This project was supported by Agriculture and Food Research Initiative Competitive Grant no. 2100-68003-30395 from the USDA National Institute of Food and Agriculture.

NOT: Tüm kan toplama prosedürleri Appalachian State University (ASU) Kurumsal Değerlendirme Kurulu (KİK) tarafından belirlenen kurallara uygun olarak yapılmıştır. 1. Tam Kan Toplama <ol><li> sertifikalı flebotomist Dünya Sağlık Örgütü kurallarına göre kanımı var. </li><li> Di-Potasyum Etilendiamintetraasetik asit içeren bir 4 ml kan toplama tüpü (K 2 EDTA) içine kan çizin. üreticinin talimatlarına göre kan toplama tüpü ters çevirin. ayrılık kadar tezgah üstü rocker oda sıcaklığında kan toplama tüpü bulundurun. </li></ol> DIO-etiketli hedef hücreler, 2. hazırlanması <ol><li> K562 hücrelerinin büyümeye Tam Iscove Modifiye Dulbecco Ortam hücrelerinin sağlık sağlamak için tahlil önce birkaç hafta,% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 penisilin streptomisin ile desteklenmiş (IMDM). concentrat ayarlayın3 x 10 5 hücre hücrelerin iyon / ml her gün hücre tamamlanmasıyla sayısı ve hücrelerin daha sonra geçit. her 2 ila 3 gün tam bir medya bir değişiklik yapın. </li><li> 1 hemasitometre: Analiz gününde, bir 1 kullanarak bir hücre sayımı yapar. <ol><li> K562 şişeden 10 uL çıkarın ve 1,5 ml tüp içine yerleştirin. </li><li> 1 seyreltme faktörü için aynı 1.5 ml tüp içine tripan mavi boya 10 mcL ekleyin: 1. </li><li> Yavaşça fiske tüp K562 hücreleri karıştırmak ve mavi boya tripan için. </li><li> K562 hücre-tripan mavi boya, oda sıcaklığında 1 dakika boyunca inkübasyona izin verin. </li><li> tüpten boyanmış K562 hücrelerinin 15 mcL çıkarın. </li><li> hücre sayımı için hemasitometre üzerine Pipet. </li><li> dört köşe meydanlarda hücrelerin yanı sıra beş kareler toplam orta kare güvenin. </li><li> denklemi kullanılarak hücre sayısı hesaplanır: Toplam hücre / ml = Toplam hücreler sayıldı X (seyreltme faktörü / kareler sayısı) x 10,000 / ml </li></ol></li&gt; <li> Serumsuz IMDM kültür ortamında 1 x 10 6 hücre / ml&#39;lik bir son yoğunluğa yeniden süspanse K562 hedef hücreler. </li><li> Boyanmamış K562 hedef hücrelere, 10 x 10 6 K562 hücrelerinin toplam 1 x 10 6 hücre / mL yoğunluğunda bir 15 ml tüp K562 hedef hücrelere 10 ml. Kullanıma hazır olana kadar,% 5 CO2 ile 37 ° C inkübatör içine yerleştirin. </li><li> K562, bir 15 ml tüp hücrelerini hedef DIO lekeli K562 hedef hücrelere, 10 x 10 6 K562 hücrelerinin toplam 1 x 10 6 hücre / mL yoğunluğunda 10 ml. <ol><li> DIO boyama ve yavaşça girdap için belirlenen 15 ml tüp içinde hücre süspansiyonu, mL başına 1 uL DIO hücre etiketleme solüsyonu ekleyin. Örneğin, 1 x 10 6 hücre / ml bir hacimde 10 x 10 6 K562 hücre / ml DIO hücre işaretleme çözeltisinin 10 uL ekleyin. </li><li> 15 ml&#39;lik bir tüp içinde% 5 CO2 ile 37 ° C &#39;de 20 dakika boyunca inkübe K562-dio çözeltisi. </li></ol></li><li> Takip etkuluçka ing 15 ml tüp ihtiva eden K562-dio çözeltisine oda sıcaklığında fosfat tamponlu serum fizyolojik (PBS) 3 ilave edin. </li><li> Oda sıcaklığında 135 x g&#39;de 10 dakika süre ile santrifüjlenir. </li><li> Dikkatle 1.000 ul hacim ayarlanabilir pipet yardımıyla hücre pelletini bozmadan süpernatant kaldırmak. </li><li> Hücre pelet içeren 15 ml tüp taze IMDM 10 ml ekleyin. </li><li> Yavaşça vorteks tüp hücreleri tekrar süspansiyon. </li><li> Tekrarlayın 2.7 2.10 iki kez daha yineleyin. </li><li> Kullanıma hazır olana kadar,% 5 CO2 ile 37 ° C kuluçka makinesi içinde mağazası hücreleri. Not: Hücreler kadar, 24 saat boyunca kuluçka makinesi içinde saklanabilir ancak aynı gün kullanmak tercih edilir. </li></ol> Kontroller 3. hazırlanması <ol><li> Ayrı ve uygun şekilde etiketlenmiş 1.5 ml tüpler içine aşağıdaki aktarın: <ol><li> Taze IMDM 500 uL 1.5 mL tüp etiketli &quot;Çift Pozitif&quot; olarak K562 hücreleri Dio-etiketli yeniden süspanse içeren ekle. </li><li> Taze IMDM 500 uL ekleyin &quot;sadece dio&quot; içine Dio-etiketli K562 hücreleri yeniden süspanse içeren 1.5 mL tüp etiketli. </li><li> içine yeniden süspanse etiketsiz K562 hücreleri içeren taze IMDM 500 uL ekleyin &quot;Propidium iyodür (PI) Sadece&quot; 1.5 mL tüp etiketli. </li></ol></li><li> 5 dakika için 55 ° C su banyosu içinde çift pozitif ve PI yalnızca tüpler yerleştirin. </li><li> 5 dakika geçtikten sonra, tüpleri kaldırmak ve% 70 etanol ile silin. </li><li> Çift Pozitif için PI ve PI sadece 1.5 mL tüpler 10 L ekleyin. </li><li> 30 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübatör içinde üç K562 hedef hücre kontrolleri yerleştirin. </li><li> 30 dakika inkübasyon 163 x g&#39;de 2 dakika süre ile santrifüj üç K562 hedef hücre kontrolleri geçtikten sonra. </li><li> Dikkatle hücre pelletini bozmadan süpernatant kaldırmak. </li><li> Taze IMDM hücre kültür ortamının 20 uL, her kontrol tekrar süspansiyon ve en az% 5 CO2 ile 37 ° C inkübatör terkOptimum dio sinyali 30 dakika. NOT: Kontroller artık sitometresi görüntüleme akışı ile çalıştırmak üzere hazırdır. </li></ol> 4. NK Hücre Otomatik Ayırma <ol><li> Hücre ayırıcının açma ve start-up döngüsü bitirmek için izin verir. </li><li> Tüm sıvı şişeleri aydınlatmaları, yeşil ve atık şişesi boş olduğunu olduğundan emin olun. </li><li> Bir oda sıcaklığı 15 ml tüp raf edinin. NOT: Seçim örnek hacimleri dayalıdır. Örneğin, bir birim için az 3 mi, 15 ml tüp raf kullanımı ve hacim en fazla 3 mi, 50 ml tüp raf kullanımı. </li><li> Etiket örnek tüpleri buna göre (numune / katılımcı başına tekrarlayın): Katılımcı 1 Tam Kan Örneği; Katılımcı 1 Olumsuz kesir; Katılımcı 1 Pozitif kesir. </li><li> Yavaşça &quot;bütün bir kan örneğinden&quot; 15 ml tüp içine Aşama 1.2&#39;den tam kan 1.5 mL pipetle. </li><li> Adım 4.5 den uygun şekilde etiketlenmiş 15 ml &quot;Tam Kan Örneği&quot; tüp yerleştirin ve 15 mL &quot;Negatif Kesir&quot; etiketli veTüp rafa Adım 4,4 &quot;Pozitif Fraksiyonu&quot; borular. Satır (R1) A: thefollowing örnek raf set-up kullanın Tam Kan Örneği, Satır (R2) B: Negatif, etiketsiz fraksiyon, Satır (R4) C: Pozitif, manyetik olarak etiketlenmiş fraksiyonu. </li><li> autolabeling için MiniSampler üzerine ayırıcı raf yerleştirin. </li><li> menüsünden &quot;Reaktif&quot; i seçin ve flakon ayırıcı rafa yerleştirilir konumunu vurgulamak. </li><li> 2B kod okuyucu etkinleştirmek için &quot;Reaktifini oku&quot; seçiniz. </li><li> kod okuyucu kapağının 0,5-2,5 cm arasında 2B kod okuyucu önünde uygun reaktif flakon yerleştirin. Not: Örneğin, NK hücre ayrılması için gerekli olan reaktif CD56 olup. </li><li> uygun okuma 2B kod okuyucu önünde bir açı ile reaktif, tüp tutun. </li><li> Uygun ayırıcı raf pozisyona reaktif flakon yerleştirin. </li><li> Ekranda Ayırma sekmesi altında istenilen pozisyonları vurgulayın. </li><li> Etiketleme alt menüsünden, bir au atamaktolabeling programı. </li><li> pozisyonları 1, 2, 3, ve 4 rafa Hücre Ayırma Reaktif CD56 mikro kullanarak atayın. </li><li> &quot;Posselwb&quot; ayrılık programını seçin. </li><li> &quot;Durulama&quot; yıkama programını seçin. </li><li> Sayısal tuş takımını kullanarak &quot;Cilt&quot; alt menüsünde 1500 uL numune hacmi yerleştirin. </li><li> tuş takımı üzerindeki &quot;Enter&quot; seçeneğini seçiniz. </li><li> Hücre ayrımı başlatmak için &quot;Çalıştır&quot; ı seçin. </li><li> Bu yeterli tampon tüm örneklerin işlenmesi için kullanılabilir onaylamak için &quot;Tamam&quot; ı seçin. </li></ol> 5. NK Hücre Sayımı ardından Hücre Ayırma <ol><li> Hemen hücre ayırıcı ile hücre ayırma aşağıdaki pozitif fraksiyonu almak. oda sıcaklığında bekletin. Bu fraksiyon istenen saf NK hücre popülasyonu içerir. </li><li> Her numune için, Adım 2.2 göre hemasitometre kullanarak bir hücre sayımı gerçekleştirmek. <ol><li> hesaplamalar sonrasında hücre sayımı kaydedin. </li&gt; </ol></li></ol> 6. Sitotoksisite Tahlili Numune Hazırlama <ol><li> Hazırlayın ve buna göre her bir numune / katılımcı için 1.5 ml tüpler etiket. </li><li> Pipet Her tüpe NK hücreleri ve Dio-etiketli K562 hücrelerinin oranını istenen. Not: Örneğin, K562 hedef hücrelere ve NK efektör hücrelerin arzu edilen oran 1: 5 