We thank Cora H&#252;bner and Andrea Gall for help in acquiring some of the representative results. This work was supported by the Werner Reichardt Centre for Integrative Neuroscience (CIN) at the University of Tuebingen, an Excellence Initiative funded by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) within the framework of the Excellence Initiative (EXC 307), and by funds from the Charitable Hertie Foundation.

Etik deyimi: Tüm deneysel prosedürleri araştırmalarda hayvanların kullanımına ilişkin AB direktifi uyarınca ve yerel Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylandı (Regierungspräsidium Tuebingen, Baden-Württemberg, Almanya devlet) Tübingen Üniversitesi&#39;nden sorumlu değildir. 1. Stereotaktik Enjeksiyon Yöntemi <ol><li> Bir sterilizatör kullanılarak steril aletler (makas, neşter, kelepçeler, matkap, iğneler, dikiş malzemesi) hazırlayın. Örneğin steril bir cerrahi örtü steril pamuk swap, dezenfektan, steril fosfat tamponlu tuz (PBS, pH 7.4) ve H2O 2 gibi steril araç ve diğer gerekli çözümler ve cerrahi malzemeleri düzenlemek. </li><li> Üreticinin talimatlarına göre yatay bir mikroelektrot çektirmenin bir 3 mm genişliğinde kutu filament kullanarak enjeksiyonlar için cam mikropipetler (Şekil 1A, ek) çekin. Not: Derin enjeksiyonları için, elektrot konik yeterince olmalıventral en koordinatları ulaşmak için uzun (yaklaşık 5 mm;. koordinatlar için, 1.10 bakınız). </li><li> Karışımlar virüsü çözeltisi 1 ul steril PBS içinde% 0.1 hızlı yeşil çözelti, 0.2 ul (cam pipet çözeltisi daha iyi görülmesi için). Ince ucu (Şekil 1A,) ile bir mikrolitre pipet kullanarak virüs çözümü ve hızlı yeşil karışımı ile cam pipetler doldurun. Not: rekombinant Adeno-ilişkili viral vektörler (rAAV) çalışma biyogüvenlik seviye 1 (BSL 1) çalışma olarak kabul edilir ve bir BSL 1 laboratuvarda yapılacak gerekiyor. Bu çalışmada, (Şekil 1C) kullanılan rAAVs vardı: 1) MPFC: rAAV-hSyn-ChR2 (H134R) -eYFP (serotip 2/9) 16; 2) MGM / PIN: rAAV-CAGh-ChR2 (H134R) -mCherry (serotip 2/9) 23; 3) mpITC /: Bla, rAAV-EF1a-DIOhChR2 (H134R) -YFP (serotip 2/1) 23 </li><li> küçük bir hayvan anestezi makinesi (: indüksiyon oksijen içinde% 3 İsofluranın) kullanarak bir fare anestezisi. Not: Bu çalışmada kullanılan Fare 4&#39;ü -7 haftalık ve aşağıdaki suşlar ve genotiplerinin: (Şekil 2A ve 3A-D deney) C57BL6 / J yabani tip; GAD67-GFP 24 (Şekil 2B ve 3E-H deney); Tac2-Cre 25 (Şekil 2C ve 3I-J deney). </li><li> kulak ve gözler arasındaki başını tıraş. pamuklu çubuklarla kullanarak traş kafa dezenfektan (tabanlı providon-iyot) uygulayın. </li><li> anestezi sırasında gözlerin kurumasını önlemek için bir göz merhemi sürün. Deri altına analjezik ile (meloksikam göre 0.1 ml, 5 mg / ml solüsyon) fare enjekte edilir. </li><li> (: Bakım için oksijen% 2 İsofluranın) stereotaktik çerçeve (Şekil 1A) fare yerleştirin ve bir gaz anestezi maske ile anestezi korumak. Devam etmeden önce ekstremite çekme refleksi ile anestezi derinliğini kontrol edin. Not: tüm cerrahi prosedür sırasında steril olarak mümkün olduğu kadar iyi korumak; tek kullanımlık yüz maskesi giymek, cerrahi gitmekVe eldiven wn. </li><li> makas kullanarak başın üst deri kesi olun. Yavaşça H 2 O 2 ile kafatası yüzeyi ve temiz kafatası açığa çıkarmak için kelepçeler ile düzeltmek, künt forseps kullanarak tarafına cilt çekin. </li><li> Her iki yarımkürede (Şekil 1B) için iyi bir ipucu kalıcı marker ve matkap delikleri kullanarak kafatası Mark enjeksiyon siteleri. MPFC: Bu çalışmada enjeksiyon (Bregma (mm)) vardır koordinatları anterior 1.9, 0.3 ± yan, ventral 2.1; MGM / PIN: 1.8 ± yan, 3.0 arka ventral 3.8; mpITC /: Bla 3.35 ve 4.75 ventral ± yan, 1.45 posterior. </li><li> Bir basınçlı enjeksiyon cihazına bağlı stereotaktik çerçeve üzerine dolu cam pipet montaj ve Bregma pozisyonuna pipet getirmek. </li><li> ince düz uçlu forseps kullanarak cam pipet ucu kesiyorum. virüs çözümü aerosol oluşumunu önlemek için yavaşça yapın. Pipet birkaç basınç darbeleri uygulayarak ve Viru damlalarının ekstrüzyon gözlemleyerek açık olduğundan emin olunsolüsyonu. </li><li> İstenen enjeksiyon koordinatlarına gidin ve basınçlı enjeksiyon cihazda aşağıdaki ayarları kullanarak pipet içeriği (~ 0.5 ul) yarısı enjekte: Basınç: 20 psi, ortalama darbe uzunluğu: 30 ms, bakliyat ortalama sayısı: 50. </li><li> bu geri çekme yavaş (1 mm / dakika) önce yaklaşık 1 dakika boyunca yer pipet bırakın. Not: pipet diğer yarımkürede aynı pipetle işlemi tekrarlamadan önce bloke olmadığından emin olun. Engellenen ucu durumunda, temiz ya da tekrar bregma ucu ve sıfır pipet konumunu kesiyorum. </li><li> PBS (pH 7.4) ile temiz kafatası, yavaşça, kelepçeler kaldırmak birlikte cilt çekin ve bireysel düğme sütür ile kesi sütür (3-4 knot). yaranın etrafındaki dezenfektan (tabanlı providon-iyot) uygulayın. </li><li> anestezi durdurmak ve tamamen uyanık kadar gözetimsiz fareyi bırakmayın. Tek muhafaza tutmak ya da tamamen iyileşti sadece diğer hayvanların şirkete geri dönün. Ameliyat sonrası sağlık durumunun izlemeye devam ve administer analjezik gerekirse. Yerel Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından ileri sürülen kurallara göre prosedürlerini takip edin. </li></ol> Akut Dilimleri 2. Hazırlık <ol><li> ACSF, kesme çözüm aletleri (makas, neşter, pens, spatula, Pasteur pipeti) ve agar blokları hazırlayın. Not: Yapay beyin-omurilik sıvısı (ACSF) 1 L deney başına gerekli olan ve daha önce 16,23 yayınlanan iki kez damıtılmış H2O kimyasallar çözülmesiyle hazırlanır. Kesme solüsyon 2 M MgSO 4 stok çözeltisi 0.87 ml ACSF 200 ml ilave etmek suretiyle hazırlanır. </li><li> Oksijenat ACSF ve% 95 O2 ve% 5 CO2 ile deney boyunca kesme çözeltisi. </li><li> Derin izofluran kullanarak küçük bir hayvan anestezi makinesi (oksijen% 3) kullanarak fare uyutmak. Devam etmeden önce ekstremite çekme refleksi ile anestezi derinliğini kontrol edin. </li><li> Büyük makas kullanarak fare başını kesmek ve hemen soğukbuz gibi soğuk kesim çözüm baş. </li><li> kaudal gelen rostralinde ve tek orta hat kesi açık kafatası hafifçe forseps kullanarak yanlara kafatası parçaları itin. Hızla hafifçe küçük bir yuvarlak spatula ile kafatasının dışında çekerek beyin kaldırmak. neşter ile beyincik kesti. buz gibi soğuk kesim çözüm beyin yerleştirin. </li><li> MPFC enjeksiyon siteleri için: (MPFC içeren) bir neşter kullanılarak beynin ön kısmı kesilmiş ve dilimleme kadar buz gibi soğuk kesim çözüm koymak. </li><li> Bir filtre kağıdı ile