Authors were supported by the German Cancer Aid (Max Eder Nachwuchsgruppe, Deutsche Krebshilfe; EU), the LOEWE Center for Cell and Gene Therapy Frankfurt (EU, ST) funded by the Hessian Ministry of Higher Education, Research and the Arts, Germany (III L 4- 518/17.004) and by the "Alfred- und Angelika Gutermuth-Stiftung", Frankfurt, Germany (EU). BJ was funded by a Mildred Scheel postdoctoral scholarship from the Dr. Mildred Scheel Foundation for Cancer Research. ST was founded by a GO-IN postdoctoral fellowship (PCOFUND-GA-2011-291776). The authors thank Becton Dickinson (BD) for providing the FACSCanto II and Canto10c Flow Cytometry Analyzers used in this study.

Bu çalışma Frankfurt Üniversitesi yerel etik kurul önerileri doğrultusunda gerçekleştirilmiştir. K562 hücrelerinin 1. Kültürleme <ol><li> R10 ortam Kültür K562 hücreleri, 37 ° C&#39;de ve% 5 CO bir hücre kültürü şişesi içinde, ml başına 0.5-1 x 10 6 hücre yoğunluğunda (glutamin ortamı,% 1 penisilin / streptomisin,% 10 fetal dana serumu ile RPMI-1640) 2. </li><li> Hasat K562 Hücreler Yeni deney başlamadan önce 24 saat. <ol><li> inkübatör K562 hücreleri içeren hücre kültürü şişesi çıkarın. Hafifçe yukarı ve aşağı pipetleme kültür ortamı içinde K562 hücreleri yeniden askıya. </li><li> 15 ya da 50 ml tüp içine K562 hücreleri içeren kültür ortamı aktarın ve 8 dakika boyunca 400 x g&#39;de pelet hücreleri. Süpernatantı atın ve 5 ml R10 medya hücrelerin yeniden askıya ve iyice karıştırın. </li><li> Aktarım, 96 U-bölmeli plaka iyi içine hücre çözeltisinin 20 ul. 20 uL tripan mavi ilave edin veEn az 5 kez yukarı pipetleme ve aşağı iyice karıştırın. Pipet hücre sayım odasına çözeltisi 10 ul ve hücre sayımı. </li><li> 8 dakika boyunca 400 x g&#39;de Pelet hücreleri. R10 medya hücreleri yeniden askıya ve ml başına 0.5-1 x 10 6 hücre K562 hücre konsantrasyonunu ayarlamak. </li><li> Kullanılana kadar CO2 37 ° C&#39;de bir hücre kültür şişesi içinde K562 hücreleri inkübe ve% 5. </li></ol></li></ol> NK Hücrelerinin 2. İzolasyon <ol><li> Yerel etik kurul onayı ve yönetmeliklerine uygun olarak, EDTA veya heparinli periferik kandan birinin 6-10 ml toplamadan önce sağlıklı donörün ya da hastanın yazılı bilgilendirilmiş onam edinin. </li><li> Sakla deney başlangıcına kadar 4 ° C &#39;de NK hücre izolasyon reaktifler ve steril koşullar altında, oda sıcaklığında (RT) kullanın. Manyetik mikroboncuklar ve t uygun hücre izolasyonu için belirli bir mıknatıs kullanılarak periferik kan NK hücreleri izoleÜreticinin talimatları diye. <ol><li> şişenin içine (NK hücre izolasyon kiti dahil) sağlanan tampon A 7.5 ml pipetleme liyofilize NK hücre negatif izolasyon antikor kokteyli bir flakon sulandırın. aşağı 3-4 kez yukarı pipetleme ve hafifçe karıştırın. NOT: Süspansiyon Her kullanımdan önce homojen olduğundan emin olun. </li><li> Adım 2.2.1 ve (NK hücre izolasyon kiti dahil) tampon B&#39;den yeniden pelet uygun hacimleri karıştırılarak nihai kokteyl çözüm hazırlayın. Bu miktarlar belirlemek = hacim olarak ml 1.0 tam kan örneğinin hacmini tanımlamak için kullanılır. tam kan 1 hacim işlemek ve tampon B 0.25 hacimleri (adım 2.2.1 itibaren) sulandırılmış pelet 0.25 hacimleri kullanın. </li><li> tam kan örneği içeren uygun bir tüp içine karışımı aktarın. pipet içindeki kan kaybını önlemek için aşağı yukarı pipet ve vermeyin. Bunun yerine, tüp kapatın ve Asma tavanlar kadar dikkatlice yukarı ve aşağı hareket ettirinsion homojendir. vorteks etmeyin. </li><li> Bundan başka, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca tüp rotator kullanarak örnek homojenleştirin. </li><li> steril koşullar altında, kapağı çıkarın ve üretici tarafından tavsiye edildiği gibi, 15 dakika boyunca manyetik ayırıcıya tüp yerleştirin. tüp etiketleri ayırma hattının rahatsız görünürlüğünü sağlamak için mıknatısın arka dönük olduğundan emin olun. Bu prosedür rahatsız gibi, ayrılması sırasında mıknatısı hareket ettirmeyin. </li><li> Dikkatle yeni bir 15 ml tüp içine süpernatant transferi ve tam medya ile dolmaya (CM, hematopoetik hücre ortamı,% 1 penisilin / streptomisin,% 5 insan serumu). 8 dakika boyunca 400 x g&#39;de Pelet hücreleri. <ol><li> İsteğe bağlı Pellet kırmızı ise, eritrosit lizis tamponu (1 ml hücrelerin yeniden askıya örneğin 1 amonyum klorür-potasyum (ACK) parçalama tamponu mi: 155 mM NH4CI, 0.1 mM EDTA, 10 mM KHCO 3 1 L damıtılmış su (DW)) ve oda sıcaklığında 8 dakika boyunca inkübe edin. Alternatif olarak, bir er kullanınythrocyte tükenme kiti. NOT: ACK tampon kullanımı olumsuz NK hücre fonksiyonlarını 14 etkileyebileceğini aklınızda bulundurun. </li><li> Hızla pelet hücreleri 8 dakika boyunca 400 x g&#39;de lizis ve santrifüj durdurmak için CM en az 1 ml ekleyerek ACK tampon sulandırmak. </li></ol></li><li> 1 ml CM hücre pelet yeniden askıya ve sayma işlemine devam edin. 96 U-bölmeli plaka NK hücre çözeltisinin 20 ul aktarın. Her bir oyuğa, mavi metilen 20 ul ilave edin ve en az 5 kat için pipetleme aşağı iyice karıştırın. Pipet 10 hücre sayım odasına çözeltisi ul sayısı hücreleri. Seçenek olarak ise, ticari olarak temin edilebilen hücre sayacı ile sayılması için seyreltilmemiş hücre süspansiyonu 30 ul kullanın. </li><li> 100 ul santimetre başına en az 2 X 10 4 NK hücrelerinin bir konsantrasyona hücreleri ayarlayın. </li><li> debi sitometresinde saflığını kontrol etmek izole edilmiş NK hücre yüzey antikoru boyamasını gerçekleştirin. <ol><li> PrTablo 1 gereğince belirtilen antikorların hacimleri karıştırılarak bir master miks çözüm epare. </li><li> 88.5 ul yıkama tamponunda hücrelerin yeniden askıya (WB% 0.5 sığır serum albümini (BSA),% 0.1 PBS içinde NaN3) ve ana karışım çözeltisi 11.5 ul ekle. karanlıkta 4 ° C&#39;de 20 dakika boyunca inkübe hücreleri. Dikkat: NaN 3 toksik ve mutajen olduğunu. İlgili Malzeme Güvenlik Bilgi Formunda (MSDS) buna göre idare. </li><li> 4 dakika boyunca 400 xg&#39;de hücreleri WB 1 ml ekleyin ve pelet. </li><li> 300 ul tampon boyama artı DAPI hücreleri yeniden askıya. bir akış sitometresinin kullanarak hücrelerin elde edin. NOT: NK hücre saflık tüm canlı lenfositlerin en az% 80 olması durumunda deney ile daha fazla devam edin. </li></ol></li></ol></li></ol> NK Hücre Stimulation için K562 hücrelerinin 3. Hasat <ol><li> inci (adım 1.2 dan itibaren) K562 hücreleri içeren hücre kültürü şişesi kaldır<html> e inkübatör. Hafifçe yukarı ve aşağı pipetleme kültür ortamı içinde K562 hücreleri yeniden askıya. </li><li> 15 ya da 50 ml tüp içine bütün kültür ortamı aktarın ve 8 dakika boyunca 400 x g&#39;de pelet hücreleri. Süpernatant atılır ve 5 ml fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) içinde hücrelerin yeniden askıya ve iyice karıştırın. </li><li> Aktarım, 96 U-bölmeli plaka iyi içine hücre çözeltisinin 20 ul. Mavi 20 ul tripan ekleyin ve en az 5 kez yukarı pipetleme ve aşağı iyice karıştırın. Pipet hücre sayım odasına çözeltisi 10 ul ve hücre sayımı. Alternatif olarak, ticari olarak temin edilebilen hücre sayacı ile saymak seyreltilmemiş hücre süspansiyonu 30 ul kullanın. </li><li> 8 dakika boyunca 400 x g&#39;de Pelet hücreleri. 100 ul ortam başına en az 2 X 10 4 K562 hücrelerinin bir konsantrasyonda CM hücrelerin yeniden askıya. NOT: Bir efektör iki inkübe için aynı K562 ve NK hücre konsantrasyonları kullanın: Hedef: 1 (E T) oranı: 1, daha sonra. </li></ol>Tümör Hücre Hattı K562 ve Sitokinlerle NK Hücrelerinin &quot;&gt; 4. Uyarım <ol><li> Yavaşça en az 5 kez onları pipetleme ve aşağı hücreleri karıştırın. 100 ul / kuyu NK hücre çözeltisi 96 V-plaka gerekli kuyu içine dağıtın. <ol><li> Bir uyarana (örneğin, K562 tümör hücreleri ve sitokinler) olmadan, her donör için birlikte diğeri en az iki kuyu kullanın. Mümkün olduğunda, en azından iki kez, deney sonuçlarını ve pozitif kontrol (ör forbol 12-miristat 13-asetat (PMA) ve iyonomisin; nihai konsantrasyon: 50 nM PMA, oyuk başına iyonomisin 1 uM) ilave edilir. Deney için tarih tazminatları sitometri güncellenen akış hazırlayın. NOT: antikorların önce kullanım (tartışma) titre edilir. </li></ol></li><li> ışık kapatın ve anti-CD 107a antikoru (2 ul, nihai konsantrasyon 100: 1) ekleyin, 96-V-oyuklu bir plaka üzerinde NK hücreleri, her bir kuyucuğa. </li><li> Yavaşça onları pipetleme ve en aşağı K562 hücreleri mixen az 5 kez. <ol><li> NK hücre / anti-CD 107a antikor çözüm içeren kuyulardan, K562 hücreleri ile uyarılması için planlanan olanları tespit. 100 ul / böyle kuyulara K562 hücre çözeltisinin Well ekleyin. En az 5 kez yukarı pipetleme ve aşağı dikkatlice karıştırın. </li><li> Ekle interlökin-2 (IL-2, nihai konsantrasyon 100 U / ml) ve interlökin-15 (IL-15; nihai konsantrasyon 10 ng / ml) K562 hücreleri ve NK hücre / anti-CD 107a antikor çözeltisi ihtiva eden oyuklara. <ol><li> İsteğe bağlı Tümör kaynaklı sitokin kaynaklı NK hücresi fonksiyonlarının karşılık deşifre dağıtıldı NK hücreleri tek başına K562 hücreleri veya sitokinler ya etkisini test edin. </li></ol></li><li> 96-V-oyuklu bir plaka üzerinde kuyu tespit uyarıcı olmayan negatif kontrol olarak planlanmış. Sadece NK hücre / anti-CD 107a antikor çözeltisi ihtiva eden bu oyuklara 100 ul / oyuk CM ekleyin. En az 5 kez yukarı pipetleme ve aşağı dikkatlice karıştırın. <ol><li> İsteğe bağlı: bir pozitif kontrol, 100 u ekleme, PMA ve iyonomisin ihtiva eden L CM (nihai konsantrasyon: 50 nM PMA, oyuk başına iyonomisin 1 uM) NK hücre / anti-CD 107a antikor çözeltisi ile bir kuyuya. </li></ol></li></ol></li><li> 37 ° C&#39;de karanlıkta 3 saat ve% 5 CO2 inkübe hücreleri. </li><li> Bir protein taşıma inhibitörü çözeltisi hazırlayın (örn A ve / veya monensin Brefeldin) CM. inkübasyondan 1 saat sonra, ışık ile 96 V-oyuklu plakanın her oyuğuna çözeltisini ekleyin kapatılır (nihai konsantrasyon: 0.5-1μM Brefeldin A ve 2-3 uM monensin). En az 5 kez yukarı pipetleme ve aşağı dikkatlice karıştırın. Geri kalan 2 saat inkübasyona devam edin. </li></ol> 5. Yüzey ve Hücre içi Boyama <ol><li> 3 saatlik bir bekletme süresinden sonra, en az 5 kat için pipetleme aşağı dikkatle 96 V-kuyulu plakanın kuyularına olan hücrelerin karışımı ve borular akış sitometrisi içine aktarın. 1 ml / DB tüp ekleyin. 