arasındadır. </li><li> 135 x g&#39;de 5 dakika boyunca santrifüje. </li><li> Dikkatle hücre pelletini bozmadan süpernatant kaldırmak. </li><li> Süspanse NK-dio interlökin-2 (IL-2) ve 2-merkaptoetanol (2-Me) (kısmi NK hücre kültür ortamı olmadan) NK hücre ortamının 500 uL K562 hücre karışımı etiketli. Not: tam olmayan NK hücre kültür ortamı, L-glutamin, olan ribonükleosidler ve deoksiribonükleosidler olmaksızın sodyum bikarbonat ile Essential Medium Eagle sınırı. </li><li> Her tüpe PI 5 mcL ekleyin. </li><li> 163 x g&#39;de 2 dakika süre ile santrifüje. </li><li> 2 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe hücreleri. </li><li> 2 saat inkübasyondan sonra, Santrifüj163 x g&#39;de 2 dakika süre ile GE. </li><li> Dikkatle hücre pelletini bozmadan süpernatant kaldırmak. </li><li> 25 uL eksik NK hücre kültür ortamında yeniden süspanse hücreleri. </li></ol> Spontan 7. Hazırlama ( &quot;S&quot;) Örnek <ol><li> DIO-etiketli K562 hücrelerinin pipetle 500 ul 1.5 ml tüp içine (1 x 10 6 hücre / ml konsantrasyonda). </li><li> Her tüpe PI 10 mcL ekleyin. </li><li> 163 x g&#39;de 2 dakika süre ile santrifüj tüpü. </li><li> 2 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe hücreleri. </li><li> 2 saat kuluçkadan, 163 x g&#39;de 2 dakika süre ile santrifüj sonrasında. </li><li> Dikkatle hücre pelletini bozmadan süpernatant kaldırmak. </li><li> 25 ul tam olmayan alfa-Minimum Esansiyel Medium (α-MEM) hücre kültür ortamı içinde yeniden süspanse hücreleri. </li></ol> Görüntüleme Akış Sitometre 8. Veri Toplama <ol><li> enstrüman açmak için akış sitometresi görüntüleme ön kapı içinde yeşil düğmeye basın. </li><li> al açıngörüntüleme ile ilişkili l bilgisayarlar akış sitometresi. </li><li> Yazılımın sitometresi görüntüleme akışını başlatın. </li><li> sistemini temizlemek ve örnek hattını hazırlamak için &quot;Başlangıç&quot; düğmesine tıklayın. </li><li> &quot;Başlangıç&quot; tamamlandıktan sonra, &quot;Kalibrasyon&quot; penceresini kapatmak. </li><li> Kanal atama: sol üst tarafta, bunları atamak için her kanalda tıklayın. </li><li> Area_M06 vs Raw Max Piksel _MC_6, Area_M02 vs Raw Max Piksel _MC_2, AspectRatio_M01 vs Area_M05 ve FieldArea_M01 vs Raw Max Piksel _MC_5: Sağ tarafta, 4 saçılım oluşturmak için scatter plot butonuna tıklayın. </li><li> İlk &quot;Çift Pozitif&quot; kontrolü kullanarak örnekleri analiz başlayın. <ol><li> tıklayın &quot;Load&quot;. </li><li> Numune Yükleyicisi&#39;a 3.9 Adımlar 3,4 &quot;Çift Pozitif&quot; örnek ile 1.5 ml tüp yerleştirin. </li><li> &quot;Büyütme&quot; sekmesi altında 40X hedefi seçin. </li><li> 405 mW açın ve642 mW lazerler. </li><li> &quot;Aydınlık&quot; bir kanal açın. </li><li> tıklayın &quot;Select Intensity.&quot; </li><li> Dedektör aşırı değil yani &quot;Çift Pozitif&quot; kontrol numunesi dayanarak, 405 mW lazer için istenen yoğunluğunu belirlemek. Not: Örneğin, bu deney için en uygun yoğunluk 11 mW ayarlandı. </li></ol></li><li> İstenilen set-up sağlandıktan sonra veri elde. <ol><li> &quot;Toplama Dosya&quot; sekmesi altında, özel bir dosya adı metin girin. veri dosya (lar) kaydetmek için bir klasör seçin. </li><li> &quot;Toplama&quot; yanında kazanmak için hücrelerin sayısını girin. Genellikle bu sayı 10.000&#39;e 1,000 arasında değişmektedir. </li><li> Tıklayın &quot;Edinme.&quot; NOT: Hücrelerin istediğiniz sayı elde edilir sonra, veri dosyası otomatik olarak önceden seçilen klasöre kaydedilir. </li></ol></li><li> Satın alma tamamlandıktan sonra, bir sonraki kontrol örneği yükleyin - Dio sadece kontrol. </strong&gt; <ol><li> tıklayın &quot;Load&quot;. </li><li> Numune Yükleyicisi&#39;a &quot;Dio sadece&quot; örnek ile 1.5 ml tüp yerleştirin. </li><li> Seçilen &quot;Büyütme&quot; sekmesi altında 40X objektif bırakın. </li><li> 405 mW lazer açık bırakın. </li><li> 642 mW lazer ve &quot;aydınlık&quot; kanalı kapatın. NOT: Şimdi istenen set-up elde edildiğini, veri elde edilebilir. </li><li> &quot;Toplama Dosya&quot; sekmesi altında, özel bir dosya adı metin girmek ve veri dosya (lar) kaydetmek için bir klasör seçin. yanında elde etmek için hücrelerin sayısını girin &quot;toplayın.&quot;. Genellikle bu sayı 1000&#39;dir. </li><li> Tıklayın &quot;Edinme.&quot; NOT: Hücrelerin istediğiniz sayı kazanılır sonra veri dosyası otomatik olarak önceden seçilen klasöre kaydedilir. </li></ol></li><li> &quot;PI sadece&quot; kontrol numunesi için yineleyin 8.10. deney örnekleri şimdi tahsil edilecek hazırız. </li><li> remaini Kolu&quot;Kendiliğinden &#39;S&#39; Örnekleri&quot; şöyle de dahil olmak üzere, deneysel örnekleri ng: <ol><li> Seçilen &quot;Büyütme&quot; sekmesi altında 40X objektif bırakın. </li><li> 405 mW ve 642 mW lazerler AÇIN. </li><li> &quot;Aydınlık&quot; kanal AÇIN. </li><li> tıklayın &quot;Set Yoğunluk.&quot; </li><li> &quot;Toplama Dosya&quot; sekmesi altında, özel bir dosya adı metin girmek ve veri dosya (lar) kaydetmek için bir klasör seçin. Özel bir dosya adı metin girin. </li><li> yanında elde etmek için hücrelerin sayısını girin &quot;toplayın.&quot; </li><li> &quot;Edinme&quot; butonuna tıklayın. NOT: Hücrelerin istediğiniz sayı kazanılır sonra veri dosyası otomatik olarak önceden seçilen klasöre kaydedilir. </li></ol></li><li> tüm deneysel numuneler için yineleyin 8.12. </li><li> tüm deneysel veriler ve dosyalar toplanan edildikten sonra, sistem sterilize etmek &quot;kapatma&quot; düğmesine tıklayın. </li></ol> 9. Imaging Akış Sitometre Numune Analizi <ol><li> analiz yazılım uygulaması sitometresi görüntüleme akışını açın. </li><li> &quot;File&quot; altında, deneysel .RIF dosyasını açın. </li><li> seçerek tek renk .RIF dosyaları (DIO-sadece kontrol etmek ve adım 8.10 ve 8.11 sırasında oluşturulan PI-sadece kontrol) kullanarak yeni bir matris inşa yazılımın sitometresi görüntüleme akışında Tazminat sekmesi altında &quot;Yeni Matrix oluştur&quot;. NOT: Yazılım tek renk dosyalarının seçimi için isteyecektir ve bir matris dosyası (.ctm dosya uzantısı) oluşturmak için bunları birleştirme, o kanal tazminat uygulamak için seçilmelidir. </li><li> Yazılımın &quot;yapı taşları&quot; fonksiyonunu kullanarak nokta araziler oluşturun. <ol><li> Bir nokta-arsa kapısına (frekansı vs BrightFieldGradient_RMS) odaklı hücreler oluşturun. Kapıyı &quot;Focus&quot; (Şekil 1A) arayın. </li><li> &quot;Focus&quot; kapıyı kullanarak, g Parlak Alan Aspect Ratio vs Aydınlık Alan Alanı&#39;nın bir nokta arsa oluşturmak<html> tekli hücrelere yedik. Kapı &quot;Single&quot; (Şekil 1B) arayın. </li><li> &quot;Tek&quot; kapısı kullanarak, Intensity_MC_Ch5 vs Intensity_MC_Ch02 bir nokta arsa oluşturun. Belirlemek ve kapı DIO-pozitif sadece hücreleri (hedefler, canlı) ve PI-Dio (ölü hedefler) çift pozitif hücreler (Şekil 1C) Bu arsa kullanın. NOT: Tüm araziler adımlar 9.4.1, 9.4.2 açıklanan ve 9.4.3 yazılımı &quot;yapı taşları&quot; fonksiyonunu kullanarak oluşturulabilir. </li></ol></li><li> Her kapının hücre sayıları erişmek için nokta arsa istatistikleri fonksiyonu tıklayın. </li><li> Aşağıdaki formülü kullanarak spontan numunede ölü hedefler ve deney örneklerinin yüzdesini hesaplayın: numunedeki% ölü hedefler = (#dead hedefleri x 100) / (# hedefler + #dead hedefler canlı) </li><li> Aşağıdaki formül kullanılarak sitotoksisite hesaplayın: % Sitotoksisite = [(Deneysel ölü Spontan ölü) / (100-Spontan ölü)] x100 </li></ol>1 &quot;&gt;:&quot; keep-together.within sayfa = fo &quot;_content <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54779/54779fig1.jpg" /> Şekil 1: sitotoksik aktivite analizi için Temsilcisi histogram, saçılım grafikleri ve görüntüleri. (A) odak hücre analizi. (B) tek hücre analizi. (C), hedef hücre boyama analizi. Tüm tespitler her olaya bağlı görüntü kullanılarak yapılır. Bu sadece grafikler olay tıklayarak analiz yazılımı ulaşılabilir. Bir apoptotik NK hücre ve canlı bir K562 hedef gösteren (D) ikili olayın Örnek görüntüsü. Ch01&#39;den, aydınlık. CH02, dio. Ch05 PI. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54779/54779fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