aşırı kesim çözüm çıkarın ve vibratome sahneye beynin posterior bölümünü tutkal. </li><li> Eğik amigdala dilimleri için, 35 ° açı (Şekil 1D, orta) bir agar bloğu (% 4) kesim üzerinde beyin tutkal. Koronal amigdala dilimleri, MGM / PIN enjeksiyon siteleri ve MPFC enjeksiyon siteleri için, (Şekil 1D, sol ve sağ) sahnede doğrudan beyin tutkal. dilimleme sırasında istikrar için beynin arkasındaki ek agar blok yerleştirin. </li><li> Placbir soğutma birimi ile, 4 ° C&#39;de muhafaza edilir, buz soğukluğunda oksijenli kesme çözeltisi ile bölme kesme e aşaması. Bir safir bıçak kullanarak amigdala (320 mikron) akut dilimleri hazırlayın. Oda sıcaklığında oksijenli ACSF ile birlikte bir ara bölmesi dilimleri yerleştirin. </li><li> 45 dakika - Akut amigdala dilimleri hazırlanmasından sonra, 35 dilim kurtarmak için 36 ° C sıcaklıkta bir su banyosu içinde ara yüz bölümü yerleştirin. Daha sonra, oda sıcaklığına ara yüz bölümü geri döner. Bu dilimler kayıt, adım 3.2 ile devam edin. </li><li> Akut amigdala dilimleri (- 2.9 2.8 adımları) için daha önce açıklandığı gibi adım 2.10 başlamasından sırasında, enjeksiyon siteleri dilim kesti. su banyosu dilimler geçmesi burada gerekli değildir. İsteğe bağlı: hızlı, enjeksiyon yeri konumunu tahmin floresan lamba ve uygun filtre setleri ile donatılmış bir Stereoskop dilimleri gözlemlemek. </li><li> iki filtre kağıtları ve Dalg arasına sandviç by-hoc sonrası analizi için enjeksiyon siteleri içeren dilimleri FixPBS çözeltisi O / N% 4 paraformaldehid (PFA) bunları dig. Enjeksiyon sitelerin analizi için adım 4.1 ile devam edin. </li></ol> Presinaptik Liflerin 3. Görselleştirme ve Uyarım <ol><li> liflerin ve hücrelerin Optogenetic aktivasyonu için yama mikroskop hazırlanması: <ol><li> Işık teslimat yolunun üzerine monte ışık yayan diyot (LED) merkezi. </li><li> arka odak düzlemi de ve 470 nm uygun dalga boyu seçiminde bir güç metre ile her bir amacın çıkışında LED ışık yoğunluğunu ölçün. </li><li> MW / mm 2 ışık yoğunluğunu hesaplamak ve 470 nm dalga boyundaki için ölçülen değerler için her hedef için (ışık çıkışı (mW / mm2) karşı LED yoğunluğu (%)) bir kalibrasyon eğrisi oluşturun. </li></ol></li><li> Bir floresan lamba ile donatılmış dik mikroskop üzerine monte dilim odasında arayüz odası ve yerden akut amigdala dilim almak. dilim böyle dilim konumlandırmak için özenarayüz odasında yukarı bakacak e yüzeyi de kayıt odasında yukarı bakacak. ~ 31 ° C&#39;lik bir sıcaklıkta, 2 ml / dak - 1 bir oranda taze oksijenli ASCF sahip dilim serpmek. </li><li> ifade spesifik floresan proteini için uygun filtre setleri ile birlikte floresan lamba kullanarak dilim presinaptik liflerin gözlemleyin. Bir genel (Şekil 1 E) ve hedef alanı içinde lif yoğunluğu değerlendirmesi için 60x objektif elde etmek için 5x amacı kullanın. GFP ve YFP için, kullanım Filtre belirtilen MCherry &quot;kırmızı&quot; (Uyarma 560/40, ışın ayıracı 585, Emisyon 630/70) set filtre kullanın için &quot;yeşil&quot; (Uyarma 472/20, ışın ayıracı 495, Emisyon 490 LP) ayarlayın: Not malzemeler / ekipman tabloda. </li><li> Aç veya deney (Şekil 2D) için arzu edildiği şekilde bir mikroskop ışık yolu diyaframı kısıtlar. </li><li> Bir yama kayıt elde etmek için, iç çözümü ile bir yama pipet doldurmak ve ben montajn-elektrotu tutucu. yama pipet pozitif basınç uygulayın ve yavaş yavaş mikromanipülatör kullanarak dilim içine görsel kontrol altında ilk banyo çözeltisi içine ve sonra indirin. <ol><li> yan ve üstten yama pipet ile ilgi nöron yaklaşın. Pipet (hücre yüzeyinde girinti görünür) hücrenin yüzeyi üzerinde olduğunda, pozitif basınç serbest bırakın ve negatif basınç uygulanarak, bir &quot;gigaseal&quot; elde edilir. </li><li> tam hücreli kayıt elde etmek için membran yama rüptüre daha emiş uygulayın. Daha sonra, hücreden elektrik yanıtları kaydederken Chr (470 nm) aktive etmek için uygun dalga boyu kullanılarak bağlanan LED ile etiketlenmiş lifleri uyarır. </li><li> sinaptik stimülasyonu için düşük LED yoğunluğu ile başlar ve istenen sinaptik akım genliği ulaşılana kadar artar. Zamanlama ve darbe uzunluğu Şekil (örnekler kontrol etmek için veri toplama yazılımı dijital çıkışları yapılandırarak LED tetik3). Not: diğer yazılım ve / veya TTL üreten cihazlar LED tetiklemek için kullanılabilir. </li></ol></li><li> ve / veya belirli ilaçların mevcudiyetinde aşağıdaki kaydedilen hücre için arzu edildiği gibi mikroskop ışık yolu açılmış ya da sınırlı açıklığı (aşama 3.4) ile tekrar uyarılması. </li><li> Kayıttan sonra, iki filtre kağıtları arasına sandviç ve% 4 PFA O / N onları daldırarak-hoc sonrası analizi için dilimleri düzeltin. </li><li> elektrofizyolojik verileri analiz edin. Not: Uygun yazılım her uyarım çevrimdışı kaydedilen tarama verileri görselleştirmek için. ilaçların etkilerini analiz ederken, tüm bireysel tarama için sinaptik akım genlikleri uyuşturucu etkisinin zaman sürecini elde etmek için zirve algılama rutinleri kullanın. ilaç etkisi kararlı duruma ulaştığında belirleyin. Deneysel koşul başına ortalama ≥10 bireysel Piyango yazılım kullanın, rakamlar için temsili ortalama yanıtları hazırlamak için (cf Şekil 3B-D, FHJ sağ panel). Not: Birkaç alternatif yazılım paketleri veri analizi için kullanılabilir. </li></ol> Enjeksiyon Siteleri 4. Post-hoc analizi <ol><li> ve (yeniden görüntüleme adımı 3,7, arzu edildiği takdirde), PBS içinde üç kez sitesi kayıt (adım 2.12) enjeksiyon bölgesi dilimleri yıkayın. Bu arka arkaya 10 dakika için bir döner sallayıcı üzerinde taze PBS ile üç kez çözelti değiştirerek yapılır. </li><li> PBS içinde% 2 agar-agar çözeltisi hazırlayın ve ~ 65 ° C&#39;ye kadar soğumaya bırakın. Bir küçük 30 mm çaplı petri altındaki düz yer dilimleri, agar-agar dilimleri gömmek ve katı kadar soğumasını bekleyin. </li><li> Bir vibratome aşamasında gömülü dilim veya dilimleri ile bir agar bloğu Tutkal ve PBS ile odasını kesme sahne yerleştirin. </li><li> Rezeksiyon 70 mikron kalınlığında dilim gömülü. İsteğe bağlı: rezeksiyon sonra, dilimler, hücre mimarisini (Şekil 3A, C) ortaya çıkarmak için NeuroTrace ile, yani lekeli olabilir ve / veya bYFP veya mCherry için y immünofloresan boyama Chr füzyon proteininden sinyalini arttırmak için. </li><li> montaj medya ile slaytlar ve lamel üzerine monte dilimleri. Resim enjeksiyon bölgesi ve eğer istenirse, bir flüoresan mikroskop veya konfokal lazer tarama mikroskobu (Şekil 2A-C) projeksiyon alanlarda lifler ihtiva eden, aynı zamanda görüntü dilimleri. </li></ol>

