Name: flow cytometric analysis of natural killer cell lytic activity in human whole blood
Uploaded: 2017-03-17T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood at JoVE.com

This project was supported by Agriculture and Food Research Initiative Competitive Grant no. 2100-68003-30395 from the USDA National Institute of Food and Agriculture.

NOT: Tüm kan toplama prosedürleri Appalachian State University (ASU) Kurumsal Değerlendirme Kurulu (KİK) tarafından belirlenen kurallara uygun olarak yapılmıştır. 1. Tam Kan Toplama <ol><li> sertifikalı flebotomist Dünya Sağlık Örgütü kurallarına göre kanımı var. </li><li> Di-Potasyum Etilendiamintetraasetik asit içeren bir 4 ml kan toplama tüpü (K 2 EDTA) içine kan çizin. üreticinin talimatlarına göre kan toplama tüpü ters çevirin. ayrılık kadar tezgah üstü rocker oda sıcaklığında kan toplama tüpü bulundurun. </li></ol> DIO-etiketli hedef hücreler, 2. hazırlanması <ol><li> K562 hücrelerinin büyümeye Tam Iscove Modifiye Dulbecco Ortam hücrelerinin sağlık sağlamak için tahlil önce birkaç hafta,% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 penisilin streptomisin ile desteklenmiş (IMDM). concentrat ayarlayın3 x 10 5 hücre hücrelerin iyon / ml her gün hücre tamamlanmasıyla sayısı ve hücrelerin daha sonra geçit. her 2 ila 3 gün tam bir medya bir değişiklik yapın. </li><li> 1 hemasitometre: Analiz gününde, bir 1 kullanarak bir hücre sayımı yapar. <ol><li> K562 şişeden 10 uL çıkarın ve 1,5 ml tüp içine yerleştirin. </li><li> 1 seyreltme faktörü için aynı 1.5 ml tüp içine tripan mavi boya 10 mcL ekleyin: 1. </li><li> Yavaşça fiske tüp K562 hücreleri karıştırmak ve mavi boya tripan için. </li><li> K562 hücre-tripan mavi boya, oda sıcaklığında 1 dakika boyunca inkübasyona izin verin. </li><li> tüpten boyanmış K562 hücrelerinin 15 mcL çıkarın. </li><li> hücre sayımı için hemasitometre üzerine Pipet. </li><li> dört köşe meydanlarda hücrelerin yanı sıra beş kareler toplam orta kare güvenin. </li><li> denklemi kullanılarak hücre sayısı hesaplanır: Toplam hücre / ml = Toplam hücreler sayıldı X (seyreltme faktörü / kareler sayısı) x 10,000 / ml </li></ol></li&gt; <li> Serumsuz IMDM kültür ortamında 1 x 10 6 hücre / ml&#39;lik bir son yoğunluğa yeniden süspanse K562 hedef hücreler. </li><li> Boyanmamış K562 hedef hücrelere, 10 x 10 6 K562 hücrelerinin toplam 1 x 10 6 hücre / mL yoğunluğunda bir 15 ml tüp K562 hedef hücrelere 10 ml. Kullanıma hazır olana kadar,% 5 CO2 ile 37 ° C inkübatör içine yerleştirin. </li><li> K562, bir 15 ml tüp hücrelerini hedef DIO lekeli K562 hedef hücrelere, 10 x 10 6 K562 hücrelerinin toplam 1 x 10 6 hücre / mL yoğunluğunda 10 ml. <ol><li> DIO boyama ve yavaşça girdap için belirlenen 15 ml tüp içinde hücre süspansiyonu, mL başına 1 uL DIO hücre etiketleme solüsyonu ekleyin. Örneğin, 1 x 10 6 hücre / ml bir hacimde 10 x 10 6 K562 hücre / ml DIO hücre işaretleme çözeltisinin 10 uL ekleyin. </li><li> 15 ml&#39;lik bir tüp içinde% 5 CO2 ile 37 ° C &#39;de 20 dakika boyunca inkübe K562-dio çözeltisi. </li></ol></li><li> Takip etkuluçka ing 15 ml tüp ihtiva eden K562-dio çözeltisine oda sıcaklığında fosfat tamponlu serum fizyolojik (PBS) 3 ilave edin. </li><li> Oda sıcaklığında 135 x g&#39;de 10 dakika süre ile santrifüjlenir. </li><li> Dikkatle 1.000 ul hacim ayarlanabilir pipet yardımıyla hücre pelletini bozmadan süpernatant kaldırmak. </li><li> Hücre pelet içeren 15 ml tüp taze IMDM 10 ml ekleyin. </li><li> Yavaşça vorteks tüp hücreleri tekrar süspansiyon. </li><li> Tekrarlayın 2.7 2.10 iki kez daha yineleyin. </li><li> Kullanıma hazır olana kadar,% 5 CO2 ile 37 ° C kuluçka makinesi içinde mağazası hücreleri. Not: Hücreler kadar, 24 saat boyunca kuluçka makinesi içinde saklanabilir ancak aynı gün kullanmak tercih edilir. </li></ol> Kontroller 3. hazırlanması <ol><li> Ayrı ve uygun şekilde etiketlenmiş 1.5 ml tüpler içine aşağıdaki aktarın: <ol><li> Taze IMDM 500 uL 1.5 mL tüp etiketli &quot;Çift Pozitif&quot; olarak K562 hücreleri Dio-etiketli yeniden süspanse içeren ekle. </li><li> Taze IMDM 500 uL ekleyin &quot;sadece dio&quot; içine Dio-etiketli K562 hücreleri yeniden süspanse içeren 1.5 mL tüp etiketli. </li><li> içine yeniden süspanse etiketsiz K562 hücreleri içeren taze IMDM 500 uL ekleyin &quot;Propidium iyodür (PI) Sadece&quot; 1.5 mL tüp etiketli. </li></ol></li><li> 5 dakika için 55 ° C su banyosu içinde çift pozitif ve PI yalnızca tüpler yerleştirin. </li><li> 5 dakika geçtikten sonra, tüpleri kaldırmak ve% 70 etanol ile silin. </li><li> Çift Pozitif için PI ve PI sadece 1.5 mL tüpler 10 L ekleyin. </li><li> 30 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübatör içinde üç K562 hedef hücre kontrolleri yerleştirin. </li><li> 30 dakika inkübasyon 163 x g&#39;de 2 dakika süre ile santrifüj üç K562 hedef hücre kontrolleri geçtikten sonra. </li><li> Dikkatle hücre pelletini bozmadan süpernatant kaldırmak. </li><li> Taze IMDM hücre kültür ortamının 20 uL, her kontrol tekrar süspansiyon ve en az% 5 CO2 ile 37 ° C inkübatör terkOptimum dio sinyali 30 dakika. NOT: Kontroller artık sitometresi görüntüleme akışı ile çalıştırmak üzere hazırdır. </li></ol> 4. NK Hücre Otomatik Ayırma <ol><li> Hücre ayırıcının açma ve start-up döngüsü bitirmek için izin verir. </li><li> Tüm sıvı şişeleri aydınlatmaları, yeşil ve atık şişesi boş olduğunu olduğundan emin olun. </li><li> Bir oda sıcaklığı 15 ml tüp raf edinin. NOT: Seçim örnek hacimleri dayalıdır. Örneğin, bir birim için az 3 mi, 15 ml tüp raf kullanımı ve hacim en fazla 3 mi, 50 ml tüp raf kullanımı. </li><li> Etiket örnek tüpleri buna göre (numune / katılımcı başına tekrarlayın): Katılımcı 1 Tam Kan Örneği; Katılımcı 1 Olumsuz kesir; Katılımcı 1 Pozitif kesir. </li><li> Yavaşça &quot;bütün bir kan örneğinden&quot; 15 ml tüp içine Aşama 1.2&#39;den tam kan 1.5 mL pipetle. </li><li> Adım 4.5 den uygun şekilde etiketlenmiş 15 ml &quot;Tam Kan Örneği&quot; tüp yerleştirin ve 15 mL &quot;Negatif Kesir&quot; etiketli veTüp rafa Adım 4,4 &quot;Pozitif Fraksiyonu&quot; borular. Satır (R1) A: thefollowing örnek raf set-up kullanın Tam Kan Örneği, Satır (R2) B: Negatif, etiketsiz fraksiyon, Satır (R4) C: Pozitif, manyetik olarak etiketlenmiş fraksiyonu. </li><li> autolabeling için MiniSampler üzerine ayırıcı raf yerleştirin. </li><li> menüsünden &quot;Reaktif&quot; i seçin ve flakon ayırıcı rafa yerleştirilir konumunu vurgulamak. </li><li> 2B kod okuyucu etkinleştirmek için &quot;Reaktifini oku&quot; seçiniz. </li><li> kod okuyucu kapağının 0,5-2,5 cm arasında 2B kod okuyucu önünde uygun reaktif flakon yerleştirin. Not: Örneğin, NK hücre ayrılması için gerekli olan reaktif CD56 olup. </li><li> uygun okuma 2B kod okuyucu önünde bir açı ile reaktif, tüp tutun. </li><li> Uygun ayırıcı raf pozisyona reaktif flakon yerleştirin. </li><li> Ekranda Ayırma sekmesi altında istenilen pozisyonları vurgulayın. </li><li> Etiketleme alt menüsünden, bir au atamaktolabeling programı. </li><li> pozisyonları 1, 2, 3, ve 4 rafa Hücre Ayırma Reaktif CD56 mikro kullanarak atayın. </li><li> &quot;Posselwb&quot; ayrılık programını seçin. </li><li> &quot;Durulama&quot; yıkama programını seçin. </li><li> Sayısal tuş takımını kullanarak &quot;Cilt&quot; alt menüsünde 1500 uL numune hacmi yerleştirin. </li><li> tuş takımı üzerindeki &quot;Enter&quot; seçeneğini seçiniz. </li><li> Hücre ayrımı başlatmak için &quot;Çalıştır&quot; ı seçin. </li><li> Bu yeterli tampon tüm örneklerin işlenmesi için kullanılabilir onaylamak için &quot;Tamam&quot; ı seçin. </li></ol> 5. NK Hücre Sayımı ardından Hücre Ayırma <ol><li> Hemen hücre ayırıcı ile hücre ayırma aşağıdaki pozitif fraksiyonu almak. oda sıcaklığında bekletin. Bu fraksiyon istenen saf NK hücre popülasyonu içerir. </li><li> Her numune için, Adım 2.2 göre hemasitometre kullanarak bir hücre sayımı gerçekleştirmek. <ol><li> hesaplamalar sonrasında hücre sayımı kaydedin. </li&gt; </ol></li></ol> 6. Sitotoksisite Tahlili Numune Hazırlama <ol><li> Hazırlayın ve buna göre her bir numune / katılımcı için 1.5 ml tüpler etiket. </li><li> Pipet Her tüpe NK hücreleri ve Dio-etiketli K562 hücrelerinin oranını