Funding was provided by the Austrian Science Fund FWF grant No. P-22969-B11 to F. Ferraguti, and by the Charitable Hertie Foundation and the Werner Reichardt Centre for Integrative Neuroscience and by the DFG (CIN-Exc. 307) to I. Ehrlich.

<ol>
	<li>Fujimoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SDS-digested+freeze-fracture+replica+labeling+electron+microscopy+to+study+the+two-dimensional+distribution+of+integral+membrane+proteins+and+phospholipids+in+biomembranes:+practical+procedure,+interpretation+and+application.">SDS-digested freeze-fracture replica labeling electron microscopy to study the two-dimensional distribution of integral membrane proteins and phospholipids in biomembranes: practical procedure, interpretation and application.</a> Histochem Cell Biol. 107 (2), 87-96 (1997).</li><li>Masugi-Tokita, M., Shigemoto, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+quantitative+visualization+of+glutamate+and+GABA+receptors+at+central+synapses.">High-resolution quantitative visualization of glutamate and GABA receptors at central synapses.</a> Curr Opin Neurobiol. 17 (3), 387-393 (2007).</li><li>Rash, J. E., Yasumura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+immunogold+labeling+of+connexins+and+aquaporin-4+in+freeze-fracture+replicas+of+liver,+brain,+and+spinal+cord:+factors+limiting+quantitative+analysis.">Direct immunogold labeling of connexins and aquaporin-4 in freeze-fracture replicas of liver, brain, and spinal cord: factors limiting quantitative analysis.</a> Cell Tissue Res. 296 (2), 307-321 (1999).</li><li>Emes, R. D., Grant, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+synapse+complexity+and+diversity.">Evolution of synapse complexity and diversity.</a> Annu Rev Neurosci. 35, 111-131 (2012).</li><li>Matsuzaki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+spine+geometry+is+critical+for+AMPA+receptor+expression+in+hippocampal+CA1+pyramidal+neurons.">Dendritic spine geometry is critical for AMPA receptor expression in hippocampal CA1 pyramidal neurons.</a> Nat Neurosci. 4 (11), 1086-1092 (2001).</li><li>Rollenhagen, A., L&#252;bke, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+morphology+of+excitatory+central+synapses:+from+structure+to+function.">The morphology of excitatory central synapses: from structure to function.</a> Cell Tissue Res. 326 (2), 221-237 (2006).</li><li>Tarusawa, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Input-specific+intrasynaptic+arrangements+of+ionotropic+glutamate+receptors+and+their+impact+on+postsynaptic+responses.">Input-specific intrasynaptic arrangements of ionotropic glutamate receptors and their impact on postsynaptic responses.</a> J Neurosci. 29 (41), 12896-12908 (2009).</li><li>Nusser, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type+and+pathway+dependence+of+synaptic+AMPA+receptor+number+and+variability+in+the+hippocampus.">Cell type and pathway dependence of synaptic AMPA receptor number and variability in the hippocampus.</a> Neuron. 21 (3), 545-559 (1998).</li><li>Ny&#236;ri, G., Stephenson, F. A., Freund, T. F., Somogyi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+variability+in+synaptic+N-methyl-D-aspartate+receptor+density+on+interneurons+and+a+comparison+with+pyramidal-cell+spines+in+the+rat+hippocampus.">Large variability in synaptic N-methyl-D-aspartate receptor density on interneurons and a comparison with pyramidal-cell spines in the rat hippocampus.</a> Neuroscience. 119 (2), 347-363 (2003).</li><li>Nicholson, D. A., Geinisman, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axospinous+synaptic+subtype-specific+differences+in+structure,+size,+ionotropic+receptor+expression,+and+connectivity+in+apical+dendritic+regions+of+rat+hippocampal+CA1+pyramidal+neurons.">Axospinous synaptic subtype-specific differences in structure, size, ionotropic receptor expression, and connectivity in apical dendritic regions of rat hippocampal CA1 pyramidal neurons.</a> J Comp Neurol. 512 (3), 399-418 (2009).</li><li>Millhouse, O. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intercalated+cells+of+the+amygdala.">The intercalated cells of the amygdala.</a> J Comp Neurol. 247 (2), 246-271 (1986).</li><li>Busti, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+fear+states+engage+distinct+networks+within+the+intercalated+cell+clusters+of+the+amygdala.">Different fear states engage distinct networks within the intercalated cell clusters of the amygdala.</a> J Neurosci. 31 (13), 5131-5144 (2011).</li><li>Amano, T., Unal, C. T., Par&#233;, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+correlates+of+fear+extinction+in+the+amygdala.">Synaptic correlates of fear extinction in the amygdala.</a> Nat Neurosci. 13 (4), 489-494 (2010).</li><li>Duvarci, S., Pare, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amygdala+microcircuits+controlling+learned+fear.">Amygdala microcircuits controlling learned fear.</a> Neuron. 82 (5), 966-980 (2014).</li><li>J&#252;ngling, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropeptide+S-mediated+control+of+fear+expression+and+extinction:+role+of+intercalated+GABAergic+neurons+in+the+amygdala.">Neuropeptide S-mediated control of fear expression and extinction: role of intercalated GABAergic neurons in the amygdala.</a> Neuron. 59 (2), 298-310 (2008).</li><li>Asede, D., Bosch, D., L&#252;thi, A., Ferraguti, F., Ehrlich, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+inputs+to+intercalated+cells+provide+fear-learning+modulated+inhibition+to+the+basolateral+amygdala.">Sensory inputs to intercalated cells provide fear-learning modulated inhibition to the basolateral amygdala.</a> Neuron. 86 (2), 541-554 (2015).</li><li>Maren, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurobiology+of+Pavlovian+fear+conditioning.">Neurobiology of Pavlovian fear conditioning.</a> Annu Rev Neurosci. 24, 897-931 (2001).</li><li>Pape, H. C., Pare, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastic+synaptic+networks+of+the+amygdala+for+the+acquisition,+expression,+and+extinction+of+conditioned+fear.">Plastic synaptic networks of the amygdala for the acquisition, expression, and extinction of conditioned fear.</a> Physiol Rev. 90 (2), 419-463 (2010).</li><li>Sigurdsson, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+potentiation+in+the+amygdala:+a+cellular+mechanism+of+fear+learning+and+memory.">Long-term potentiation in the amygdala: a cellular mechanism of fear learning and memory.</a> Neuropharmacology. 52 (1), 215-227 (2007).</li><li>Bosch, D., Asede, D., Ehrlich, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex-vivo+optogenetic+dissection+of+fear+circuits+in+brain+slices.">Ex-vivo optogenetic dissection of fear circuits in brain slices.</a> J. Vis. Exp. (110), e53628 (2016).</li><li>Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+and+application+of+optogenetics.">The development and application of optogenetics.</a> Annu Rev Neurosci. 34, 389-412 (2011).</li><li>Bienvenu, T. C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+intercalated+neurons+of+amygdala+relay+noxious+sensory+information.">Large intercalated neurons of amygdala relay noxious sensory information.</a> J. Neurosci. 35 (5), 2044-2057 (2015).</li><li>Sandri, C., Akert, K., Livingston, R. B., Moor, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+aggregations+at+specialized+sites+in+freeze-etched+postsynaptic+membranes.">Particle aggregations at specialized sites in freeze-etched postsynaptic membranes.</a> Brain Res. 41 (1), 1-16 (1972).</li><li>Likhtik, E., Popa, D., Apergis-Schoute, J., Fidacaro, G. A., Par&#233;, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amygdala+intercalated+neurons+are+required+for+expression+of+fear+extinction.">Amygdala intercalated neurons are required for expression of fear extinction.</a> Nature. 454 (7204), 642-645 (2008).</li><li>Fukazawa, Y., Shigemoto, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-synapse-type+and+inter-synapse-type+relationships+between+synaptic+size+and+AMPAR+expression.">Intra-synapse-type and inter-synapse-type relationships between synaptic size and AMPAR expression.</a> Curr Opin Neurobiol. 22 (3), 446-452 (2012).</li><li>Amiry-Moghaddam, M., Ottersen, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunogold+cytochemistry+in+neuroscience.">Immunogold cytochemistry in neuroscience.</a> Nat Neurosci. 16 (7), 798-804 (2013).</li><li>Fukazawa, Y., Masugi-Tokita, M., Tarusawa, E., Hagiwara, A., Shigemoto, R., Cavalier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SDS-digested+Freeze-fracture+replica+labelling+(SDS-FRL).">SDS-digested Freeze-fracture replica labelling (SDS-FRL).