<ol><li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Channelrhodopsin-2%2C+a+directly+light-gated+cation-selective+membrane+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (24), 13940-13945 (2003).</li>
<li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Millisecond-timescale%2C+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nat Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).</li>
<li>Tye, K. M., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+investigation+of+neural+circuits+underlying+brain+disease+in+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models.</a> Nat Rev Neurosci. 13 (4), 251-266 (2012).</li>
<li>Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetics+in+neural+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Optogenetics in neural systems.</a> Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).</li>
<li>Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Channelrhodopsin-2-assisted+circuit+mapping+of+long-range+callosal+projections%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections.</a> Nat Neurosci. 10 (5), 663-668 (2007).</li>
<li>Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotaxic+gene+delivery+in+the+rodent+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Stereotaxic gene delivery in the rodent brain.</a> Nat Protoc. 1 (6), 3166-3173 (2006).</li>
<li>Huang, Z. J., Zeng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+approaches+to+neural+circuits+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genetic approaches to neural circuits in the mouse.</a> Annu Rev Neurosci. 36, 183-215 (2013).</li>
<li>LeDoux, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emotion+circuits+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Emotion circuits in the brain.</a> Annu Rev Neurosci. 23, 155-184 (2000).</li>
<li>Pape, H. C., Pare, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plastic+synaptic+networks+of+the+amygdala+for+the+acquisition%2C+expression%2C+and+extinction+of+conditioned+fear%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Plastic synaptic networks of the amygdala for the acquisition, expression, and extinction of conditioned fear.</a> Physiol Rev. 90 (2), 419-463 (2010).</li>
<li>Myers, K. M., Davis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+fear+extinction%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of fear extinction.</a> Mol Psychiatry. 12 (2), 120-150 (2007).</li>
<li>Quirk, G. J., Mueller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+mechanisms+of+extinction+learning+and+retrieval%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Neural mechanisms of extinction learning and retrieval.</a> Neuropsychopharmacology. 33 (1), 56-72 (2008).</li>
<li>Vidal-Gonzalez, I., Vidal-Gonzalez, B., Rauch, S. L., Quirk, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microstimulation+reveals+opposing+influences+of+prelimbic+and+infralimbic+cortex+on+the+expression+of+conditioned+fear%5BTitle%5D)+AND+%22Learn+Mem%22%5BJournal%5D)">Microstimulation reveals opposing influences of prelimbic and infralimbic cortex on the expression of conditioned fear.</a> Learn Mem. 13 (6), 728-733 (2006).</li>
<li>Sierra-Mercado, D., Padilla-Coreano, N., Quirk, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissociable+roles+of+prelimbic+and+infralimbic+cortices%2C+ventral+hippocampus%2C+and+basolateral+amygdala+in+the+expression+and+extinction+of+conditioned+fear%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Dissociable roles of prelimbic and infralimbic cortices, ventral hippocampus, and basolateral amygdala in the expression and extinction of conditioned fear.</a> Neuropsychopharmacology. 36 (2), 529-538 (2011).</li>
<li>Cho, J. H., Deisseroth, K., Bolshakov, V. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+encoding+of+fear+extinction+in+mPFC-amygdala+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Synaptic encoding of fear extinction in mPFC-amygdala circuits.</a> Neuron. 80 (6), 1491-1507 (2013).</li>
<li>Arruda-Carvalho, M., Clem, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathway-Selective+Adjustment+of+Prefrontal-Amygdala+Transmission+during+Fear+Encoding%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Pathway-Selective Adjustment of Prefrontal-Amygdala Transmission during Fear Encoding.</a> J Neurosci. 34 (47), 15601-15609 (2014).</li>
<li>Hubner, C., Bosch, D., Gall, A., Luthi, A., Ehrlich, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+dissection+of+optogenetically+activated+mPFC+and+hippocampal+inputs+to+neurons+in+the+basolateral+amygdala%3A+implications+for+fear+and+emotional+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Behav+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Ex vivo dissection of optogenetically activated mPFC and hippocampal inputs to neurons in the basolateral amygdala: implications for fear and emotional memory.</a> Front Behav Neurosci. 8, 64(2014).</li>
<li>Strobel, C., Marek, R., Gooch, H. M., Sullivan, R. K., Sah, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prefrontal+and+Auditory+Input+to+Intercalated+Neurons+of+the+Amygdala%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Prefrontal and Auditory Input to Intercalated Neurons of the Amygdala.</a> Cell Rep. 10 (9), 1435-1442 (2015).</li>
<li>Sigurdsson, T., Doyere, V., Cain, C. K., LeDoux, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+potentiation+in+the+amygdala%3A+a+cellular+mechanism+of+fear+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Long-term potentiation in the amygdala: a cellular mechanism of fear learning.</a> Neuropharmacology. 52 (1), 215-227 (2007).</li>
<li>Ehrlich, I., Humeau, Y., Grenier, F., Ciocchi, S., Herry, C., Luthi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amygdala+inhibitory+circuits+and+the+control+of+fear+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Amygdala inhibitory circuits and the control of fear memory.</a> Neuron. 62 (6), 757-771 (2009).</li>
<li>Millhouse, O. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intercalated+cells+of+the+amygdala%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">The intercalated cells of the amygdala.</a> J Comp Neurol. 247 (2), 246-271 (1986).</li>
<li>Busti, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+fear+states+engage+distinct+networks+within+the+intercalated+cell+clusters+of+the+amygdala%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Different fear states engage distinct networks within the intercalated cell clusters of the amygdala.</a> J Neurosci. 31 (13), 5131-5144 (2011).</li>
<li>Palomares-Castillo, E., Hernandez-Perez, O. R., Perez-Carrera, D., Crespo-Ramirez, M., Fuxe, K., Perez de la Mora, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intercalated+paracapsular+islands+as+a+module+for+integration+of+signals+regulating+anxiety+in+the+amygdala%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">The intercalated paracapsular islands as a module for integration of signals regulating anxiety in the amygdala.</a> Brain Res. 1476, 211-234 (2012).</li>
<li>Asede, D., Bosch, D., Luthi, A., Ferraguti, F., Ehrlich, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+inputs+to+intercalated+cells+provide+fear-learning+modulated+inhibition+to+the+basolateral+amygdala%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Sensory inputs to intercalated cells provide fear-learning modulated inhibition to the basolateral amygdala.</a> Neuron. 86 (2), 541-554 (2015).</li>
<li>Tamamaki, N., Yanagawa, Y., Tomioka, R., Miyazaki, J., Obata, K., Kaneko, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+fluorescent+protein+expression+and+colocalization+with+calretinin%2C+parvalbumin%2C+and+somatostatin+in+the+GAD67-GFP+knock-in+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Green fluorescent protein expression and colocalization with calretinin, parvalbumin, and somatostatin in the GAD67-GFP knock-in mouse.</a> J Comp Neurol. 467 (1), 60-79 (2003).</li>
<li>Mar, L., Yang, F. C., Ma, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+marking+and+characterization+of+Tac2-expressing+neurons+in+the+central+and+peripheral+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Brain%22%5BJournal%5D)">Genetic marking and characterization of Tac2-expressing neurons in the central and peripheral nervous system.</a> Mol Brain. 5, (2012).</li>
<li>Jackman, S. L., Beneduce, B. M., Drew, I. R., Regehr, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Achieving+high-frequency+optical+control+of+synaptic+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Achieving high-frequency optical control of synaptic transmission.</a> J Neurosci. 34 (22), 7704-7714 (2014).</li>
<li>Li, H., Penzo, M. A., Taniguchi, H., Kopec, C. D., Huang, Z. J., Li, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experience-dependent+modification+of+a+central+amygdala+fear+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Experience-dependent modification of a central amygdala fear circuit.</a> Nat Neurosci. 16 (3), 332-339 (2013).</li>
<li>Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. M., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+subcellular+organization+of+neocortical+excitatory+connections%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The subcellular organization of neocortical excitatory connections.</a> Nature. 457 (7233), 1142-1145 (2009).</li>
<li>Felix-Ortiz, A. C., Beyeler, A., Seo, C., Leppla, C. A., Wildes, C. P., Tye, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BLA+to+vHPC+inputs+modulate+anxiety-related+behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">BLA to vHPC inputs modulate anxiety-related behaviors.</a> Neuron. 79 (4), 658-664 (2013).</li>
<li>Chu, H. Y., Ito, W., Li, J., Morozov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target-specific+suppression+of+GABA+release+from+parvalbumin+interneurons+in+the+basolateral+amygdala+by+dopamine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Target-specific suppression of GABA release from parvalbumin interneurons in the basolateral amygdala by dopamine.</a> J Neurosci. 32 (42), 14815-14820 (2012).</li>
<li>Zhang, Y. P., Oertner, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+induction+of+synaptic+plasticity+using+a+light-sensitive+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Optical induction of synaptic plasticity using a light-sensitive channel.</a> Nat Methods. 4 (2), 139-141 (2007).</li>
<li>Britt, J. P., Benaliouad, F., McDevitt, R. A., Stuber, G. D., Wise, R. A., Bonci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+and+behavioral+profile+of+multiple+glutamatergic+inputs+to+the+nucleus+accumbens%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Synaptic and behavioral profile of multiple glutamatergic inputs to the nucleus accumbens.</a> Neuron. 76 (4), 790-803 (2012).</li>
<li>Kohl, M. M., Shipton, O. A., Deacon, R. M., Rawlins, J. N., Deisseroth, K., Paulsen, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemisphere-specific+optogenetic+stimulation+reveals+left-right+asymmetry+of+hippocampal+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Hemisphere-specific optogenetic stimulation reveals left-right asymmetry of hippocampal plasticity.</a> Nat Neurosci. 14 (11), 1413-1415 (2011).</li>
<li>Morozov, A., Sukato, D., Ito, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+suppression+of+plasticity+in+amygdala+inputs+from+temporal+association+cortex+by+the+external+capsule%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Selective suppression of plasticity in amygdala inputs from temporal association cortex by the external capsule.</a> J Neurosci. 31 (1), 339-345 (2011).</li>
<li>Davidson, B. L., Breakefield, X. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+vectors+for+gene+delivery+to+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Viral vectors for gene delivery to the nervous system.</a> Nat Rev Neurosci. 4 (5), 353-364 (2003).</li>
<li>Aschauer, D. F., Kreuz, S., Rumpel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+transduction+efficiency%2C+tropism+and+axonal+transport+of+AAV+serotypes+1%2C+2%2C+5%2C+6%2C+8%2C+and+9+in+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Analysis of transduction efficiency, tropism and axonal transport of AAV serotypes 1, 2, 5, 6, 8, and 9 in the mouse brain.</a> PLoS One. 8 (9), (2013).</li>
<li>Salegio, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+transport+of+adeno-associated+viral+vectors+is+serotype-dependent%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Axonal transport of adeno-associated viral vectors is serotype-dependent.</a> Gene Ther. 20 (3), 348-352 (2013).</li>
<li>Holehonnur, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+viral+serotypes+produce+differing+titers+and+differentially+transduce+neurons+within+the+rat+basal+and+lateral+amygdala%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated viral serotypes produce differing titers and differentially transduce neurons within the rat basal and lateral amygdala.</a> BMC Neurosci. 15, (2014).</li>
<li>McFarland, N. R., Lee, J. S., Hyman, B. T., McLean, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+transduction+efficiency+of+recombinant+AAV+serotypes+1%2C+2%2C+5%2C+and+8+in+the+rat+nigrostriatal+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Comparison of transduction efficiency of recombinant AAV serotypes 1, 2, 5, and 8 in the rat nigrostriatal system.</a> J Neurochem. 109 (3), 838-845 (2009).</li>
<li>Miyashita, T., Shao, Y. R., Chung, J., Pourzia, O., Feldman, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+channelrhodopsin-2+%28ChR2%29+expression+can+induce+abnormal+axonal+morphology+and+targeting+in+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Long-term channelrhodopsin-2 (ChR2) expression can induce abnormal axonal morphology and targeting in cerebral cortex.</a> Front Neural Circuits. 7, (2013).</li>
</ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Bu protokol değilse tüm kolayca çoğunda uygulanabilir nöral devreleri ve yerel bağlantı ex vivo optogenetic soruşturma için bir yöntem açıklanır, Epifloresans ışık limanda bir LED ~ 470 nm ile donatarak dik dilim patch-kelepçe kayıt kurulumları. dilimleri aksonal çıkıntıların Optogenetic uyarım önemli bir avantajı, mukabil lif yollarının bilinmemektedir açık bir şekilde tanımlanmış olup, ya da korunmuş değildi, çünkü belirli bir aktivasyonu ve konvansiyonel elektrik stim?...