4 dakika boyunca 400 xg&#39;de Pelet hücreleri. <ol><li> İsteğe bağlı: santrifüj ilgili FACS tüpü içine hücreleri aktarmadan önce en az 5 kat için pipetleme aşağı hücre geri kazanımını optimize etmek için, 100 ul / göz PBS ile yıkayın önce. </li></ol></li><li> Süpernatantı atın ve Yüzey Boyama ile devam edin. </li><li> Bir tamir edilebilir ölü hücre işaretleyici (DCM) gibi 423 nm&#39;lik bir emisyon maksimum hücreleri canlı olmayan geçirgen olan bir amin-reaktif floresan boya içerir. önce (aşağıya bakınız) veya antikor yüzeyi boyama kullanılabilir, DCM tipine bağlı olarak paralel olarak boyama gerçekleştirin. <ol><li> 99 ul / tüp PBS hücrelerin askıya Re 1 ul / tamir edilebilir DCM (nihai konsantrasyon: 1: 100) tüp ekleyin. de bir girdap kullanarak hücreleri karıştırın ve karanlıkta oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe. </li><li> (Adım sütun boyama bkz mavi vurgulanmış) Tablo 2&#39;de listelenen &quot;yüzey&quot; antikorlar karıştırılarak bir master miks çözeltisi hazırlayın. in kullanhacimleri / tüp dicated ve tüpler lekeli edilecek akış sitometri sayısı ile çarpın. </li><li> İnkübasyondan sonra hücreler tüpler akış sitometrisi almak ve 1 ml / WB tüpünü ekleyin. 4 dakika boyunca 400 x g&#39;de Pelet hücreleri. </li><li> WB 84 ul / tüp içinde hücrelerin yeniden askıya ve 16 ul / master miks çözümün tüp ekleyin süpernatant atın. iyi bir girdap kullanarak hücrelerin karıştırın. karanlıkta 4 ° C&#39;de 20 dakika boyunca inkübe hücreleri. </li><li> 20 dakika sonra 4 dakika boyunca 400 x g&#39;de 1 ml / tüp WB ve pelet hücreleri ekleyin. </li></ol></li><li> Süpernatantı atın ve 100 ul / soğuk sabitleme solüsyonu (örneğin,% 2 (son) paraformaldehid veya formaldehit) bir tüp içinde hücrelerin yeniden askıya. iyi bir girdap kullanarak hücrelerin karıştırın. karanlıkta 4 ° C&#39;de 10 dakika süreyle inkübe hücreleri. <ol><li> Bu adımdan sonra, hücre içi sitokin / kemokin için hücrelerin lekelenmesi ya da UVB 4 ° C&#39;de bir gece boyunca muhafaza edin. NOT: Gece boyunca inkübasyondan sonra, daha düşük bir hücre elde oluşabilir. </ol></li><li> 4 dakika boyunca 400 x g&#39;de 1 ml / tüp WB hücreleri yıkayın ve Permeabilization adımla devam edin. </li><li> Permeabilizasyon tamponu (PB) (PBS içinde, örneğin,% 0.2 saponin,% 1 BSA çözeltisi) hazırlayın. </li><li> 4 dakika boyunca 400 x g&#39;de PB 1 ml / tüp içinde hücreler iki kez yıkayın. hücre içi boyama ile devam edin. Dikkat: Saponin potansiyel rahatsız edici. İlgili Malzeme Güvenlik Bilgi Formunda (MSDS) buna göre idare. </li><li> (Yeşil vurgulanır) Tablo 2&#39;de belirtilen &quot;hücre içi&quot; antikor birimleri kullanarak bir master miks çözeltisi hazırlayın. tüplerin sayısı ile bu miktarlar çarpın lekeli edilecek. <ol><li> 90 ul / tüp PB hücreleri yeniden askıya ve 10 ul / antikor master miks çözümünün tüpünü uygulanır. bir girdap kullanarak iyice karıştırın ve 3 hücreleri inkübeKaranlıkta 4 ° C&#39;de 0 dak. </li></ol></li><li> 4 dakika boyunca 400 xg&#39;de PB 1 ml / tüp içinde iki kez Hücreler yıkayın. </li><li> Süpernatantı atın ve 400 ul / tüp PB hücreleri yeniden askıya. iyi bir girdap kullanarak hücrelerin karıştırın. Ölçme kadar karanlıkta buz üzerinde hücrelerin yerleştirin. </li></ol> 6. Akım Sitometri Tazminat ve Toplama <ol><li> Farklı fluorochromes için kanalı seçin parametre kurulum klasöründe toplama yazılımı flow sitometri içinde (bakınız Tablo 2). Buna ek olarak, FSC A kanal seçim ve SSC-A ve -H olarak -H. </li><li> satın alma dosyasına seçilen parametreler için oluşturulan bir tazminat matris yükleyin. <ol><li> Her kullanılan florokrom için tek renkli bir leke gerçekleştirerek aşama 2.2.8 gelen izole edilmiş NK hücreleri kullanılarak bir dengeleme matris oluşturmak (bakınız Tablo 2). adımlarda 5,1-5,4 açıklanan yüzey boyama protokolü kullanın. Herhangi bir antikor olmadan lekesiz kontrolü (Dahil) Ve izotip kontrolleri ve / veya floresan eksi kontrol (FMO). Not: Hücre bazlı telafisi için bir alternatif olarak, dengeleme kontrol olarak boncuklar IgG bağlama kullanın. </li><li> Tek leke örnekleri için her tüpü ve numune enjeksiyon portu (SIP) içine antikorlar olmadan örnek yerleştirin. Akış sitometri edinme yazılımı &quot;kayıt&quot; butonuna tıklayın ve örnek başına en az 5 x 10 3 NK hücreleri bir hücre sayısını kazanır. </li><li> bir tazminat matris oluşturmak için sitometri toplama yazılımı tazminat hesaplama uygulamasını kullanın. </li></ol></li><li> NK Hücre Nüfus belirlenmesi için Nokta Arsalar oluşturun. <ol><li> FSC-A / FSC-H ve SSC-A / SSC-H nokta araziler kullanılarak tek hücre tanımlayın. &quot;Çokgen kapısı&quot; butonuna tıklayın. Her iki nokta araziler doğrusal dağıtım desen var hücreler, etrafında bir kapı çizin. Yeni bir nokta arsa açmak için kapıları çift tıklayın. </li><li> lenfosit tanımlamak için bir FSC-A / SSC-A nokta arsa seçin/ NK hücre popülasyonu (Şekil 1). etrafında bir poligon kapısı çizin ve kapısı üzerinde çift tıklayın. </li></ol></li><li> SIP içine NK hücre uyarımı testinin her örnek tüp yerleştirin. &quot;Kayıt&quot; butonuna tıklayın ve örnek başına en az 5 x 10 3 NK hücreleri bir hücre sayısını kazanır. </li></ol> 7. Analiz ve İstatistik <ol><li> Analiz yazılım programı flow sitometri açın. uyarılmamış kontrol örneği açmak için yükleme örnek butonuna tıklayın. </li><li> Farklı NK hücre alt (Şekil 1) için Yolluk Sistemi oluşturun. <ol><li> Bir FSC-A / SSC-A arsa oluşturmak için nokta arsa butonuna tıklayın. Dikdörtgen kapı düğmesine tıklayın ve&gt; 5 x 10 4 enkaz dışlamak için bir FSC-A değerine sahip tüm olayları üzerinde bir dikdörtgen kapısı çizin. Kapının üzerinde çift tıklayarak kapıyı açın. </li><li> Yine yeni nokta arsa içinde FSC-A / SSC-A parametrelerini seçin ve poligon kapı düğmesine tıklayın. DLenfosit popülasyonunun etrafında bir poligon kapısı ham (Şekil 1). Kapıyı aç. </li><li> Yeni nokta arsa için SSC-A / SSC-H parametresini seçin ve çevresindeki tüm tek hücreleri bir poligon kapısı çizin. Tek hücreler FSC A / FSC H&#39;dir ve SSC-A / SSC-H parametreleri arasında doğrusal dağılımını göstermektedir (bakınız Şekil 1). Bunun üzerine çift tıklayarak kapıyı açın. </li><li> FSC-A / FSC-H parametreleri bu kez kullanarak adımı yineleyin 7.2.3. </li><li> parametre CD45 kullanın ve kanal Damper (CD3, CD14, CD19, DCM) ölü hücreleri hariç. Tüm CD45 pozitif etrafında bir dikdörtgen kapı çizin ve kanal negatif hücreleri döker. Kapının üzerinde çift tıklayarak kapıyı açın. </li><li> CD56 ile bütün NK hücre popülasyonu tespit ve kanal parametrelerini döker. CD56 pozitif etrafında bir dikdörtgen kapı oluşturun ve negatif hücreleri kanal döker. Bunun üzerine çift tıklayarak kapıyı açın. </li><li> etrafında bir CD56 / CD16 nokta arsa içinde üç NK hücre alt grupları bir dikdörtgen kapı çizin. ide, CD56 ++ CD16 + ve CD56 + CD16 ++ NK hücre alt - CD56 ++ CD16 gibi farklı alt kümelerini ntify. </li></ol></li><li> Her Bireysel NK Hücre Altkümedeki için NK Hücre Fonksiyonları analiz edin. <ol><li> açmak için üç NK hücresi alt kümesi kapılarından biri üzerine tıklayın. CD56 / CD 107a, CD56 / IFN-y ve CD56 / MIP-1 p için üç farklı nokta araziler oluşturun. </li><li> Sırasıyla, CD 107a, IFN-y ya da MIP-1 p için de pozitif CD56 pozitif hücreler, bir dikdörtgen kapı çizin (bakınız Şekil 1). </li><li> kalan her NK hücre alt kümesi için yineleyin 7.3.1-7.3.2. </li></ol></li><li> Adımı tekrarlayın 7.2 ve tüm uyarılmış numuneler için 7.3. analiz yazılımları içinde istatistik ihraç düğmesine tıklayarak her numunenin tüm istatistiksel değerleri kaydedin. </li><li> NK hücre fonksiyonlarını analiz etmek için bireysel örneklerin istatistiksel değerlerini içeren dosyaları açmak. Bireysel NK hücre için değerleri seçinalt grupları (örneğin, CD56 ++ CD16 - NK hücreleri) başka bir dosyaya kopyalayarak. <ol><li> uyarıcı ile muamele edilmiştir CD 107a pozitif NK hücreleri yüzdesi arasında, bir uyarıcı ile muamele edilmemiş CD 107a pozitif NK hücreleri, yüzdesini çıkarın. Not: uyarana yanıt olarak bu, özellikle NK hücresi alt kümesi degranülasyon kapasitesini göstermek için sonuç kullanın. </li><li> IFN-y ve MIP-1p-pozitif NK hücreleri için yineleyin 7.5.1 uyarıcıya tepki olarak sitokin ve kemokin üretimini göstermek için. </li><li> kalan her NK hücre alt kümesi için yineleyin 7.5.1-7.5.2 stimülasyon üzerine kendi degranülasyonu kapasitesi ve sitokin / kemokin üretimini değerlendirmek. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Watzl, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+trigger+a+killer:+modulation+of+natural+killer+cell+reactivity+on+many+levels.">How to trigger a killer: modulation of natural killer cell reactivity on many levels.</a> Adv Immunol. 124, 137-170 (2014).</li><li>Khaznadar, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+NK+Cells+in+Acute+Myeloid+Leukemia+Patients+at+Diagnosis+Are+Associated+with+Blast+Transcriptional+Signatures+of+Immune+Evasion.">Defective NK Cells in Acute Myeloid Leukemia Patients at Diagnosis Are Associated with Blast Transcriptional Signatures of Immune Evasion.</a> J Immunol. 195 (6), 2580-2590 (2015).</li><li>Pical-Izard, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+natural+killer+cells+in+HLA-matched+HSCT+after+reduced-intensity+conditioning:+impact+on+clinical+outcome.">Reconstitution of natural killer cells in HLA-matched HSCT after reduced-intensity conditioning: impact on clinical outcome.</a> Biol Blood Marrow Transplant. 21 (3), 429-439 (2015).</li><li>Ahlenstiel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+changes+in+natural+killer+cell+function+indicate+virologic+response+to+interferon+therapy+for+hepatitis+C.">Early changes in natural killer cell function indicate virologic response to interferon therapy for hepatitis C.</a> Gastroenterology. 141 (4), 1231-1239 (2011).</li><li>Porrata, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+lymphocyte+recovery+predicts+superior+survival+after+autologous+stem+cell+transplantation+in+non-Hodgkin+lymphoma:+a+prospective+study.">Early lymphocyte recovery predicts superior survival after autologous stem cell transplantation in non-Hodgkin lymphoma: a prospective study.</a> Biol Blood Marrow Transplant. 14 (7), 807-816 (2008).</li><li>Silva, I. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversal+of+NK-cell+exhaustion+in+advanced+melanoma+by+Tim-3+blockade.">Reversal of NK-cell exhaustion in advanced melanoma by Tim-3 blockade.</a> Cancer Immunol Res. 2 (5), 410-422 (2014).</li><li>Kiessling, R., Klein, E., Wigzell, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="Natural"+killer+cells+in+the+mouse.+I.+Cytotoxic+cells+with+specificity+for+mouse+Moloney+leukemia+cells.+Specificity+and+distribution+according+to+genotype.">"Natural" killer cells in the mouse. I. Cytotoxic cells with specificity for mouse Moloney leukemia cells. Specificity and distribution according to genotype.</a> Eur J Immunol. 5 (2), 112-117 (1975).</li><li>Somanchi, S. S., Senyukov, V. V., Denman, C. J., Lee, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion,+purification,+and+functional+assessment+of+human+peripheral+blood+NK+cells.">Expansion, purification, and functional assessment of human peripheral blood NK cells.</a> J Vis Exp. (48), (2011).</li><li>Mariani, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokine+production+by+natural+killer+cells+from+nonagenarians.">Chemokine production by natural killer cells from nonagenarians.</a> Eur J Immunol. 32 (6), 1524-1529 (2002).</li><li>Reefman, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine+secretion+is+distinct+from+secretion+of+cytotoxic+granules+in+NK+cells.">Cytokine secretion is distinct from secretion of cytotoxic granules in NK cells.</a> J Immunol. 184 (9), 4852-4862 (2010).</li><li>Jacobs, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NK+Cell+Subgroups,+Phenotype,+and+Functions+After+Autologous+Stem+Cell+Transplantation.">NK Cell Subgroups, Phenotype, and Functions After Autologous Stem Cell Transplantation.</a> Front. Immunol. 6, 583 (2015).</li><li>Alter, G., Malenfant, J. M., Altfeld, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD107a+as+a+functional+marker+for+the+identification+of+natural+killer+cell+activity.">CD107a as a functional marker for the identification of natural killer cell activity.</a> J Immunol Methods. 294 (1-2), 15-22 (2004).</li><li>Theorell, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+and+viable+quantification+of+inside-out+signals+for+LFA-1+activation+in+human+cytotoxic+lymphocytes+by+flow+cytometry.">Sensitive and viable quantification of inside-out signals for LFA-1 activation in human cytotoxic lymphocytes by flow cytometry.</a> J Immunol Methods. 366 (1-2), 106-118 (2011).</li><li>Brander, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+human+NK+cell-mediated+cytotoxicity+by+exposure+to+ammonium+chloride.">Inhibition of human NK cell-mediated cytotoxicity by exposure to ammonium chloride.</a> J Immunol Methods. 252 (1-2), 1-14 (2001).</li><li>Beeton, C., Chandy, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichment+of+NK+cells+from+human+blood+with+the+RosetteSep+kit+from+StemCell+technologies.">Enrichment of NK cells from human blood with the RosetteSep kit from StemCell technologies.</a> J Vis Exp. (8), e326 (2007).</li><li>Lamoreaux, L., Roederer, M., Koup, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+cytokine+optimization+and+standard+operating+procedure.">Intracellular cytokine optimization and standard operating procedure.</a> Nat. Protoc. 1 (3), 1507-1516 (2006).</li><li>Baginska, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granzyme+B+degradation+by+autophagy+decreases+tumor+cell+susceptibility+to+natural+killer-mediated+lysis+under+hypoxia.">Granzyme B degradation by autophagy decreases tumor cell susceptibility to natural killer-mediated lysis under hypoxia.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (43), 17450-17455 (2013).</li><li>He, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+flow+cytometry-based+cytotoxic+T-lymphocyte+assay+through+detection+of+cleaved+caspase+3+in+target+cells.">A sensitive flow cytometry-based cytotoxic T-lymphocyte assay through detection of cleaved caspase 3 in target cells.</a> J Immunol Methods. 304 (1-2), 43-59 (2005).</li><li>Sutton, V. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serglycin+determines+secretory+granule+repertoire+and+regulates+NK+cell+and+CTL+cytotoxicity.">Serglycin determines secretory granule repertoire and regulates NK cell and CTL cytotoxicity.</a> FEBS J. 283 (5), 947-961 (2016).</li><li>Sch&#246;nberg, K., Hejazi, M., Uhrberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+the+clonal+analysis+of+NK+cell+effector+functions+by+multi-parameter+flow+cytometry.">Protocol for the clonal analysis of NK cell effector functions by multi-parameter flow cytometry.</a> Methods Mol Biol. 903, 381-392 (2012).</li><li>Bj&#246;rkstr&#246;m, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+patterns+of+NKG2A,+KIR,+and+CD57+define+a+process+of+CD56dim+NK-cell+differentiation+uncoupled+from+NK-cell+education.">Expression patterns of NKG2A, KIR, and CD57 define a process of CD56dim NK-cell differentiation uncoupled from NK-cell education.</a> Blood. 116 (19), 3853-3864 (2010).</li><li>Bryceson, Y. T., Ljunggren, H. G., Long, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+requirement+for+induction+of+natural+cytotoxicity+and+intersection+of+activation+signals+by+inhibitory+receptors.">Minimal requirement for induction of natural cytotoxicity and intersection of activation signals by inhibitory receptors.</a> Blood. 114 (13), 2657-2666 (2009).</li><li>Cooper, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+natural+killer+cells:+a+unique+innate+immunoregulatory+role+for+the+CD56(bright)+subset.">Human natural killer cells: a unique innate immunoregulatory role for the CD56(bright) subset.</a> Blood. 97 (10), 3146-3151 (2001).</li><li>Fauriat, C., Long, E. O., Ljunggren, H. G., Bryceson, Y. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+human+NK-cell+cytokine+and+chemokine+production+by+target+cell+recognition.">Regulation of human NK-cell cytokine and chemokine production by target cell recognition.</a> Blood. 115 (11), 2167-2176 (2010).</li><li>Postow, M. A., Callahan, M. K., Wolchok, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+Checkpoint+Blockade+in+Cancer+Therapy.">Immune Checkpoint Blockade in Cancer Therapy.</a> J Clin Oncol. 33 (17), 1974-1982 (2015).</li><li>Glienke, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+and+applications+of+CAR-expressing+natural+killer+cells.">Advantages and applications of CAR-expressing natural killer cells.</a> Front Pharmacol. 6, 21 (2015).</li><li>Curran, K. J., Brentjens, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor+T+cells+for+cancer+immunotherapy.">Chimeric antigen receptor T cells for cancer immunotherapy.</a> J Clin Oncol. 33 (15), 1703-1706 (2015).</li><li>Zappasodi, R., de Braud, F., Di Nicola, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphoma+Immunotherapy:+Current+Status.">Lymphoma Immunotherapy: Current Status.</a> Front. Immunol. 6, 448 (2015).</li><li>Laprevotte, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+IL-8+acts+as+a+CD16+co-activator+for+natural+killer-mediated+anti-CD20+B+cell+depletion+in+chronic+lymphocytic+leukemia.">Endogenous IL-8 acts as a CD16 co-activator for natural killer-mediated anti-CD20 B cell depletion in chronic lymphocytic leukemia.</a> Leuk Res. 37 (4), 440-446 (2013).</li><li>Maloney, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IDEC-C2B8+(Rituximab)+anti-CD20+monoclonal+antibody+therapy+in+patients+with+relapsed+low-grade+non-Hodgkin's+lymphoma.">IDEC-C2B8 (Rituximab) anti-CD20 monoclonal antibody therapy in patients with relapsed low-grade non-Hodgkin's lymphoma.</a> Blood. 90 (6), 2188-2195 (1997).</li><li>Salles, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+1+study+results+of+the+type+II+glycoengineered+humanized+anti-CD20+monoclonal+antibody+obinutuzumab+(GA101)+in+B-cell+lymphoma+patients.">Phase 1 study results of the type II glycoengineered humanized anti-CD20 monoclonal antibody obinutuzumab (GA101) in B-cell lymphoma patients.</a> Blood. 119 (22), 5126-5132 (2012).</li><li>Terszowski, G., Klein, C., Stern, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KIR/HLA+interactions+negatively+affect+rituximab-+but+not+GA101+(obinutuzumab)-induced+antibody-dependent+cellular+cytotoxicity.">KIR/HLA interactions negatively affect rituximab- but not GA101 (obinutuzumab)-induced antibody-dependent cellular cytotoxicity.</a> J Immunol. 192 (12), 5618-5624 (2014).</li><li>Hsu, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunostimulatory+effect+of+lenalidomide+on+NK-cell+function+is+profoundly+inhibited+by+concurrent+dexamethasone+therapy.">The immunostimulatory effect of lenalidomide on NK-cell function is profoundly inhibited by concurrent dexamethasone therapy.</a> Blood. 117 (5), 1605-1613 (2011).</li><li>Salih, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+BCR/ABL-inhibitors+imatinib,+nilotinib+and+dasatinib+differentially+affect+NK+cell+reactivity.">The BCR/ABL-inhibitors imatinib, nilotinib and dasatinib differentially affect NK cell reactivity.</a> Int J Cancer. 127 (9), 2119-2128 (2010).</li><li>Benson, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phase+1+trial+of+the+anti-KIR+antibody+IPH2101+in+patients+with+relapsed/refractory+multiple+myeloma.">A phase 1 trial of the anti-KIR antibody IPH2101 in patients with relapsed/refractory multiple myeloma.</a> Blood. 120 (22), 4324-4333 (2012).</li><li>Vey, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phase+1+trial+of+the+anti-inhibitory+KIR+mAb+IPH2101+for+AML+in+complete+remission.">A phase 1 trial of the anti-inhibitory KIR mAb IPH2101 for AML in complete remission.</a> Blood. 120 (22), 4317-4323 (2012).</li><li>Terme, M., Ullrich, E., Delahaye, N. F., Chaput, N., Zitvogel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+killer+cell-directed+therapies:+moving+from+unexpected+results+to+successful+strategies.">Natural killer cell-directed therapies: moving from unexpected results to successful strategies.</a> Nat Immunol. 9 (5), 486-494 (2008).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