</a> Handbook of Cryo-Preparation Methods for Electron Microscopy. , 567-586 (2007).</li><li>Severs, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Freeze-fracture+electron+microscopy.">Freeze-fracture electron microscopy.</a> Nat Protoc. 2 (3), 547-576 (2007).</li><li>Tanaka, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Number+and+density+of+AMPA+receptors+in+single+synapses+in+immature+cerebellum.">Number and density of AMPA receptors in single synapses in immature cerebellum.</a> J Neurosci. 25 (4), 799-807 (2005).</li><li>Mansouri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+subsynaptic+localization+of+type+1+metabotropic+glutamate+receptors+at+glutamatergic+and+GABAergic+synapses+in+the+rodent+cerebellar+cortex.">Distinct subsynaptic localization of type 1 metabotropic glutamate receptors at glutamatergic and GABAergic synapses in the rodent cerebellar cortex.</a> Eur J Neurosci. 41 (2), 157-167 (2015).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Freeze-kırık elektron mikroskobu 40 yılı aşkın bir süredir ultrastrüktürel araştırma önemli bir teknik olmuştur. Ancak, membran moleküler kompozisyon çalışmak için etkin araçların eksikliği kullanımında önemli bir düşüş üretti. Son zamanlarda, bağlı immünolojik etiketleme 1, 2, yani FRIL tekniği ile yekpare zar proteinleri ortaya çıkarmak için etkin yolların geliştirilmesi için donma-fraktür elektron mikroskopisi büyük bir canlanma olmuştur. FRIL teknik diğer immünolojik ultrastrüktürel metotlardan fazla birkaç avantaj sahiptir. İlk olarak, proteinler, duyarlılığı artırmak antikorlara kolaylıkla temin edilebilir. İkincisi, çoğaltma iki boyutlu yüzey üzerinde böyle postsinaptik membranın olarak plazma zarı uzmanlık, büyük kısmının poz seri &#39;zahmetli ve zaman alıcı yeniden olmadan ilgi moleküllerin mekansal dağılımı ve fiziksel bitişiklik denetlenmesine izin veriral ince kesitler. Üçüncü olarak, plazma zarının iki yarısı mevcudiyeti, her bir yapı için etiketlenebilir proteinlerin sayısı, Resim uygun antikorlar mevcuttur arttırır. kırılma üzerine bölme zarın hidrofobik yüzü kırık yüzey üzerinde kalan protein etki güçlendirmektedir karbon platin ile kaplanır. Bu durum, bu etki antijenlerine karşı antikorların erişimi engeller. Bir yineleme P-yüzünde Örneğin protoplazma alan bakan tek epitopu ise, sadece antikor ile bağlı olabilir exoplasmic alan bakan epitoplar e-yüzünde, antikorlar ile tespit edilebilir (bakınız Şekil 2). Öte yandan, FRIL tekniği de bazı sınırlamalar 2 uğrar. kırıklar rasgele olarak belirli hücreler ya da yapıların hedef zor olabilir. Bu aynı zamanda fra farklı olasılık verilen, sinaps koleksiyonunda, örneğin bir örnekleme yanlılığı, yol açabilirFarklı eğrilik (milleri karşı örneğin, dikenler) yapıların zar boyunca cturing. Ayrıca, iki yüzlerinden birine zar proteinlerinin ayırma tahmin edilemez. Bu nedenle, P-yüze ya da E-yüzüne bir protein dağılımı, özellikle de niceliksel çalışmalar için, dikkatle hücre içi ve hücre dışı etki reaktif antikorları kullanılarak incelendi gerekir. sadece morfolojik özelliklere dayalı Son olarak, bu tür presinaptik akson terminalleri gibi bazı yapıların yinelemedeki tanımlanması zor olabilir. Bununla birlikte, işaret proteinleri için spesifik antikorların kullanımı veya etiketli integral membran proteinleri ya da ek araçlar viral vektörler sunar kullanılarak kanalların iletim kırılan membran belirlenmesini kolaylaştırmak için. Örneğin, bu çalışmada, postsinaptik Beni ortaya μ-opioid reseptörleri için amigdala ve etiketleme aksonal eferent nöronları tespit etmek talamik nöronlarda ChR2 YFP transdüksiyonu yararlandıITC nöron mbranes. başarılı bir şekilde FRIL tekniği gerçekleştirmek için, özellikle dikkat doku fiksasyon ilgili alınmalıdır. Güçlü doku fiksasyonu (&gt;% 2 paraformaldehid) çapraz kırık yüksek oranda ve etiketleme duyarlılığında azalmaya neden olabilir. Öte yandan, zayıf tespitler doku işleme ve hazırlama (bölümlerin örneğin, kesme) zorlaştırır. Kesilmiş blok kalınlığı çift taraflı bant kalınlığını eşleştiğini kontrol etmek de önemlidir. Numunenin kalınlığı bandının daha düşük ise, doku yüzeyleri iki metal taşıyıcı yüzeyine bağlanır olabilir, buna bağlı olarak, dondurulmuş numune parçalanmış değildir. Doku kalın ise iki bakır taşıyıcıların sandviç yapıldığında, bu kaçınılmaz yapısal bozukluklar ile sıkıştırılmış olacaktır. Numune kırılmış olan sıcaklık (Bu protokol, -115 ° C), aynı zamanda önemli bir rol oynamaktadırçoğaltma yapısı. Daha yüksek sıcaklıklar, bu tür önceki ya da buharlaşma sırasında doku yüzeyi üzerinde su buharının yoğunlaşması eserler daha yüksek bir oranı üretebilir. Düşük sıcaklıklar (&lt;-125 ° C) kırılma sırasında malzemenin kapalı bölme riskini artırabilir. Bu malzeme numune yüzeyi üzerine düşmesine ya da ona bağlı kalabilir. Malzemenin bu pulları da kaplanmış ve görüntü üzerinde koyu lekeler üreten tezat vardır. Daha düşük sıcaklıklarda, özellikle kırılma dendritik dikenler küçük ince yapılar için enine kırık sıklığını etkileyebilir. kopyaları hazırlanmasında bir başka kritik bir adım deterjan sindirim olduğunu. sindirim eksik ise, sindirilmemiş doku TEM de yapının analizini karıştırıcı, çoğaltma koyu lekeler belirir. Ayrıca, sindirilmemiş doku arka plan etiketleme artan non-spesifik tuzak veya bağlanan antikorlar olabilir. deterjan Diğer yandan, kullanımıDoku sindirimi için s ikincil ve üçüncül yapıları değiştirerek çoğaltma ilişkili molekülleri denatüre olabilir. Bu nedenle, bazı antijenler için yavaş yavaş ilave yıkama adımları ile SDS seyreltilmesi için gerekli olabilir. immunolabeling, ikincil antikorlara konjuge altın partikülü farklı boyutlarda mevcudiyeti, aynı zamanda tespit sağlar, ama sadece nitel, hatta postsinaptik uzmanlık olarak plazma zarının spesifik mikro bölgeler çok sayıda proteinler. Ancak, sterik engel nedeniyle, sayısal çalışmalar genel olarak tek bir molekülün saptanması ile sınırlıdır. altın parçacığı boyutu da markalama etkinliğini etkileyebilir. FRIL etiketleme yorumlanması için, bunun nedeni esnek karmaşık forma immunogold parçacık antijen 20-25 nm yarıçaplı bir hemisfer içinde herhangi bir yerde bulunabilir akılda tutulmalıdırBirincil ve ikincil antikor 26 ile ed. Teori ve FRIL ve ilgili tekniklerin uygulamaya hakkında daha fazla bilgi için, diğer metodolojik makaleler 27, 28&#39;e de okuyucu bakın. FRIL tekniği son zamanlarda 30. Ayrıca, AMPA-R için FRIL tekniğinin algılama hassasiyeti bir işlevsel AMPA başına bir immunogold parçacık olarak yüksek olarak tahmin edilmiştir çeşitli sinaps popülasyonlarında 29, glutamat reseptör lokalizasyonu yüksek çözünürlüklü sayısal analizler için kullanılmıştır -R kanal 29. Böylece, bu yaklaşım ölçmek ve merkezi sinapslarda AMPA-R ve NMDA-R postsinaptik ifade desen analiz etmek genel olarak çok faydalıdır. Burada, PIN / MGN-ITC sinaps uygulanabilirliğini, korku klima sırasında ABD bilgi geçişi için büyük olasılıkla önemli bir site gösterdi. AMPA reseptör alt birimlerinin Glu yüksek derecede korunmuş hücre-dışı amino asit kalıntıları karşı artan bir antikor kullanılarakA1-GluA4, biz postsinaptik membran uzmanlık karşılık gelen IMP kümeler içinde altın parçacıkları eşit dağılımını bulundu. ITC dikenler AMPA-R yoğunluğu PIN / MGN talamik afferentleri tarafından hedeflenen şaft sinaps göre anlamlı derecede yüksek bulundu. Her iki omurga ve şaft sinaps, AMPA-R için etiketleme ve postsinaptik alanı arasında pozitif bir korelasyon, diğer glutamat sinaps 25 ortak bir özellik tespit edildi. PIN / MGN-ITC sinapslarda AMPA-R yoğunluğu düşük varyans kortikal sinaps 25 den talamik efferentler 7 tarafından oluşturulan diğer sinaps benzer, ancak farklı bir homojen dağılımını göstermektedir. Tersine, NMDA-R yoğunluğu daha değişken ve AMPA-R farklı bir düzenleme düşündüren omurga ve mil sinaps arasında fark yoktu. Gelecekte, FRIL tekniği yüksek tekrarlanabilirliği sadece merkezi sinaps bazal molekül bileşimi değerlendirmek için izin vermez, ancak c saptanmasını kolaylaştırabilirkorku öğrendikten sonra iyonotropik glutamat reseptör numaraları ve subsynaptic dağılımındaki Hanges, bu girdilerin öncesi ve postsinaptik özellikleri ex-vivo kayıtları tamamlayan. girdilerin kökeni ve postsinaptik unsurların doğa ve kompozisyon disentangling önemli ama sorunlu olduğu Sonuç olarak, bu yaklaşım diğer birçok nöral devrelerde giriş özgü uyarıcı sinaps yapı-işlev ilişkilerinin içine anlayışlar kazanmak için diğer araştırmacılar tarafından kullanılabilir .