<ol>
	<li>Cerwenka, A., Lanier, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+killer+cells,+viruses+and+cancer.">Natural killer cells, viruses and cancer.</a> Nat Rev Immunol. 1 (1), 41-49 (2001).</li><li>Nieman, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exercise,+infection,+and+immunity.">Exercise, infection, and immunity.</a> Int J Sports Med. 15, 131-141 (1994).</li><li>Romeo, J., Warnberg, J., Pozo, T., Marcos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+activity,+immunity+and+infection.">Physical activity, immunity and infection.</a> Proc Nutr Soc. 69 (3), 390-399 (2010).</li><li>Nieman, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marathon+training+and+immune+function.">Marathon training and immune function.</a> Sports Med. 37 (4-5), 412-415 (2007).</li><li>Simpson, R. J., Kunz, H., Agha, N., Graff, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exercise+and+the+Regulation+of+Immune+Functions.">Exercise and the Regulation of Immune Functions.</a> Prog Mol Biol Transl Sci. 135, 355-380 (2015).</li><li>Walsh, N. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Position+statement.+Part+one:+Immune+function+and+exercise.">Position statement. Part one: Immune function and exercise.</a> Exerc Immunol Rev. 17, 6-63 (2011).</li><li>Timmons, B. W., Cieslak, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+natural+killer+cell+subsets+and+acute+exercise:+a+brief+review.">Human natural killer cell subsets and acute exercise: a brief review.</a> Exerc Immunol Rev. 14, 8-23 (2008).</li><li>Westermann, J., Pabst, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+lymphocyte+subsets+and+natural+killer+cells+in+the+human+body.">Distribution of lymphocyte subsets and natural killer cells in the human body.</a> Clin Investig. 70 (7), 539-544 (1992).</li><li>Boyum, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+leucocytes+from+human+blood.+Further+observations.+Methylcellulose,+dextran,+and+ficoll+as+erythrocyteaggregating+agents.">Isolation of leucocytes from human blood. Further observations. Methylcellulose, dextran, and ficoll as erythrocyteaggregating agents.</a> Scand J Clin Lab Invest Suppl. 97, 31-50 (1968).</li><li>McMillan, R., Scott, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+labeling+with+51-Chromium.+I.+Technic+and+results+in+normal+subjects.">Leukocyte labeling with 51-Chromium. I. Technic and results in normal subjects.</a> Blood. 32 (5), 738-754 (1968).</li><li>Berk, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+long+endurance+running+on+natural+killer+cells+in+marathoners.">The effect of long endurance running on natural killer cells in marathoners.</a> Med Sci Sports Exerc. 22 (2), 207-212 (1990).</li><li>McAnulty, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+blueberry+ingestion+on+natural+killer+cell+counts,+oxidative+stress,+and+inflammation+prior+to+and+after+2.5+h+of+running.">Effect of blueberry ingestion on natural killer cell counts, oxidative stress, and inflammation prior to and after 2.5 h of running.</a> Appl Physiol Nutr Metab. 36 (6), 976-984 (2011).</li><li>Millard, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brief+Exercise+Increases+Peripheral+Blood+NK+Cell+Counts+without+Immediate+Functional+Changes,+but+Impairs+their+Responses+to+ex+vivo+Stimulation.">Brief Exercise Increases Peripheral Blood NK Cell Counts without Immediate Functional Changes, but Impairs their Responses to ex vivo Stimulation.</a> Front Immunol. 4, 125 (2013).</li><li>Janeway, C. A., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Immunobiology: The Immune System in Health and Disease. 5th edn. , (2001).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Bu çalışmada tarif edilen yöntem ile doğrudan (bu özel durumda, uzun süreli egzersiz) uyaranlara yanıt olarak, bir bireyin NK hücrelerinin spesifik aktivitesini ölçer. Tipik haliyle, NK hücreleri belirteçlerin bir kombinasyonu kullanılarak sıralama yoğunluk gradyanları ya da hücre kullanılarak bir kanından izole edilmektedir. bunlar, zaman alıcı olan birden çok manipülasyonlar içerir ve ağır kullanım bağlıdır: Bu yöntemler yaygın olarak kullanılsa da, pek çok sakıncaları vardır. Bun...