görselleştirme ve beyin bölgeleri ve nöronların belirli türleri arasında belirli bağlantı eşzamanlı aktivasyonu için hassas aletleri fonksiyonel bağlantı altta yatan sağlıklı beyin fonksiyonu ve hastalık durumları anlamada daha önemli hale gelmektedir. İdeal olarak, bu nöronlar iletişim tespit hangi hassas sinaptik özellikleri fizyolojik soruşturma gerektirir. Bu, tek bir akut beyin diliminde korunamaz beyin alanları arasında bağlantı için geçerlidir. Geçmişte, bu büyük ölçüde ayrı deneylerde elde edilmiştir. Bir yandan, nöral izleyiciler enjekte in vivo daha sonra ışık veya ön ve postsinaptik mümkün elektron mikroskopik analizi ile bir arada kullanılmıştır. Kalkış bölgesinden lif yollarının korunması ve dilim hazırlanmasında erişilebilir Diğer taraftan, elektrik stimülasyonu hedef bölgede hücrelerin sinaptik iletişim mekanizması değerlendirmek için kullanılmıştır. Kendi görselleştirme ve post-hoc anatomik analiz 1- için izin verirken optogenetics gelişine, bu tür floresan proteinleri kaynaşmış Channelrhodopsins (Chrs) olarak ışık kapılı katyon kanalları, hedeflenen ifadesi, artık nöronlar ve onların aksonal yörüngeleri aktivasyonunu sağlar 4. Lif yolları belirli yörünge ayrılabilir olmadığı veya nedeni, 1) geleneksel elektrik stimülasyonu ile erişilebilir değildi beyin bölgelerinden girişleri değerlendirmek: Üst somata 5 kopmuş zaman CHR-ifade aksonlar bile teşvik edilebilir, çünkü beyin dilimleri mümkündür bilinmemektedir; 2) tümden öne ama eksik anlaşılmıştır belirli girdiler için menşe bölgeyi tanımlamak; ve 3) hem yerel hem de uzun menzilli projeksiyonlar, tanımlanan hücre tipleri arasında işlevsel bağlantı araştırmak. Çünkü avantajları bir dizi, beyin dilimleri devre Bu Optogenetic eşleme çapında olmuşturly son yıllarda kullanılan ve floresan etiketli CHRS ekspresyonu için viral vektörler, çeşitli ticari satıcılardan kolayca temin edilebilir. elektriksel stimülasyon da geçit veya diğer yakın hücrelerden ve eşit derecede hızlı ve zamansal hassas stimülasyon lifleri işe çünkü geleneksel elektrik stimülasyonu üzerinde optogenetic aktivasyonu bazı önemli avantajları nedeniyle stimülasyon elektrotları, fiber stimülasyon özgüllüğü yerleştirme dokuya hiçbir zarar vardır. Buna ek olarak, viral vektörlerin stereotaktik enjeksiyon kolayca Kre-bağımlı ekspresyonunu ve / veya özel promoterler 7 kullanılarak elde edilebilir, belirli beyin bölgelerinde 6 ve koşullu veya hücre tipi özel ifadesine hedeflenebilir. İşte, bu teknik korku sisteminde uzun menzilli haritalanması ve yerel devreleri için uygulanır. Amigdala korku ve duygusal anıları 8,9 edinimi ve korku ifadesi ve depolama için bir anahtar bölgedir. Apart froamigdala m, medial prefrontal korteks (MPFC) ve hipokampus (HC), karşılıklı olarak amigdala bağlı yapılar, korku ve yok oluş anı 10,11 edinimi, konsolidasyon ve alma yönleri sorumlu tutulmaktadır. MPFC alt bölümleri aktivite 12,13 devletler, yüksek ve düşük hem de korku kontrolünde bir çift rol oynadığı düşünülmektedir. Bu kısmen amigdala aktivitesi ve çıkışını kontrol ediyorum amigdala için MPFC doğrudan bağlantıları aracılık olabilir. Bu nedenle, son yıllarda, bazı çalışmalar amigdala 14-17 yılında MPFC afferentleri ve belirli hedef hücreleri arasındaki sinaptik etkileşimlerini araştırmak için ex-vivo dilim deneyler başladı. korku öğrenme sırasında, klimalı ve koşulsuz uyaranlara ilgili duyusal bilgiler belirli talamik ve kortikal bölgelerden projeksiyonlar aracılığıyla amigdala ulaşır. Başol lateral (LA) nöronlara bu girdilerin Plastisiteateral amigdala (BLA) korku klima 9,18 altında yatan önemli bir mekanizmadır. Artan kanıtlar amigdala paralel plastik süreçleri korku bellek 19 kontrol etmek için inhibitör unsurlar içerdiğini göstermektedir. Kümelenmiş inhibitör nöronların bir grup GABAerjik medial paracapsular enterkale hücreler (mpITCs) vardır, ama bunların kesin bağlantı ve fonksiyon tam olarak 20-22 anlaşılmaktadır. Burada, optogenetic devre haritalama mpITCs talamik ve kortikal röle istasyonları 23 doğrudan duyusal girdileri almak olduğunu gösteren, afferent ve efferent bu hücrelerin bağlantı ve amigdala hedef nöronlar üzerindeki etkilerini değerlendirmek için kullanılır. mpITCs veya BLA nöronlarda CHR spesifik ifadesi etkili bir BLA aktivitesini kontrol roman ileri beslemeli ve geri bildirim inhibitör devrelerde yerleştirerek, mpITCs engellediğini ortaya, yerel etkileşimlerin haritalama sağlar, aynı zamanda karşılıklı BLA ana nöronlar tarafından aktive edilir23.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Surgery&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Stereotactic frame</td><td>Stoelting, USA</td><td>51670</td><td>can be replaced by other stereotactic frame for mice</td></tr><tr><td>Steretoxic frame mouse adaptor</td><td>Stoelting, USA</td><td>51625</td><td>can be replaced by other stereotactic frame for mice</td></tr><tr><td>Gas anesthesia mask for mice</td><td>Stoelting, USA</td><td>50264</td><td>no longer available, replaced by item no. 51609M</td></tr><tr><td>Pressure injection device, Toohey Spritzer</td><td>Toohey Company, USA</td><td>T25-2-900</td><td>other pressure injection devices (e.g. Picospritzer) can be used</td></tr><tr><td>Kwik Fill glass capillaries</td><td>World Precision Instruments, Germany</td><td>1B150F-4</td><td></td></tr><tr><td>Anesthesia machine, IsoFlo</td><td>Eickemeyer, Germany</td><td>213261</td><td></td></tr><tr><td>DC Temperature Controler and heating pad</td><td>FHC, USA</td><td>40-90-8D</td><td></td></tr><tr><td>Horizontal Micropipette Puller Model P-1000</td><td>Sutter Instruments, USA</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>Surgical tool sterilizer, Sterilizator 75</td><td>Melag, Germany</td><td>08754200</td><td></td></tr><tr><td>rAAV-hSyn-ChR2(H134R)-eYFP (serotype 2/9)</td><td>Penn Vector Core, USA</td><td>AV-9-26973P</td><td></td></tr><tr><td>rAAV-CAGh-ChR2(H134R)-mCherry (serotype 2/9)&amp;nbsp;</td><td>Penn Vector Core, USA</td><td>AV-9-20938M</td><td></td></tr><tr><td>rAAV-EF1a-DIOhChR2(H134R)-YFP (serotype 2/1)&amp;nbsp;</td><td>Penn Vector Core, USA</td><td>AV-1-20298P</td><td></td></tr><tr><td>fast green</td><td>Roth, Germany</td><td>0301.1</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane Anesthetic, Isofuran CP (1ml/ml)</td><td>CP Pharma, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antiseptic, Betadine (providone-iodine)</td><td>Purdure