tarif edilen yöntem sağlıklı vericilerden veya hastanın tam kan örnekleri NK hücre fonksiyonlarını incelemek için kolay, hızlı ve güvenilir bir yaklaşımdır. Bu yöntem, kaçınarak doğrudan tam kan NK hücrelerinin saflaştırılması için büyük bir avantaj sunmaktadır zaman alıcı bir çok saflaştırma yöntemleri 15 için zorunlu olan yoğunluk gradyan santrifüjleme. Ayrıca, pediatrik ve / veya bağışıklık eksikliği olan hastalarda örnekler için uygun bir alternatif yapar &qu...

doğuştan gelen bağışıklık sistemi doğal katil bir parçası olarak (NK) hücreleri virüs bulaşmış ya da malign hücre transformasyonu karşı ilk savunma hattı katkıda bulunur. inhibe edici ve aktive edici reseptör bir sistem T hücrelerinin aksine önceki antijen astarsız sağlıklı ve dönüştürülmüş hücreler arasında ayrım sağlar. Hedef hücre karşılaşma üzerine NK hücreleri hedeflerini öldürmek için bağışıklık sinaps içine sitotoksik granül (örneğin, perforin, granzymes) içeriğini bırakın. Hedef hücre üzerinde (MIP-1β, örneğin, makrofaj enflamatuar protein 1β) ve kemokinleri:;: Ayrıca, NK hücreleri, farklı sitokin türde (TNF-α, tümör nekroz faktörü-α, IFN-γ, örneğin, interferon-γ) üreten ve salgılayan etkileşimi veya sitokin stimülasyonu 1. Böyle sitotoksisite, kemokin ve sitokin üretimi yeterli NK hücre fonksiyonları farklı dis kaderi üzerinde önemli bir etkiye sahipkolaylaştırır. Onlar azaltılmış IFN-γ üretimi ve NK hücre reseptörlerini 2 aktive azaltılmış ifade oluşan tanı anındaki bir kusurlu NK hücre profili sergileyen eğer Lösemi hastaları nüks oranları artış göstermektedir. Hedef hücre etkileşimi üzerine sitokin üretimi de dahil olmak üzere, NK hücre sayıları ve fonksiyonu bir erken toparlanma allojenik kök hücre transplantasyonu 3 alan hastalarda azalmış nüks ve sağkalım oranı ile ilişkilidir. Ayrıca, hepatit C virüsü ile enfekte hastalarda interferon tedavisinin başlaması ile periferik NK hücrelerinin degranülasyonu kapasitesi olmayan yanıt 4 daha erken yanıt güçlüdür. NK hücre sayıları (&gt; 80 / ul) lenfoma veya multipl miyelom muzdarip hastalarda otolog kök hücre nakli (autoSCT) gün sonra 15 geliştirilmiş bir ilerlemesinde ve genel sağkalım 5 için öngörü vardır. melanom hastalarında T-hücresi ekspresyonu İmmünoglobulin ve müsin-alan-containing molekül-3 (TİM-3), NK hücreleri üzerinde bağışıklık-düzenleyici protein, bir hastalık aşaması ve prognoz 6 ile bağlantılıdır. Bilim adamları son yıllarda boyunca NK hücre fonksiyonlarını takip var. Önceden astarsız tümör hücrelerine karşı NK hücre sitotoksisite başlangıç analizi, 51Cr-açığa çıkarma deneyinde 7 ile ele alındı. Daha yakın zamanda, bilim adamları, genişletilmiş NK hücrelerinin 8 sitotoksisitesini değerlendirmek için radyoaktif olmayan bir yöntem geliştirdi. Sitokin ve kemokin üretimi sıklıkla enzim bağlantılı immünosorbent deneyi (ELISA) tekniği 9,10 kullanılarak değerlendirilmiştir. Son yıllarda bu yöntemler flow sitometri tabanlı analizleri ile tamamlanmıştır. Geleneksel yüzey boyama protokolleri ile birlikte protein taşıma inhibitörleri (örneğin, Brefeldin A ve monensin) ve hücre permeabilization yöntemlerinin kullanımı, farklı spesifik lenf kemokin ve sitokin üretimini incelemek için bilim adamları sağladıocyte alt-kümeleri (örneğin, T, B ya da NK hücreleri) 11. Ayrıca, farklı akış sitometri bazlı deneyler T ve NK hücre sitotoksisitesini izlemek için geliştirilmiştir. 2004 Alter ve ark., Sitotoksik granüller 12 degranülasyonunun için bir markör olarak hedef hücre karşılaşıldığında NK hücreleri üzerinde lizozom ilişkili protein CD 107a (LAMP1) yüzey ekspresyonunu tarif. Farklı fluorochromes ve çok kanallı akış sitometrelerinde geniş bir yelpazede günümüzde mevcut olduğundan, aynı anda farklı NK hücre alt gruplarında çeşitli NK hücre fonksiyonlarını (sitotoksisite, sitokin ve kemokin üretimi) izlenmesi mümkün hale gelmiştir. Bu biyopsi veya lökopeni mustarip hastaların kan örneklerinde, örneğin Örnek büyüklüğü sınırlı olduğu durumlarda özellikle önemli hale gelir. Global NK hücresi fonksiyonlarını test etmek için, farklı akış sitometri bazlı deneyler etkin birleştirilebilir. Theorell ve ark. İşitme cihazı uyarılır NK hücrelerilthy tümör hücre çizgisi K562 ile bağışçıların ve 13 flow sitometri aracılığı ile NK hücre degranülasyonu, iç-dış sinyal ve kemokin üretimini analiz. Son zamanlarda NK hücre alt grupları, autoSCT sırasında fenotipleri ve tümör hastalarında fonksiyonları sitometri tabanlı deneyler akış kullanılarak analiz edildi. Bu NK hücreleri degranüle ve autoSCT 11 sonra çok erken zaman noktalarında tümör hücre tanıma üzerine sitokinler / kemokinleri üretmek mümkün olduğu gösterilmiştir. Burada bir protokol degranülasyonu kapasitesi, kemokin ve sitokin üretimi dahil olmak üzere tümör hücrelerinin mümkün aynı anda farklı alt NK hücre fonksiyonlarını izlemek için yapan bir akış sitometrisi bazlı analiz kullamlarak etkileşimin ardından NK hücre fonksiyonlarını değerlendirmek için tarif edilmektedir.