Doğal öldürücü hücreler doğuştan gelen bağışıklık sisteminin önemli bir unsurdur. Çok düzenlenir olsa da, kabul ve hücre-hücre temas yoluyla önceki aktivasyonu 1 olmaksızın, anormal hücreleri ortadan kaldırmak için yeteneğine sahiptir. Bu nedenle, bu enfeksiyonlara karşı savunma hızlı bir çizgi oluşturur. Özellikle yoğun egzersiz, geçici bağışıklık sistemini 2, 3, 4, 5 bastırmak için gösterilmiştir. NK hücreleri etkili bir şekilde hastalığa karşı duyarlılığın arttırılmasına bir pencere oluşturma bu etki, 4, 6, 7 için özellikle müsaittir. Bu nedenle, müdahalelerin çalışma öncesinde, sırasında veya NK hücre fonksiyonu üzerindeki etkisini azaltma amacı ile yoğun egzersizden sonra sporcular sonrası yarışmalar refahı için özellikle ilginçtir. 8 seyrek 1); 2) NK hücreleri strese karşı çok hassastır ve deney sırasında canlı ve sabit kalması fizyolojik koşullar sürekli maruz güveniyor; ve 3) standart tahliller gibi Ficoll geçişlerini 9 olarak, NK hücre sitotoksisitesini belirlemek ve analizleri 10 serbest bırakmak için, güvenilmez ve tutarsız. İnsan örneklerin doğal değişkenliği sadece bu konuları bileşik. müdahaleler sırasında toplanan taze insan örnekleri, en azından bir hayvan örnekleri veya ölümsüzleştirilmiş hücre hatlarına kıyasla, temin oldukça düzenlenmiş ve zordur. Bu deneyler tekrarlamak ya da istatistiksel olarak anlamlı eşiklere ulaşması çalışma kohort katılımcı eklemek için fırsat azaltır. Topluca, bu sorunlar fo izin veren bir aerodinamik protokolü ihtiyacını destekR hem de yüksek verimlilik ve insan örnekleri NK hücre litik faaliyetinin yüksek güvenilirlik analizi. Biz, tespit yabancı etkenlere maruz kalmasını asgariye düşürür insan tam kandan izole ve test NK hücreleri için gerekli süreyi kısaltır bir iş akışı kurdu. azalırsa veya NK hücre sitotoksik artışların saptanmasına olanak tanınması için E oranı: Yöntem iki sensör, manyetik-bazlı hücre sıralayıcı ve sitometresi bir görüntüleme akışı ve bir deney özgü optimize edilmiş T kullanımı optimize eder.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1275">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">K-562 lymphoblasts</td>
			<td style="width:183px;">ATCC</td>
			<td style="width:136px;">CCL-243</td>
			<td style="width:585px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Iscove&#39;s Modified Dulbecco&#39;s Media</td>
			<td style="width:183px;">ATCC</td>
			<td style="width:136px;">30-2005</td>
			<td>High glucose, with L-Glutamine, with HEPES, Sterile-filtered</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Alpha Minimum Essential medium</td>
			<td style="width:183px;">ATCC</td>
			<td style="width:136px;">CRL-2407</td>
			<td style="width:585px;">Without ribonucleosides and deoxyribonucleosides but with 2 mM L-glutamine and 1.5 g/L sodium bicarbonate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Trypan Blue Solution 0.4%</td>
			<td style="width:183px;">Amresco</td>
			<td style="width:136px;">K940-100ML</td>
			<td>Tissue culture grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Propridium Iodide Staining Solution</td>
			<td style="width:183px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:136px;">51-66211E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Vybranto DiO cell-labeling solution</td>
			<td style="width:183px;">Vybranto</td>
			<td style="width:136px;">V-22886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">autoMACS Pro Separator</td>
			<td style="width:183px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:136px;">130-092-545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">autoMACS Running Buffer</td>
			<td style="width:183px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:136px;">130-091-221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">autoMACS Washing Buffer</td>
			<td style="width:183px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:136px;">130-092-987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">autoMACS Columns</td>
			<td style="width:183px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:136px;">130-021-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Whole Blood CD56 MicroBeads, human</td>
			<td style="width:183px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:136px;">130-090-875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ImageStream X Mark II Imaging Flow Cytometer</td>
			<td style="width:183px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Speedbeads</td>
			<td style="width:183px;">Amnis Corporation</td>
			<td style="width:136px;">400030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.4-0.7% Hypochlorite (Sterilizer)</td>
			<td style="width:183px;">VWR</td>
			<td>JT9416-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Coulter Clenz</td>
			<td style="width:183px;">Beckman Coulter</td>
			<td>8546929</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">70% Isopropanol (Debubbler)</td>
			<td style="width:183px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:136px;">1.3704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-PBS (Sheath fluid)</td>
			<td style="width:183px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:136px;">BSS-1006-B (1X)</td>
			<td>No calcium or magnesium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">INSPIRE Software</td>
			<td style="width:183px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td>Version Mark II, September 2013</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ideas Application Software</td>
			<td style="width:183px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td>Version 6.1, July 2014</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow cytometric analysis of natural killer cell lytic activity in human whole blood