istenen. Not: Örneğin, K562 hedef hücrelere ve NK efektör hücrelerin arzu edilen oran 1: 5 arasındadır. </li><li> 135 x g&#39;de 5 dakika boyunca santrifüje. </li><li> Dikkatle hücre pelletini bozmadan süpernatant kaldırmak. </li><li> Süspanse NK-dio interlökin-2 (IL-2) ve 2-merkaptoetanol (2-Me) (kısmi NK hücre kültür ortamı olmadan) NK hücre ortamının 500 uL K562 hücre karışımı etiketli. Not: tam olmayan NK hücre kültür ortamı, L-glutamin, olan ribonükleosidler ve deoksiribonükleosidler olmaksızın sodyum bikarbonat ile Essential Medium Eagle sınırı. </li><li> Her tüpe PI 5 mcL ekleyin. </li><li> 163 x g&#39;de 2 dakika süre ile santrifüje. </li><li> 2 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe hücreleri. </li><li> 2 saat inkübasyondan sonra, Santrifüj163 x g&#39;de 2 dakika süre ile GE. </li><li> Dikkatle hücre pelletini bozmadan süpernatant kaldırmak. </li><li> 25 uL eksik NK hücre kültür ortamında yeniden süspanse hücreleri. </li></ol> Spontan 7. Hazırlama ( &quot;S&quot;) Örnek <ol><li> DIO-etiketli K562 hücrelerinin pipetle 500 ul 1.5 ml tüp içine (1 x 10 6 hücre / ml konsantrasyonda). </li><li> Her tüpe PI 10 mcL ekleyin. </li><li> 163 x g&#39;de 2 dakika süre ile santrifüj tüpü. </li><li> 2 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe hücreleri. </li><li> 2 saat kuluçkadan, 163 x g&#39;de 2 dakika süre ile santrifüj sonrasında. </li><li> Dikkatle hücre pelletini bozmadan süpernatant kaldırmak. </li><li> 25 ul tam olmayan alfa-Minimum Esansiyel Medium (α-MEM) hücre kültür ortamı içinde yeniden süspanse hücreleri. </li></ol> Görüntüleme Akış Sitometre 8. Veri Toplama <ol><li> enstrüman açmak için akış sitometresi görüntüleme ön kapı içinde yeşil düğmeye basın. </li><li> al açıngörüntüleme ile ilişkili l bilgisayarlar akış sitometresi. </li><li> Yazılımın sitometresi görüntüleme akışını başlatın. </li><li> sistemini temizlemek ve örnek hattını hazırlamak için &quot;Başlangıç&quot; düğmesine tıklayın. </li><li> &quot;Başlangıç&quot; tamamlandıktan sonra, &quot;Kalibrasyon&quot; penceresini kapatmak. </li><li> Kanal atama: sol üst tarafta, bunları atamak için her kanalda tıklayın. </li><li> Area_M06 vs Raw Max Piksel _MC_6, Area_M02 vs Raw Max Piksel _MC_2, AspectRatio_M01 vs Area_M05 ve FieldArea_M01 vs Raw Max Piksel _MC_5: Sağ tarafta, 4 saçılım oluşturmak için scatter plot butonuna tıklayın. </li><li> İlk &quot;Çift Pozitif&quot; kontrolü kullanarak örnekleri analiz başlayın. <ol><li> tıklayın &quot;Load&quot;. </li><li> Numune Yükleyicisi&#39;a 3.9 Adımlar 3,4 &quot;Çift Pozitif&quot; örnek ile 1.5 ml tüp yerleştirin. </li><li> &quot;Büyütme&quot; sekmesi altında 40X hedefi seçin. </li><li> 405 mW açın ve642 mW lazerler. </li><li> &quot;Aydınlık&quot; bir kanal açın. </li><li> tıklayın &quot;Select Intensity.&quot; </li><li> Dedektör aşırı değil yani &quot;Çift Pozitif&quot; kontrol numunesi dayanarak, 405 mW lazer için istenen yoğunluğunu belirlemek. Not: Örneğin, bu deney için en uygun yoğunluk 11 mW ayarlandı. </li></ol></li><li> İstenilen set-up sağlandıktan sonra veri elde. <ol><li> &quot;Toplama Dosya&quot; sekmesi altında, özel bir dosya adı metin girin. veri dosya (lar) kaydetmek için bir klasör seçin. </li><li> &quot;Toplama&quot; yanında kazanmak için hücrelerin sayısını girin. Genellikle bu sayı 10.000&#39;e 1,000 arasında değişmektedir. </li><li> Tıklayın &quot;Edinme.&quot; NOT: Hücrelerin istediğiniz sayı elde edilir sonra, veri dosyası otomatik olarak önceden seçilen klasöre kaydedilir. </li></ol></li><li> Satın alma tamamlandıktan sonra, bir sonraki kontrol örneği yükleyin - Dio sadece kontrol. </strong&gt; <ol><li> tıklayın &quot;Load&quot;. </li><li> Numune Yükleyicisi&#39;a &quot;Dio sadece&quot; örnek ile 1.5 ml tüp yerleştirin. </li><li> Seçilen &quot;Büyütme&quot; sekmesi altında 40X objektif bırakın. </li><li> 405 mW lazer açık bırakın. </li><li> 642 mW lazer ve &quot;aydınlık&quot; kanalı kapatın. NOT: Şimdi istenen set-up elde edildiğini, veri elde edilebilir. </li><li> &quot;Toplama Dosya&quot; sekmesi altında, özel bir dosya adı metin girmek ve veri dosya (lar) kaydetmek için bir klasör seçin. yanında elde etmek için hücrelerin sayısını girin &quot;toplayın.&quot;. Genellikle bu sayı 1000&#39;dir. </li><li> Tıklayın &quot;Edinme.&quot; NOT: Hücrelerin istediğiniz sayı kazanılır sonra veri dosyası otomatik olarak önceden seçilen klasöre kaydedilir. </li></ol></li><li> &quot;PI sadece&quot; kontrol numunesi için yineleyin 8.10. deney örnekleri şimdi tahsil edilecek hazırız. </li><li> remaini Kolu&quot;Kendiliğinden &#39;S&#39; Örnekleri&quot; şöyle de dahil olmak üzere, deneysel örnekleri ng: <ol><li> Seçilen &quot;Büyütme&quot; sekmesi altında 40X objektif bırakın. </li><li> 405 mW ve 642 mW lazerler AÇIN. </li><li> &quot;Aydınlık&quot; kanal AÇIN. </li><li> tıklayın &quot;Set Yoğunluk.&quot; </li><li> &quot;Toplama Dosya&quot; sekmesi altında, özel bir dosya adı metin girmek ve veri dosya (lar) kaydetmek için bir klasör seçin. Özel bir dosya adı metin girin. </li><li> yanında elde etmek için hücrelerin sayısını girin &quot;toplayın.&quot; </li><li> &quot;Edinme&quot; butonuna tıklayın. NOT: Hücrelerin istediğiniz sayı kazanılır sonra veri dosyası otomatik olarak önceden seçilen klasöre kaydedilir. </li></ol></li><li> tüm deneysel numuneler için yineleyin 8.12. </li><li> tüm deneysel veriler ve dosyalar toplanan edildikten sonra, sistem sterilize etmek &quot;kapatma&quot; düğmesine tıklayın. </li></ol> 9. Imaging Akış Sitometre Numune Analizi <ol><li> analiz yazılım uygulaması sitometresi görüntüleme akışını açın. </li><li> &quot;File&quot; altında, deneysel .RIF dosyasını açın. </li><li> seçerek tek renk .RIF dosyaları (DIO-sadece kontrol etmek ve adım 8.10 ve 8.11 sırasında oluşturulan PI-sadece kontrol) kullanarak yeni bir matris inşa yazılımın sitometresi görüntüleme akışında Tazminat sekmesi altında &quot;Yeni Matrix oluştur&quot;. NOT: Yazılım tek renk dosyalarının seçimi için isteyecektir ve bir matris dosyası (.ctm dosya uzantısı) oluşturmak için bunları birleştirme, o kanal tazminat uygulamak için seçilmelidir. </li><li> Yazılımın &quot;yapı taşları&quot; fonksiyonunu kullanarak nokta araziler oluşturun. <ol><li> Bir nokta-arsa kapısına (frekansı vs BrightFieldGradient_RMS) odaklı hücreler oluşturun. Kapıyı &quot;Focus&quot; (Şekil 1A) arayın. </li><li> &quot;Focus&quot; kapıyı kullanarak, g Parlak Alan Aspect Ratio vs Aydınlık Alan Alanı&#39;nın bir nokta arsa oluşturmak<html> tekli hücrelere yedik. Kapı &quot;Single&quot; (Şekil 1B) arayın. </li><li> &quot;Tek&quot; kapısı kullanarak, Intensity_MC_Ch5 vs Intensity_MC_Ch02 bir nokta arsa oluşturun. Belirlemek ve kapı DIO-pozitif sadece hücreleri (hedefler, canlı) ve PI-Dio (ölü hedefler) çift pozitif hücreler (Şekil 1C) Bu arsa kullanın. NOT: Tüm araziler adımlar 9.4.1, 9.4.2 açıklanan ve 9.4.3 yazılımı &quot;yapı taşları&quot; fonksiyonunu kullanarak oluşturulabilir. </li></ol></li><li> Her kapının hücre sayıları erişmek için nokta arsa istatistikleri fonksiyonu tıklayın. </li><li> Aşağıdaki formülü kullanarak spontan numunede ölü hedefler ve deney örneklerinin yüzdesini hesaplayın: numunedeki% ölü hedefler = (#dead hedefleri x 100) / (# hedefler + #dead hedefler canlı) </li><li> Aşağıdaki formül kullanılarak sitotoksisite hesaplayın: % Sitotoksisite = [(Deneysel ölü Spontan ölü) / (100-Spontan ölü)] x100 </li></ol>1 &quot;&gt;:&quot; keep-together.within sayfa = fo &quot;_content <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54779/54779fig1.jpg" /> Şekil 1: sitotoksik aktivite analizi için Temsilcisi histogram, saçılım grafikleri ve görüntüleri. (A) odak hücre analizi. (B) tek hücre analizi. (C), hedef hücre boyama analizi. Tüm tespitler her olaya bağlı görüntü kullanılarak yapılır. Bu sadece grafikler olay tıklayarak analiz yazılımı ulaşılabilir. Bir apoptotik NK hücre ve canlı bir K562 hedef gösteren (D) ikili olayın Örnek görüntüsü. Ch01&#39;den, aydınlık. CH02, dio. Ch05 PI. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54779/54779fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

