Diese Arbeit wurde von NIH / NIAID Zuschuss AI45889 zu SAP Flow-Zytometrie unterstützten Studien wurden unter Verwendung von Kernanlagen durch die Einstein Cancer Center (NIH / NCI CA013330) und Zentrum für AIDS-Forschung (NIH / NIAID AI51519) unterstützt FACS durchgeführt.

Tierversuche werden in Übereinstimmung mit genehmigten Richtlinien der institutionellen Tierpflege und Nutzung Ausschuss (IACUC) durchgeführt. Alle Verfahren erfordern Sterilität sind in einem Bio-Sicherheitsschrank durchgeführt. 1. Die Implantation von B16.Flt3L Melanom bei Mäusen <ol><li> Kultur der Flt-3 exprimierenden B16 - Melanomzelllinie in T25 - Gewebekulturkolben in einer Dichte von 0,5 x 10 6 Zellen / ml in komplettem DMEM - Medium mit 10% CO 2 bei 37 ° C. Wachsen, bis die Zellen erreichen ~ 90% Konfluenz (~ 20 h). </li><li> Ernte der Zellen durch Trypsin-Verdau. Absaugen Zellkulturmedien und waschen Sie die anhaftenden Zellen mit PBS. 5 ml 0,05% Trypsin und Inkubation bei 37 ° C für 5 min. Cold 20 ml komplettes DMEM-Medium (4 ° C) fötalem Kälberserum (FCS), enthaltend die Protease-Verdauung zu quenchen. Heben Sie die Zellen aus, indem Sie leicht durch sanftes Auf- und Abpipettieren gefolgt tippen. </li><li> Sammle die Zellen durch Zentrifugation bei 300xg für 10 min bei 4 ° C. Zählen Sie die Zellen mit einer Zählkammer oder eines automatisierten Zelllebensfähigkeit Zähler. Resuspendieren zu einer Dichte von 10 8 Zellen / ml in PBS. </li><li> Implantat - Mäuse (C57BL / 6 oder ein anderes histokompatiblen Stamm) mit Tumorzellen durch subkutane Injektion , wie beschrieben von Machholz et al. 19 an der Basis des Halses mit 100 ul Zellsuspension (10 7 Zellen). </li><li> Lassen Sie den Tumor bis greifbar oder sichtbar zu wachsen (2 bis 10 mm im Durchmesser, in der Regel 7 bis 12 Tage), bevor die Tiere für Organentnahmen zu opfern. </li></ol> 2. Herstellung von Splenic Einzelzellsuspension von Tumor-tragenden Mäusen <ol><li> Anesthetize Mäuse mit einer Überdosis von Isofluran (Flussrate von Isofluran auf&gt; 5% einstellen und weiterhin Anschläge Exposition mindestens 2 Minuten nach der Atmung). Opfere die Flt-3-Melanomtumoren tragenden Mäusen durch Genickbruch gemäß gültiger Richtlinien für Sterbehilfe. </li><li> Disinfect die Haut mit 70% Ethanol und Ernte Milz unter aseptischen Bedingungen mit Hilfe einer sterilen Schere 20. </li><li> Legen Sie die Milz in eine sterile Petrischale für den Transport zur Biosicherheit Schrank. Führen Sie alle Schritte von hier auf unter sterilen Bedingungen. </li><li> Übertragen Milz auf eine frische Petrischale und waschen mit RPMI-Medium. Schneiden Sie die Milz in kleine (~ 0,2 cm 2) Stücke mit einem Skalpell. Inkubieren für 30 min bei 37 ° C mit 10 ml Kollagenase / DNase-Lösung. </li><li> Gießen Sie die teilweise verdaute Suspension von Milzgewebe auf eine 70 um Zelle Sieb. Komprimieren der verbleibenden Gewebefragmente durch die Maschen des Siebs eine 5 ml Spritzenkolben verwendet. </li><li> Waschen Sie den Netzfilter mit 10 ml frischem Medium und entsorgen Sie den Filter. Zentrifugiere die Suspension bei 300 xg für 10 min bei 4 ° C um die Zellen zu pelletieren. </li><li> Aspirieren den Überstand und Zellpellet in 2 ml Puffer RBC-Lyse. Inkubieren bei RT foder 10 min. Quench den Puffer RBC-Lyse von 10 ml komplettem RPMI-Medium hinzugefügt wird. </li><li> Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 300 xg für 5 min bei 4 ° C. Resuspendieren in geeigneten Volumen Zelldichte von 10 8 Zellen / ml in Zellsortierungspuffer (beispielsweise MACS) , enthaltend 20 ug / ml Fc-block - Antikörper (2.4G2) zu erreichen. </li></ol> 3. Reinigung von Plasmazytoide DCs, CD8a Pos DCs und CD8a Neg DCs von Splenic Einzelzellsuspension Hinweis: Isolierung der splenic DC Untergruppen von Einzelzellsuspension ist ein mehrstufiges Verfahren , wie in 1 dargestellt Führen alle Schritte unter Verwendung von vorgekühlten Puffer und einem Eiswasserbad Temperatur bei 4 zu halten - 8 ° C.. Alle Reagenzienvolumina in dem folgenden Abschnitt des Protokolls für eine anfängliche Eingabe von 200 ul splenic Zellsuspension bei 10 8 Zellen / ml) berechnet. Dies kann skaliert werden odernach Bedarf auf nach unten durch das Volumen der Zellsuspension Ändern (immer bei einer Dichte von 1 × 10 8 Zellen / ml) und andere Reagenzien proportional in dem Anfangsschritt (3.1.1 und 3.2.1). Stellen Sie Reagenzvolumina in allen späteren Schritten entsprechend. Wenn beginnend mit 100 &amp; mgr; l von Milz- Zellsuspension zum Beispiel bei 1 x 10 8 / ml, verwenden Sie die Hälfte der angegebenen Reagenzienvolumina in allen Schritten. <ol><li> Isolierung von Plasmazytoide DCs (PDC) <ol><li> In 300 ul Biotin-markierte Antikörper-Cocktail in der plasmazytoiden DC-Extraktions-Kit zu 200 ul splenic Zellsuspension zur Verfügung gestellt. </li><li> Gut mischen und Inkubation in Eiswasser-Bad für 15 min. Tippen Sie das Röhrchen alle 3 min zu halten Zellen suspendiert und zu maximieren Antikörperbindung. </li><li> Hinzufügen 12 ml Zellenpuffer Sortier- und pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 300 x g für 5 min bei 4 ° C. Überstand entfernen ungebundenen biotinylierten Antikörper zu entfernen. </li><li> Resuspendieren der Zellein 500 ul Zellsortierpuffer pelletieren. In 300 ul Anti-Biotin-Antikörper-konjugierten Perlen. Wiederholen Sie Schritt 3.1.2 und 3.1.3. </li><li> Überstand verwerfen und Zellpellet in 2 ml Zellsortierungspuffer. Führen Sie alle Schritte von diesem Zeitpunkt an bei RT mit vorgekühlten Puffer. </li><li> Legen Sie eine frische magnetische activated cell sorting LS