nanometre ölçeğinde biyomembranlar fonksiyonel mimarisi tanımı transmisyon elektron mikroskobu için uygun immün bir takım teknikler geliştirilmesi ile son yıllarda öne sürülmüştür. Bununla birlikte, bu teknikler, örneğin, ön ve son gömme immünolojik, antijenlere ve / veya zar-bağlı protein sınırlı kantitatif bir değerlendirme zayıf algılama dahil önemli sınırlamalar, bir dizi vardır. Bu sınırlamalar, hücre çeşitliliği ve sinaps heterojen yüksek derecede ile karakterizedir sinir sistemi, ince yapısı soruşturma özellikle kritik hale gelir. Ön ve postsinaptik elemanları ya da diferansiyel ekspresyonu, zenginleştirme veya bu reseptörlerin taşıyıcılar ve efektör molekülleri olarak sinyal proteinleri arasındaki etkileşim tarafından dikte yapısal ve işlevsel farklılıklara bu heterojenite sonuçlanır. Doğrudan immunolabe için yeni bir yaklaşımDeterjan-çözünür donma-fraktür kopyaları (FRIL) integral ya da çapraz-bağlanmış membran proteinlerinin Ling ilk iki yıl önce 1 Fujimoto tarafından ortaya atılmıştır. Bu orijinal bir yöntem vardı, ancak, çeşitli sınırlamalar, yani beyin gibi karmaşık dokularda ayrı ayrı eşlenen hücreleri ile etiketlenmiş moleküllerin anlamlı korelasyon engel kopyaları, şiddetli parçalanması. Yaklaşık 10 yıl önce, Shigemoto ve Fukazawa giderek tekniği 2 düzeldi. Bu da önemli ölçüde gap junction 3 çalışması için, özellikle tekniği geliştirilmiş Colorado State University Boulder laboratuarlarında, bilim adamları başka bir grup çabaları paralel edildi. dondurularak kırılma protokolleri ve makinelerde iyileştirme, hem de (yüksek basınç altında) Hızlı dondurma giriş, Hi araştırmacılar nispeten büyük boyutta ve örneklerin kesintisiz kopyalarını üretmek için izin verirsınırlamaları ve güçlü kimyasal tespitler tarafından üretilen eserler olmadan en hücresel bileşenlerin gh kaliteli görüntüler. FRIL tekniği öncesi ve postsinaptik bir plan görünüşüdür ek avantajı, beyin gibi, karmaşık doku içinde bir ya da daha fazla eşleştirilmiş histolojik olarak (aynı anda) protein ve sitolojik tanımlanan hücrelerin in situ tespiti bir yüksek kantitatif büyük avantajı sunar tek bir çoğaltma unsurları. Bu nedenle, FRIL tekniği, birçok teknik engellere rağmen, özellikle bireysel sinapsların yapısal ve fonksiyonel özelliklerinin korelasyonu için, çok önemli bilimsel buluşlar bir dizi için umut vaat ediyor. Son birkaç on yılda, büyük bir bilgi anlaşma moleküler makyaj, yapısı üzerinde elde edilmiştir, ve sinapsların fizyolojik fonksiyonu; Henüz sinaps morfolojik ve moleküler oldukça çeşitli öncesi ve postsinaptik pa bağlı olankira nöronlar 4. Sadece sinaps türleri bir avuç yapı-fonksiyon şimdiye kadar yapılan çalışmalar 5-7 başarılı idi. Bu durum öncesi ve postsinaptik unsurların doğa kesin bir kimlik engelledi teknik kısıtlamalar çoğunlukla oldu. Ultrastrüktürel analiz sinaptik iletim gücü ve plastisite üzerinde büyük bir etkisi vardır nörotransmiter reseptörleri 6 farklı sinaptik kişileri arasında hem sinaptik boyutu ve içeriği bakımından postsinaptik membran uzmanlık değişkenliği, içine kritik bilgi sağlamaktadır. Bundan başka, bir araştırma büyük bir gövde sinaps farklı ifade iyonotropik glutamat reseptörlerinin sayısının afferent- ve hedef-bağlı bir şekilde 7-10 düzenlendiğini gösterir. Burada, bir yöntem define postsinaptik membran uzmanlık yapısı ve reseptör kompozisyon analizi izin veren ana hatlarıylad presinaptik elemanları ve işlevi. Bu yaklaşım, Channelrhodopsin2 (CHR2) geliştirilen yeni ışığa duyarlı alg proteinler, presinaptik ifade yararlanır ve FRIL tekniğin α-amino-3-hidroksi-5-metil-4-isoxazolepropionic postsinaptik sentezleme modelini analiz asit (AMPA-R) ve N-metil-D-aspartat (NMDA-R) glutamat reseptörleri. Bu amigdala (ITC) ve interkelatlaşmış hücre kütlelerinin nöronlar üzerine arka talamik-medial genikülat çekirdekleri (PIN / MGN) kaynaklanan aksonlar oluşturduğu sinaps gösterilmiştir. ITC nöronlar bazolateral amigdaloid kompleksi (BLA) 11, 12 çevreleyen kümeler düzenlenen küçük dikenli GABAerjik hücrelerdir. ITC nöronlar BLA ana nöronlardan eksitatör sinyaller almak ve (CEA) merkez çekirdeğini hedef bilinmektedir, bu nedenle bir inhibitör kapısı olarak işlev bilgi için BLA ve CEA 12-15 arasında akar. Son zamanlarda, biz IT gösterdiBLA ve CEA arasında medio-dorsal kümede bulunan C nöronlar da korku Pavlovian işitsel korku klima 16 sırasında öğrenme üzerine değiştirilmiş duyusal talamik ve temporal kortikal bölgelerde, direkt ve yakınsak eksitatör sinyaller alırlar. Korku şartlandırma beyin mekanizmaları açısından birleştirici öğrenme en iyi anlaşılan biçimlerinden biridir. Korku klima, başlangıçta nötr koşullandırılmış uyaran (CS, örneğin, bir ton) bir CS-ABD dernek sonuçlanan bir caydırıcı koşulsuz uyarıcı (ABD, örneğin, bir hafif ayak şoku) ile eşleştirilmiş ve korku tepkisi 17, 18 şartına bağlıdır. Eksitatör CS ve ABD temsil eden bilgiyi taşıyan talamik ve neokortikal alanlar, hem giriş, sırasıyla, amigdala (LA) yanal çekirdeğin piramidal nöronlar üzerine yakınsama ve plastisite 19 geçmesi biliniyordu. Bizim önceki çalışma duyusal giriş bilgileri ITC nöronlar geçirilen paralel de olduğunu ortaya koydu <s&gt; 16 kadar. Bireysel duyusal girdi mekanistik moleküler analiz doğru bir ilk adım ITC nöronlar üzerine sinapsların, biz ChR2 sarı floresan protein (YFP) ile etiketlenmiş ifade etmek için bir adeno-ilişkili virüs (AAV) kullanılır. AAV PIN / MGN enjekte edildi ve akson terminalleri ChR2 YFP bunların ifadesi ile belirlenmiştir. Biz PIN / MGN akson terminalleri tarafından ITC nöronlar ile oluşturulan sinaps postsinaptik AMPA-R ve NMDA-R yoğunluğunu değerlendirmek için FRIL tekniği ile üretilen, her iki yüzü kullanılır.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Surgery&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereotactic frame</td><td>Stoelting, USA</td><td>51670</td><td>can be replaced by other stereotactic frame for mice</td></tr><tr><td>Stereotactic frame mouse adaptor</td><td>Stoelting, USA</td><td>51625</td><td></td></tr><tr><td>Gas anesthesia mask for mice</td><td>Stoelting, USA</td><td>50264</td><td>no longer available, replaced by item no. 51609M</td></tr><tr><td>Pressure injection device, Toohey Spritzer</td><td>Toohey Company, USA</td><td>T25-2-900</td><td>other pressure injection devices (e.g. Picospritzer) can be used</td></tr><tr><td>Kwik Fill glass capillaries</td><td>World Precision Instruments, Germany</td><td>1B150F-4</td><td></td></tr><tr><td>Anesthesia machine, IsoFlo</td><td>Eickemeyer, Germany</td><td>213261</td><td></td></tr><tr><td>DC Temperature Controler and heating pad</td><td>FHC, USA</td><td>40-90-8D</td><td></td></tr><tr><td>Horizontal Micropipette Puller Model P-1000</td><td>Sutter Instruments, USA</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>Surgical tool sterilizer, Sterilizator 75</td><td>Melag, Germany</td><td>08754200</td><td></td></tr><tr><td>rAAV-hSyn-ChR2(H134R)-eYFP (serotype 2/9)</td><td>Penn Vector Core, USA</td><td>AV-9-26973P</td><td></td></tr><tr><td>fast green</td><td>Roth, Germany</td><td>0301.1</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane Anesthetic, Isofuran CP (1 ml/ml)</td><td>CP Pharma, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antiseptic, Betadine (providone-iodine)</td><td>Purdure Products, USA</td><td>BSOL32</td><td>can be replaced by other disinfectants</td></tr><tr><td>Analgesic, Metacam Solution (5 mg/ml meloxicam)</td><td>Boehringer Ingelheim, Germany</td><td></td><td>can be replaced by other