This work was supported by a Research Catalyst Award from Utah State University. The authors would like to thank Annelise Dykes, Cameron Zabriskie, and Donald Wooley for their contributions.

Tamponlar 1. Hazırlık <ol><li> Fosfat tamponlu tuz (PBS) <ol><li> 1x PBS konsantrasyonu yapmak için, 450 ml HPLC dereceli su ile 10 kat PBS 50 ml seyreltilir. Steril filtre 0.22 um filtre ile çözeltisi. </li><li> oda sıcaklığında saklayın çözüm. </li></ol></li><li> Tris Tamponlu Tuzlu Su + Tween 20 (TBST) hazırlanması <ol><li> 1x konsantrasyonunu yapmak için, 450 ml HPLC dereceli su ile 10x Tris tamponlu tuz (TBS), 50 ml seyreltilir. Tween-20% 0.05 (h / h) Tween-20, 250 ul ekle. Steril filtre 0.22 um filtre ile çözeltisi. </li><li> Oda sıcaklığında saklayınız. </li></ol></li><li> Insan serum albümini hazırlanması (HSA) Bloklama çözeltisi, <ol><li> HSA çözeltisi ağırlık / hacim% 3 olmak üzere steril filtre edildi 1x PBS 15 ml HSA 0.45 g tartılır. HSA kadar Vortex çözüm tamamen çözülür. </li><li> 4 ° C&#39;de saklayın HSA çözüm. Not: Sığır Serum Albümini(BSA), bir bloklama çözeltisi olarak kullanılabilir. </li></ol></li><li> PEG&#39;lenmiş antikorun hazırlanması (PEG-Ab) çözeltisi Not: antikor çözeltisi bağlanma yerleri N-hidroksi-(NHS) için rekabet ederek konjugasyon reaksiyonlara müdahale böyle BSA gibi taşıyıcı veya stabilize proteinler, bağımsız olmalıdır. Antikor bir Tris veya glisin tampon çözeltisi içinde gelirse, NHS konjügasyon reaksiyonu engellemeyen aminlerin ya da amonyum tuzlan önlemek için bir tampon değişimi geçmesi gerekir. antikor, bir liyofilize formda ise, 1-10 mg / ml&#39;lik bir konsantrasyonda, üreticinin tavsiyesine göre yeniden süspanse edilebilir. <ol><li> Tris veya glisin tampon içinde antikorlarla, bir tuz giderme kolonu kullanılarak, 100 mM sodyum bikarbonat tampon değişimi. Konjugasyon reaksiyonu hızlandırmak için yaklaşık 8.5&#39;a pH değerini yükseltmek için, 100 mM tampon kullanın. </li><li> 100 mm s olan hidrat orto-piridil disülfür, PEG-NHS (OPSS-PEG-NHS)1 mg / ml veya daha büyük bir konsantrasyonda kullanıldıklarında, 1 ml &#39;lik bir hacme kadar, sodyum bikarbonat. Not: OPSS-PEG-NHS taze ve yaklaşık 20 dakika içinde kullanılmalıdır. OPSS-PEG-NHS NHS grubu pH 8.5&#39;te, bir sulu çözelti içinde, yaklaşık 20 dakikalık bir yarı ömre sahiptir. </li><li> 1 oranında (PEG: antikoru) 2 antikor çözeltisine OPSS-PEG-NHS ekleme konjügasyon oranı test numuneleri için kullanılır. kontrol için kullanılacak 1 konjügasyon oranı: Ayrı bir mikrosantrifüj tüpü içinde bir 2 antijen çözeltisine OPSS-PEG-NHS ilave edin. Not 2: 1 oranında bir% 50 birleşme etkinliğinin üstlenmektedir. Hedef Bir PEG zincirinin her antikorunu etiketlemek için. Bu adımda, aşırı etiketleme altında etiketleme daha iyidir. OPSS-PEG-NHS ve antikor çözeltisi, uygun hacimleri belirlemek için aşağıdaki denklem kullanarak: <img alt="denklem" src="/files/ftp_upload/54795/54795eq_2.jpg" /> V hacmidir, Cı molekülleri ya da ifade edilen konsantrasyondurml başına antikorlarının verilmesinin. İndisler PEG ve Ab sırasıyla OPSS-PEG-NHS ve antikor bulunmaktadır. Nihai hacim, yaklaşık 250 ul olmalıdır. </li><li> 8 saat veya gece boyunca 4 ° C &#39;de, PEG-Ab çözelti inkübe edin. donma ve erime döngülerinde sınırı ve düşük bağlama tüpler kullanımı emin olmak için, -20 ° C &#39;de yaklaşık 25 ul hacimde çalışan saklayın çözeltisi. </li></ol></li></ol> 2. hazırlayın UV-Vis / Raman Sondalar <ol><li> Çıplak AuNP çözüm hazırlayın <ol><li> Ml başına yaklaşık olarak 1 x 10 11 parçacıkların bir konsantrasyon ile AuNPs bir 2 mi çözelti hazırlayın. <ol><li> AuNPs konsantre