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640 + glutamine</td><td>Invitrogen</td><td>6187-044</td><td></td></tr><tr><td>penicilin/streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon Round Bottom Tube</td><td>BD</td><td>352008</td><td></td></tr><tr><td>fetal calf serum</td><td>Invitrogen</td><td>10270-106</td><td>heat inactivated before use</td></tr><tr><td>T-flask</td><td>Greiner Bio-One</td><td>690195</td><td></td></tr><tr><td>K562 tumor cell line</td><td>DSMZ GmbH</td><td>ACC 10</td><td></td></tr><tr><td>ammonium-chloride-potassium (ACK) lysis buffer</td><td>made in house</td><td>/</td><td>components are listed in the text</td></tr><tr><td>Distilled water: Ampuwa Sp&amp;uuml;ll&amp;ouml;sung 1,000 ml Plastipur</td><td>Fresenius Kabi</td><td>1088813</td><td></td></tr><tr><td>Megafuge 40R Centrifuge</td><td>Heraeus</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>EDTA blood collector tubes</td><td>Sarstedt</td><td>386453</td><td>S-Monovette 7.5 ml, K&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;EDTA</td></tr><tr><td>UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0</td><td>Life Technologies</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>Hematopoietic media (XVIVO)</td><td>Lonza Group Ltd</td><td>BE04-743Q</td><td></td></tr><tr><td>human serum</td><td>DRK Blutspendedienst, Frankfurt/M&amp;nbsp;</td><td>/</td><td>healthy donors with blood type AB; heat inactivated before use</td></tr><tr><td>Neubauer-improved counting chamber, bright line</td><td>Marienfeld superior/ LO-Laboroptik Ltd.</td><td>0640030/ 1110000</td><td></td></tr><tr><td>trypan blue solution (0.4%)</td><td>Invitrogen</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>3% acetic acid with methylene blue</td><td>Stemcell Technologies&amp;nbsp;</td><td>07060</td><td></td></tr><tr><td>Corning 96 Well Clear V-Bottom TC-treated Microplates</td><td>Corning&amp;nbsp;</td><td>3894</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 96 Well Round Bottom Not Treated Microplates</td><td>Corning&amp;nbsp;</td><td>351177</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;- and Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;-free)</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>14190-169</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2153-100G</td><td></td></tr><tr><td>NaN&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>08591-1ML-F</td><td></td></tr><tr><td>phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)&amp;nbsp;</td><td>Merck</td><td>524400-1MG</td><td></td></tr><tr><td>ionomycin&amp;nbsp;</td><td>PromoKine</td><td>PK-CA577-1566-5</td><td></td></tr><tr><td>interleukin 15 (IL-15)</td><td>PeproTech</td><td>200-15</td><td></td></tr><tr><td>Proleukin S (IL-2)&amp;nbsp;</td><td>Novartis Pharma</td><td>730523</td><td></td></tr><tr><td>Golgi Stop, Protein Transport Inhibitor (containing Monensin)</td><td>BD Biosciences</td><td>554724</td><td>This product can be used in combination or instead of Golgi Plug. The best combination for the wished experimental setting has to be tested.</td></tr><tr><td>Golgi Plug, Protein Transport Inhibitor (containing Brefeldin A)</td><td>BD Biosciences</td><td>555029</td><td></td></tr><tr><td>paraformaldehyde</td><td>AppliChem</td><td>UN2209</td><td></td></tr><tr><td>saponin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>flow cytometer: Canto10C</td><td>BD Biosciences</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>TreeStar Inc.</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>Graph Pad</td><td>Graph Pad Inc.</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>MACSxpress Separator</td><td>Miltenyi Biotec&amp;nbsp;</td><td>130-098-308</td><td></td></tr><tr><td>MACSxpress NK isolation kit</td><td>Miltenyi Biotec&amp;nbsp;</td><td>130-098-185</td><td></td></tr><tr><td>MACSxpress Erythrocyte Depletion Kit, human</td><td>Miltenyi Biotec&amp;nbsp;</td><td>130-098-196</td><td></td></tr><tr><td>MACSmix Tube Rotator&amp;nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec&amp;nbsp;</td><td>130-090-753</td><td></td></tr><tr><td>anti-human CD3 APC</td><td>Biolegend</td><td>300412</td><td></td></tr><tr><td>anti-human CD3 V450</td><td>BD Biosciences</td><td>560366</td><td></td></tr><tr><td>anti-human CD14 PerCP</td><td>Miltenyi Biotec&amp;nbsp;</td><td>130-094-969</td><td></td></tr><tr><td>anti-human CD14 V450</td><td>BD Biosciences</td><td>560349</td><td></td></tr><tr><td>anti-human CD16 PE</td><td>Biolegend</td><td>302008</td><td></td></tr><tr><td>anti-human CD16 PerCP</td><td>Biolegend</td><td>302029</td><td></td></tr><tr><td>anti-human CD19 PE-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>302216</td><td></td></tr><tr><td>anti-human CD19 V450</td><td>BD Biosciences</td><td>560353</td><td></td></tr><tr><td>anti-human CD45 BV510</td><td>BD Biosciences</td><td>563204</td><td></td></tr><tr><td>anti-human CD56 FITC</td><td>Biolegend</td><td>345811</td><td></td></tr><tr><td>anti-human CD107a PE</td><td>Biolegend</td><td>328608</td><td></td></tr><tr><td>anti-human IFN-&amp;gamma; AF-647</td><td>BD Biosciences</td><td>557729</td><td></td></tr><tr><td>anti-human MIP-1&amp;beta; APC-H7</td><td>BD Biosciences</td><td>561280</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Biolegend</td><td>422801</td><td></td></tr><tr><td>Zombie Violet Fixable Viability Kit</td><td>Biolegend</td><td>423113</td><td>fixable dead cell marker</td></tr></tbody></table>