Products, USA</td><td>BSOL32</td><td>can be replaced by other disinfectant</td></tr><tr><td>Analgesic, Metacam Solution (5mg/ml meloxicam)</td><td>Boehringer Ingelheim, Germany</td><td></td><td>can be replaced by other analgesics</td></tr><tr><td>Bepanthen eye ointment</td><td>Bayer, Germany</td><td>0191</td><td>can be replaced by other eye ointment</td></tr><tr><td>Drill NM3000 (SNKG1341 and SNIH1681)</td><td>Nouvag, Switzerland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sutranox Suture Needle</td><td>Fine Science Tools, Germany</td><td>12050-01</td><td></td></tr><tr><td>Braided Silk Suture</td><td>Fine Science Tools, Germany</td><td>18020-60</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Recordings, light stimulation, and analysis&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>artificial cerebrospinal fluid (ACSF)</td><td>for composition see references #16 and #23</td><td></td><td></td></tr><tr><td>internal patch solutions</td><td>for composition see references #16 and #23</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MagnesiumSulfate Heptahydrate</td><td>Roth, Germany</td><td>P027.1</td><td>prepare 2M stock solution in purified water</td></tr><tr><td>Slicer, Microm HM650V</td><td>Fisher Scientific, Germany</td><td>920120</td><td></td></tr><tr><td>Cooling unit for tissue slicer, CU65</td><td>Fisher Scientific, Germany</td><td>770180</td><td></td></tr><tr><td>Sapphire blade</td><td>Delaware Diamond Knives</td><td></td><td>custom order, inquire with company</td></tr><tr><td>Stereoscope, SZX2-RFA16</td><td>Olympus, Japan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xcite fluorescent lamp (XI120Q-1492)</td><td>Lumen Dynamics Group, Canada</td><td>2012-12699</td><td></td></tr><tr><td>Patch microscope, BX51WI</td><td>Olympus, Japan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multiclamp 700B patch amplifier&amp;nbsp;</td><td>Molecular Devices, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Digitdata 1440A</td><td>Molecular Devices, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PClamp software, Version 10</td><td>Molecular Devices, USA</td><td></td><td>used to control data acquisition and stimulation</td></tr><tr><td>Bath temperature controler, TC05</td><td>Luigs &amp;amp; Neumann, Germany</td><td>200-100 500 0145</td><td></td></tr><tr><td>Three axis micromanipulator Mini 25</td><td>Luigs &amp;amp; Neumann, Germany</td><td>210-100 000 0010</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator controller SM7</td><td>Luigs &amp;amp; Neumann, Germany</td><td>200-100 900 7311</td><td></td></tr><tr><td>glass capillaries for patch pipettes</td><td>World Precision Instruments, Germany</td><td>GB150F-8P</td><td></td></tr><tr><td>Cellulose nitrate filterpaper for interface chamber&amp;nbsp;</td><td>Satorius Stedim Biotech, Germany</td><td>13006--50----ACN</td><td></td></tr><tr><td>LED unit, CoolLED pE</td><td>CoolLED, UK</td><td>244-1400</td><td>CoolLED or USL 70/470 and appropriate adapters are two alternative choices for LED stimulation</td></tr><tr><td>CoolLED 100 Dual Adapt</td><td>CoolLED, UK</td><td>pE-ADAPTOR-50E</td><td>CoolLED or USL 70/470 and appropriate adapters are two alternative choices for LED stimulation</td></tr><tr><td>LED unit, USL 70/470</td><td>Rapp Optoelectronic</td><td>L70-000</td><td>CoolLED or USL 70/470 and appropriate adapters are two alternative choices for LED stimulation</td></tr><tr><td>Dual port adapter</td><td>Rapp Optoelectronic</td><td>inquire with company</td><td>CoolLED or USL 70/470 and appropriate adapters are two alternative choices for LED stimulation</td></tr><tr><td>Filter set red (excitation)</td><td>AHF, Germany</td><td>F49-560</td><td>Filters can be bought as set F46-008</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; (beamsplitter)</td><td>AHF, Germany</td><td>F48-585</td><td>Filters can be bought as set F46-008</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; (emission)</td><td>AHF, Germany</td><td>F47-630</td><td>Filters can be bought as set F46-008</td></tr><tr><td>Filter set green (excitation)</td><td>AHF, Germany</td><td>F39-472</td><td>Alternatives: filterset F36-149 or F46-002 (with bandpass emission)</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; (beamsplitter)</td><td>AHF, Germany</td><td>F43-495W</td><td>Alternatives: filterset F36-149 or F46-002 (with bandpass emission)</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; (emission)</td><td>AHF, Germany</td><td>F76-490</td><td>Alternatives: filterset F36-149 or F46-002 (with bandpass emission)</td></tr><tr><td>LaserCheck, handheld power meter</td><td>Coherent, USA</td><td>1098293</td><td></td></tr><tr><td>IgorPro Software, Version 6</td><td>Wavemetrics, USA</td><td></td><td>for electrophysiology data analysis, other alternative software packages can also be used&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Neuromatic suite of macros for IgorPro</td><td>http://www.neuromatic.thinkrandom.com</td><td></td><td>for electrophysiology data analysis, other alternative software packages can also be used&amp;nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Post hoc analysis of injections and projections&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde powder (PFA)</td><td>Roth, Germany</td><td>0335.2</td><td></td></tr><tr><td>Neurotrace 435/455 blue fluorescent Nissl stain</td><td>Invitrogen</td><td>N-21479</td><td></td></tr><tr><td>agar-agar for embedding and resectioning</td><td>Roth, Germany</td><td>5210.3</td><td></td></tr><tr><td>30 x 10 mm petri dishes for embedding</td><td>SPL Life Sciences</td><td></td><td>alternatives can be used</td></tr><tr><td>Slides, Super Frost</td><td>R. Langenbrinck, Germany</td><td>61303802</td><td>alternatives can be used</td></tr><tr><td>cover slips</td><td>R. Langenbrinck, Germany</td><td>3000302</td><td>alternatives can be used</td></tr><tr><td>Vecta Shield mounting medium</td><td>Vector Laboratories, USA</td><td>H-1000</td><td>alternative mounting media can be used</td></tr><tr><td>cellulose nitrate filter for flattening slices for fixation</td><td>Satorius Stedim Biotech, Germany</td><td>11406--25------N</td><td></td></tr><tr><td>Confocal Laser Scanning Microscope LSM 710</td><td>Zeiss, Germany</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ex vivo optogenetic dissection of fear circuits in brain slices