gerekiyorsa, 20 dakika veya süpernatant netleşene kadar 5.000 xg&#39;de 2.000 Stokta AuNP ul ve santrifüj ile düşük bağlanma santrifüj tüpleri doldurmak. AuNP pelet rahatsız etmemek için dikkatli olmak, pipetleme süpernatantı. </li><li> bir tüp içine kalan AuNP çözümleri birleştirin ve konsantrasyonunun tahminUV-Vis ölçümü elde etmek ve bu doğrusal bir ilişki olarak bilinen konsantrasyonlarda değerleri karşılaştırarak yon. </li></ol></li></ol></li><li> Uygun Raman muhabiri etiketleme oranını belirlemek <ol><li> metanol içinde çözülmüş Raman raportör bir çalışma çözeltisi hazırlayın. Bu konsantrasyon kullanılan muhabiri bağlı olacaktır. Bu çalışmada, 200 uM&#39;lik bir çalışma çözeltisi olarak 3,3-diethylthiatricarbocyanine iyodür (DTTC) hazırlanması. </li><li> Her bir kuyu için 100 ul nihai bir hacim varsayarak, Raman raportör 0.2 uM ila 10 uM konsantrasyonu aralığında olacak şekilde 96 oyuklu bir plakanın birinci sırasındaki her çukuruna çalışma raportör çözeltisi kadar ekleyin. hacmi 80 uL olduğu her bir tür için yeterli HPLC dereceli su ilave edilir. Her bir hazne, 100 ul&#39;lik bir son hacim de yapma AuNP 20 ul ekle. Bir örnek, Tablo 1 &#39;de verilmektedir. </li><li> UV-Vis spektrumları 400 ila ölçünBir plaka okuma UV-Vis spektrofotometre kullanılarak 700 nm. uygun bir konsantrasyon, UV-Vis spektrumu için tanımlanan tepe en yüksek konsantrasyondur. AuNPs Raman gazetecilere en yüksek konsantrasyon oranına kadar Artan konsantrasyonlarda adımı yineleyin 2.2.2 bulunmuştur. NOT: boya ve AuNP şekli, boyutu ve üretici uygun konsantrasyonunu etkiler. Bu nedenle, sıralanan adımlar kullanılan bileşenlere bağlı olarak değerlendirilir ve değiştirilmesi gerekir. Bu protokol, pozitif yüklü bir boya kullanımını kapsamıştır. Bu nedenle, AuNP ve raportör arasındaki bağlanma negatif yüklü AuNPs kullanılarak geliştirilmiştir. Bu sitrat şapkalı AuNPs kullanılarak yapıldı. Daha fazla bilgi için tartışma bölümüne bakın. </li></ol></li><li> Raman muhabiri ve PEG-Ab Binding AuNP için <ol><li> Raman raportör oda sıcaklığında 30 dakika boyunca AuNPs bağlanmasına izin önceden belirlenmiş konsantrasyonda AuNP ve Raman raportör iki 1.5 mi toplu hazırlayın.</li><li> parçacıklara antikor: 1 oranını 200 oluşturmak için AuNP ve Raman raportör çözeltisinin bir toplu PEG&#39;lenmiş antikoru (PEG-Ab) ekleyin. Bu çözelti, test numuneleri için olacaktır. kontrol olarak kullanılmak üzere taneciklerin antikorun: 1 oranında ayrı bir mikrosantrifüj tüpü içinde bir 200 AuNP ve Raman raportör çözümün diğer toplu PEG&#39;lenmiş antijeni ekleyin. Oda sıcaklığında 30 dakika için çözümler inkübe edin. NOT: parçacıklara antikorların oranı AuNPs özgü ve kullanılan boya ve her durum için optimize edilmelidir olacaktır. AuNP probları partiküllerin toplanmasını önler bağlanma burada amaç antikorların en yüksek orana sahip olmaktır. Birlikte eklemek için uygun hacimleri belirlemek için aşağıdaki denklemi kullanın: <img alt="denklem" src="/files/ftp_upload/54795/54795eq_200.jpg" /> V hacmidir, Cı ml başına parçacıklar veya antikorlar olarak ifade konsantrasyondur. yüzgeçark hacmi yaklaşık 1.5 ml olmalıdır. </li></ol></li><li> Blok mPEG-SH ile AuNP yüzeyde siteleri kalan. <ol><li> su kullanarak bir 200 uM konsantrasyonuna katı metoksi polietilen glikol tiyol eriterek mPEG-SH hazırlayın. mPEG-SH tamamen eriyene kadar çözelti vorteksleyin. </li><li> Adım 2.3 yapılan AuNP-PEG-Ab çözüm: 1 oranında bir 40.000 mPEG-SH ekleyin. Altın nanopartikül kalan kısımlar bloke edilmiştir sağlamak için 10 dakika boyunca oda sıcaklığında çözelti inkübe edin. Birlikte eklemek için uygun hacimleri