flow cytometry-based assay for the monitoring of nk cell functions

Natural killer (NK) cells are an important part of the human tumor immune surveillance system. NK cells are able to distinguish between healthy and virus-infected or malignantly transformed cells due to a set of germline encoded inhibitory and activating receptors. Upon virus or tumor cell recognition a variety of different NK cell functions are initiated including cytotoxicity against the target cell as well as cytokine and chemokine production leading to the activation of other immune cells. It has been demonstrated that accurate NK cell functions are crucial for the treatment outcome of different virus infections and malignant diseases. Here a simple and reliable method is described to analyze different NK cell functions using a flow cytometry-based assay. NK cell functions can be evaluated not only for the whole NK cell population, but also for different NK cell subsets. This technique enables scientists to easily study NK cell functions in healthy donors or patients in order to reveal their impact on different malignancies and to further discover new therapeutic strategies.

<html> Bütün NK hücre ve üç farklı NK hücresi alt kümelerinin degranülasyonu, sitokin ve kemokin üretimini analiz etmek için Ayırıcı stratejisi, Şekil 1 &#39;de gösterilmiştir. Bir sağlıklı donörün Örnek sonuçlar Şekil 2&#39;de gösterilmektedir. Bir uyarıcı olmadan NK hücreleri de IFN-y veya MIP-1 p üretilen ve yüzeyi üzerinde CD 107a (Şekil 2A)...

Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions at JoVE.com

Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions

Basit ve güvenilir bir yöntem, örneğin, farklı NK hücresi alt-gruplar içinde degranülasyonu, sitokin ve kemokin üretimi gibi NK hücresi fonksiyonlarının bir dizi analiz için tarif edilmektedir.