<ol>
	<li>Cerwenka, A., Lanier, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+killer+cells,+viruses+and+cancer.">Natural killer cells, viruses and cancer.</a> Nat Rev Immunol. 1 (1), 41-49 (2001).</li><li>Nieman, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exercise,+infection,+and+immunity.">Exercise, infection, and immunity.</a> Int J Sports Med. 15, 131-141 (1994).</li><li>Romeo, J., Warnberg, J., Pozo, T., Marcos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+activity,+immunity+and+infection.">Physical activity, immunity and infection.</a> Proc Nutr Soc. 69 (3), 390-399 (2010).</li><li>Nieman, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marathon+training+and+immune+function.">Marathon training and immune function.</a> Sports Med. 37 (4-5), 412-415 (2007).</li><li>Simpson, R. J., Kunz, H., Agha, N., Graff, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exercise+and+the+Regulation+of+Immune+Functions.">Exercise and the Regulation of Immune Functions.</a> Prog Mol Biol Transl Sci. 135, 355-380 (2015).</li><li>Walsh, N. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Position+statement.+Part+one:+Immune+function+and+exercise.">Position statement. Part one: Immune function and exercise.</a> Exerc Immunol Rev. 17, 6-63 (2011).</li><li>Timmons, B. W., Cieslak, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+natural+killer+cell+subsets+and+acute+exercise:+a+brief+review.">Human natural killer cell subsets and acute exercise: a brief review.</a> Exerc Immunol Rev. 14, 8-23 (2008).</li><li>Westermann, J., Pabst, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+lymphocyte+subsets+and+natural+killer+cells+in+the+human+body.">Distribution of lymphocyte subsets and natural killer cells in the human body.</a> Clin Investig. 70 (7), 539-544 (1992).</li><li>Boyum, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+leucocytes+from+human+blood.+Further+observations.+Methylcellulose,+dextran,+and+ficoll+as+erythrocyteaggregating+agents.">Isolation of leucocytes from human blood. Further observations. Methylcellulose, dextran, and ficoll as erythrocyteaggregating agents.</a> Scand J Clin Lab Invest Suppl. 97, 31-50 (1968).</li><li>McMillan, R., Scott, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+labeling+with+51-Chromium.+I.+Technic+and+results+in+normal+subjects.">Leukocyte labeling with 51-Chromium. I. Technic and results in normal subjects.</a> Blood. 32 (5), 738-754 (1968).</li><li>Berk, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+long+endurance+running+on+natural+killer+cells+in+marathoners.">The effect of long endurance running on natural killer cells in marathoners.</a> Med Sci Sports Exerc. 22 (2), 207-212 (1990).</li><li>McAnulty, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+blueberry+ingestion+on+natural+killer+cell+counts,+oxidative+stress,+and+inflammation+prior+to+and+after+2.5+h+of+running.">Effect of blueberry ingestion on natural killer cell counts, oxidative stress, and inflammation prior to and after 2.5 h of running.</a> Appl Physiol Nutr Metab. 36 (6), 976-984 (2011).</li><li>Millard, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brief+Exercise+Increases+Peripheral+Blood+NK+Cell+Counts+without+Immediate+Functional+Changes,+but+Impairs+their+Responses+to+ex+vivo+Stimulation.">Brief Exercise Increases Peripheral Blood NK Cell Counts without Immediate Functional Changes, but Impairs their Responses to ex vivo Stimulation.</a> Front Immunol. 4, 125 (2013).</li><li>Janeway, C. A., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Immunobiology: The Immune System in Health and Disease. 5th edn. , (2001).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Bu çalışmada tarif edilen yöntem ile doğrudan (bu özel durumda, uzun süreli egzersiz) uyaranlara yanıt olarak, bir bireyin NK hücrelerinin spesifik aktivitesini ölçer. Tipik haliyle, NK hücreleri belirteçlerin bir kombinasyonu kullanılarak sıralama yoğunluk gradyanları ya da hücre kullanılarak bir kanından izole edilmektedir. bunlar, zaman alıcı olan birden çok manipülasyonlar içerir ve ağır kullanım bağlıdır: Bu yöntemler yaygın olarak kullanılsa da, pek çok sakıncaları vardır. Bun...