belirlemek için aşağıdaki denklemi kullanın: <img alt="denklem" src="/files/ftp_upload/54795/54795eq_40000.jpg" /> V hacmidir, Cı ml başına parçacıklar veya antikorlar olarak ifade konsantrasyondur. Nihai hacmi, yaklaşık 1.5 ml olmalıdır. </li></ol></li><li> Fonksiyonalize Raman probları kurtarın. <ol><li> Düşük bağlama c 20 dakika boyunca 5.000 xg&#39;de santrifüj parçacıklarentrifuge tüpler veya süpernatant netleşene kadar. AuNPs rahatsız etmemek için dikkatli olmak pipetleme süpernatantı. </li><li> Daha önce yapılan 1x PBS çözeltisi 1 ml parçacıklar yeniden süspanse edin. çözeltisi (3 uL), küçük bir hacim içinde bir UV ölçümü alınarak AuNP konsantrasyonu hesabının ve bilinen AuNP konsantrasyonundan ölçümlere karşılaştırın. Nihai çözüm ml başına en az 1 x 10 11 parçacıklar olacak şekilde ses seviyesini ayarlayın. </li><li> 4 ° C&#39;de saklayın çözümleri immunoassay plaka işlevselleştirilmesi için kullanılan kadar. bir hafta içinde çözümleri kullanın. </li></ol></li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td colspan="3"> Hacimler her bileşenin eklemek için (mi) </td></tr><tr><td> DTTC nihai konsantrasyon (mM) </td><td> DTTC çalışma çözeltisi (200 mM) </td><td> AuNP </td><td> Su </td></tr><tr><td> 0.2 </td&gt; <td> 0.1 </td><td> 20 </td><td> 79.9 </td></tr><tr><td> 0.6 </td><td> 0.3 </td><td> 20 </td><td> 79.7 </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 0.5 </td><td> 20 </td><td> 79.5 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 1.0 </td><td> 20 </td><td> 79 </td></tr><tr><td> 5 </td><td> 2.5 </td><td> 20 </td><td> 77.5 </td></tr><tr><td> 7 </td><td> 3.5 </td><td> 20 </td><td> 76.5 </td></tr><tr><td> 10 </td><td> 5.0 </td><td> 20 </td><td> 75 </td></tr></tbody></table> Tablo 1. DTTC seyreltme, örneğin. DTTC çeşitli seyreltileri ve stok DTTC altın nano partıküler çözeltisi ve su ilişkili hacimleri. 3. İmmunoassay Plaka Hazırlama <ol><li> Bağışıklık plakasının istenen antijeni bağlayan. <ol><li> polistiren kuyu doldurmak için yeterli seyreltilmiş antijen (50 ug / ml) hazırlayın. , Çözüm vortekshemen plaka oyuklarına solüsyonu ekleyin. Antijen, oda sıcaklığında 1 saat boyunca plakaları bağlanmasına izin verir. </li></ol></li><li> Ilişkisiz antijenleri yıkayın. <ol><li> Bir bertaraf kabına çözüm damping ve bir kağıt havlu kaplı masa karşı plaka vurarak aşırı antijen çözüm çıkarın. </li><li> daha önce belirtildiği gibi aynı şekilde yıkama daha sonra yüzey yıkama kaldırmak için oyuklara TBST ilave edin. Bu adımı iki kez daha tekrarlayın. </li></ol></li><li> Blok spesifik olmayan önlemek için plaka bağlama bölgeleri. <ol><li> plakanın her oyuğuna HSA engelleme çözeltisi 70 ul ilave edin ve 30 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Çıkarın ve adım 3.2 &#39;de belirtildiği gibi aynı prosedürü kullanarak plaka yıkayın. Daha fazla kullanım için hazır olana kadar 4 ° C&#39;de plaka ve saklamak kuru örtün. </li></ol></li><li> Immunoassay plaka işlevselleştirmek. <ol><li> T 70 ul ekleBir 96-yuvalı plakanın birinci sütuna Bölüm 2&#39;de hazırlanan nano-tanecikleri prob ve 1 ile daha sonra sütun seyreltik: 2 dizi dilüsyon. Plaka, en az 1 saat boyunca inkübe izin verin. Immünolojik plaka hazırlanması için nasıl bir örneği Şekil 3&#39;te verilmiştir. </li><li> uygun AuNPs imha etme emin adımlar 3.2 detaylı olarak TBST ile beş kez plaka yıkayın. Son yıkamadan sonra her bir göze 1x PBS 70 ul ve bir plaka conta ile kapak. NOT: Kontrol numuneleri açık olmalıdır. Spesifik olmayan bağlanma, söz konusu ise, kontrol numuneleri test numuneleri benzer bir renk vardır. </li></ol></li><li> UV-Vis ve