analgesics</td></tr><tr><td>Bepanthen eye ointment</td><td>Bayer, Germany</td><td>0191</td><td>can be replaced by other eye ointments</td></tr><tr><td>Drill NM3000 (SNKG1341 and SNIH1681)</td><td>Nouvag, Switzerland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sutranox Suture Needle</td><td>Fine Science Tools, Germany</td><td>12050-01</td><td></td></tr><tr><td>Braided Silk Suture</td><td>Fine Science Tools, Germany</td><td>18020-60</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Tissue preparation&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde EM grade</td><td>Agar Scientific Ltd., United Kingdom</td><td>AGR1018</td><td></td></tr><tr><td>Saturated picric acid solution</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>P6744-1GA</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;-2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0</td><td>Merck Millipore, Germany</td><td>1065860500</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;-2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&amp;nbsp;</td><td>Merck Millipore, Germany</td><td>1063451000</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Merck Millipore, Germany</td><td>1064041000</td><td></td></tr><tr><td>4N NaOH</td><td>Carl Roth, Germany</td><td>T198.1</td><td></td></tr><tr><td>Thiopental</td><td>Sandoz, Austria</td><td>5,133</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>G5516-500ML</td><td></td></tr><tr><td>GenPure ultrapure water system</td><td>Thermo Fisher Scientific, USA</td><td>50131235</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltic pump</td><td>ISMATEC, Germany</td><td>ISM 930C</td><td></td></tr><tr><td>Filter Paper</td><td>MACHEREY-NAGEL, Germany</td><td>MN 615 1/4</td><td></td></tr><tr><td>Vibroslicer, VT1000S</td><td>Leica Microsystems, Austria</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ophthalmic scalpel</td><td>Alcon Laboratories, USA</td><td></td><td>can be replaced by other ophthalmic scalpels</td></tr><tr><td>Perfusion cannula</td><td>Vieweg, Germany</td><td>F560088-1</td><td>can be replaced by similar items from other companies</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;High-pressure&amp;nbsp; Freezing&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Copper carriers</td><td>Engineering Office M. Wohlwend, CH</td><td>528</td><td></td></tr><tr><td>Sidol Polish</td><td>Henkel, Germany</td><td></td><td>can be replaced by same item from other companies</td></tr><tr><td>Chamois skin</td><td>Household supply store</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hole punch, 1,5mm</td><td>Stubai, Austria</td><td></td><td>can be replaced by same item from other companies</td></tr><tr><td>Denatured ethanol</td><td>Donauchem, Austria</td><td></td><td>can be replaced by same item from other companies</td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Roth, Germany</td><td>9372.5</td><td>CAUTION!</td></tr><tr><td>High Pressure Freezing Machine HPM 010</td><td>BalTec, CH; now Leica Microsystems</td><td>HPM010</td><td>not produced any more, substituted by LeicaEM HPM100</td></tr><tr><td>Stereo-microscope</td><td>Olympus, Japan</td><td>SZX10</td><td></td></tr><tr><td>Liquid nitrogen</td><td></td><td></td><td>CAUTION!</td></tr><tr><td>Cryo-vials</td><td>Roth, Germany</td><td>E309.1</td><td>can be replaced by same item from other companies</td></tr><tr><td>CryoCane</td><td>Nalge Nunc International,USA</td><td>5015-0001</td><td>can be replaced by same item from other companies</td></tr><tr><td>CryoSleeve</td><td>Nalge Nunc International,USA</td><td>5016-0001</td><td>can be replaced by same item from other companies</td></tr><tr><td>Liquid nitrogen storage vessel</td><td>Cryopal, France</td><td>GT38</td><td>can be replaced by same item from other companies</td></tr><tr><td>Non-ionic detergent (Lavocid)</td><td>Werner &amp;amp; Mertz Professional, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Freeze-fracture and Replication&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sandblaster, Mikromat 200-1</td><td>JOKE Joisten &amp;amp; Kettenbaum, Germany</td><td>SANDURET 2-K</td><td>can be replaced by same item from other companies</td></tr><tr><td>Siliciumcarbid SIC 360, grain size 25 - 21&amp;micro;</td><td>JOKE Joisten &amp;amp; Kettenbaum, Germany</td><td>955932</td><td></td></tr><tr><td>Freeze Fracture System BAF 060</td><td>BalTec, CH; now Leica Microsystems</td><td>BAF060</td><td></td></tr><tr><td>Ceramic 12 well plate</td><td>Gr&amp;ouml;pel, Austria</td><td>14511</td><td>can be replaced by same item from other companies</td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>SIGMA, USA</td><td>T1503</td><td>can be replaced by same item from other companies</td></tr><tr><td>Trizma hydrochloride</td><td>SIGMA, USA</td><td>T3253</td><td>can be replaced by same item from other companies</td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Merck, Germany</td><td>1,064,041,000</td><td>can be replaced by same item from other companies</td></tr><tr><td>SDS, Sodium lauryl sulfate</td><td>Roth, Germany</td><td>5136.1</td><td>CAUTION! ;&amp;nbsp; can be replaced by same item from other companies</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Merck, Germany</td><td>1,076,871,000</td><td>can be replaced by same item from other companies</td></tr><tr><td>TRIS</td><td>Roth, Germany</td><td>5429.3</td><td>can be replaced by same item from other companies</td></tr><tr><td>Universal Hybridization Oven</td><td>Binder, Germany</td><td>7001-0050</td><td>can be replaced by same item from other companies</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Immunolabelling&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>SIGMA, USA</td><td>A9647</td><td>can be replaced by same item from other companies</td></tr><tr><td>Anti-GFP Antibody</td><td>Molecular Probes, USA</td><td>A11122</td><td></td></tr><tr><td>Anti-pan-AMPAR Antibody</td><td>Frontier Institute, Japan</td><td>pan AMPAR-GP-Af580-1</td><td></td></tr><tr><td>Anti-NMDAR1 Antibody, clone 54.1</td><td>Merck Millipore, Germany</td><td>MAB363</td><td></td></tr><tr><td>Opioid Receptor-Mu (MOR) Antibody</td><td>ImmunoStar, USA</td><td>24216</td><td></td></tr><tr><td>EM goat anti-guinea pig, 5 nm; secondary antibody</td><td>BBInternational, UK</td><td>EM.GAG5</td><td></td></tr><tr><td>EM goat anti-rabbit, 15 nm; secondary antibody</td><td>BBInternational, UK</td><td>EM.GAR15</td><td></td></tr><tr><td>Donkey anti-rabbit, 10nm, secondary antibody</td><td>AURION, Netherlands</td><td>DAR 10nm</td><td></td></tr><tr><td>Copper grids, 100 Parallel Bar</td><td>&amp;nbsp;Agar scientific, UK</td><td>G2012C</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Major Science, USA</td><td>MO-RC</td><td>can be replaced by same item from other companies</td></tr><tr><td>Pioloform Powder</td><td>&amp;nbsp;Agar scientific, UK</td><td>R1275</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Roth, Germany</td><td>3313.1</td><td>CAUTION! ;&amp;nbsp; can be replaced by same item from other companies</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;EM analysis&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Philips CM120 TEM</td><td>Philips/FEI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Morada CCD camera</td><td>Soft Imaging Systems, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>iTEM Ver. 5.2, imaging software</td><td>Soft Imaging Systems, Germany</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