Doğal öldürücü hücreler doğuştan gelen bağışıklık sisteminin önemli bir unsurdur. Çok düzenlenir olsa da, kabul ve hücre-hücre temas yoluyla önceki aktivasyonu 1 olmaksızın, anormal hücreleri ortadan kaldırmak için yeteneğine sahiptir. Bu nedenle, bu enfeksiyonlara karşı savunma hızlı bir çizgi oluşturur. Özellikle yoğun egzersiz, geçici bağışıklık sistemini 2, 3, 4, 5 bastırmak için gösterilmiştir. NK hücreleri etkili bir şekilde hastalığa karşı duyarlılığın arttırılmasına bir pencere oluşturma bu etki, 4, 6, 7 için özellikle müsaittir. Bu nedenle, müdahalelerin çalışma öncesinde, sırasında veya NK hücre fonksiyonu üzerindeki etkisini azaltma amacı ile yoğun egzersizden sonra sporcular sonrası yarışmalar refahı için özellikle ilginçtir. 8 seyrek 1); 2) NK hücreleri strese karşı çok hassastır ve deney sırasında canlı ve sabit kalması fizyolojik koşullar sürekli maruz güveniyor; ve 3) standart tahliller gibi Ficoll geçişlerini 9 olarak, NK hücre sitotoksisitesini belirlemek ve analizleri 10 serbest bırakmak için, güvenilmez ve tutarsız. İnsan örneklerin doğal değişkenliği sadece bu konuları bileşik. müdahaleler sırasında toplanan taze insan örnekleri, en azından bir hayvan örnekleri veya ölümsüzleştirilmiş hücre hatlarına kıyasla, temin oldukça düzenlenmiş ve zordur. Bu deneyler tekrarlamak ya da istatistiksel olarak anlamlı eşiklere ulaşması çalışma kohort katılımcı eklemek için fırsat azaltır. Topluca, bu sorunlar fo izin veren bir aerodinamik protokolü ihtiyacını destekR hem de yüksek verimlilik ve insan örnekleri NK hücre litik faaliyetinin yüksek güvenilirlik analizi. Biz, tespit yabancı etkenlere maruz kalmasını asgariye düşürür insan tam kandan izole ve test NK hücreleri için gerekli süreyi kısaltır bir iş akışı kurdu. azalırsa veya NK hücre sitotoksik artışların saptanmasına olanak tanınması için E oranı: Yöntem iki sensör, manyetik-bazlı hücre sıralayıcı ve sitometresi bir görüntüleme akışı ve bir deney özgü optimize edilmiş T kullanımı optimize eder.