NK hücre sitotoksisite NK hücre fonksiyonu üzerindeki dış müdahale etkisini belirlemek için yaygın olarak kullanılan bir ölçüdür. Ancak, bu testin doğruluğunu ve tekrarlanabilirliği için kullanıcının hatalar nedeniyle ya da deneysel manipülasyon NK hücrelerinin duyarlılığının ya kararsız olarak kabul edilebilir. Bu sorunları ortadan kaldırmak için, en az bunları azaltan bir iş akışı kurulmuş ve sunulmuştur. Biz kaçak arasında, çeşitli zaman noktalarında kan örnekleri alındı, göstermek için (n = 4) egzersiz yoğun butik tabi ki. İlk olarak, NK hücreleri aynı anda tespit edilir ve doğrudan tam kandan ve gibi kısa bir sürede mililitre gelen CD56 etiketleme ve manyetik bazlı sıralama ile izole edilmiştir. kriteri NK hücreleri herhangi bir ayıraç veya kapatma antikorların kaldırılır. Bunlar kan mililitre başına doğru bir NK hücre sayısı tespit etmek için sayılabilir. İkinci olarak, kriteri NK hücrelerinin (efektör hücreleri ya da E) 3,3-Diotade karıştırılabilirHer olayın görselleştirme ve herhangi bir yanlış pozitif ortadan kaldırılması için izin veren bir görüntüleme akış Sitometreyi kullanarak E oranı ve analiz: 5 T: cyloxacarbocyanine perklorat (DIO) bir tahlil optimal 1 de K562 hücreleri (hedef hücreleri ya da T) etiketli ya da (örneğin çiftler veya efektör hücreleri gibi) yanlış negatif. Bu iş akışı yaklaşık 4 saat içinde tamamlandı ve hatta insan numuneleri ile çalışan çok kararlı sonuçlar sağlar edilebilir. Kullanılabilir olduğunda, araştırma ekipleri, insan deneklerde birkaç deneysel müdahaleleri test ve veri bütünlüğünü tehlikeye atmadan birkaç zaman noktaları arasında ölçümleri karşılaştırabilirsiniz.