combined optogenetic and freeze-fracture replica immunolabeling to examine input-specific arrangement of glutamate receptors in the mouse amygdala

Freeze-kırık elektron mikroskobu 40 yılı aşkın bir süredir ultrastrüktürel araştırma önemli bir teknik olmuştur. Ancak, membran moleküler kompozisyon çalışmak için etkin araçların eksikliği kullanımında önemli bir düşüş üretti. Son zamanlarda, immünolojik etiketleme ile yekpare zar proteinleri ortaya çıkarmak için etkin yolların geliştirilmesi için donma-fraktür elektron mikroskobu sayesinde önemli bir canlanma olmuştur. Bu yöntemlerden biri, deterjan-çözünür donma-fraktür çoğaltma immün (FRIL) olarak da bilinir. optogenetics ile FRIL tekniğinin kombinasyonu merkez sinapsların yapısal ve fonksiyonel özelliklerinin ilişkili analiz sağlar. Bu yaklaşımı kullanarak, tespit ve etiketli channelrhodopsin ilgili ifadesi ve özel moleküler belirteçleri ile öncesi ve postsinaptik nöronların iki karakterize edilmesi mümkün olur. glutamat postsinaptik membran uzmanlık ayırt edici bir görünümerjik ölçmek ve bu reseptörlerin intrasynaptic dağılımının analizi için, daha sinapsların iyonotropik glutamat reseptörlerinin etiketlenmesi üzerine verir. Burada, eşleşmiş kopyaları ve bunların nasıl immunolabel hazırlamak için gerekli prosedürlerin adım adım tanımını verir. Biz de, potansiyel örnekleme önyargıları ile ilişkili özellikle de FRIL tekniğinin uyarılar ve sınırlamalar ele alınacaktır. optogenetics ile kombine edildiğinde FRIL tekniği yüksek tekrarlanabilirlik ve çok yönlülük, beyinde tespit nöronal mikrodevreler sinaptik iletim farklı yönlerini karakterizasyonu için çok güçlü bir yaklaşım sunuyor. Burada, bu yaklaşım fare amigdala interkalar hücre kütlelerinin nöronlar da uyarıcı sinaps yapı-işlev ilişkilerinin içgörü kazanmak için nasıl kullanıldığını bir örnek oluşturmaktadır. Özellikle, belirlenen girişlerin iyonotropik glutamat reseptörlerinin ekspresyonunu araştırdık veyatalamik arka intralaminar ve medial genikülat çekirdeklerine iginated. Bu sinapslar korku öğrenme için uygun duyusal bilgiyi röle ve korku klima üzerine plastik değişikliklere gösterilmiştir.