Raman spektroskopisi ile test tahlil duyarlılık. <ol><li> her bir için, UV-Vis spektrumu, bir plaka okuma UV-Vis spektrofotometre kullanılarak 400 ila 700 nm arasında değişen ölçer. </li><li> ters bir Raman mikroskobu kullanılarak, AuNP probları vardır kuyunun yüzeyine hedefi odaklanır. obiyi bir Raman tain. 1800 cm -1 400 cm arasında değişen bir spektrum toplayın -1. Tüm kuyuları için bu adımı tekrarlayın. </li><li> Uygun bir spektral yazılımı kullanarak, UV-Vis spektrumları için Raman için 11. dereceden çok terimli temel düzeltme ve 3. sipariş Polinom gerçekleştirin. </li><li> Uygun bir spektral yazılımı kullanarak, Raman ve UV-Vis spektrumları normalleştirmek. 1 maksimum değeri belirler ve buna göre tüm diğer değerleri ölçek. Raman normalleştirmek için, benzersiz bir polistiren tepe seçmek ve eşit 1&#39;e set ve buna göre tüm diğer değerleri ölçek. </li><li> Uygun bir spektral yazılımı kullanarak, her spektrum için zirve entegrasyonu gerçekleştirmek. Raman için, Raman raportör temsil pik polistiren zirveleri bir bölge Evde olmayan olmalıdır. zirve entegrasyonunu gerçekleştirmek için, istenilen zirve için ayrılmaz sınırlarını belirlemek ve kontroller dahil olmak üzere tüm örnekler için istenen pik alanı kaydedin. </li><li> plilişkili standart sapma gösteren her bir nokta için hata çubukları ile beraber AuNP konsantrasyonunun log bir fonksiyonu olarak ilgi ortalama pik alanı ot. 4 parametreli bir lojistik eğri bu kalibrasyon noktası uygun. </li><li> Boş numune için ilgi zirve alanının ortalamasının alınmasıyla boş ortalama değerini belirler. Bu alanların standart sapmasını belirlemek; Bu boşluğun standart sapma olduğunu. </li><li> önceki adımda analiz Aynı zirve için, en düşük konsantrasyonu için bu zirve alanının standart sapması bulabilirsiniz. </li><li> Temsilcisi sonuçları bölümünde belirtildiği gibi algılama boş ve alt limit sınırını hesaplayın. AuNP konsantrasyonu cinsinden LLOD belirlemek için 4 PL kalibrasyon eğrileri bu değerleri kullanın. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Israelsen, N. D., Hanson, C., Vargis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle+properties+and+synthesis+effects+on+surface-enhanced+Raman+scattering+enhancement+factor:+an+introduction.">Nanoparticle properties and synthesis effects on surface-enhanced Raman scattering enhancement factor: an introduction.</a> Sci. World J. , e124582 (2015).</li><li>Wang, Y., Schl&#252;cker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+design+and+synthesis+of+SERS+labels.">Rational design and synthesis of SERS labels.</a> Analyst. 138 (8), 2224-2238 (2013).</li><li>Wang, Y., Yan, B., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SERS+tags:+novel+optical+nanoprobes+for+bioanalysis.">SERS tags: novel optical nanoprobes for bioanalysis.</a> Chem. Rev. 113 (3), 1391-1428 (2013).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Immunoassay Handbook: Theory and applications of ligand binding, ELISA and related techniques. , (2013).</li><li>Cox, K. L., Devanarayan, V., Kriauciunas, A., Manetta, J., Montrose, C., Sittampalam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoassay+Methods.">Immunoassay Methods.</a> Assay Guid. Man. , (2004).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> ELISA development guide. , (2016).</li><li>Israelsen, N. D., Wooley, D., Hanson, C., Vargis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+design+of+Raman-labeled+nanoparticles+for+a+dual-modality,+light+scattering+immunoassay+on+a+polystyrene+substrate.">Rational design of Raman-labeled nanoparticles for a dual-modality, light scattering immunoassay on a polystyrene substrate.