<table><tbody><tr><td>K-562 lymphoblasts</td><td>ATCC</td><td>CCL-243</td><td></td></tr><tr><td>Iscove&#039;s Modified Dulbecco&#039;s Media</td><td>ATCC</td><td>30-2005</td><td>High glucose, with L-Glutamine, with HEPES, Sterile-filtered</td></tr><tr><td>Alpha Minimum Essential medium</td><td>ATCC</td><td>CRL-2407</td><td>Without ribonucleosides and deoxyribonucleosides but with 2 mM L-glutamine and 1.5 g/L sodium bicarbonate</td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution 0.4%</td><td>Amresco</td><td>K940-100ML</td><td>Tissue culture grade</td></tr><tr><td>Propridium Iodide Staining Solution</td><td>BD Pharmingen</td><td>51-66211E</td><td></td></tr><tr><td>Vybranto DiO cell-labeling solution</td><td>Vybranto</td><td>V-22886</td><td></td></tr><tr><td>autoMACS Pro Separator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-545</td><td></td></tr><tr><td>autoMACS Running Buffer</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>autoMACS Washing Buffer</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-987</td><td></td></tr><tr><td>autoMACS Columns</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-021-101</td><td></td></tr><tr><td>Whole Blood CD56 MicroBeads, human</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-875</td><td></td></tr><tr><td>ImageStream X Mark II Imaging Flow Cytometer</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Speedbeads</td><td>Amnis Corporation</td><td>400030</td><td></td></tr><tr><td>0.4-0.7% Hypochlorite (Sterilizer)</td><td>VWR</td><td>JT9416-1</td><td></td></tr><tr><td>Coulter Clenz</td><td>Beckman Coulter</td><td>8546929</td><td></td></tr><tr><td>70% Isopropanol (Debubbler)</td><td>EMD Millipore</td><td>1.3704</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS (Sheath fluid)</td><td>EMD Millipore</td><td>BSS-1006-B (1X)</td><td>No calcium or magnesium</td></tr><tr><td>INSPIRE Software</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td>Version Mark II, September 2013</td></tr><tr><td>Ideas Application Software</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td>Version 6.1, July 2014</td></tr></tbody></table>

flow cytometric analysis of natural killer cell lytic activity in human whole blood

