IsoLG-protein adducts react with self-proteins and promote an autoimmune-like state and hypertension. We have developed and optimized state-of-the-art methods to study DC function in hypertension. Here, we provide a detailed protocol for isolation, in vitro treatment with elevated sodium, and adoptive transfer of murine splenic CD11c+ cells into recipient mice to study their role in hypertension.

Here, we present a protocol to isolate dendritic cells from murine spleens by magnetic cell sorting and subsequent adoptive transfer into na&#239;ve mice. The model of high-salt activated dendritic cells was chosen to explain the step-by-step procedures of adoptive transfer and flow cytometry.

Yalıtım ve yüksek tuz evlat edinen Transfer dendritik hücreler antijen sunan tedavi

Excess dietary salt intake contributes to inflammation and plays a vital role in the development of hypertension. We previously found that ...

Characterization and Isolation of Mouse Primary Microglia by Density Gradient Centrifugation

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has revealed microglia to be dynamic, capable of assuming both pro-inflammatory and anti-inflammatory phenotypes. Both M1 (pro-inflammatory) and M2 (pro-reparative) phenotypes play an important role in neuroinflammatory conditions such as perinatal brain injury, and exhibit differing functions in response to certain environmental stimuli. The modulation of microglial activation has been noted to confer neuroprotection thus suggesting microglia may have therapeutic potential in brain injury. However, more research is required to better understand the role of microglia in disease, and this protocol facilitates that. The protocol described below combines a density gradient centrifugation process to reduce cellular debris, with magnetic separation, producing a highly pure sample of primary microglial cells that can be used for in vitro experimentation, without the need for 2-3 weeks culturing. Additionally, the characterization steps yield robust functional data about microglia, aiding studies to better our understanding of the polarization and priming of these cells, which has strong implications in the field of regenerative medicine.

A protocol for the isolation of primary microglia from murine brains is presented. This technique aids in furthering the current understanding of neurological conditions. Density gradient centrifugation and magnetic separation are combined to produce sufficient yield of a highly pure sample. Furthermore, we outline the steps for characterization of microglia.

Karakterizasyonu ve yoğunluk Gradient Santrifüjü tarafından fare birincil Microglia izolasyonu

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has ...

Nörobilim

Economical and Efficient Protocol for Isolating and Culturing Bone Marrow-derived Dendritic Cells from Mice

The demand for dendritic cells (DCs) is gradually increasing as immunology research advances. However, DCs are rare in all tissues. The traditional method for isolating DCs primarily involves inducing bone marrow (BM) differentiation into DCs by injecting large doses (&#62;10 ng/mL) of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor/interleukin-4 (GM-CSF/IL-4), making the procedure complex and expensive. In this protocol, using all BM cells cultured in 10 ng/mL GM-CSF/IL-4 medium, after 3-4 half-culture exchanges, up to 2.7 x 107 CD11c+ cells&#160;(DCs) per mouse (two femurs) were harvested with a purity of 80%-95%. After 10 days in culture, the expression of CD11c, CD80, and MHC II increased, whereas the number of cells decreased. The number of cells peaked after 7 days of culture. Moreover, this method only took 10 min to harvest all bone marrow cells, and a high number of DCs were obtained after 1 week of culture.

Here, we present an economical and efficient method to isolate and generate high-purity bone marrow-derived dendritic cells from mice after 7 days of culture with 10 ng/mL GM-CSF/IL-4.

Kemik İliği Kaynaklı Dendritik Hücrelerin Farelerden İzole Edilmesi ve Kültürlenmesi için Ekonomik ve Verimli Protokol

The demand for dendritic cells (DCs) is gradually increasing as immunology research advances. However, DCs are rare in all tissues. The traditional method ...

Bone Marrow-Derived Dendritic Cells Generation: A Method to Generate Dendritic Cells from Mouse Bone Marrow

Source:Nguyen, H. D., et al. <a href="https://www.jove.com/t/60083">Bone Marrow Transplantation Platform to Investigate the Role of Dendritic Cells in Graft-versus-Host Disease.</a> J. Vis. Exp.. (2020).
This video describes a protocol for the generation of dendritic cells--key antigen-presenting cells that activate T cells--from the bone marrow of an adult mouse.

Kemik İliği Kaynaklı Dendritik Hücreler Üretimi: Fare Kemik İliğinden Dendritik Hücreler Üretme Yöntemi

Source:Nguyen, H. D., et al. Bone Marrow Transplantation Platform to Investigate the Role of Dendritic Cells in Graft-versus-Host Disease. J. Vis. Exp.. ...