</a> J. Biol. Eng. 10, (2016).</li><li>Menges, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Spekwin32 - optical spectroscopy software. Version 1.72.1. , (2016).</li><li>Findlay, J. W. A., Dillard, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appropriate+calibration+curve+fitting+in+ligand+binding+assays.">Appropriate calibration curve fitting in ligand binding assays.</a> AAPS J. 9 (2), E260-E267 (2007).</li><li>Yu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+the+Antibody+Binding+on+Protein+Microarrays+using+Microarray+Nonlinear+Calibration.">Quantifying the Antibody Binding on Protein Microarrays using Microarray Nonlinear Calibration.</a> BioTechniques. 54, 257-264 (2013).</li><li>Armbruster, D. A., Pry, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limit+of+blank,+limit+of+detection+and+limit+of+quantitation.">Limit of blank, limit of detection and limit of quantitation.</a> Clin. Biochem. Rev. 29 (Suppl 1), S49-S52 (2008).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> EP17-A2: Evaluation of Detection Capability for Clinical Laboratory Measurement Procedures; Approved Guideline. 32. No 8, (2012).</li><li>Leigh, S. Y., Som, M., Liu, J. T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+assessing+the+reliability+of+molecular+diagnostics+based+on+multiplexed+SERS-coded+nanoparticles.">Method for assessing the reliability of molecular diagnostics based on multiplexed SERS-coded nanoparticles.</a> Plos One. 8 (4), e62084 (2013).</li><li>Sinha, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+the+binding+potential+of+cell-surface+receptors+in+fresh+excised+specimens+via+dual-probe+modeling+of+SERS+nanoparticles.">Quantification of the binding potential of cell-surface receptors in fresh excised specimens via dual-probe modeling of SERS nanoparticles.</a> Sci. Rep. 5, 8582 (2015).</li><li>Shi, W., Paproski, R. J., Moore, R., Zemp, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+circulating+tumor+cells+using+targeted+surface-enhanced+Raman+scattering+nanoparticles+and+magnetic+enrichment.">Detection of circulating tumor cells using targeted surface-enhanced Raman scattering nanoparticles and magnetic enrichment.</a> J. Biomed. Opt. 19, 056014 (2014).</li><li>Xia, X., Li, W., Zhang, Y., Xia, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silica-coated+dimers+of+silver+nanospheres+as+surface-enhanced+Raman+scattering+tags+for+imaging+cancer+cells.">Silica-coated dimers of silver nanospheres as surface-enhanced Raman scattering tags for imaging cancer cells.</a> Interface Focus. 3 (3), 20120092 (2013).</li><li>McLintock, A., Cunha-Matos, C. A., Zagnoni, M., Millington, O. R., Wark, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+surface-enhanced+Raman+tags:+individual+nanorods+for+measurements+from+the+visible+to+the+infrared+(514-1064+nm).">Universal surface-enhanced Raman tags: individual nanorods for measurements from the visible to the infrared (514-1064 nm).</a> Acs Nano. 8 (8), 8600-8609 (2014).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Ayrıntılı protokolde, adres birçok kritik noktalar vardır. Tek sorun Raman muhabir ve altın nanopartikülünün seçimdir. Protokol bağımsız kullanım için adapte edilmesi yazılmış de, Raman raportör DTTC örnek olarak kullanılmıştır. DTTC pozitif yüklü bir muhabir ve olumsuz gibi sitrat şapkalı AuNPs olarak yüzeyleri ücret bağlanır. Bu protokol, yüzey yükü ile altın nano parçacıklar kullanarak negatif yüklü muhabir için adapte edilebilir. Örneğin, polietilenimin (PEI) başlıklı Au...