Akış NK Hücre Fonksiyonları İzleme Testi Sitometri tabanlı

Natural killer (NK) cells are an important part of the human tumor immune surveillance system. NK cells are able to distinguish between healthy and ...

flow-cytometry-based-assay-for-the-monitoring-of-nk-cell-functions

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

20.8K Görüntüleme.  Johann Wolfgang Goethe-University.  Basit ve güvenilir bir yöntem, örneğin, farklı NK hücresi alt-gruplar içinde degranülasyonu, sitokin ve kemokin üretimi gibi NK hücresi fonksiyonlarının bir dizi analiz için tarif edilmektedir. 

Video: Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions

Preparation and Use of HIV-1 Infected Primary CD4+ T-Cells as Target Cells in Natural Killer Cell Cytotoxic Assays

Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK cells to recognize and lyse HIV-1 infected cells because identifying any aberrancy in NK cell function against HIV-infected cells could potentially lead to therapies that would enhance their cytolytic activity. There is a need to use HIV-infected primary T-cell blasts as target cells rather then infected-T-cell lines in the cytotoxicity assays. T-cell lines, even without infection, are quite susceptible to NK cell lysis. Furthermore, it is necessary to use autologous primary cells to prevent major histocompatibility complex class I mismatches between the target and effector cell that will result in lysis. Early studies evaluating NK cell cytolytic responses to primary HIV-infected cells failed to show significant killing of the infected cells 1,2. However, using HIV-1 infected primary T-cells as target cells in NK cell functional assays has been difficult due the presence of contaminating uninfected cells 3. This inconsistent infected cell to uninfected cell ratio will result in variation in NK cell killing between samples that may not be due to variability in donor NK cell function. Thus, it would be beneficial to work with a purified infected cell population in order to standardize the effector to target cell ratios between experiments 3,4. Here we demonstrate the isolation of a highly purified population of HIV-1 infected cells by taking advantage of HIV-1's ability to down-modulate CD4 on infected cells and the availability of commercial kits to remove dead or dying cells 3-6. The purified infected primary T-cell blasts can then be used as targets in either a degranulation or cytotoxic assay with purified NK cells as the effector population 5-7. Use of NK cells as effectors in a degranulation assay evaluates the ability of an NK cell to release the lytic contents of specialized lysosomes 8 called "cytolytic granules". By staining with a fluorochrome conjugated antibody against CD107a, a lysosomal membrane protein that becomes expressed on the NK cell surface when the cytolytic granules fuse to the plasma membrane, we can determine what percentage of NK cells degranulate in response to target cell recognition. Alternatively, NK cell lytic activity can be evaluated in a cytotoxic assay that allows for the determination of the percentage of target cells lysed by release of 51Cr from within the target cell in the presence of NK cells.

Cytotoxicity assays to measure natural killer cell lytic responses to HIV-infected cells is limited by the purity of the target cells. We demonstrate here the isolation of a highly purified population of HIV-1 infected primary T-cell blasts by taking advantage of HIV-1 s ability to down-modulate CD4.

Hazırlanması ve kullanımı, HIV-1 Enfekte İlköğretim CD4 + T-Hücreleri Hedef Hücreler olarak Natural Killer Hücre Sitotoksik Tahliller

 Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Two Flow Cytometric Approaches of NKG2D Ligand Surface Detection to Distinguish Stem Cells from Bulk Subpopulations in Acute Myeloid Leukemia

Within the same patient, absence of NKG2D ligands (NKG2DL) surface expression was shown to distinguish leukemic subpopulations with stem cell properties (so called leukemic stem cells, LSCs) from more differentiated counterpart leukemic cells that lack disease initiation potential although they carry similar leukemia specific genetic mutations. NKG2DL are biochemically highly diverse MHC class I-like self-molecules. Healthy cells in homeostatic conditions generally do not express NKG2DL on the cell surface. Instead, expression of these ligands is induced upon exposure to cellular stress (e.g., oncogenic transformation or infectious stimuli) to trigger elimination of damaged cells via lysis through NKG2D-receptor-expressing immune cells such as natural killer (NK) cells. Interestingly, NKG2DL surface expression is selectively suppressed in LSC subpopulations, allowing these cells to evade NKG2D-mediated immune surveillance. Here, we present a side-by-side analysis of two different flow cytometry methods that allow the investigation of NKG2DL surface expression on cancer cells i.e., a method involving pan-ligand recognition and a method involving staining with multiple antibodies against single ligands. These methods can be used to separate viable NKG2DL negative cellular subpopulations with putative cancer stem cell properties from NKG2DL positive non-LSC.

We present two different staining protocols for NKG2D ligand (NKG2DL) detection in human primary acute myeloid leukemia (AML) samples. The first approach is based on a fusion protein, able to recognize all known and potentially yet unknown ligands, while the second protocol relies on the addition of multiple anti-NKG2DL antibodies.

Akut Miyeloid Lösemide Kök Hücreleri Toplu AltÜlmelerden Ayırt Etmek İçin NKG2D Ligand Yüzey Tespitinin İki Akış Sitometrik Yaklaşımı

Within the same patient, absence of NKG2D ligands (NKG2DL) surface expression was shown to distinguish leukemic subpopulations with stem cell properties ...

Kanser Araştırmaları

Cell-based Flow Cytometry Assay to Measure Cytotoxic Activity

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells to kill CD4+ T cells loaded with their cognate peptide. Target CD4+ T cells are divided into two populations, labeled with two different concentrations of CFSE. One population is pulsed with the peptide of interest (CFSE-low) while the other remains un-pulsed (CFSE-high). Pulsed and un-pulsed CD4+ T cells are mixed at an equal ratio and incubated with an increasing number of purified CD8+ T cells. The specific killing of autologous target CD4+ T cells is analyzed by flow cytometry after coculture with CD8+ T cells containing the antigen-specific effector CD8+ T cells detected by peptide/MHCI tetramer staining. The specific lysis of target CD4+ T cells measured at different effector versus target ratios, allows for the calculation of lytic units, LU30/106 cells. This simple and straightforward assay allows for the accurate measurement of the intrinsic capacity of CD8+ T cells to kill target CD4+ T cells.

This protocol describes a sensitive, cell-based cytotoxicity assay. By enumerating the decrease in frequency of live target CD4+ T cells in the presence of an increasing number of effector CD8+ T cells, this assay allows for the direct assessment of cytolytic activity of antigen-specific CD8+ T cells.

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and reproducibility of this assay can be considered unstable, either because of user&#39;s errors or because of the sensitivity of NK cells to experimental manipulation. To eliminate these issues, a workflow that reduces them to a minimum was established and is presented here. To illustrate, we obtained blood samples, at various time points, from runners (n = 4) that were submitted to an intense bout of exercise. First, NK cells are simultaneously identified and isolated through CD56 tagging and magnetic-based sorting, directly from whole blood and from as little as one milliliter. The sorted NK cells are removed of any reagent or capping antibodies. They can be counted in order to establish an accurate NK cell count per milliliter of blood. Secondly, the sorted NK cells (effectors cells or E) can be mixed with 3,3&#39;-Diotadecyloxacarbocyanine Perchlorate (DiO) tagged K562 cells (target cells or T) at an assay-optimal 1:5 T:E ratio, and analyzed using an imaging flow-cytometer that allows for the visualization of each event and the elimination of any false positive or false negatives (such as doublets or effector cells). This workflow can be completed in about 4 h, and allows for very stable results even when working with human samples. When available, research teams can test several experimental interventions in human subjects, and compare measurements across several time points without compromising the data&#39;s integrity.

This work describes an advanced workflow for the accurate and fast determination of NK (Natural Killer) cell count and NK cell cytotoxicity in human blood samples.

İnsan Tüm Kan Natural Killer Hücre Parçalayıcı Faaliyet Akışı Sitometrik Analizi

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity

Within the innate immune system, effector lymphocytes known as natural killer (NK) cells play an essential role in host defense against aberrant cells, specifically eliminating tumoral and virally infected cells. Approximately 30 known monogenic defects, together with a host of other pathological conditions, cause either functional or classic NK cell deficiency, manifesting in reduced or absent cytotoxic activity. Historically, cytotoxicity has been investigated with radioactive methods, which are cumbersome, expensive and potentially hazardous. This article describes a streamlined, clinically applicable flow cytometry-based method to quantify NK cell cytotoxic activity. In this assay, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or purified NK cell preparations are co-incubated at different ratios with a target tumor cell line known to be sensitive to NK cell-mediated cytotoxicity (NKCC). The target cells are pre-labeled with a fluorescent dye to allow their discrimination from the effector cells (NK cells). After the incubation period, killed target cells are identified by a nucleic acid stain, which specifically permeates dead cells. This method is amenable to both diagnostic and research applications and, thanks to the multi-parameter capabilities of flow cytometry, has the added advantage of potentially enabling a deeper analysis of NK cell phenotype and function.