NK hücre sitotoksisite NK hücre fonksiyonu üzerindeki dış müdahale etkisini belirlemek için yaygın olarak kullanılan bir ölçüdür. Ancak, bu testin doğruluğunu ve tekrarlanabilirliği için kullanıcının hatalar nedeniyle ya da deneysel manipülasyon NK hücrelerinin duyarlılığının ya kararsız olarak kabul edilebilir. Bu sorunları ortadan kaldırmak için, en az bunları azaltan bir iş akışı kurulmuş ve sunulmuştur. Biz kaçak arasında, çeşitli zaman noktalarında kan örnekleri alındı, göstermek için (n = 4) egzersiz yoğun butik tabi ki. İlk olarak, NK hücreleri aynı anda tespit edilir ve doğrudan tam kandan ve gibi kısa bir sürede mililitre gelen CD56 etiketleme ve manyetik bazlı sıralama ile izole edilmiştir. kriteri NK hücreleri herhangi bir ayıraç veya kapatma antikorların kaldırılır. Bunlar kan mililitre başına doğru bir NK hücre sayısı tespit etmek için sayılabilir. İkinci olarak, kriteri NK hücrelerinin (efektör hücreleri ya da E) 3,3-Diotade karıştırılabilirHer olayın görselleştirme ve herhangi bir yanlış pozitif ortadan kaldırılması için izin veren bir görüntüleme akış Sitometreyi kullanarak E oranı ve analiz: 5 T: cyloxacarbocyanine perklorat (DIO) bir tahlil optimal 1 de K562 hücreleri (hedef hücreleri ya da T) etiketli ya da (örneğin çiftler veya efektör hücreleri gibi) yanlış negatif. Bu iş akışı yaklaşık 4 saat içinde tamamlandı ve hatta insan numuneleri ile çalışan çok kararlı sonuçlar sağlar edilebilir. Kullanılabilir olduğunda, araştırma ekipleri, insan deneklerde birkaç deneysel müdahaleleri test ve veri bütünlüğünü tehlikeye atmadan birkaç zaman noktaları arasında ölçümleri karşılaştırabilirsiniz.

NK hücre sayısı tayini Tam kan NK hücre sayımı ağır çalışan etkisi Şekil 2&#39;de tarif edilen egzersiz protokolü kullanılarak ölçülmüştür. Kan örnekleri ilk kan çekildikten sonra nihayet 24 ve 48 saat 1.5 saat egzersiz sonrası, egzersizden hemen sonra, egzersiz öncesi çekilmiş ve bulundu. Tam kan mililitrede NK hücrelerinin konsantrasyonu her koşucu (Şekil 3A) ve her bir zaman noktası için ortalama (Şekil 3...

Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood at JoVE.com

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

This work describes an advanced workflow for the accurate and fast determination of NK (Natural Killer) cell count and NK cell cytotoxicity in human blood samples.

İnsan Tüm Kan Natural Killer Hücre Parçalayıcı Faaliyet Akışı Sitometrik Analizi

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

flow-cytometric-analysis-natural-killer-cell-lytic-activity-human

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

12.4K Görüntüleme.  North Carolina A&T State University, North Carolina Research Campus. This work describes an advanced workflow for the accurate and fast determination of NK (Natural Killer) cell count and NK cell cytotoxicity in human blood samples.

Video: Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

Preparation and Use of HIV-1 Infected Primary CD4+ T-Cells as Target Cells in Natural Killer Cell Cytotoxic Assays

Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK cells to recognize and lyse HIV-1 infected cells because identifying any aberrancy in NK cell function against HIV-infected cells could potentially lead to therapies that would enhance their cytolytic activity. There is a need to use HIV-infected primary T-cell blasts as target cells rather then infected-T-cell lines in the cytotoxicity assays. T-cell lines, even without infection, are quite susceptible to NK cell lysis. Furthermore, it is necessary to use autologous primary cells to prevent major histocompatibility complex class I mismatches between the target and effector cell that will result in lysis. Early studies evaluating NK cell cytolytic responses to primary HIV-infected cells failed to show significant killing of the infected cells 1,2. However, using HIV-1 infected primary T-cells as target cells in NK cell functional assays has been difficult due the presence of contaminating uninfected cells 3. This inconsistent infected cell to uninfected cell ratio will result in variation in NK cell killing between samples that may not be due to variability in donor NK cell function. Thus, it would be beneficial to work with a purified infected cell population in order to standardize the effector to target cell ratios between experiments 3,4. Here we demonstrate the isolation of a highly purified population of HIV-1 infected cells by taking advantage of HIV-1's ability to down-modulate CD4 on infected cells and the availability of commercial kits to remove dead or dying cells 3-6. The purified infected primary T-cell blasts can then be used as targets in either a degranulation or cytotoxic assay with purified NK cells as the effector population 5-7. Use of NK cells as effectors in a degranulation assay evaluates the ability of an NK cell to release the lytic contents of specialized lysosomes 8 called "cytolytic granules". By staining with a fluorochrome conjugated antibody against CD107a, a lysosomal membrane protein that becomes expressed on the NK cell surface when the cytolytic granules fuse to the plasma membrane, we can determine what percentage of NK cells degranulate in response to target cell recognition. Alternatively, NK cell lytic activity can be evaluated in a cytotoxic assay that allows for the determination of the percentage of target cells lysed by release of 51Cr from within the target cell in the presence of NK cells.

Cytotoxicity assays to measure natural killer cell lytic responses to HIV-infected cells is limited by the purity of the target cells. We demonstrate here the isolation of a highly purified population of HIV-1 infected primary T-cell blasts by taking advantage of HIV-1 s ability to down-modulate CD4.

Hazırlanması ve kullanımı, HIV-1 Enfekte İlköğretim CD4 + T-Hücreleri Hedef Hücreler olarak Natural Killer Hücre Sitotoksik Tahliller

 Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Cell-based Flow Cytometry Assay to Measure Cytotoxic Activity

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells to kill CD4+ T cells loaded with their cognate peptide. Target CD4+ T cells are divided into two populations, labeled with two different concentrations of CFSE. One population is pulsed with the peptide of interest (CFSE-low) while the other remains un-pulsed (CFSE-high). Pulsed and un-pulsed CD4+ T cells are mixed at an equal ratio and incubated with an increasing number of purified CD8+ T cells. The specific killing of autologous target CD4+ T cells is analyzed by flow cytometry after coculture with CD8+ T cells containing the antigen-specific effector CD8+ T cells detected by peptide/MHCI tetramer staining. The specific lysis of target CD4+ T cells measured at different effector versus target ratios, allows for the calculation of lytic units, LU30/106 cells. This simple and straightforward assay allows for the accurate measurement of the intrinsic capacity of CD8+ T cells to kill target CD4+ T cells.