Tipik sandviç immüno dolaylı iki antikor kullanarak bir antijen mevcudiyetini algılar. zaptedilen antikoru bir katı yüzeye bağlanmış ve uygun bir antijene yakın bir antikor-antijen kompleksi olduğunda oluşturur. Bir saptama antikor kişiye ve antijene bağlanır. Şekil 1A gösterildiği gibi yıkandıktan sonra, antikor / antijen / antikor kompleksinin kalıntıları ve etiketlenmiş algılama antikoru ile tespit edilir. Tipik algılama geniş bir spektrum zirveleri 2,3 nedeniyle 10 analitlerle çoklama sınırlayan, bir flüoresan veya renk ölçümsel detektörü ile yapılır. Buna karşılık, Raman-tabanlı sistemler kadar 100 analitlerin 2,3 eşzamanlı algılama iddia kaynaklarla gelişmiş çoğullama yetenekleri ile sonuçlanan daha dar emisyon zirveleri var. Birçok literatür kaynakları IMMUNOASSAYS ilgili önemli yönlerini kapsayacak hangi mevcuttur 4-6 gibi adım-adım olarakAyrıntılar kişiselleştirilmiş ELISA kitleri oluşturun. Ne yazık ki, bu protokoller özelleştirilmiş immun çoklayıcı kapasitesini sınırlayan, flüoresan veya kolorimetrik tespiti içindir. Bu ihtiyacı karşılamak için, biz Şekil 1B gösterildiği gibi doğrudan bir immunoassay için daha önce 7 yayınlanmış UV-Vis / Raman immunoassayin imal etmek detaylı bir prosedür mevcut. Bu protokol, işlevselleştirilmiş altın nanopartikül bazlı prob imalat, Şekil 2&#39;de gösterilen içerir. Altın nano partiküller yüzeyi (AuNPs) için Raman habercilerin bağlanarak başlar Raman / UV-Vis probları yapmak için prosedür. AuNPs daha sonra polietilen glikol (PEG) ile ilişkilendirilmiş antikorlar ile fonksiyonalize edilir. AuNPs üzerinde kalan bağlanma yerleri analizi sırasında daha sonra spesifik olmayan bağlanma bilmek AuNPs metoksi polietilen glikol tiyol (mPEG-SH) bağlanmak suretiyle engellenir. hazırlanan AuNP Probes antijenlere bağlanması ile test edilmiştirŞekil 1B &#39;de gösterildiği gibi bir polistiren plaka oyuklarına sabit. ilişkili Raman habercilerin Raman spektroskopisi ile tespit edilirken plakayı yıkayarak üzerine, AuNP sondaları UV-Vis spektroskopisi kullanılarak tespit edilir. UV-Vis ve Raman spektral verileri birleştiren Bu immünodenemenin yeteneklerini arttırmak, analiz iki yöntem sağlar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1041">
	<tbody>
		<tr height="121">
			<td height="121" style="height:121px;width:405px;">60nm Gold Nanoparticle</td>
			<td style="width:159px;">Ted Pella, Inc.</td>
			<td style="width:153px;">15708-6</td>
			<td style="width:324px;">These are citrate capped gold nanoparticles. Please see Discussion for relationship between Raman reporter and AuNP surface charge and its imporance to proper selection of AuNP and/or Raman reporter.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S233-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Methanol</td>
			<td>Pharmco-Aaper</td>
			<td>339000000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tris Buffered Saline (10X) pH 7.5</td>
			<td>Scy Tek</td>
			<td>TBD999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bottle Top Filtration Unit</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97066-202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tween 20 (polysorbate 20)</td>
			<td>Scy Tek</td>
			<td>TWN500</td>
			<td>Used as an emulsifying agent for washing steps.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phosphate Buffered Saline 10X Concentrate, pH 7.4</td>
			<td>Scy Tek</td>
			<td>PBD999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Protein LoBind Tube 2.0 mL</td>
			<td>Eppendorf Tubes</td>
			<td>22431102</td>
			<td style="width:324px;">LoBind tubes prevent binding of proteins and AuNPs to surfaces of the tubes.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Protein LoBind Tube 0.5 mL</td>
			<td>Eppendorf Tubes</td>
			<td>22431064</td>
			<td style="width:324px;">LoBind tubes prevent binding of proteins and AuNPs to surfaces of the tubes.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microplate Devices UniSeal</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>7704-0001</td>