Optogenetic yaklaşımlar günümüzde yaygın ışığı ışık ile aktive olan protein ve nöral etkinlik sonraki manipülasyon hedeflenen ifade birleştirerek nöral popülasyonları ve devrelerin işlevini incelemek için kullanılır. Channelrhodopsins (CHRS) ışık geçişli katyon-kanal ve bir flüoresan proteinine olduğunda ekspresyon görselleştirme ve özel hücre tipleri aynı anda harekete geçirmek ve beynin belirli bölgelerde aksonal projeksiyonlar sağlar. Viral vektörlerin stereotaktik enjeksiyon yoluyla, CHR füzyon proteinleri yapısal olarak ya da koşullu tanımlanmış bir beyin bölgesi spesifik hücrelerde eksprese edilebilir, ve aksonal çıkıntılar daha sonra beyin kesitleri ex vivo Optogenetic aktivasyonu yoluyla anatomik ve fonksiyonel olarak incelenebilir. Geleneksel elektriksel stimülasyon yaklaşımlarla ele edilemeyen bağlantılarının sinaptik özelliklerini anlamak amacıyla bu, ya da roman AFFE belirlenmesinde özel bir öneme sahiptirkira ve daha önce çok az anlaşılmış oldu efferent bağlantısı. İşte bir kaç örnek bu teknik amigdala korku ile ilgili devreleri açıklık bu soruları araştırmak için nasıl uygulanabileceğini göstermektedir. amigdala korku ve duygusal anılar edinilmesi ve korku ifadesi ve depolama için bir anahtar bölgedir. kanıt kaç satır medial prefrontal korteks (MPFC) korku edinimi ve nesli farklı yönlerini katılır, ancak amigdala ile hassas bağlantı sadece anlaşılmalıdır başlıyor düşündürmektedir. Ex vivo Optogenetic aktivasyon bazolateral amigdala (bla) &#39;de MPFC afferent ve hedef hücreler arasındaki sinaptik iletişim yönlerini incelemek için nasıl kullanılabileceğini İlk olarak, gösterilmiştir. Bundan başka, bu ex vivo Optogenetic yaklaşım, amigdala GABAerjik nöronlar bir grup ile yeni bir bağlantı boyutlarını ölçen uygulanabilir kadar gösterilmiş olup, bir örnek olarak paracapsular birleştirilmiş zigot (mpITC).