Spalte im magnetischen stehen. Waschen und equilibrieren Säule mit 5 ml Zellsortierpuffer. </li><li> Pipette die Zellsuspension auf die Säule, Aufbringen sie sanft in die Mitte der Oberfläche des Säulenbettes. Sammeln Sie die Strömung durch. </li><li> Die Säule wird mit 10 ml Zellsortierungspuffer. Sammeln Sie diese Strömung durch und verbinden sich mit dem Strom durch von Schritt 3.1.7. Die pDCs werden in dieser Spalte Fluss durch (FT1) angereichert. </li><li> Pelletierung der Zellen von FT1 durch Zentrifugation bei 300 xg für 5 min bei 4 ° C, Resuspendieren in 2 ml Zellsortierungspuffer und die Zellen durch eine frische LS Säule passierendurch die Schritte 3.1.6 Wiederholung - 3.1.8. Diese Verwendung von zwei aufeinanderfolgenden Spalten ergibt eine verbesserte Reinheit der isolierten Zellen. </li><li> Pellet Zellen durch Zentrifugation bei 300 xg für 5 min bei 4 ° C und Resuspension mit 2 ml komplettem RPMI. Auf Eis, bis sie benötigt. </li></ol></li><li> Isolierung von CD8a Pos und CD8a Neg DCs Hinweis: Der erste Schritt in diesem Verfahren ist Depletion von B, pDC, T und NK-Zellen. <ol><li> Beginnend mit der ganzen Milz - Zellsuspension (1 ml von 10 ml 8 Zellen / in Schritt 2.8), 100 &amp; mgr; l Biotin-konjugiertem Antikörper - Cocktail im Kit Pos DC Isolations CD8a vorgesehen. </li><li> Gut mischen und Inkubation in Eiswasser-Bad für 15 min. Tippen das Röhrchen sanft alle 3 min Bindung von Biotin-markiertem Antikörper an ihre Zielzellen zu maximieren. </li><li> Hinzufügen 12 ml Zellenpuffer Sortier- und pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 300 xg für 5 min bei 4 ° C. absaugen Supernatant ungebundenen biotinylierten Antikörper zu entfernen. </li><li> Zugabe von 150 ul Zellsortierpuffer und 100 ul anti-Biotin versehen Kügelchen in der CD8a Pos DC - Extraktions - Kit. Gut mischen und Inkubation in Eiswasser-Bad für 15 min. </li><li> 10 ml Zellpuffer Sortier- und pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 300 xg für 5 min bei 4 ° C. </li><li> Die Zellen in 1 ml Zellsortierpuffer und eine neue LS-Säule übergehen nach dem Verfahren in den Schritten 3.1.6 bis 3.1.8. </li><li> Sammeln Sie die unbeschriftete Fluss durch 2 (FT2) und die Spalte Retentat verwerfen. Diese unmarkierten Fraktion wird für CD8a Pos und CD8a Neg DCs angereichert. </li><li> Pelletieren Sie die Zellen in FT2 durch Zentrifugation bei 300 xg für 5 min bei 4 ° C. </li><li> Resuspendieren der Zellen in 1 ml Zellsortierpuffer und mit 200 &amp; mgr; l anti-CD8a konjugierten magnetischen Kügelchen im Kit Pos DC Isolation CD8a zur Verfügung gestellt. </li><li> Vertreteressen Schritte 3.2.2 bis 3.2.6. Der Fluß durch die Säule wird für CD8a Neg DCs angereichert und CD8a Pos DCs abgereichert. Dies wird Fluss durch 3 (FT3) markiert. </li><li> Um die CD8a Pos DCs in der Säule zurückgehalten, entfernen Sie die Säule aus dem Magneten eluieren, 5 ml Zellsortierpuffer und spülen Sie die Spaltenmatrix mit den Kolben mit dem LS - Säule zur Verfügung gestellt. </li><li> Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 300 xg für 5 min bei 4 ° C. Absaugen Überstand und resuspendieren in 1 ml Zellsortierpuffer. Um die Reinheit zu erhöhen, laufen wieder die eluierten Zellen durch eine frische LS-Säule durch die Schritte 3.1.6 bis 3.1.8: Wiederholung, mit Ausnahme der Strömung durch verwerfen und sammeln beibehalten Zellen wie in 3.2.11. </li><li> Um die CD8a Neg DCs aus der FT3 Suspension reinigen, pelletieren Sie die FT3 durch Zentrifugation bei 300 xg für 5 min bei 4 ° C und resuspendieren in 300 &amp; mgr; l Zellsortierungspuffer. </li><li> 100 l anti-CD11c magmagnetischen Perlen. Gut mischen und Inkubation in Eiswasser-Bad für 15 min. </li><li> 10 ml Zellsortierungspuffer und Pellet Zellen durch Zentrifugation bei 300 xg für 5 min bei 4 ° C. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 3.1.5 bis 3.1.8. Die CD8a Neg DCs sind positiv mit CD11c beads ausgewählt und an die Säule gebunden. Die Strömung kann durch verworfen werden. </li><li> Eluieren in der Säule zurückgehalten Zellen als 3.2.11 in Schritt beschrieben , die das gereinigte CD8a Neg DCs zu sammeln. </li></ol></li></ol> 4. Pulsing APCs mit Antigenen und Zelltransfer <ol><li> Zählen Sie die lebenden Zellen nach der Reinigung Trypanblauausschluß 21 zu unterscheiden lebenden und toten Zellen. </li><li> Inkubieren der Zellen mit dem Antigen der Wahl. Verwenden Sie Analoga von Glycolipid - Antigen genannt alpha-Galactosyl - Ceramid (αGalCer) bei 100 nM Konzentration 13. Typischerweise Platte 10 6 lebensfähigen Zellen / Vertiefung in komplettem RPMI - Medium unter Verwendung von Ultra-Low - attachment U-Boden-96-Well-Platten Zellanhaftung zu minimieren. Inkubieren der Zellen in einem 5% CO 2 -Atmosphäre bei 37 ° C für 1 - 4 Stunden. </li><li> Ernten Sie die Zellen durch mehrere Male sanft Pipettieren. Verwenden Sie weite Bohrung Pipettenspitzen Zellschäden durch Scherkräfte zu minimieren. Waschen Sie die Vertiefungen mit PBS und bündeln diese Wäschen Zellernte zu maximieren. </li><li> Pelletieren Sie die Zellen bei 300 g für 5 min bei 4 ° C und Resuspendierung in gewünschte Dichte in PBS. Typischerweise injizieren 1 Million Zellen in 200 ul pro Empfängertier. Halten Sie die Zellen auf Eis zu maximieren Lebensfähigkeit vor der Verabreichung in Wirtstiere. </li><li> Injizieren Zellen intravenös in Mäuse entweder durch den seitlichen Schwanz vergeblich oder dem retroorbitalen Venenplexus 19. Verwenden Sie eine 27 G-Nadel auf einer 1-ml-Spritze und injizieren ein maximales Volumen von 0,1 ml pro Maus. </li></ol>