This protocol describes a sensitive, cell-based cytotoxicity assay. By enumerating the decrease in frequency of live target CD4+ T cells in the presence of an increasing number of effector CD8+ T cells, this assay allows for the direct assessment of cytolytic activity of antigen-specific CD8+ T cells.

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells ...

Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions

Natural killer (NK) cells are an important part of the human tumor immune surveillance system. NK cells are able to distinguish between healthy and virus-infected or malignantly transformed cells due to a set of germline encoded inhibitory and activating receptors. Upon virus or tumor cell recognition a variety of different NK cell functions are initiated including cytotoxicity against the target cell as well as cytokine and chemokine production leading to the activation of other immune cells. It has been demonstrated that accurate NK cell functions are crucial for the treatment outcome of different virus infections and malignant diseases. Here a simple and reliable method is described to analyze different NK cell functions using a flow cytometry-based assay. NK cell functions can be evaluated not only for the whole NK cell population, but also for different NK cell subsets. This technique enables scientists to easily study NK cell functions in healthy donors or patients in order to reveal their impact on different malignancies and to further discover new therapeutic strategies.

A simple and reliable method is described here to analyze a set of NK cell functions such as degranulation, cytokine and chemokine production within different NK cell subsets.

Akış NK Hücre Fonksiyonları İzleme Testi Sitometri tabanlı

Natural killer (NK) cells are an important part of the human tumor immune surveillance system. NK cells are able to distinguish between healthy and ...

A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity

Within the innate immune system, effector lymphocytes known as natural killer (NK) cells play an essential role in host defense against aberrant cells, specifically eliminating tumoral and virally infected cells. Approximately 30 known monogenic defects, together with a host of other pathological conditions, cause either functional or classic NK cell deficiency, manifesting in reduced or absent cytotoxic activity. Historically, cytotoxicity has been investigated with radioactive methods, which are cumbersome, expensive and potentially hazardous. This article describes a streamlined, clinically applicable flow cytometry-based method to quantify NK cell cytotoxic activity. In this assay, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or purified NK cell preparations are co-incubated at different ratios with a target tumor cell line known to be sensitive to NK cell-mediated cytotoxicity (NKCC). The target cells are pre-labeled with a fluorescent dye to allow their discrimination from the effector cells (NK cells). After the incubation period, killed target cells are identified by a nucleic acid stain, which specifically permeates dead cells. This method is amenable to both diagnostic and research applications and, thanks to the multi-parameter capabilities of flow cytometry, has the added advantage of potentially enabling a deeper analysis of NK cell phenotype and function.

A flow cytometry-based method to quantitatively determine the cytotoxic activity of human natural killer cells is shown here.

Akış Sitometresi tabanlı sitotoksisite tahlil insan NK hücre etkinliği değerlendirilmesi için

Within the innate immune system, effector lymphocytes known as natural killer (NK) cells play an essential role in host defense against aberrant cells, ...

Assessment of Human Natural Killer Cell Events Driven by Fc&#947;RIIIa Engagement in the Presence of Therapeutic Antibodies

One mechanism of action for clinical efficacy by therapeutic antibodies is the promotion of immune-related functions, such as cytokine secretion and cytotoxicity, driven by Fc&#947;RIIIa (CD16) expressed on natural killer (NK) cells. These observations have led to research focusing on methods to increase Fc receptor-mediated events, which include removal of a fucose moiety found on the Fc portion of the antibody. Further studies have elucidated the mechanistic changes in signaling, cellular processes, and cytotoxic characteristics that increase ADCC activity with afucosylated antibodies. Additionally, other studies have shown the potential benefits of these antibodies in combination with small molecule inhibitors. These experiments demonstrated the molecular and cellular mechanisms underlying the benefits of using afucosylated antibodies in combination settings. Many of these observations were based on an artificial in vitro activation assay in which the Fc&#947;RIIIa on human NK cells was activated by therapeutic antibodies. This assay provided the flexibility to study downstream effector NK cell functions, such as cytokine production and degranulation. In addition, this assay has been used to interrogate signaling pathways and identify molecules that can be modulated or used as biomarkers. Finally, other therapeutic molecules (i.e., small molecule inhibitors) have been added to the system to provide insights into the combination of these therapeutics with therapeutic antibodies, which is essential in the current clinical space. This manuscript aims to provide a technical foundation for performing this artificial human NK cell activation assay. The protocol demonstrates key steps for cell activation as well as potential downstream applications that range from functional readouts to more mechanistic observations.

A protocol for studying Fc&#947;RIIIa-driven events by therapeutic antibodies in human natural killer cells is described here. This artificial stimulation platform permits the interrogation of downstream effector functions such as degranulation, chemokine/cytokine production, and signaling pathways mediated by the Fc&#947;RIIIa and Fc portions of antibodies involved in binding.

Terapötik Antikorların Varlığında FcφRIIIa Katılımı tarafından Yönlendirilen İnsan Doğal Öldürücü Hücre Olaylarının Değerlendirilmesi

One mechanism of action for clinical efficacy by therapeutic antibodies is the promotion of immune-related functions, such as cytokine secretion and ...

Analysis of Human Natural Killer Cell Metabolism

Natural Killer (NK) cells mediate mainly innate anti-tumor and anti-viral immune responses and respond to a variety of cytokines and other stimuli to promote survival, cellular proliferation, production of cytokines such as interferon gamma (IFN&#947;) and/or cytotoxicity programs. NK cell activation by cytokine stimulation requires a substantial remodeling of metabolic pathways to support their bioenergetic and biosynthetic requirements. There is a large body of evidence that suggests that impaired NK cell metabolism is associated with a number of chronic diseases including obesity and cancer, which highlights the clinical importance of the availability of a method to determine NK cell metabolism. Here we describe the use of an extracellular flux analyzer, a platform that allows real-time measurements of glycolysis and mitochondrial oxygen consumption, as a tool to monitor changes in the energy metabolism of human NK cells. The method described here also allows for the monitoring of metabolic changes after stimulation of NK cells with cytokines such as IL-15, a system that is currently being investigated in a wide range of clinical trials.