Bu bölümde, duyusal ve modülatör BLA uzun menzilli projeksiyonlar ve mpITC nöronlar yanı sıra mpITC ve BLA arasında yerel bağlantı özelliklerinin fizyolojik özelliklerini araştırmak için bir ex vivo optogenetic yaklaşım ve farklı deneysel stratejiler temsili sonuçların akışını gösterir. Fare beyin arzu edilen koordinatları için seçilen viral vektörün stereotaktik enjeksiyon sonrasında <s...

Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices at JoVE.com

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Beyin Dilimleri Korku Devre Ex Vivo optogenetic Diseksiyon

Optogenetic yaklaşımlar yaygın nöral aktiviteyi işlemek ve beyin fonksiyonu için sonuçlarını değerlendirmek için kullanılır. Burada, bir teknik optik aktivatör channelrhodopsin in vivo tanımlanması üzerine, korku ile ilgili devreler özel uzun menzilli ve yerel sinirsel bağlantılar sinaptik özellikleri ex vivo analiz için izin verdiği gösterilmiştir.

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated ...

ex-vivo-optogenetic-dissection-of-fear-circuits-in-brain-slices

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

15.9K Görüntüleme.  University of Tuebingen.  Optogenetic yaklaşımlar yaygın nöral aktiviteyi işlemek ve beyin fonksiyonu için sonuçlarını değerlendirmek için kullanılır. Burada, bir teknik optik aktivatör channelrhodopsin in vivo tanımlanması üzerine, korku ile ilgili devreler özel uzun menzilli ve yerel sinirsel bağlantılar sinaptik özellikleri ex vivo analiz için izin verdiği gösterilmiştir. 

Video: Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Laser-scanning Photostimulation of Optogenetically Targeted Forebrain Circuits

The sensory forebrain is composed of intricately connected cell types, of which functional properties have yet to be fully elucidated. Understanding the interactions of these forebrain circuits has been aided recently by the development of optogenetic methods for light-mediated modulation of neuronal activity. Here, we describe a protocol for examining the functional organization of forebrain circuits&#160;in vitro using laser-scanning photostimulation of channelrhodopsin, expressed optogenetically via viral-mediated transfection. This approach also exploits the utility of cre-lox recombination in transgenic mice to target expression in specific neuronal cell types. Following transfection, neurons are physiologically recorded in slice preparations using whole-cell patch clamp to measure their evoked responses to laser-scanning photostimulation of channelrhodopsin expressing fibers. This approach enables an assessment of functional topography and synaptic properties. Morphological correlates can be obtained by imaging the neuroanatomical expression of channelrhodopsin expressing fibers using confocal microscopy of the live slice or post-fixed tissue. These methods enable functional investigations of forebrain circuits that expand upon more conventional approaches.

We describe a method for characterizing the functional topography and synaptic properties of forebrain circuits using an optogenetic approach to photostimulate neuronal populations&#160;in vitro.

Optogenetically Hedeflenen Önbeyin Devreler Lazer tarama photostimulation

The sensory forebrain is composed of intricately connected cell types, of which functional properties have yet to be fully elucidated. Understanding the ...

Nörobilim

In Vivo Intracerebral Stereotaxic Injections for Optogenetic Stimulation of Long-Range Inputs in Mouse Brain Slices

Knowledge of cell-type specific synaptic connectivity is a crucial prerequisite for understanding brain-wide neuronal circuits. The functional investigation of long-range connections requires targeted recordings of single neurons combined with the specific stimulation of identified distant inputs. This is often difficult to achieve with conventional and electrical stimulation techniques, because axons from converging upstream brain areas may intermingle in the target region. The stereotaxic targeting of a specific brain region for virus-mediated expression of light-sensitive ion channels allows selective stimulation of axons originating from that region with light. Intracerebral stereotaxic injections can be used in well-delimited structures, such as the anterior thalamic nuclei, in addition to other subcortical or cortical areas throughout the brain.
Described here is a set of techniques for precise stereotaxic injection of viral vectors expressing channelrhodopsin in the mouse brain, followed by photostimulation of axon terminals in the brain slice preparation. These protocols are simple and widely applicable. In combination with whole-cell patch clamp recording from a postsynaptically connected neuron, photostimulation of axons allows the detection of functional synaptic connections, pharmacological characterization, and evaluation of their strength. In addition, biocytin filling of the recorded neuron can be used for post-hoc morphological identification of the postsynaptic neuron.

This protocol describes a set of methods to identify the cell-type specific functional connectivity of long-range inputs from distant brain regions using optogenetic stimulations in ex vivo brain slices.

Fare Beyin Dilimlerinde Uzun Menzilli Girdilerin Optogenetik Stimülasyonu için Vivo İntraserebral Stereotaksik Enjeksiyonlarda

Knowledge of cell-type specific synaptic connectivity is a crucial prerequisite for understanding brain-wide neuronal circuits. The functional ...

Wide-field Single-photon Optical Recording in Brain Slices Using Voltage-sensitive Dye

Wide-field single photon voltage-sensitive dye (VSD) imaging of brain slice preparations is a useful tool to assess the functional connectivity in neural circuits. Due to the fractional change in the light signal, it has been difficult to use this method as a quantitative assay. This article describes special optics and slice handling systems, which render this technique stable and reliable. The present article demonstrates the slice handling, staining, and recording of the VSD-stained hippocampal slices in detail. The system maintains physiological conditions for a long time, with good staining, and prevents mechanical movements of the slice during the recordings. Moreover, it enables staining of slices with a small amount of the dye. The optics achieve high numerical aperture at low magnification, which allows recording of the VSD signal at the maximum frame rate of 10 kHz, with 100 pixel x 100-pixel spatial resolution. Due to the high frame rate and spatial resolution, this technique allows application of the post-recording filters that provide sufficient signal-to-noise ratio to assess the changes in neural circuits.

We introduce a reproducible and stable optical recording method for brain slices using voltage-sensitive dye. The article describes voltage-sensitive dye staining and recording of optical signals using conventional hippocampal slice preparations.

Gerilim duyarlı boya kullanarak beyin dilimleri geniş alan tek foton optik kayıt

Wide-field single photon voltage-sensitive dye (VSD) imaging of brain slice preparations is a useful tool to assess the functional connectivity in neural ...

Optogenetic Activation of Afferent Pathways in Brain Slices and Modulation of Responses by Volatile Anesthetics

Anesthetics influence consciousness in part via their actions on thalamocortical circuits. However, the extent to which volatile anesthetics affect distinct cellular and network components of these circuits remains unclear. Ex vivo brain slices provide a means by which investigators may probe discrete components of complex networks and disentangle potential mechanisms underlying the effects of volatile anesthetics on evoked responses. To isolate potential cell type- and pathway-specific drug effects in brain slices, investigators must be able to independently activate afferent fiber pathways, identify non-overlapping populations of cells, and apply volatile anesthetics to the tissue in aqueous solution. In this protocol, methods to measure optogenetically-evoked responses to two independent afferent pathways to neocortex in ex vivo brain slices are described. Extracellular responses are recorded to assay network activity and targeted whole-cell patch clamp recordings are conducted in somatostatin- and parvalbumin-positive interneurons. Delivery of physiologically relevant concentrations of isoflurane via artificial cerebral spinal fluid to modulate cellular and network responses is described.

Ex vivo brain slices can be used to study the effects of volatile anesthetics on evoked responses to afferent inputs. Optogenetics are employed to independently activate thalamocortical and corticocortical afferents to non-primary neocortex, and synaptic and network responses are modulated with isoflurane.

Beyin Dilimlerinde Afferent Yolakların Optogenetik Aktivasyonu ve Uçucu Anesteziklerle Yanıtların Modülasyonu

Anesthetics influence consciousness in part via their actions on thalamocortical circuits. However, the extent to which volatile anesthetics affect ...