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	<li>Steinman, R. M., Cohn, Z. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+novel+cell+type+in+peripheral+lymphoid+organs+of+mice.+I.+Morphology,+quantitation,+tissue+distribution.">Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice. I. Morphology, quantitation, tissue distribution.</a> J Exp Med. 137 (5), 1142-1162 (1973).</li><li>Banchereau, J., Steinman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+and+the+control+of+immunity.">Dendritic cells and the control of immunity.</a> Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).</li><li>Dudziak, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+antigen+processing+by+dendritic+cell+subsets+in+vivo.">Differential antigen processing by dendritic cell subsets in vivo.</a> Science. 315 (5808), 107-111 (2007).</li><li>Belz, G. T., Nutt, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+programming+of+the+dendritic+cell+network.">Transcriptional programming of the dendritic cell network.</a> Nat Rev Immunol. 12 (2), 101-113 (2012).</li><li>den Haan, J. M., Bevan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutive+versus+activation-dependent+cross-presentation+of+immune+complexes+by+CD8(+)+and+CD8(-)+dendritic+cells+in+vivo.">Constitutive versus activation-dependent cross-presentation of immune complexes by CD8(+) and CD8(-) dendritic cells in vivo.</a> J Exp Med. 196 (6), 817-827 (2002).</li><li>Carbone, F. R., Kurts, C., Bennett, S. R., Miller, J. F., Heath, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-presentation:+a+general+mechanism+for+CTL+immunity+and+tolerance.">Cross-presentation: a general mechanism for CTL immunity and tolerance.</a> Immunol Today. 19 (8), 368-373 (1998).</li><li>Yamazaki, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8++CD205++splenic+dendritic+cells+are+specialized+to+induce+Foxp3++regulatory+T+cells.">CD8+ CD205+ splenic dendritic cells are specialized to induce Foxp3+ regulatory T cells.</a> J Immunol. 181 (10), 6923-6933 (2008).</li><li>Mukherjee, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DEC-205-mediated+antigen+targeting+to+steady-state+dendritic+cells+induces+deletion+of+diabetogenic+CD8(+)+T+cells+independently+of+PD-1+and+PD-L1.">DEC-205-mediated antigen targeting to steady-state dendritic cells induces deletion of diabetogenic CD8(+) T cells independently of PD-1 and PD-L1.</a> Int Immunol. 25 (11), 651-660 (2013).</li><li>Melief, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mini-review:+Regulation+of+cytotoxic+T+lymphocyte+responses+by+dendritic+cells:+peaceful+coexistence+of+cross-priming+and+direct+priming.">Mini-review: Regulation of cytotoxic T lymphocyte responses by dendritic cells: peaceful coexistence of cross-priming and direct priming.</a> Eur J Immunol. 33 (10), 2645-2654 (2003).</li><li>Bendelac, A., Savage, P. B., Teyton, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+NKT+cells.">The biology of NKT cells.</a> Annu Rev Immunol. 25, 297-336 (2007).</li><li>Benlagha, K., Bendelac, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD1d-restricted+mouse+V+alpha+14+and+human+V+alpha+24+T+cells:+lymphocytes+of+innate+immunity.">CD1d-restricted mouse V alpha 14 and human V alpha 24 T cells: lymphocytes of innate immunity.</a> Semin Immunol. 12 (6), 537-542 (2000).</li><li>Brennan, P. J., Brigl, M., Brenner, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invariant+natural+killer+T+cells:+an+innate+activation+scheme+linked+to+diverse+effector+functions.">Invariant natural killer T cells: an innate activation scheme linked to diverse effector functions.</a> Nature reviews. Immunology. 13 (2), 101-117 (2013).</li><li>Arora, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+subset+of+dendritic+cells+controls+the+cytokine+bias+of+natural+killer+T+cell+responses+to+diverse+glycolipid+antigens.">A single subset of dendritic cells controls the cytokine bias of natural killer T cell responses to diverse glycolipid antigens.</a> Immunity. 40 (1), 105-116 (2014).</li><li>Semmling, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+cross-priming+through+CCL17-CCR4-mediated+attraction+of+CTLs+toward+NKT+cell-licensed+DCs.">Alternative cross-priming through CCL17-CCR4-mediated attraction of CTLs toward NKT cell-licensed DCs.</a> Nat Immunol. 11 (4), 313-320 (2010).</li><li>Duriancik, D. M., Hoag, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+identification+and+enumeration+of+dendritic+cell+populations+from+individual+mouse+spleen+and+Peyer's+patches+using+flow+cytometric+analysis.">The identification and enumeration of dendritic cell populations from individual mouse spleen and Peyer's patches using flow cytometric analysis.</a> Cytometry A. 75 (11), 951-959 (2009).</li><li>Karsunky, H., Merad, M., Cozzio, A., Weissman, I. L., Manz, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flt3+ligand+regulates+dendritic+cell+development+from+Flt3++lymphoid+and+myeloid-committed+progenitors+to+Flt3++dendritic+cells+in+vivo.">Flt3 ligand regulates dendritic cell development from Flt3+ lymphoid and myeloid-committed progenitors to Flt3+ dendritic cells in vivo.</a> J Exp Med. 198 (2), 305-313 (2003).</li><li>Mach, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+dendritic+cells+stimulated+in+vivo+by+tumors+engineered+to+secrete+granulocyte-macrophage+colony-stimulating+factor+or+Flt3-ligand.">Differences in dendritic cells stimulated in vivo by tumors engineered to secrete granulocyte-macrophage colony-stimulating factor or Flt3-ligand.</a> Cancer Res. 60 (12), 3239-3246 (2000).</li><li>Vremec, D., Segura, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+purification+of+large+numbers+of+antigen+presenting+dendritic+cells+from+mouse+spleen.">The purification of large numbers of antigen presenting dendritic cells from mouse spleen.</a> Methods Mol Biol. 960, 327-350 (2013).</li><li>Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manual+restraint+and+common+compound+administration+routes+in+mice+and+rats.">Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats.</a> J Vis Exp. (67), (2012).</li><li>Reeves, J. P., Reeves, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unit+1.9,+Removal+of+lymphoid+organs.">Unit 1.9, Removal of lymphoid organs.</a> Curr Protoc Immunol. , (2001).</li><li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appendix+3B,+Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability.">Appendix 3B, Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Curr Protoc Immunol. , (2001).</li><li>Vremec, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintaining+dendritic+cell+viability+in+culture.">Maintaining dendritic cell viability in culture.</a> Mol Immunol. 63 (2), 264-267 (2015).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Dendritische Zellen werden akzeptiert die wichtigsten professionellen Antigen zu sein Zellen beteiligt in der Priming von T-Zell-Antworten zu präsentieren. Ihre Hauptfunktion ist es, die Gewebe-Mikroumgebung Umfrage durch die Aufnahme und Verarbeitung von Antigenen für die Präsentation an T-Zellen. Um die Funktion von spezifischen DC Untergruppen zu untersuchen, müssen diese in ausreichender Zahl isoliert werden, um einen Ansatz, der ihren normalen Phänotyp und Funktionen beibehält. Die meisten Protokolle basieren...