In this paper, we describe a method to measure glycolysis and mitochondrial respiration in primary human Natural Killer (NK) cells isolated from peripheral blood, at rest or following IL15-induced activation. The protocol described could be easily extended to primary human NK cells activated by other cytokines or soluble stimuli.

İnsan Doğal Katil Hücre Metabolizmasının Analizi

Natural Killer (NK) cells mediate mainly innate anti-tumor and anti-viral immune responses and respond to a variety of cytokines and other stimuli to ...

Profiling of the Human Natural Killer Cell Receptor-Ligand Repertoire

Natural killer (NK) cells are among the first responders to viral infections. The ability of NK cells to rapidly recognize and kill virally infected cells is regulated by their expression of germline-encoded inhibitory and activating receptors. The engagement of these receptors by their cognate ligands on target cells determines whether the intercellular interaction will result in NK cell killing. This protocol details the design and optimization of two complementary mass cytometry (CyTOF) panels. One panel was designed to phenotype NK cells based on receptor expression. The other panel was designed to interrogate expression of known ligands for NK cell receptors on several immune cell subsets. Together, these two panels allow for the profiling of the human NK cell receptor-ligand repertoire. Furthermore, this protocol also details the process by which we stain samples for CyTOF. This process has been optimized for improved reproducibility and standardization. An advantage of CyTOF is its ability to measure over 40 markers in each panel, with minimal signal overlap, allowing researchers to capture the breadth of the NK cell receptor-ligand repertoire. Palladium barcoding also reduces inter-sample variation, as well as consumption of reagents, making it easier to stain samples with each panel in parallel. Limitations of this protocol include the relatively low throughput of CyTOF and the inability to recover cells after analysis. These panels were designed for the analysis of clinical samples from patients suffering from acute and chronic viral infections, including dengue virus, human immunodeficiency virus (HIV), and influenza. However, they can be utilized in any setting to investigate the human NK cell receptor-ligand repertoire. Importantly, these methods can be applied broadly to the design and execution of future CyTOF panels.

Here we design two complementary mass cytometry (CyTOF) panels and optimize a CyTOF staining protocol with the aim of profiling the natural killer cell receptor and ligand repertoire in the setting of viral infections.

Natural killer (NK) cells are among the first responders to viral infections. The ability of NK cells to rapidly recognize and kill virally infected cells ...

Measurement of Natural Killer Cell-Mediated Cytotoxicity and Migration in the Context of Hepatic Tumor Cells

Natural killer (NK) cells are a subset of the cytotoxic lymphocyte population of the innate immune system and participate as a first line of defense by clearing pathogen-infected, malignant, and stressed cells. The ability of NK cells to eradicate cancer cells makes them an important tool in the fight against cancer. Several new immune-based therapies are under investigation for cancer treatment which rely either on enhancing NK cell activity or increasing the sensitivity of cancer cells to NK cell-mediated eradication. However, to effectively develop these therapeutic approaches, cost-effective in vitro assays to monitor NK cell-mediated cytotoxicity and migration are also needed. Here, we present two in vitro protocols that can reliably and reproducibly monitor the effect of NK-cell cytotoxicity on cancer cells (or other target cells). These protocols are non-radioactivity-based, simple to set up, and can be scaled up for high-throughput screening. We also present a flow cytometry-based protocol to quantitatively monitor NK cell migration, which can also be scaled up for high-throughput screening. Collectively, these three protocols can be used to monitor key aspects of NK cell activity that are necessary for the cells&#39; ability to eradicate dysfunctional target cells.

Evasion of natural killer (NK) cell-mediated eradication by cancer cells is important for cancer initiation and progression. Here, we present two non-radioactivity-based protocols to evaluate NK cell-mediated cytotoxicity toward hepatic tumor cells. Additionally, a third protocol is presented to analyze NK cell migration.

Hepatik Tümör Hücreleri Bağlamında Doğal Öldürücü Hücre Aracılı Sitotoksisite ve GöçÖlçümü

Natural killer (NK) cells are a subset of the cytotoxic lymphocyte population of the innate immune system and participate as a first line of defense by ...

Tıp

Natural Killer Cell-Mediated Cytotoxicity Assay Sample Preparation for Flow Cytometric Analysis

Source: McBride, J. E., et al. <a href="https://app.jove.com/v/54779">Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood.</a> J. Vis. Exp. (2017).
This video demonstrates the lytic activity of natural killer cells against fluorescently-stained target cells. The method enables NK cell-induced cytotoxicity measurement by staining dead cells and using a flow cytometer to quantify live and dead target cells.

Akış Sitometrik Analizi için Doğal Öldürücü Hücre Aracılı Sitotoksisite Testi Numune Hazırlama

1.&#160;Preparation of Controls

	Transfer the following into separate and appropriately labeled 1.5 ml tubes:
	
		Add 500 &#181;L of fresh IMDM ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

İmmünoloji

İmmünodiyagnostik

Hücresel İmmünodiyagnostik

An In Vitro Assay for Evaluating Natural Killer Cell Cytotoxicity against Cancer Cells

Source: Baik, C. H., et al. <a href="https://app.jove.com/v/58961">A Plate-based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Rat Placental Natural Killer Cell Cytolytic Function.</a> J. Vis. Exp. (2019)
This video demonstrates performing a lactate dehydrogenase release assay to determine the cytotoxicity of natural killer (NK) cells against the target cancer cells. The assay quantifies the release of the cytoplasmic lactate dehydrogenase enzyme from cancer cells by measuring the absorbance of the red-colored product formed.

Kanser Hücrelerine Karşı Doğal Öldürücü Hücre Sitotoksisitesini Değerlendirmek için İn Vitro Test

1. Cytotoxicity Assay: Assay Protocol

	Use a round bottom, culture treated 96-well plate to set up the plate as suggested in Table 1. This table shows ...