FRIL tekniği, mikrobiyal orijinli 21, örneğin, plazma membranında entegre ve etkili aksonları boyunca anterogradely taşınan kanallar Optogenetic aktüatörlerin ifadesi ile bir araya getirildiğinde, belirli bir alt grup niceliksel olarak AMPA-R ve NMDA-R postsinaptik ifade incelemeye olanak sağlar sinaps. Bu amigdala ITC nöronlar üzerine (örneğin, PIN / MGN) farklı talamik çekirdeklere kaynaklanan aksonlar için burada gösterilir. Bu yaklaşım, ITC nöronlar, şimdiye kadar ayrıntılı bir anatomik ve moleküler karakterizasyonu dirençli olan hücrelerin bir grup üzerinde ayrı ayrı duyusal girdi sinaps moleküler analiz edilmesini sağlar. Dört hafta PIN / MGN içine rAAV-ChR2 YFP stereotaktik enjeksiyonundan sonra, ChR2 YFP pozitif aksonlar yoğun LA, amygdalostriatal geçiş alanı (Astria) ve medial paracapsular I inerve<html> Amigdala TC küme, önceki izleme ile tamamen uyumlu bir desen 22, 16 inceler. Biz de rAAV-ChR2 YFP- gelen donma-kırık çoğaltma akson ve terminallerin P-yüzünde ChR2 YFP için immün yoğun altın tespit enjekte edilen fareler (Şekil 5A), ancak olmayan enjekte edilmiş farelerden alınan yinelemede. Bir yineleme glutamaterjik sinaps postsinaptik membran uzmanlık plazma zarı 2, 23 E-yüzünde zar içi parçacıklar (IMPS) bir küme olarak görülebilir ve sıklıkla presinaptik plazma zarı 7 P yüze eşlik ediyor (Şekil 5B-C). PIN / MGN akson terminalleri tarafından oluşturulan glutamaterjik sinaps postsinaptik uzmanlık belirlemek için izin Bu özellikler (Şekil 5 ve 6). Bu NMDA Rs esas NR1 alt birimine karşı bir antikor kullanılarak tespit edilmiştir, oysa tüm dört alt birimden (GluA1-4) tanıyan bir antikor ile AMPA-R etiketli. &quot;Fo: keep-together.within-page =&quot; ntent 1 &quot;&gt; Bu sinapsların dendritik dikenler veya ITC nöronların milleri ile yapılmış olup aynı çoğaltma tespit araçlarının eksikliği nedeniyle, biz u için gelen çoğaltma yüzünü etiketli ITC nöronlar bu reseptörlerin 24 postsynaptically yüksek seviyelerde ifade şekilde -opioid reseptörleri. Bu yerler kullanan bir strateji kullanarak iki yineleme (Şekil 5C-F Şekil 6A-B) &#39;de, aynı postsinaptik profillerin tespit gerekir (Şekil 4E) . <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/53853/53853fig5.jpg" /> Şekil 5. immunogold Parçacıklar tarafından Replica üzerinde ChR2 YFP ve iyonotropik glutamat reseptörlerinin, algılama. (A) çapraz kırık akson terminali (açık mavi) ve ChR2 YFP tespit 15 nm altın parçacıkları ile etiketlenmiş olan P-yüzünün küçük porsiyonlarda. terminal içinde membran Of sayıda sinaptik kesecikler gözlenebilir (SV). plazma membran ile sınırlı büyük ölçüde immunolabeling özgüllüğünü edin. ChR2 için Etiketleme PIN / MGN oluşan en terminali tanımlar. Terminal bir omurga ile asimetrik sinaps oluşturur. E-yüzünde postsinaptik zar uzmanlık (PSD) zar içi parçacıkların karakteristik kümesini gösterir ve AMPA-R ortaya 5 nm altın parçacıkları ile etiketlenir. (B) (15 nm altın parçacıkları ile etiketlenmiş), bir ChR2 ifade akson p-yüzü, iki dendrit onları NMDA Rs ortaya 5 nm altın parçacıkları ile etiketlenmiş iki PİO&#39;ların sahip birini çevreleyen gösterilmiştir. (CD) PIN / MGN-ITC sinaps öncesi ve postsinaptik membran Karşısı yüzleri. (C) terminalinin P-yüzü (15 nm altın parçacıkları ile etiketli) ChR2 ifade ve iki dendritik milleri, onları AMPA-R (5 nm altın parçacıkları) için etiketli iki PSDS içeren birinin e-yüze boyunca uzanır. ( <strong&gt; D) iki dendritler karşılık gelen P-yüz μ-opioid reseptörlerin (10 nm altın parçacıkları) etiketlenmiştir. (EF) kesik çizgilerle belirtilen alanların Genişletilmiş manzarası. Ölçek çubukları:. 500 nm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53853/53853fig5large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> PIN / MGN-ITC sinapslarda AMPA-R için İmmün parçacıklar postsinaptik uzmanlık (Şekil 5E) içinde homojen bir dağılım düşündüren, tüm IMP küme üzerinde bulundu. Bir anlamlı olarak daha yüksek (eşleşmemiş t-testi p &lt;0.018) AMPA-R etiketleme yoğunluğu PIN / MGN gözlendi ITC dikenler üzerine sinapsların (715 ± 38 altın parçacıkları / mikron 2, n = 32) ITC dendritler üzerine sinapsların karşılaştırıldığında (590 ± 44 altın parçacıkları / um 2, n = 32). Genel olarak, PIN / MGN-ITC sinapsların AMPA-R yoğunluğu nispeten düşük gösterdiVaryans (varyans katsayısı, CV = 0.37) homojen bir dağılım tutarlı. PIN / MGN-ITC sinapslarda NMDA Rs İmmün genellikle düzensiz postsinaptik IMP kümeleri (Şekil 5B) içinde dağıtılan gözlenmiştir. NMDA-R etiketleme yoğunluğu (eşleşmemiş t-testi, p = 0.39) PIN / MGN ITC dikenler üzerine sinapsların arasında benzerdi (1070 ± 153 altın parçacıkları / mikron 2, n = 8) ve ITC dendritler (812 ± 183 altın parçacıkları / um2, n = 9). AMPA-R gözlendi aksine ne PIN / MGN-ITC sinapsların NMDA-R yoğunluğu (CV = 0.54) çok değişken oldu. <img alt="Şekil 6," src="/files/ftp_upload/53853/53853fig6.jpg" /> Belirlenen PIN / MGN-ITC Sinapslar de Şekil 6. AMPA-R ve NMDA-R ile immün. (AB) PIN / MGN-ITC öncesi ve postsinaptik membran Karşısı yüzleriTerminalin P-yüzü ChR2 ifade eden bir dendritik omurga üzerine yapılan sinaps (15 nm altın parçacıkları ile etiketli) ve dendritik omurga üzerine PSD AMPA-R (5 nm altın parçacıkları) etiketlenmiştir. (CD) kesikli çizgi ile belirtilen alanların Genişletilmiş manzarası. Bu alanlar PSD daha iyi bir görünüm sağlamak için yaklaşık 45 ° saat yönünün tersine döndürülmüş edilmiştir. (E) ITC omurgada ve dendrit sinaptik alanına karşılık AMPA-R parçacıkların sayısının saçılım. Her iki yapılarda, pozitif bir korelasyon gözlenmiştir. (F) ITC omurgada ve dendrit sinaptik alanına karşı NMDA R parçacıkların sayısının saçılım. Anlamlı bir pozitif korelasyon sadece dendritik dikenler tespit edildi. Ölçek çubukları:. 500 nm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53853/53853fig6large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> çünkügenellikle kısmen postsinaptik IMP küme üste presinaptik plazma zarı P-yüz, biz sinapsların sadece% 30 sinaptik alanını tahmin olabilir (dikenler: parkı 0.032 mikron 2, aralık ortalama: 0.007 mikron 2 0.063 n = 8; dendritler: 0.047 mikron 2, aralığı: 0.024 11 mikron 2 0.166 kadar, n =). Daha önce analiz telencephalic glutamaterjik 25 sinapsların Bunlar benzer bir aralıkta idi. Her iki dikenler ve dendritler, bireysel sinapslarda AMPA-R için altın immün parçacıkları sayısının pozitif sinaptik alanı ile korelasyon (Spearman, dikenler: r = 0.88, dendritler: r = 0.60, p &lt;0.0001) (Şekil 6E). Ancak dendritler (r = 0.21, p = 0.29) (Şekil 6F içinde: Tersine, NMDA-R altın immün parçacıkları sayısını dikenler (r = 0.90, p &lt;0.002 Spearman, dikenler) sinaptik alanı ile ilişkili olduğu bulunmuştur ).

Watch this Scientific Journal Video about Combined Optogenetic and Freeze-fracture Replica Immunolabeling to Examine Input-specific Arrangement of Glutamate Receptors in the Mouse Amygdala at JoVE.com

Combined Optogenetic and Freeze-fracture Replica Immunolabeling to Examine Input-specific Arrangement of Glutamate Receptors in the Mouse Amygdala

This article illustrates how the expression of neurotransmitter receptors can be quantified and the pattern analyzed at synapses with identified pre and postsynaptic elements using a combination of viral transduction of optogenetic tools and the freeze-fracture replica immunolabeling technique.

Optogenetic ve donma-fraktür çoğaltma ile immün Fare amigdalada glutamat reseptörlerinin giriş-özel bir düzenleme incelemek için bir araya

Freeze-fracture electron microscopy has been a major technique in ultrastructural research for over 40 years. However, the lack of effective means to ...

combined-optogenetic-freeze-fracture-replica-immunolabeling-to

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.0K Görüntüleme.  Medical University of Innsbruck. This article illustrates how the expression of neurotransmitter receptors can be quantified and the pattern analyzed at synapses with identified pre and postsynaptic elements using a combination of viral transduction of optogenetic tools and the freeze-fracture replica immunolabeling technique.