Dendritische Zellen (DC) wurden vor fast vierzig Jahren entdeckt , als die &quot;große stel (griechisch Dendron) Zelle&quot; 1 in lymphatischen Organen. Viele Studien haben gezeigt , dass DCs die einzigen Antigen - präsentierende Zellen sind , die effektiv naiver T - Zellen zu stimulieren 2. Eine wichtige Funktion dieser Zellen ist die Aufnahme und Präsentation von Antigenen und deren effiziente Verarbeitung und Laden derselben auf Antigen-präsentierenden Molekülen. In der Milz der Maus können DCs in plasmazytoiden und konventionelle Subsets getrennt werden. Die plasmazytoiden DCs zeichnen sich durch niedrige Expression von CD11c und ein hohes Maß an B220 und Gr-1 aus. Sie sind auch positiv für die Oberflächenmarker mPDCA1 und absondern Typ I in Reaktion auf maut Interferon like Rezeptor 9 (TLR9) Liganden. Die herkömmlichen DCs sind hoch für CD11c und MHC-Klasse-II-Expression. Sie können auf der Grundlage der Oberflächenexpression von phänotypischen Markern wie CD4, CD8a, DEC205, CD in drei verschiedene Untergruppen aufgeteilt werden,11b und dendritischen Zellen hemmenden Rezeptor 2 (DCIR2, anerkannt durch den 33D1 - Antikörper) Proteine ​​3,4. Die CD8a Pos DCs sind auch als CDC1 bekannt ist , sind positiv für DEC205, aber negativ für myeloische Marker wie CD11b und 33D1. Die CD8a Neg DCs, auch cdc2 genannt, sind positiv für 33D1, CD11b und CD4 aber es fehlt DEC205. Die doppelt negative Untergruppe (dh negativ für beide CD4 und CD8a) ist relativ selten, und ist negativ für DEC205 und 33D1. Es ist die am wenigsten charakterisierten Teilmenge und kann eine weniger differenzierte Form von CD8a Neg DC sein. Phänotypischen Unterschiede in den verschiedenen Teilmengen DC auch auf ihre in vivo - Funktionen erweitern. Die CD8a Neg DCs sind stark phagozytierenden und werden gedacht , exogene Antigen zu präsentieren hauptsächlich über MHC - Klasse - II an CD4 - T - Zellen 3. Im Gegensatz dazu sind die CD8a Pos DCs Fach zur Präsentation von löslichem Protein - Antigen auf MHC - Klasse Iin einem Mechanismus Kreuzpräsentation genannt. Das Ergebnis der Kreuzpräsentation hängt von der Aktivierungsstatus dieser DCs 5, und kann entweder zur Expansion von zytotoxischen T - Zellen (CTL) oder die Entwicklung von regulatorischen T - Zellen 6 2,7 führen. Targeting von Antigen an CD8a Pos DCs unter Verwendung von Anti-DEC205-Antikörper-vermittelte Abgabe resultiert im Wesentlichen in der Streichung von T - Zellen 8, während Präsentation von infizierten apoptotischen Zellen abgeleiteten Antigenen induziert eine starke CTL - Antwort 9. Zusätzlich zur Erkennung von Peptidantigenen, hat das Immunsystem von Säugetieren entwickelt Lipid und Glycolipid-Antigene zu erkennen. Diese Antigene werden von CD1-Molekülen präsentiert werden, welche MHC-Klasse-I-like Zelloberflächenproteine, die in mehreren verwandten Formen in verschiedenen Säugetieren existieren. Bei Mäusen, die so genannte eine einzige Art von hochkonservierten CD1 - Molekül ist CD1d verantwortlich für die Präsentation von Glycolipid - Antigenen 10. Der Bürgermeister<html> Population von T-Zellen, die CD1d / Glykolipid Komplexe erkennen ist invariant NKT-Zellen (iNKT Zellen) genannt. Diese Zellen exprimieren ein semi-invariant T - Zell - Rezeptor (TCR) einer invariant TCR &amp; agr; Kette zusammengesetzt , die mit TCR &amp; bgr; Ketten gekoppelt ist , die 11 Vielfalt begrenzt haben. Im Gegensatz zu herkömmlichen T - Zellen , die aktiviert Effektor - T - Zellen zu vermehren und zu differenzieren müssen zu werden, existieren iNKT Zellen als Effektor Bevölkerung und beginnen schnell nach Glykolipid Verwaltung 12 reagiert. Identifizierung von physiologisch relevanten präsentierenden Zellen Lipid-Antigen ist ein aktives Forschungsgebiet, und mehrere verschiedene Zelltypen, wie beispielsweise B-Zellen, Makrophagen und DCs wurden vorgeschlagen, um diese Funktion auszuführen. Es wurde jedoch gezeigt , dass die CD8a Pos Teilmenge von DCs die primäre Zelle ist vermittelnde Aufnahme und Präsentation von Antigenen auf Lipid Maus iNKT Zellen 13 und Glycolipid - vermittelten cross-Priming von CD8 - T - Zellen 14. ove_content &quot;&gt; Um die Effizienz der Antigen-Präsentation durch verschiedene Antigen-präsentierende Zellen zu vergleichen, ein einfacher Ansatz ist, verschiedene Arten von gereinigten APCs gepulst mit äquivalenten Mengen an Antigen in naiven hosts. Cell Transfer Experimente dieses Typs übertragen werden häufig für immunologische Untersuchungen durchgeführt. Allerdings Durchführen eines Transferstudien mit ex vivo Antigen behandelt DCs ist eine Herausforderung, da diese Zellen so selten Populationen in lymphatischen Organen bestehen , wo sie machen weniger als 2% der gesamten Zellen 15. daher ist es notwendig , die Entwicklung dieser Zellen in Spendertiere zu verbessern die Effizienz der Isolation Protokolle zu erhöhen. Es ist bekannt , dass die gemeinsame lymphoiden und myeloiden Vorläufern gemeinsamen, die zur Erzeugung von pDC, CD8 Pos und CD8 Neg DC Subsets express fms-verwandte Rezeptor - Tyrosinkinase 3 (Flt-3) erforderlich sind. Bei der In - vivo - Flt-3 - Ligand (Flt-3L) Verwaltung, emigratIon von Flt-3 - Vorläuferzellen aus dem Knochenmark exprimiert , wird erhöht, 16 in der erhöhten Aussaat von peripheren lymphatischen Organen und den Ausbau ihrer reifen DC Nachkommen zur Folge hat . Die Expression von Flt-3 wird während der Verpflichtung zur B, T oder NK-Zell-Differenzierungswege verloren. Daher ist nur eine minimale Veränderungen in diesen Zellen auf Flt-3L Verabreichung beobachtet. Ähnliche Expansion in DC - Populationen in Mäusen beobachtet tragenden Tumoren , die durch Implantation eines B16-Melanomzelllinie sekretierenden murinen