A flow cytometry-based method to quantitatively determine the cytotoxic activity of human natural killer cells is shown here.

Akış Sitometresi tabanlı sitotoksisite tahlil insan NK hücre etkinliği değerlendirilmesi için

Within the innate immune system, effector lymphocytes known as natural killer (NK) cells play an essential role in host defense against aberrant cells, ...

A Plate-based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Rat Placental Natural Killer Cell Cytolytic Function

It is well known that decidual natural killer (NK) cells play a critical role in establishment and maintenance of normal pregnancy. Recent studies have demonstrated an altered population of circulating and decidual NK cells in women who suffer from adverse pregnancy complications such as recurrent miscarriage and preeclampsia. Studies from our group have shown that hypertension in pregnancy is associated with an increased population of activated NK cells in the placenta based on the expression of surface activation markers. This manuscript provides a detailed protocol to assess the cytotoxic function of NK cells isolated from placentas in a preeclampsia-like animal model of surgically induced placental ischemia. The following steps are described in detail: generation of single cell suspension, NK cell isolation, ex vivo stimulation, effector:target cell co-culture, and the cytotoxicity assay.

Here, we provide a detailed methodology to isolate and assess cytotoxic function of natural killer cells from placentas by a colorimetric plate assay. The reduced uterine perfusion pressure rat model of placental ischemia was chosen to demonstrate the antibody-mediated isolation and assessment of the cytotoxic function of natural killer cells.

Rat placental doğal katil hücre Cytolytic fonksiyon değerlendirilmesi için bir plaka tabanlı sitotoksisite assay

It is well known that decidual natural killer (NK) cells play a critical role in establishment and maintenance of normal pregnancy. Recent studies have ...

Assessment of Human Natural Killer Cell Events Driven by Fc&#947;RIIIa Engagement in the Presence of Therapeutic Antibodies

One mechanism of action for clinical efficacy by therapeutic antibodies is the promotion of immune-related functions, such as cytokine secretion and cytotoxicity, driven by Fc&#947;RIIIa (CD16) expressed on natural killer (NK) cells. These observations have led to research focusing on methods to increase Fc receptor-mediated events, which include removal of a fucose moiety found on the Fc portion of the antibody. Further studies have elucidated the mechanistic changes in signaling, cellular processes, and cytotoxic characteristics that increase ADCC activity with afucosylated antibodies. Additionally, other studies have shown the potential benefits of these antibodies in combination with small molecule inhibitors. These experiments demonstrated the molecular and cellular mechanisms underlying the benefits of using afucosylated antibodies in combination settings. Many of these observations were based on an artificial in vitro activation assay in which the Fc&#947;RIIIa on human NK cells was activated by therapeutic antibodies. This assay provided the flexibility to study downstream effector NK cell functions, such as cytokine production and degranulation. In addition, this assay has been used to interrogate signaling pathways and identify molecules that can be modulated or used as biomarkers. Finally, other therapeutic molecules (i.e., small molecule inhibitors) have been added to the system to provide insights into the combination of these therapeutics with therapeutic antibodies, which is essential in the current clinical space. This manuscript aims to provide a technical foundation for performing this artificial human NK cell activation assay. The protocol demonstrates key steps for cell activation as well as potential downstream applications that range from functional readouts to more mechanistic observations.

A protocol for studying Fc&#947;RIIIa-driven events by therapeutic antibodies in human natural killer cells is described here. This artificial stimulation platform permits the interrogation of downstream effector functions such as degranulation, chemokine/cytokine production, and signaling pathways mediated by the Fc&#947;RIIIa and Fc portions of antibodies involved in binding.

Terapötik Antikorların Varlığında FcφRIIIa Katılımı tarafından Yönlendirilen İnsan Doğal Öldürücü Hücre Olaylarının Değerlendirilmesi

One mechanism of action for clinical efficacy by therapeutic antibodies is the promotion of immune-related functions, such as cytokine secretion and ...

Profiling of the Human Natural Killer Cell Receptor-Ligand Repertoire

Natural killer (NK) cells are among the first responders to viral infections. The ability of NK cells to rapidly recognize and kill virally infected cells is regulated by their expression of germline-encoded inhibitory and activating receptors. The engagement of these receptors by their cognate ligands on target cells determines whether the intercellular interaction will result in NK cell killing. This protocol details the design and optimization of two complementary mass cytometry (CyTOF) panels. One panel was designed to phenotype NK cells based on receptor expression. The other panel was designed to interrogate expression of known ligands for NK cell receptors on several immune cell subsets. Together, these two panels allow for the profiling of the human NK cell receptor-ligand repertoire. Furthermore, this protocol also details the process by which we stain samples for CyTOF. This process has been optimized for improved reproducibility and standardization. An advantage of CyTOF is its ability to measure over 40 markers in each panel, with minimal signal overlap, allowing researchers to capture the breadth of the NK cell receptor-ligand repertoire. Palladium barcoding also reduces inter-sample variation, as well as consumption of reagents, making it easier to stain samples with each panel in parallel. Limitations of this protocol include the relatively low throughput of CyTOF and the inability to recover cells after analysis. These panels were designed for the analysis of clinical samples from patients suffering from acute and chronic viral infections, including dengue virus, human immunodeficiency virus (HIV), and influenza. However, they can be utilized in any setting to investigate the human NK cell receptor-ligand repertoire. Importantly, these methods can be applied broadly to the design and execution of future CyTOF panels.

Here we design two complementary mass cytometry (CyTOF) panels and optimize a CyTOF staining protocol with the aim of profiling the natural killer cell receptor and ligand repertoire in the setting of viral infections.

Natural killer (NK) cells are among the first responders to viral infections. The ability of NK cells to rapidly recognize and kill virally infected cells ...

Measurement of Natural Killer Cell-Mediated Cytotoxicity and Migration in the Context of Hepatic Tumor Cells

Natural killer (NK) cells are a subset of the cytotoxic lymphocyte population of the innate immune system and participate as a first line of defense by clearing pathogen-infected, malignant, and stressed cells. The ability of NK cells to eradicate cancer cells makes them an important tool in the fight against cancer. Several new immune-based therapies are under investigation for cancer treatment which rely either on enhancing NK cell activity or increasing the sensitivity of cancer cells to NK cell-mediated eradication. However, to effectively develop these therapeutic approaches, cost-effective in vitro assays to monitor NK cell-mediated cytotoxicity and migration are also needed. Here, we present two in vitro protocols that can reliably and reproducibly monitor the effect of NK-cell cytotoxicity on cancer cells (or other target cells). These protocols are non-radioactivity-based, simple to set up, and can be scaled up for high-throughput screening. We also present a flow cytometry-based protocol to quantitatively monitor NK cell migration, which can also be scaled up for high-throughput screening. Collectively, these three protocols can be used to monitor key aspects of NK cell activity that are necessary for the cells&#39; ability to eradicate dysfunctional target cells.

Evasion of natural killer (NK) cell-mediated eradication by cancer cells is important for cancer initiation and progression. Here, we present two non-radioactivity-based protocols to evaluate NK cell-mediated cytotoxicity toward hepatic tumor cells. Additionally, a third protocol is presented to analyze NK cell migration.

Hepatik Tümör Hücreleri Bağlamında Doğal Öldürücü Hücre Aracılı Sitotoksisite ve GöçÖlçümü

Natural killer (NK) cells are a subset of the cytotoxic lymphocyte population of the innate immune system and participate as a first line of defense by ...

Tıp

Natural Killer Cell-Mediated Cytotoxicity Assay Sample Preparation for Flow Cytometric Analysis

Source: McBride, J. E., et al. <a href="https://app.jove.com/v/54779">Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood.</a> J. Vis. Exp. (2017).
This video demonstrates the lytic activity of natural killer cells against fluorescently-stained target cells. The method enables NK cell-induced cytotoxicity measurement by staining dead cells and using a flow cytometer to quantify live and dead target cells.