Video: Combined Optogenetic and Freeze-fracture Replica Immunolabeling to Examine Input-specific Arrangement of Glutamate Receptors in the Mouse Amygdala

Post-embedding Immunogold Labeling of Synaptic Proteins in Hippocampal Slice Cultures

Immunoelectron microscopy is a powerful tool to study biological molecules at the subcellular level. Antibodies coupled to electron-dense markers such as colloidal gold can reveal the localization and distribution of specific antigens in various tissues1. The two most widely used techniques are pre-embedding and post-embedding techniques. In pre-embedding immunogold-electron microscopy (EM) techniques, the tissue must be permeabilized to allow antibody penetration before it is embedded. These techniques are ideal for preserving structures but poor penetration of the antibody (often only the first few micrometers) is a considerable drawback2. The post-embedding labeling methods can avoid this problem because labeling takes place on sections of fixed tissues where antigens are more easily accessible. Over the years, a number of modifications have improved the post-embedding methods to enhance immunoreactivity and to preserve ultrastructure3-5.
Tissue fixation is a crucial part of EM studies. Fixatives chemically crosslink the macromolecules to lock the tissue structures in place. The choice of fixative affects not only structural preservation but also antigenicity and contrast. Osmium tetroxide (OsO4), formaldehyde, and glutaraldehyde have been the standard fixatives for decades, including for central nervous system (CNS) tissues that are especially prone to structural damage during chemical and physical processing. Unfortunately, OsO4 is highly reactive and has been shown to mask antigens6, resulting in poor and insufficient labeling. Alternative approaches to avoid chemical fixation include freezing the tissues. But these techniques are difficult to perform and require expensive instrumentation. To address some of these problems and to improve CNS tissue labeling, Phend et al. replaced OsO4 with uranyl acetate (UA) and tannic acid (TA), and successfully introduced additional modifications to improve the sensitivity of antigen detection and structural preservation in brain and spinal cord tissues7. We have adopted this osmium-free post-embedding method to rat brain tissue and optimized the immunogold labeling technique to detect and study synaptic proteins.
We present here a method to determine the ultrastructural localization of synaptic proteins in rat hippocampal CA1 pyramidal neurons. We use organotypic hippocampal cultured slices. These slices maintain the trisynaptic circuitry of the hippocampus, and thus are especially useful for studying synaptic plasticity, a mechanism widely thought to underlie learning and memory. Organotypic hippocampal slices from postnatal day 5 and 6 mouse/rat pups can be prepared as described previously8, and are especially useful to acutely knockdown or overexpress exogenous proteins. We have previously used this protocol to characterize neurogranin (Ng), a neuron-specific protein with a critical role in regulating synaptic function8,9 . We have also used it to characterize the ultrastructural localization of calmodulin (CaM) and Ca2+/CaM-dependent protein kinase II (CaMKII)10. As illustrated in the results, this protocol allows good ultrastructural preservation of dendritic spines and efficient labeling of Ng to help characterize its distribution in the spine8. Furthermore, the procedure described here can have wide applicability in studying many other proteins involved in neuronal functions.

The localization and distribution of proteins provide important information for understanding their cellular functions. The superior spatial resolution of electron microscopy (EM) can be used to determine the subcellular localization of a given antigen following immunohistochemistry. For tissues of the central nervous system (CNS), preserving structural integrity while maintaining antigenicity has been especially difficult in EM studies. Here, we adopt a procedure that has been used to preserve structures and antigens in the CNS to study and characterize synaptic proteins in rat hippocampal CA1 pyramidal neurons.

Hipokampal Dilim Kültürleri Synaptic Proteinler Post-gömme immunogold Etiketleme

Immunoelectron microscopy is a powerful tool to study biological molecules at the subcellular level. Antibodies coupled to electron-dense markers such as ...

Nörobilim

High-Resolution Quantitative Immunogold Analysis of Membrane Receptors at Retinal Ribbon Synapses

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA receptors (NMDARs) and AMPA receptors (AMPARs). Physiological data have indicated that glutamate receptors at RGCs are expressed not only in postsynaptic but also in perisynaptic or extrasynaptic membrane compartments. However, precise anatomical locations for glutamate receptors at RGC synapses have not been determined. Although a high-resolution quantitative analysis of glutamate receptors at central synapses is widely employed, this approach has had only limited success in the retina. We developed a postembedding immunogold method for analysis of membrane receptors, making it possible to estimate the number, density and variability of these receptors at retinal ribbon synapses. Here we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of retinal fixation, 2) freeze-substitution, 3) postembedding immunogold electron microscope (EM) immunocytochemistry and, 4) quantitative visualization of glutamate receptors at ribbon synapses.

The postembedding immunogold method is one of the most effective ways to provide high-resolution analyses of the subcellular localization of specific molecules. Here we describe a protocol to quantitatively analyze glutamate receptors at retinal ribbon synapses.

Retina Şerit Sinapslar at Membran Reseptör Yüksek Çözünürlüklü Sayısal immunogold Analizi

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA ...

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated proteins and subsequent manipulation of neural activity by light. Channelrhodopsins (ChRs) are light-gated cation-channels and when fused to a fluorescent protein their expression allows for visualization and concurrent activation of specific cell types and their axonal projections in defined areas of the brain. Via stereotactic injection of viral vectors, ChR fusion proteins can be constitutively or conditionally expressed in specific cells of a defined brain region, and their axonal projections can subsequently be studied anatomically and functionally via ex vivo optogenetic activation in brain slices. This is of particular importance when aiming to understand synaptic properties of connections that could not be addressed with conventional electrical stimulation approaches, or in identifying novel afferent and efferent connectivity that was previously poorly understood. Here, a few examples illustrate how this technique can be applied to investigate these questions to elucidating fear-related circuits in the amygdala. The amygdala is a key region for acquisition and expression of fear, and storage of fear and emotional memories. Many lines of evidence suggest that the medial prefrontal cortex (mPFC) participates in different aspects of fear acquisition and extinction, but its precise connectivity with the amygdala is just starting to be understood. First, it is shown how ex vivo optogenetic activation can be used to study aspects of synaptic communication between mPFC afferents and target cells in the basolateral amygdala (BLA). Furthermore, it is illustrated how this ex vivo optogenetic approach can be applied to assess novel connectivity patterns using a group of GABAergic neurons in the amygdala, the paracapsular intercalated cell cluster (mpITC), as an example.

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Optogenetic approaches are widely used to manipulate neural activity and assess the consequences for brain function. Here, a technique is outlined that&#160;upon in vivo expression of the optical activator Channelrhodopsin, allows for ex vivo analysis of synaptic properties of specific long range and local neural connections in fear-related circuits.

Beyin Dilimleri Korku Devre Ex Vivo optogenetic Diseksiyon

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated ...

An Antibody Feeding Approach to Study Glutamate Receptor Trafficking in Dissociated Primary Hippocampal Cultures

Cellular responses to external stimuli heavily rely on the set of receptors expressed at the cell surface at a given moment. Accordingly, the population of surface-expressed receptors is constantly adapting and subject to strict mechanisms of regulation. The paradigmatic example and one of the most studied trafficking events in biology is the regulated control of the synaptic expression of glutamate receptors (GluRs). GluRs mediate the vast majority of excitatory neurotransmission in the central nervous system and control physiological activity-dependent functional and structural changes at the synaptic and neuronal levels (e.g., synaptic plasticity). Modifications in the number, location, and subunit composition of surface expressed GluRs deeply affect neuronal function and, in fact, alterations in these factors are associated with different neuropathies. Presented here is a method to study GluR trafficking in dissociated hippocampal primary neurons. An &#34;antibody-feeding&#34; approach is used to differentially visualize GluR populations expressed at the surface and internal membranes. By labeling surface receptors on live cells and fixing them at different times to allow for receptors endocytosis and/or recycling, these trafficking processes can be evaluated and selectively studied. This is a versatile protocol that can be used in combination with pharmacological approaches or overexpression of altered receptors to gain valuable information about stimuli and molecular mechanisms affecting GluR trafficking. Similarly, it can be easily adapted to study other receptors or surface expressed proteins.