Flt-3L, die für die Bereitstellung anhalt systemische Spiegel von Flt-3L 17,18 , ein einfaches und wirtschaftliches Verfahren zur Verfügung stellt. Unter Verwendung dieses Ansatzes haben wir ein Protokoll basiert auf der Implantation von B16-Melanomzellen sezer Flt-3L entwickelt, um die Expansion aller normalen DC Untergruppen in der Milz der Maus zu stimulieren und somit erheblich die Ausbeuten dieser Zellen zu erhöhen, die für die nachfolgenden Experimenten isoliert werden kann . Wir finden immer wieder, dass innerhalb von 10 bis 14 Tagen nach subkutaner imPlantage des Tumors Flt-3 sezernierenden, Mäuse entwickeln Splenomegalie mit deutlichen Anreicherung von DCs 40 zu bilden - 60% der gesamten Milz-Zellen. Aus diesen Milzen können verschiedene DC Untergruppen mit hoher Reinheit unter Verwendung von handelsüblichen Zellreinigung Kits isoliert werden, die Teilmenge spezifischen phänotypischen Marker verwenden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA&#160;</td>
			<td>Life Technologies, Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CDS019936-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase D&#160;</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>11088858001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I (dry powder)</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>79254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 proof ethanol&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>9-6705-004-220</td>
			<td>Used to prepare 70% ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBC lysis buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R7757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 medium with L-glutamine&#160;</td>
			<td>Life Technologies, Gibco</td>
			<td>11875-119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM medium with L-glutamine&#160;</td>
			<td>Life Technologies, Gibco</td>
			<td>11995-073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 mM L-glutamine&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM non-essential amino acids&#160;</td>
			<td>Life Technologies, Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM essential amino acids&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11130-051&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol&#160;</td>
			<td>Life Technologies, Invitrogen</td>
			<td>21985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES&#160;</td>
			<td>Life Technologies, Invitrogen</td>
			<td>15630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS Ca2+ and Mg2+ free pH 7.2)</td>
			<td>Life Technologies, Invitrogen</td>
			<td>20012-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s PBS (DPBS with Ca2+ and Mg2+)</td>
			<td>Life Technologies, Gibco</td>
			<td>14040-182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M Ethylenediaminetetraacetate (EDTA) solution&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15575-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11050&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin&#160;</td>
			<td>Life Technologies, Invitrogen</td>
			<td>15140-163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue (dry powder)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6146-5G&#160;</td>
			<td>Prepare 0.08% with PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmacytoid Dendritic Cell Isolation Kit II, mouse</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-092-786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic beads conjugated with anti-mouse CD11c&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-152-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8&#945;Pos mouse DC isolation kit&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-091-169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc-gamma receptor blocking antibody (Clone 2.4G2)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD11c-FITC&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD8&#945;-PerCP&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse B220-PE&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml syringes&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>26048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23 G1 needle&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>305145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Petri dishes&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical instruments&#160;</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>INSMOUSEKIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer (70 &#181;m&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Petri plates&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum filtration system (500 ml(0.22 um&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS columns&#160;</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stand MACS separator&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide-bore 200 &#956;l pipette tips&#160;</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>111623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning ultra-low attachment 96-well plates&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS3474-24EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-8 week old female C57BL/6 mice&#160;</td>
			<td>Jackson Research Laboratories, Jax</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine B16.Flt3L melanoma cell line</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>described by Mach et al. ,2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serum free DMEM and RPMI media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 ml DMEM with L-glutamine, or 500 ml RPMI-1640 with L-glutamine 
			 