In Situ Visualization of Axon Growth and Growth Cone Dynamics in Acute Ex Vivo Embryonic Brain Slice Cultures

During neuronal development, axons navigate the cortical environment to reach their final destinations and establish synaptic connections. Growth cones -the sensory structures located at the distal tips of developing axons- execute this process. Studying the structure and dynamics of the growth cone is crucial to understanding axonal development and the interactions with the surrounding central nervous system (CNS) that enable it to form neural circuits. This is essential when devising methods to reintegrate axons into neural circuits following injury in fundamental research and pre-clinical contexts. Thus far, the general understanding of growth cone dynamics is primarily founded on studies of neurons cultured in two dimensions (2D). Although undoubtedly fundamental to the current knowledge of growth cone structural dynamics and response to stimuli, 2D studies misrepresent the physiological three-dimensional (3D) environment encountered by neuronal growth cones in intact CNS tissue. More recently, collagen gels were employed to overcome some of these limitations, enabling the investigation of neuronal development in 3D. However, both synthetic 2D and 3D environments lack signaling cues within CNS tissue, which direct the extension and pathfinding of developing axons. This protocol provides a method for studying axons and growth cones using organotypic brain slices, where developing axons encounter physiologically relevant physical and chemical cues. By combining fine-tuned in utero and ex utero electroporation to sparsely deliver fluorescent reporters along with super-resolution microscopy, this protocol presents a methodological pipeline for the visualization of axon and growth cone dynamics in situ. Furthermore, a detailed toolkit description of the analysis of long-term and live-cell imaging data is included.

In Situ Visualization of Axon Growth and Growth Cone Dynamics in Acute Ex Vivo Embryonic Brain Slice Cultures

This protocol demonstrates a straightforward and robust method to study in situ axon growth and growth cone dynamics. It describes how to prepare ex vivo physiologically relevant acute brain slices and provides a user-friendly analysis pipeline.

Yerinde Akut Ex Vivo Embriyonik Beyin Dilimi Kültürlerinde Akson Büyümesi ve Büyüme Koni Dinamiğinin Görselleştirilmesi

During neuronal development, axons navigate the cortical environment to reach their final destinations and establish synaptic connections. Growth cones ...

Ex Vivo Optogenetic Interrogation of Long-Range Synaptic Transmission and Plasticity from Medial Prefrontal Cortex to Lateral Entorhinal Cortex

Studying the physiological properties of specific synapses in the brain, and how they undergo plastic changes, is a key challenge in modern neuroscience. Traditional in vitro electrophysiological techniques use electrical stimulation to evoke synaptic transmission. A major drawback of this method is its nonspecific nature; all axons in the region of the stimulating electrode will be activated, making it difficult to attribute an effect to a particular afferent connection. This issue can be overcome by replacing electrical stimulation with optogenetic-based stimulation. We describe a method for combining optogenetics with in vitro patch-clamp recordings. This is a powerful tool for the study of both basal synaptic transmission and synaptic plasticity of precise anatomically defined synaptic connections and is applicable to almost any pathway in the brain. Here, we describe the preparation and handling of a viral vector encoding channelrhodopsin protein for surgical injection into a pre-synaptic region of interest (medial prefrontal cortex) in the rodent brain and making of acute slices of downstream target regions (lateral entorhinal cortex). A detailed procedure for combining patch-clamp recordings with synaptic activation by light stimulation to study short- and long-term synaptic plasticity is also presented. We discuss examples of experiments that achieve pathway- and cell-specificity by combining optogenetics and Cre-dependent cell labeling. Finally, histological confirmation of the pre-synaptic region of interest is described along with biocytin labeling of the post-synaptic cell, to allow further identification of the precise location and cell type.

Ex Vivo Optogenetic Interrogation of Long-Range Synaptic Transmission and Plasticity from Medial Prefrontal Cortex to Lateral Entorhinal Cortex

Here we present a protocol describing viral transduction of discrete brain regions with optogenetic constructs to permit synapse-specific electrophysiological characterization in acute rodent brain slices.

Eski Vivo Medial Prefrontal Korteksten Lateral Entorinal Kortekse Uzun Menzilli Sinaptik İletim ve Plastisitenin Optogenetik Sorgulanması

Studying the physiological properties of specific synapses in the brain, and how they undergo plastic changes, is a key challenge in modern neuroscience. ...

Visualization and Mapping of Neuronal Pathways in an Amygdala Brain Slice

Source: Bosch, D., et al. <a href="https://app.jove.com/v/53628">Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices.</a> J. Vis. Exp. (2016).
This video demonstrates a procedure for analyzing synaptic connectivity between medial prefrontal cortex (mPFC) and amygdala neurons using acute amygdala brain slices from mice. The mPFC neurons in these mice express channelrhodopsin fused to a fluorescent protein. The channelrhodopsins facilitate ion influx and action potential generation in the mPFC neurons upon light activation. Consequently, mPFC neurons release neurotransmitters that bind to postsynaptic amygdala neurons, triggering postsynaptic currents that are recorded to visualize mPFC-amygdala connectivity.

Amigdala Beyin Dilimindeki Nöronal Yolların Görselleştirilmesi ve Haritalanması

All procedures involving animal samples have been reviewed and approved by the appropriate animal ethical review committee.
1. Visualization and ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neurophysiology

Imaging and Optical Techniques

An Electrophysiological Study of Retinogeniculate and Corticogeniculate Synapses in Mouse Brain Slices

Source: Chen, X., et al. <a href="https://app.jove.com/v/59680">Electrophysiological Investigations of Retinogeniculate and Corticogeniculate Synapse Function.</a> J. Vis. Exp. (2019).
The video describes the electrophysiological recording of retinogeniculate and corticogeniculate synapses in mouse brain slices. The slices containing the dorsal lateral geniculate nucleus (dLGN) are placed in a recording chamber. A stimulating pipette is positioned on either the optic tract to stimulate retinal ganglion cells (RGCs) and investigate retinogeniculate synapses or the nucleus reticularis thalami to stimulate cortical neurons and investigate corticogeniculate synapses. Upon stimulation, the RGCs and cortical neurons release excitatory neurotransmitters, which produce synaptic currents in the LGN relay neurons. These currents are recorded using a patch-clamp recording pipette.

Fare Beyin Dilimlerinde Retinogenikülat ve Kortikogenikülat Sinapsların Elektrofizyolojik Bir Çalışması

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Solutions

	Dissection solution
	
...

Electrophysiology Techniques

Simultaneous Optical and Electrophysiological Monitoring of Neuronal Cells in Brain Slices

Source:&#160; Murphy, C. A., et al. <a href="https://app.jove.com/v/61333">Optogenetic activation of afferent pathways in brain slices and modulation of responses by volatile anesthetics.</a> J. Vis. Exp. (2020)
This video outlines a method for simultaneously imaging and recording electrical activity from transgenic brain slices that contain neuron-specific fluorescent proteins. The procedure involves maintaining the brain slice in a perfusion chamber with aerated artificial cerebrospinal fluid, using a light source to excite fluorescent-labeled cells, and recording the electrical signals with a multichannel probe and patch clamp.

Beyin Dilimlerindeki Nöronal Hücrelerin Eş Zamanlı Optik ve Elektrofizyolojik İzlenmesi

All procedures involving animal samples have been reviewed and approved by the appropriate animal ethical review committee.&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;
...

Generation of Tilted Amygdala Slices from a Mouse Brain

Source: Bosch, D., et al. <a href="https://app.jove.com/v/53628">Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices.</a> J. Vis. Exp. (2016)
The video demonstrates the generation of tilted amygdala slices from a mouse brain. The brain is positioned at an angle on the vibratome specimen stage to obtain slices containing the amygdala and axons from the medial prefrontal cortex that form synaptic connections with the amygdala. The brain slices are maintained at the physiological temperature to preserve the tissue for further experiments.

Bir Fare Beyninden Eğik Amigdala Dilimlerinin Üretilmesi

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Preparation of Acute Slices

	...