NK hücre sayısı tayini Tam kan NK hücre sayımı ağır çalışan etkisi Şekil 2&#39;de tarif edilen egzersiz protokolü kullanılarak ölçülmüştür. Kan örnekleri ilk kan çekildikten sonra nihayet 24 ve 48 saat 1.5 saat egzersiz sonrası, egzersizden hemen sonra, egzersiz öncesi çekilmiş ve bulundu. Tam kan mililitrede NK hücrelerinin konsantrasyonu her koşucu (Şekil 3A) ve her bir zaman noktası için ortalama (Şekil 3...

Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood at JoVE.com

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

This work describes an advanced workflow for the accurate and fast determination of NK (Natural Killer) cell count and NK cell cytotoxicity in human blood samples.

İnsan Tüm Kan Natural Killer Hücre Parçalayıcı Faaliyet Akışı Sitometrik Analizi

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

flow-cytometric-analysis-natural-killer-cell-lytic-activity-human

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

12.3K Görüntüleme.  North Carolina A&T State University, North Carolina Research Campus. This work describes an advanced workflow for the accurate and fast determination of NK (Natural Killer) cell count and NK cell cytotoxicity in human blood samples.

Video: Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

Super-resolution Imaging of the Natural Killer Cell Immunological Synapse on a Glass-supported Planar Lipid Bilayer

The glass-supported planar lipid bilayer system has been utilized in a variety of disciplines. One of the most useful applications of this technique has been in the study of immunological synapse formation, due to the ability of the glass-supported planar lipid bilayers to mimic the surface of a target cell while forming a horizontal interface. The recent advances in super-resolution imaging have further allowed scientists to better view the fine details of synapse structure. In this study, one of these advanced techniques, stimulated emission depletion (STED), is utilized to study the structure of natural killer (NK) cell synapses on the supported lipid bilayer. Provided herein is an easy-to-follow protocol detailing: how to prepare raw synthetic phospholipids for use in synthesizing glass-supported bilayers; how to determine how densely protein of a given concentration occupies the bilayer's attachment sites; how to construct a supported lipid bilayer containing antibodies against NK cell activating receptor CD16; and finally, how to image human NK cells on this bilayer using STED super-resolution microscopy, with a focus on distribution of perforin positive lytic granules and filamentous actin at NK synapses. Thus, combining the glass-supported planar lipid bilayer system with STED technique, we demonstrate the feasibility and application of this combined technique, as well as intracellular structures at NK immunological synapse with super-resolution.

We describe here a combination of the glass-supported lipid bilayer technique of forming immunological synapses with the super-resolution imaging technique of stimulated emission depletion (STED) microscopy. The goal of this protocol is to provide users with the instructions necessary to successfully carry out these two techniques.

Bir Cam destekli Planar çift katlı lipid Doğal Öldürücü Hücre İmmünoloji Synapse Süper çözünürlüklü Görüntüleme

The glass-supported planar lipid bilayer system has been utilized in a variety of disciplines. One of the most useful applications of this technique has ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various nanoparticle systems have been engineered to mimic features of pathogens to improve antigen delivery to draining lymph nodes and increase antigen uptake by antigen-presenting cells, leading to new vaccine formulations optimized for induction of antigen-specific CD8+ T cell responses. In this article, we describe the synthesis of a &#8220;pathogen-mimicking&#8221; nanoparticle system, termed interbilayer-crosslinked multilamellar vesicles (ICMVs) that can serve as an effective vaccine carrier for co-delivery of subunit antigens and immunostimulatory agents and elicitation of potent cytotoxic CD8+ T lymphocyte (CTL) responses. We describe methods for characterizing hydrodynamic size and surface charge of vaccine nanoparticles with dynamic light scattering and zeta potential analyzer and present a confocal microscopy-based procedure to analyze nanoparticle-mediated antigen delivery to draining lymph nodes. Furthermore, we show a new bioluminescence whole-animal imaging technique utilizing adoptive transfer of luciferase-expressing, antigen-specific CD8+ T cells into recipient mice, followed by nanoparticle vaccination, which permits non-invasive interrogation of expansion and trafficking patterns of CTLs in real time. We also describe tetramer staining and flow cytometric analysis of peripheral blood mononuclear cells for longitudinal quantification of endogenous T cell responses in mice vaccinated with nanoparticles.