			5 ml MEM nonessential amino acids (100x, 10 mM)&#160;&#160;&#160;&#160; 
			 
			5 ml HEPES Buffer (1 M)&#160;&#160;&#160;&#160; 
			 
			5 ml L-glutamine (200 mM)&#160; 
			 
			0.5 ml 2-mercaptoethanol (5.5 x 10-2 M)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix all the ingredients in a biosafety cabinet with either DMEM or RPMI media depending on your need.&#160; Filter sterilize the media by passing through a 0.22 &#181;m vacuum filtration system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete RPMI and DMEM media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Add 50 ml of heat inactivated fetal calf serum to serum free RPMI or DMEM media to obtain complete media.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS buffer:&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Add 2 ml of 0.5 M EDTA and 10 ml of heat inactivated fetal calf serum to 500 ml of Phosphate-buffered saline (PBS, Ca2+ and Mg2+ Free, pH 7.2) and 2 ug/ml 2.4G2 (Fc-Block antibody).&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS staining buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dissolve sodium azide to 0.05% (0.25 g per 500 ml) in MACS buffer to obtain FACS staining buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Collagenase D and DNase 1 stock solution 
			Dissolve 1 g of collagenase D and 0.2 ml of DNase 1 stock (1 mg/ml, 100x) in 20 ml of PBS containing Ca++ and Mg++ to obtain a solution of approximately 1,000-</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2,000 Units of collagenase activity per ml 
			 
			This 10x stock solution can be prepared ahead of time and stored at -20 &#176;C for several weeks. Dilute 1 ml of this with 9 ml of serum free RPMI immediately before use</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an efficient and high yield method for isolation of mouse dendritic cell subsets

Dendritische Zellen (DCs) sind professionelle Antigen-präsentierende Zellen, in erster Linie verantwortlich für die Erfassung, Verarbeitung und Antigenen auf Antigen-präsentierenden Molekülen präsentiert T-Zellen vermittelte Immunität zu initiieren. Dendritische Zellen können in mehrere phänotypisch und funktionell heterogenen Untergruppen getrennt werden. Drei wichtige Untergruppen von Milz- dendritischen Zellen sind plasmazytoiden, CD8a Pos und CD8a Neg Zellen. Die plasmazytoiden DCs sind natürliche Produzenten von Typ I Interferon und sind wichtig für die anti-virale T-Zell-Immunität. Die CD8a Neg DC Teilmenge wird für MHC - Klasse - II - Antigen - Präsentation spezialisiert und ist in Priming CD4 - T - Zellen zentral beteiligt. Die CD8a Pos DCs sind in erster Linie verantwortlich für die Kreuzpräsentation von exogenen Antigenen und CD8 T - Zellen - Priming. Die CD8a Pos DCs nachgewiesen wurden bei der Präsentation von Glycolipid - Antigenen durch CD1d Moleküle an eine spezialisierte T cel am effizientestenl Bevölkerung als unveränderliche natürliche Killer-T (iNKT) Zellen bekannt. Verabreichung von Flt-3-Ligand erhöht die Frequenz der Migration der dendritischen Zellvorläuferzellen aus Knochenmark, letztendlich in Expansion der dendritischen Zellen in peripheren lymphoiden Organen in murinen Modellen resultiert. Wir haben dieses Modell angepasst für eine große Anzahl von funktionellen dendritischen Zellen zu reinigen , die Verwendung in der Zellübertragung Experimente in vivo Fähigkeits verschiedener DC Untergruppen zu vergleichen.

Die Ergebnisse dieses Verfahrens beruht auf der Expansion des DC Untergruppen durch murine Flt-3L durch die implantierten Melanomzellen exprimiert wird. Der B16.Flt3L Tumor wurde aus einer C57BL / 6-Maus abgeleitet und sollte mit diesem Stamm Hintergrund, um in Tiere implantiert werden Versagen des Tumors zu vermeiden wegen Ablehnung zu etablieren. In einigen Fällen kann es wünschenswert sein, genetisch veränderte Mäuse verwenden DCs mit bekannten Defekten in Signalwege oder Rezeptor...

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An Efficient and High Yield Method for Isolation of Mouse Dendritic Cell Subsets

Distinct dendritic cell subsets exist as rare populations in lymphoid organs, and therefore are challenging to isolate in sufficient numbers and purity for immunological experiments. Here we describe a high efficiency, high yield method for isolation of all of the currently known major subsets of mouse splenic dendritic cells.

Eine effiziente und High-Yield-Methode zur Isolierung von Maus über dendritische Zellen Subsets

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen ...

an-efficient-high-yield-method-for-isolation-mouse-dendritic-cell

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

15.1K Aufrufe.  Albert Einstein College of Medicine. Distinct dendritic cell subsets exist as rare populations in lymphoid organs, and therefore are challenging to isolate in sufficient numbers and purity for immunological experiments. Here we describe a high efficiency, high yield method for isolation of all of the currently known major subsets of mouse splenic dendritic cells.

Serie: An Efficient and High Yield Method for Isolation of Mouse Dendritic Cell Subsets

Optimized Protocol for Efficient Transfection of Dendritic Cells without Cell Maturation

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection of pathogenic antigen by na&iuml;ve DCs is through pattern recognition receptors (PRRs) which are able to recognize specific conserved structures referred to as pathogen-associated molecular patterns (PAMPS). Detection of PAMPs by DCs triggers an intracellular signaling cascade resulting in their activation and transformation to mature DCs. This process is typically characterized by production of type 1 interferon along with other proinflammatory cytokines, upregulation of cell surface markers such as MHCII and CD86 and migration of the mature DC to draining lymph nodes, where interaction with T cells initiates the adaptive immune response2,3. Thus, DCs link the innate and adaptive immune systems. 
The ability to dissect the molecular networks underlying DC response to various pathogens is crucial to a better understanding of the regulation of these signaling pathways and their induced genes. It should also help facilitate the development of DC-based vaccines against infectious diseases and tumors. However, this line of research has been severely impeded by the difficulty of transfecting primary DCs4.
Virus transduction methods, such as the lentiviral system, are typically used, but carry many limitations such as complexity and bio-hazardous risk (with the associated costs)5,6,7,8. Additionally, the delivery of viral gene products increases the immunogenicity of those transduced DCs9,10,11,12. Electroporation has been used with mixed results13,14,15, but we are the first to report the use of a high-throughput transfection protocol and conclusively demonstrate its utility.
In this report we summarize an optimized commercial protocol for high-throughput transfection of human primary DCs, with limited cell toxicity and an absence of DC maturation16. Transfection efficiency (of GFP plasmid) and cell viability were more than 50% and 70% respectively. FACS analysis established the absence of increase in expression of the maturation markers CD86 and MHCII in transfected cells, while qRT-PCR demonstrated no upregulation of IFN&beta;. Using this electroporation protocol, we provide evidence for successful transfection of DCs with siRNA and effective knock down of targeted gene RIG-I, a key viral recognition receptor16,17, at both the mRNA and protein levels.