This article presents a method to study glutamate receptor (GluR) trafficking in dissociated primary hippocampal cultures. Using an antibody-feeding approach to label endogenous or overexpressed receptors in combination with pharmacological approaches, this method allows for the identification of molecular mechanisms regulating GluR surface expression by modulating internalization or recycling processes.

Disanated primer hipokampal kültürlerde glutamat reseptör kaçakçılığı çalışması için antikor beslenme yaklaşımı

Cellular responses to external stimuli heavily rely on the set of receptors expressed at the cell surface at a given moment. Accordingly, the population ...

Single Synapse Indicators of Glutamate Release and Uptake in Acute Brain Slices from Normal and Huntington Mice

Synapses are highly compartmentalized functional units that operate independently on each other. In Huntington&#39;s disease (HD) and other neurodegenerative disorders, this independence might be compromised due to insufficient glutamate clearance and the resulting spill-in and spill-out effects. Altered astrocytic coverage of the presynaptic terminals and/or dendritic spines as well as a reduced size of glutamate transporter clusters at glutamate release sites have been implicated in the pathogenesis of diseases resulting in symptoms of dys-/hyperkinesia. However, the mechanisms leading to the dysfunction of glutamatergic synapses in HD are not well understood. Improving and applying synapse imaging we have obtained data shedding new light on the mechanisms impeding the initiation of movements. Here, we describe the principle elements of a relatively inexpensive approach to achieve single synapse resolution by using the new genetically encoded ultrafast glutamate sensor iGluu, wide-field optics, a scientific CMOS (sCMOS) camera, a 473 nm laser and a laser positioning system to evaluate the state of corticostriatal synapses in acute slices from age appropriate healthy or diseased mice. Glutamate transients were constructed from single or multiple pixels to obtain estimates of i) glutamate release based on the maximal elevation of the glutamate concentration [Glu] next to the active zone and ii) glutamate uptake as reflected in the time constant of decay (TauD) of the perisynaptic [Glu]. Differences in the resting bouton size and contrasting patterns of short-term plasticity served as criteria for the identification of corticostriatal terminals as belonging to the intratelencephalic (IT) or the pyramidal tract (PT) pathway. Using these methods, we discovered that in symptomatic HD mice ~40% of PT-type corticostriatal synapses exhibited insufficient glutamate clearance, suggesting that these synapses might be at risk to excitotoxic damage. The results underline the usefulness of TauD as a biomarker of dysfunctional synapses in Huntington mice with a hypokinetic phenotype.

We present a protocol to evaluate the balance between glutamate release and clearance at single corticostriatal glutamatergic synapses in acute slices from adult mice. This protocol uses the fluorescent sensor iGluu for glutamate detection, a sCMOS camera for signal acquisition and a device for focal laser illumination.

Normal ve Huntington Farelerden Akut Beyin Dilimlerinde Glutamat Salınımı ve Alımının Tek Sinaps Göstergeleri

Synapses are highly compartmentalized functional units that operate independently on each other. In Huntington&#39;s disease (HD) and other ...

Immunolabeling of Neuronal Membrane Proteins in a Freeze-fractured Specimen of Mouse Brain Tissue

<a href='https://app.jove.com/v/53853/combined-optogenetic-freeze-fracture-replica-immunolabeling-to'>Source: Sch&#246;nherr, S., et. al. Combined Optogenetic and Freeze-fracture Replica Immunolabeling to Examine Input-specific Arrangement of Glutamate Receptors in the Mouse Amygdala. J. Vis. Exp. (2016)</a>This video demonstrates the immunolabelling of freeze-fractured replicas of mouse brain tissue for electron microscopy. The fractured and coated replicas are digested to expose receptors. Primary and gold-tagged secondary antibodies are added to label specific neuronal membrane receptors. The replica is mounted on a grid and visualized under an electron microscope.

Source: Sch&#246;nherr, S., et. al. Combined Optogenetic and Freeze-fracture Replica Immunolabeling to Examine Input-specific Arrangement of Glutamate ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neuropathology

Epilepsy and Seizure Disorders

Measuring Protein Expression in the Rodent Brain Using Near-Infrared Fluorescence and High-Resolution Scanning 

Source:&#160;<a style='text-decoration:none;' href='https://app.jove.com/v/59685/using-near-infrared-fluorescence-and-high-resolution-scanning-to-measure-protein-expression-in-the-rodent-brain'><span style='-webkit-text-decoration-skip:none;font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration-skip-ink:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>Kimmelmann-Shultz, B.,&#160;et. al.<span style='-webkit-text-decoration-skip:none;font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration-skip-ink:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>&#160;<span style='-webkit-text-decoration-skip:none;font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration-skip-ink:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>Using Near-infrared Fluorescence and High-resolution Scanning to Measure Protein Expression in the Rodent Brain.&#160;J. Vis. Exp.<span style='-webkit-text-decoration-skip:none;font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration-skip-ink:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>&#160;(2019)</a> &#160;This video demonstrates a near-infrared fluorescence and high-resolution scanning method for measuring protein expression in the rodent brain.

Source:&#160;Kimmelmann-Shultz, B.,&#160;et. al.&#160;Using Near-infrared Fluorescence and High-resolution Scanning to Measure Protein Expression in the ...

Neuroimaging

Synaptic & Cellular Imaging

Visualization and Mapping of Neuronal Pathways in an Amygdala Brain Slice

Source: Bosch, D., et al. <a href="https://app.jove.com/v/53628">Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices.</a> J. Vis. Exp. (2016).
This video demonstrates a procedure for analyzing synaptic connectivity between medial prefrontal cortex (mPFC) and amygdala neurons using acute amygdala brain slices from mice. The mPFC neurons in these mice express channelrhodopsin fused to a fluorescent protein. The channelrhodopsins facilitate ion influx and action potential generation in the mPFC neurons upon light activation. Consequently, mPFC neurons release neurotransmitters that bind to postsynaptic amygdala neurons, triggering postsynaptic currents that are recorded to visualize mPFC-amygdala connectivity.

Amigdala Beyin Dilimindeki Nöronal Yolların Görselleştirilmesi ve Haritalanması

All procedures involving animal samples have been reviewed and approved by the appropriate animal ethical review committee.
1. Visualization and ...

Neurophysiology

Imaging and Optical Techniques

An In Vitro Technique to Study Glutamate Receptor Trafficking in Hippocampal Neurons

Source: Chiu, A. M., et al. <a href="https://app.jove.com/v/59982">An Antibody Feeding Approach to Study Glutamate Receptor Trafficking in Dissociated Primary Hippocampal Cultures.</a> J. Vis. Exp. (2019)
This video demonstrates an antibody-feeding approach to study the trafficking of glutamate receptors in primary hippocampal neuronal cultures. This approach allows the observation of receptor populations at both the plasma and internal membranes. Discrimination between these subsets is achieved by labeling the receptors before and after membrane permeabilization, using the same primary antibody but secondary antibodies conjugated to different fluorophores.

Hipokampal Nöronlarda Glutamat Reseptör Kaçakçılığını İncelemek İçin İn Vitro Bir Teknik

1. Preparation Before Labeling

	Preparation and maintenance of primary hippocampal cultures&#8203;
	
		Prepare primary hippocampal cultures at a density ...

İmmünoloji

Antikor Tabanlı Teknolojiler

Karakterizasyon ve Fonksiyonel Analiz

Generation of Tilted Amygdala Slices from a Mouse Brain

Source: Bosch, D., et al. <a href="https://app.jove.com/v/53628">Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices.</a> J. Vis. Exp. (2016)
The video demonstrates the generation of tilted amygdala slices from a mouse brain. The brain is positioned at an angle on the vibratome specimen stage to obtain slices containing the amygdala and axons from the medial prefrontal cortex that form synaptic connections with the amygdala. The brain slices are maintained at the physiological temperature to preserve the tissue for further experiments.

Bir Fare Beyninden Eğik Amigdala Dilimlerinin Üretilmesi

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Preparation of Acute Slices

	...