We describe whole-animal imaging and flow cytometry-based techniques for monitoring expansion of antigen-specific CD8+ T cells in response to immunization with nanoparticles in a murine model of vaccination.

Nanopartikül Aşılama sonrası analizi antijene özgü CD8 + T hücresi tepkileri için tüm hayvan Görüntüleme ve Akış Sitometrisi Teknikleri

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident cells. A key mechanism of this inflammatory response is the migration of circulating immune cells to the ischemic brain facilitated by chemokine release and increased endothelial adhesion molecule expression. Brain-invading leukocytes are well-known contributing to early-stage secondary ischemic injury, but their significance for the termination of inflammation and later brain repair has only recently been noticed.
Here, a simple protocol for the efficient isolation of immune cells from the ischemic mouse brain is provided. After transcardial perfusion, brain hemispheres are dissected and mechanically dissociated. Enzymatic digestion with Liberase&#160;is followed by density gradient (such as Percoll) centrifugation to remove myelin and cell debris. One major advantage of this protocol is the single-layer density gradient procedure which does not require time-consuming preparation of gradients and can be reliably performed. The approach yields highly reproducible cell counts per brain hemisphere and allows for measuring several flow cytometry panels in one biological replicate. Phenotypic characterization and quantification of brain-invading leukocytes after experimental stroke may contribute to a better understanding of their multifaceted roles in ischemic injury and repair.

Inflammation plays a central role in the pathogenesis of ischemic stroke. Increasing evidence suggests that it acts as a double-edged sword which exacerbates early brain injury, but also contributes to later repair. This protocol describes the isolation of immune cells from the ischemic brain and their subsequent flow cytometric phenotyping.

İskemik Fare Beyin gelen Bağışıklık Hücreleri İzolasyon ve Akım Sitometrisi Analizi

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Glioma-infiltrating Peripheral Blood Mononuclear Cells

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 malignant gliomas soon after intracranial engraftment if the cancer cells are rendered deficient in their expression of the &#946;-galactoside-binding lectin galectin-1 (gal-1). More recent work now shows that a population of Gr-1+/CD11b+ myeloid cells is critical to this effect. To better understand the mechanisms by which NK and myeloid cells cooperate to confer gal-1-deficient tumor rejection we have developed a comprehensive protocol for the isolation and analysis of glioma-infiltrating peripheral blood mononuclear cells (PBMC). The method is demonstrated here by comparing PBMC infiltration into the tumor microenvironment of gal-1-expressing GL26 gliomas with those rendered gal-1-deficient via shRNA knockdown. The protocol begins with a description of&#160;how to culture and prepare GL26 cells for inoculation into the syngeneic C57BL/6J mouse brain. It then explains the steps involved in the isolation and flow cytometric analysis of glioma-infiltrating PBMCs from the early brain tumor microenvironment. The method is adaptable to a number of in vivo experimental designs in which temporal data on immune infiltration into the brain is required. The method is sensitive and highly reproducible, as glioma-infiltrating PBMCs can be isolated from intracranial tumors as soon as 24 hr post-tumor engraftment with similar cell counts observed from time point matched tumors throughout independent experiments. A single experimentalist can perform the method from brain harvesting to flow cytometric analysis of glioma-infiltrating PBMCs in roughly 4-6 hr depending on the number of samples to be analyzed. Alternative glioma models and/or cell-specific detection antibodies may also be used at the experimentalists&#8217; discretion to assess the infiltration of several other immune cell types of interest without the need for alterations to the overall procedure.

Presented here is a straightforward method for the isolation and flow cytometric analysis of glioma-infiltrating peripheral blood mononuclear cells that yields time-dependent quantitative data on the number and activation status of immune cells entering the early brain tumor microenvironment.

İzolasyon ve Glioma-sızmakta periferik kan mononükleer hücrelerinin Akışı Sitometrik Analizi

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 ...

A Simple Flow Cytometric Method to Measure Glucose Uptake and Glucose Transporter Expression for Monocyte Subpopulations in Whole Blood

Monocytes are innate immune cells that can be activated by pathogens and inflammation associated with certain chronic inflammatory diseases. Activation of monocytes induces effector functions and a concomitant shift from oxidative to glycolytic metabolism that is accompanied by increased glucose transporter expression. This increased glycolytic metabolism is also observed for trained immunity of monocytes, a form of innate immunological memory. Although in vitro protocols examining glucose transporter expression and glucose uptake by monocytes have been described, none have been examined by multi-parametric flow cytometry in whole blood. We describe a multi-parametric flow cytometric protocol for the measurement of fluorescent glucose analog 2-NBDG uptake in whole blood by total monocytes and the classical (CD14++CD16-), intermediate (CD14++CD16+) and non-classical (CD14+CD16++) monocyte subpopulations. This method can be used to examine glucose transporter expression and glucose uptake for total monocytes and monocyte subpopulations during homeostasis and inflammatory disease, and can be easily modified to examine glucose uptake for other leukocytes and leukocyte subpopulations within blood.

Monocytes are integral components of the human innate immune system that rely on glycolytic metabolism when activated. We describe a flow cytometry protocol to measure glucose transporter expression and glucose uptake by total monocytes and monocyte subpopulations in fresh whole blood.

Basit Akım Sitometrisi Yöntemi Tüm Kan Monosit subpopulations için glikoz alımını ve Glikoz Transporter Anlatım Tedbir

Monocytes are innate immune cells that can be activated by pathogens and inflammation associated with certain chronic inflammatory diseases. Activation of ...

Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in diameter. In addition to a characterization of forward and sideward scatter properties, it enables the use of fluorescent labeled markers like antibodies to detect respective structures. Using indirect antibody staining, flow cytometry is employed here to quantify birch pollen allergen (precisely Bet v 1)-loaded particles of 0.5 to 10 &#181;m in diameter in inhalable particulate matter (PM10, particle size &#8804;10 &#181;m in diameter). PM10 particles may act as carriers of adsorbed allergens possibly transporting them to the lower respiratory tract, where they could trigger allergic reactions.
So far the allergen content of PM10 has been studied by means of enzyme linked immunosorbent assays (ELISAs) and scanning electron microscopy. ELISA measures the dissolved and not the particle-bound allergen. Compared to scanning electron microscopy, which can visualize allergen-loaded particles, flow cytometry may additionally quantify them. As allergen content of ambient air can deviate from birch pollen count, allergic symptoms might perhaps correlate better with allergen exposure than with pollen count. In conjunction with clinical data, the presented method offers the opportunity to test in future experiments whether allergic reactions to birch pollen antigens are associated with the Bet v 1 allergen content of PM10 particles &#62;0.5 &#181;m.

Here, we present a protocol to quantify allergen-loaded particles by flow cytometry. Ambient particulate matter particles may act as carriers of adsorbed allergens. We show here that flow cytometry, a method widely used to characterize suspended solids &#62;0.5 &#181;m in diameter, can be used to measure these allergen-loaded particles.

PM10 parçacık bağlı Bet v 1 Allergen Akışı Sitometrik Analizi

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Gamma Delta T Cells

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore essential for understanding pathogenicity of different pathogens including HIV. Gamma delta (GD) T cells are the prototype of &#39;unconventional&#39; T cells and represent a relatively small subset of T cells defined by their expression of heterodimeric T-cell receptors (TCRs) composed of gamma and delta chains. This sets them apart from the classical and much better known CD4+ helper T cells and CD8+ cytotoxic T cells that are defined by alpha-beta TCRs. GD T cells often show tissue-specific localization and are enriched in epithelium. GD T cells orchestrate immune responses in inflammation, tumor surveillance, infectious disease, and autoimmunity.
Here, we present a method to reproducibly isolate and analyze human endocervical intraepithelial GD T lymphocytes. We have used endocervical cytobrush samples from women participating in the Women&#39;s Interagency HIV Infection Study (WIHS). Knowledge about GD T cells interactions during conditions in which there is an insult to the vaginal mucosal could be applied to any clinical study in which mucosal vulnerability is addressed, including the development of vaginal microbicides.In addition, knowledge about mucosal GD T cell responses has potential for application of GD T cell-based immune therapy in treating infectious diseases.

We describe here an isolation method to obtain human endocervical intraepithelial lymphocytes for the analysis of intraepithelial gamma delta T cells. This protocol can be extended for the purification of endocervical gamma delta T cells by magnetic beads or by cell sorting.

İnsan Endoservikal Gamma Delta T Hücreleri İzolasyon ve Akım Sitometrisi Analizi

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can have pathological significance. An ideal method for examining alterations to monocytes is whole blood flow cytometry as the minimal handling of samples by this method limits artifactual cell activation. However, many different approaches are taken to gate the monocyte subsets leading to inconsistent identification of the subsets between studies. Here we demonstrate a method using whole blood flow cytometry to identify and characterize human monocyte subsets (classical, intermediate, and non-classical). We outline how to prepare the blood samples for flow cytometry, gate the subsets (ensure contaminating cells have been removed), and determine monocyte subset expression of surface markers &#8212; in this example M1 and M2 markers. This protocol can be extended to other studies that require a standard gating method for assessing monocyte subset proportions and monocyte subset expression of other functional markers.

Here we present a protocol for characterizing monocyte subsets by whole blood flow cytometry. This includes outlining how to gate the subsets and assess their expression of surface markers and giving an example of the assessment of the expression of M1 (inflammatory) and M2 markers (anti-inflammatory).

İnsan monosit alt kümeleri tam kan tarafından karakterizasyonu Akış Sitometresi Analizi

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a myeloid-biased 39-antibody CyTOF panel to evaluate the hematopoietic system with a focus on the neutrophil-lineage cells by using this protocol. The CyTOF result was analyzed with an open-resource dimensional reduction algorithm, viSNE, and the data was presented to demonstrate the outcome of this protocol. We have discovered new neutrophil-lineage cell populations based on this protocol. This protocol of fresh whole BM preparation may be used for 1), CyTOF analysis to discover unidentified cell populations from whole BM, 2), investigating whole BM defects for patients with blood disorders such as leukemia, 3), assisting optimization of fluorescence-activated flow cytometry protocols that utilize fresh whole BM.

Here, we present a protocol to process fresh bone marrow (BM) isolated from mouse or human for high-dimensional mass cytometry (Cytometry by Time-Of-Flight, CyTOF) analysis of neutrophil-lineage cells.

Nötrofil kütle sitometri analizi için tüm kemik Iliği hazırlanması-Lineage hücreler

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

Invasive pulmonary infection by the mold Aspergillus fumigatus poses a great threat to immunocompromised patients. Inhaled fungal conidia (spores) are cleared from the human lung alveoli by being phagocytosed by innate monocytes and/or neutrophils. This protocol offers a fast and reliable measurement of phagocytosis by flow cytometry using fluorescein isothiocyanate (FITC)-labeled conidia for co-incubation with human leukocytes and subsequent counterstaining with an anti-FITC antibody to allow discrimination of internalized and cell-adherent conidia. Major advantages of this protocol are its rapidness, the possibility to combine the assay with cytometric analysis of other cell markers of interest, the simultaneous analysis of monocytes and neutrophils from a single sample and its applicability to other cell wall-bearing fungi or bacteria. Determination of percentages of phagocytosing leukocytes provides a means to microbiologists for evaluating virulence of a pathogen or for comparing pathogen wildtypes and mutants as well as to immunologists for investigating human leukocyte capabilities to combat pathogens.

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

This protocol provides a fast and reliable method to quantitatively measure phagocytosis of Aspergillus fumigatus conidia by human primary phagocytes using flow cytometry and to discriminate phagocytosis of conidia from mere adhesion to leukocytes.

Akış Sitometrisi Kullanılarak İnsan Lökositler tarafından Aspergillus fumigatus Conidia Fagositozunun ölçülmesi

Invasive pulmonary infection by the mold Aspergillus fumigatus poses a great threat to immunocompromised patients. Inhaled fungal conidia (spores) are ...