We present our optimized high-throughput nucleofection protocol as an efficient way of transfecting primary human monocyte-derived dendritic cells with either plasmid DNA or siRNA without causing cell maturation. We further provide evidence for successful siRNA silencing of targeted gene RIG-I at both the mRNA and protein levels.

Optimiertes Protokoll für die effiziente Transfektion von dendritischen Zellen ohne Zell-Reifung

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Isolation of Mouse Lung Dendritic Cells

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the respiratory tract. At least three main subsets of lung dendritic cells have been described in mice: conventional DC (cDC) 4, plasmacytoid DC (pDC) 5 and the IFN-producing killer DC (IKDC) 6,7. The cDC subset is the most prominent DC subset in the lung 8. 
The common marker known to identify DC subsets is CD11c, a type I transmembrane integrin (&beta;2) that is also expressed on monocytes, macrophages, neutrophils and some B cells 9. In some tissues, using CD11c as a marker to identify mouse DC is valid, as in spleen, where most CD11c+ cells represent the cDC subset which expresses high levels of the major histocompatibility complex class II (MHC-II). However, the lung is a more heterogeneous tissue where beside DC subsets, there is a high percentage of a distinct cell population that expresses high levels of CD11c bout low levels of MHC-II. Based on its characterization and mostly on its expression of F4&#47;80, an splenic macrophage marker, the CD11chiMHC-IIlo lung cell population has been identified as pulmonary macrophages 10 and more recently, as a potential DC precursor 11. 
In contrast to mouse pDC, the study of the specific role of cDC in the pulmonary immune response has been limited due to the lack of a specific marker that could help in the isolation of these cells. Therefore, in this work, we describe a procedure to isolate highly purified mouse lung cDC. The isolation of pulmonary DC subsets represents a very useful tool to gain insights into the function of these cells in response to respiratory pathogens as well as environmental factors that can trigger the host immune response in the lung.

A highly purified preparation of mouse lung dendritic cells is described. Specific emphasis is given to the isolation of conventional dendritic cell subset.

Isolierung von Maus Lung Dendritischen Zellen

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the ...

Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine

Within the intestine reside unique populations of innate and adaptive immune cells that are involved in promoting tolerance towards commensal flora and food antigens while concomitantly remaining poised to mount inflammatory responses toward invasive pathogens1,2. Antigen presenting cells, particularly DCs and macrophages, play critical roles in maintaining intestinal immune homeostasis via their ability to sense and appropriately respond to the microbiota3-14. Efficient isolation of intestinal DCs and macrophages is a critical step in characterizing the phenotype and function of these cells. While many effective methods of isolating intestinal immune cells, including DCs and macrophages, have been described6,10,15-24, many rely upon long digestions times that may negatively influence cell surface antigen expression, cell viability, and/or cell yield. Here, we detail a methodology for the rapid isolation of large numbers of viable, intestinal DCs and macrophages. Phenotypic characterization of intestinal DCs and macrophages is carried out by directly staining isolated intestinal cells with specific fluorescence-labeled monoclonal antibodies for multi-color flow cytometric analysis. Furthermore, highly pure DC and macrophage populations are isolated for functional studies utilizing CD11c and CD11b magnetic-activated cell sorting beads followed by cell sorting.

Here, we detail a methodology for the rapid isolation of mouse intestinal dendritic cells (DCs) and macrophages. Phenotypic characterization of intestinal DCs and macrophages is performed using multi-color flow cytometric analysis while magnetic bead enrichment followed by cell sorting is used to yield highly pure populations for functional studies.

Isolierung und Charakterisierung von dendritischen Zellen und Makrophagen aus dem Mausdarm

Within the intestine reside unique populations of innate and adaptive immune cells that are involved in promoting tolerance towards commensal flora and ...

Isolation of Precursor B-cell Subsets from Umbilical Cord Blood

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for isolating precursor B-cells at four different stages of differentiation. Because genes are expressed and epigenetic modifications occur in a tissue specific manner, it is vital to discriminate between tissues and cell types in order to be able to identify alterations in the genome and the epigenome that may lead to the development of disease. This method can be adapted to any type of cell present in umbilical cord blood at any stage of differentiation.	
This method comprises 4 main steps. First, mononuclear cells are separated by density centrifugation. Second, B-cells are enriched using biotin conjugated antibodies that recognize and remove non B-cells from the mononuclear cells. Third the B-cells are fluorescently labeled with cell surface protein antibodies specific to individual stages of B-cell development. Finally, the fluorescently labeled cells are sorted and individual populations are recovered. The recovered cells are of sufficient quantity and quality to be utilized in downstream nucleic acid assays.

Here we describe a protocol for isolating subsets of precursor B-cells from umbilical cord blood. A sufficient quantity and quality of nucleic acids may be extracted from the cells and used in subsequent assays utilizing DNA or RNA.

Isolierung von Precursor B-Zell-Subsets aus Nabelschnurblut

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen presenting cell (APC) types found in a normal thymus and it is well established that they play distinct roles during thymic selection. These cells are localized in distinct microenvironments in the thymus and each APC type makes up only a minor population of cells. To further understand the biology of these cell types, characterization of these cell populations is highly desirable but due to their low frequency, isolation of any of these cell types requires an efficient and reproducible procedure. This protocol details a method to obtain cells suitable for characterization of diverse cellular properties. Thymic tissue is mechanically disrupted and after different steps of enzymatic digestion, the resulting cell suspension is enriched using a Percoll density centrifugation step. For isolation of myeloid DC (CD11c+), cells from the low-density fraction (LDF) are immunoselected by magnetic cell sorting. Enrichment of TEC populations (mTEC, cTEC) is achieved by depletion of hematopoietic (CD45hi) cells from the low-density Percoll cell fraction allowing their subsequent isolation via fluorescence activated cell sorting (FACS) using specific cell markers. The isolated cells can be used for different downstream applications.

This protocol details a method to isolate antigen presenting cells from human thymus via different steps of enzymatic digestion of the tissue followed by density centrifugation of the single cell suspension and finally magnetic and/or FACS sorting of the cell populations of interest.

Isolierung von myeloider dendritischer Zellen und Epithelzellen Menschliche Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of free merozoites from the blood by phagocytic cells. However assessing the functional efficacy of merozoite specific opsonizing antibodies is challenging due to the short half-life of merozoites and the variability of primary phagocytic cells. Described in detail herein is a method for generating viable merozoites using the E64 protease inhibitor, and an assay of merozoite opsonin-dependent phagocytosis using the pro-monocytic cell line THP-1. E64 prevents schizont rupture while allowing the development of merozoites which are released by filtration of treated schizonts. &#160;Ethidium bromide labelled merozoites are opsonized with human plasma samples and added to THP-1 cells. Phagocytosis is assessed by a standardized high throughput protocol. Viable merozoites are a valuable resource for assessing numerous aspects of P. falciparum biology, including assessment of immune function. Antibody levels measured by this assay are associated with clinical immunity to malaria in naturally exposed individuals. The assay may also be of use for assessing vaccine induced antibodies. &#160;

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

Measuring antibody function is key to understanding immunity to Plasmodium falciparum malaria. This method describes the purification of viable merozoites, and measurement of opsonization-dependent phagocytosis by flow cytometry.

High Yield Reinigung von<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Merozoiten Zur Verwendung in opsonierende Antikörper-Assays

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition of cognate antigen presented on MHC class II. The cytokine signals present in the environment at the time of TCR activation are a major factor in determining the effector fate of a na&#239;ve CD4+ T cell. Although the cytokine environment during na&#239;ve T cell activation may be complex and involve both redundant and opposing signals in vivo, the addition of various cytokine combinations during naive CD4+ T cell activation in vitro can readily promote the establishment of effector T helper lineages with hallmark cytokine and transcription factor expression. Such differentiation experiments are commonly used as a first step for the evaluation of targets believed to promote or inhibit the development of certain CD4+ T helper subsets. The addition of mediators, such as signaling agonists, antagonists, or other cytokines, during the differentiation process can also be used to study the influence of a particular target on T cell differentiation. Here, we describe a basic protocol for the isolation of na&#239;ve T cells from mouse and the subsequent steps necessary for polarizing na&#239;ve cells to various T helper effector lineages in vitro.

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Na&#239;ve CD4+ T cells polarize to various subsets depending on the environment at the time of activation. The differentiation of na&#239;ve CD4+ T cells to various effector subsets can be achieved in vitro through the addition of T cell receptor stimuli and specific cytokine signals.

Maus Naive CD4<sup&gt; +</sup&gt; T-Zell-Isolierung und<em&gt; In-vitro-</em&gt; Differenzierung in T-Zell-Populationen

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident cells. A key mechanism of this inflammatory response is the migration of circulating immune cells to the ischemic brain facilitated by chemokine release and increased endothelial adhesion molecule expression. Brain-invading leukocytes are well-known contributing to early-stage secondary ischemic injury, but their significance for the termination of inflammation and later brain repair has only recently been noticed.
Here, a simple protocol for the efficient isolation of immune cells from the ischemic mouse brain is provided. After transcardial perfusion, brain hemispheres are dissected and mechanically dissociated. Enzymatic digestion with Liberase&#160;is followed by density gradient (such as Percoll) centrifugation to remove myelin and cell debris. One major advantage of this protocol is the single-layer density gradient procedure which does not require time-consuming preparation of gradients and can be reliably performed. The approach yields highly reproducible cell counts per brain hemisphere and allows for measuring several flow cytometry panels in one biological replicate. Phenotypic characterization and quantification of brain-invading leukocytes after experimental stroke may contribute to a better understanding of their multifaceted roles in ischemic injury and repair.

Inflammation plays a central role in the pathogenesis of ischemic stroke. Increasing evidence suggests that it acts as a double-edged sword which exacerbates early brain injury, but also contributes to later repair. This protocol describes the isolation of immune cells from the ischemic brain and their subsequent flow cytometric phenotyping.

Isolation und Analyse über Durchflusszytometrie von Immunzellen aus dem ischämischen Gehirn der Maus

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. Regulatory systems that utilize intracellular cyclic di-GMP (c-di-GMP) as a second messenger are one such class of target. c-di-GMP is a signaling molecule found in almost all bacteria that acts to regulate an extensive range of processes including antibiotic resistance, biofilm formation and virulence. The understanding of how c-di-GMP signaling controls aspects of antibiotic resistant biofilm development has suggested approaches whereby alteration of the cellular concentrations of the nucleotide or disruption of these signaling pathways may lead to reduced biofilm formation or increased susceptibility of the biofilms to antibiotics. We describe a simple high-throughput bioreporter protocol, based on green fluorescent protein (GFP), whose expression is under the control of the c-di-GMP responsive promoter cdrA, to rapidly screen for small molecules with the potential to modulate c-di-GMP cellular levels in Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). This simple protocol can screen upwards of 3,500 compounds within 48 hours and has the ability to be adapted to multiple microorganisms.

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

This article describes the high-throughput assay that has been successfully established to screen large libraries of small molecules for their potential ability to manipulate cellular levels of cyclic di-GMP in Pseudomonas aeruginosa, providing a new powerful tool for antibacterial drug discovery and compound testing.

Einrichtung eines Setup-Hochdurchsatz-Screening für kleine Moleküle, die Modulate c-di-GMP-Signalisierung in<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method enables researchers to better understand the characteristics of a single cell population without the influence of other cells. Compared to other methods of cell enrichment, such as magnetic-activated cell sorting (MCS), FACS is more flexible and accurate for cell separation due to the ability of phenotype detection by flow cytometry. In addition, FACS is usually capable of separating multiple cell populations simultaneously, which improves the efficiency and diversity of experiments. Although FACS has some limitations, it has been broadly used to purify cells for functional studies in both in vitro and in vivo settings. Here we report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate a very rare population of immune cells, plasmacytoid dendritic cells (pDC), with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for in vitro functional studies of pDC.

We report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate plasmacytoid dendritic cells (pDC) with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for functional studies of pDC.

Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung zur Reinigung von Plasmazytoide dendritischer Zellen aus dem Knochenmark der Maus

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Eine effiziente und High-Yield-Methode zur Isolierung von Maus über dendritische Zellen Subsets

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