			<td>Used for sealing and storing functionalized plates.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Assay Plate, With Low Evaporation Lid, 96 Well Flat Bottom</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HPLC grade water</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>270733-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">3,3&#8242;-Diethylthiatricarbocyanine iodide (DTTC)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>381306-250MG</td>
			<td>Raman reporter</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">mPEG-Thiol, MW 5,000 - 1 gram</td>
			<td>Laysan Bio, Inc.</td>
			<td>MPEG-SH-5000-1g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">OPSS-PEG-SVA, MW 5,000 - 1 gram</td>
			<td>Laysan Bio, Inc.</td>
			<td>OPSS-PEG-SVA-5000-1g</td>
			<td style="width:324px;">OPSS-PEG-SVA has an NHS end.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mouse IgG, Whole Molecule Control</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31903</td>
			<td>Antigen</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross Adsorbed Secondary Antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31164</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Human Serum Albumin Blocking Solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A1887-1G</td>
			<td>Bovine serum albumin can be used instead.</td>
		</tr>
		<tr height="160">
			<td height="160" style="height:160px;">In-house built 785nm inverted Raman microscope unit</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:324px;">An inverted Raman microscope is best for proper focusing onto surface of the well plate. Otherwise a very low magnification will be used due to height of the 96-well plate. An in-house built system was used as it was cheaper than buying from a vendor. However, any commercially available inverted Raman microscope system can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mini Centrifuge</td>
			<td>Fisher Schientific</td>
			<td>12-006-900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Nanodrop 2000c</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Synergy 2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Desalting Columns</td>
			<td>Thermor Scientific</td>
			<td>87766</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabricating a uv-vis and raman spectroscopy immunoassay platform

Immünolojik ilişkili antikorların varlığını temel proteinleri tespit etmek için kullanılır. Çünkü araştırma ve klinik ortamlarda onların geniş kullanım, immunoassay aletleri ve malzemelerin büyük altyapı bulunabilir. Örneğin, 96- ve 384-kuyucuklu polistiren plâkalara ticari olarak temin edilebilir ve çeşitli üreticilerden morötesi görünür (UV-Vis) spektroskopisi makineleri için uygun standart bir tasarıma sahiptir. Buna ek olarak, bu tür enzim bağlı immünosorbent deneyleri (ELISA) ve özel bağışıklık tasarımları için immünoglobulinler, tespit etiketleri ve bloke edici maddeler, geniş bir çeşitlilik mevcuttur. mevcut altyapı rağmen, standart ELISA kitleri pahalı ve zaman alıcı olabilir bireyselleştirilmiş immunoassay geliştirme gerektiren, tüm araştırma ihtiyaçlarını karşılamak değildir. genellikle floresan veya col bağlı olarak, örneğin, ELISA kitleri (bir defada birden fazla analitin tespiti) yetenekleri düşük çoklama vartespiti için orimetric yöntemler. Kolorimetrik ve floresan tabanlı analizler, geniş spektral zirveleri nedeniyle çoklama yetenekleri sınırlıdır. Buna karşılık, Raman Spektroskopisi tabanlı yöntemler nedeniyle dar emisyon zirveleri için çoklama için çok daha büyük bir yeteneği var. Raman spektroskopisi bir başka avantajı Raman habercilerin floresan etiketleri 1&#39;den daha az photobleaching tecrübe olmasıdır. Raman habercilerin floresan ve kolorimetrik etiketleri üzerinde sahip olduğu avantajlara rağmen, protokoller Raman tabanlı immünoassaylar sınırlıdır imal. Bu çalışmanın amacı, UV-Vis analizi ve Raman spektroskopisi ile analitlerin doğrudan saptanması için polistiren plakaları ile birlikte kullanmak için fonksiyonalize probları hazırlanması için bir protokol sağlamaktır. Bu protokol, önceden belirlenmiş altyapı üzerinde sermaye ise araştırmacılar gelecekteki çoklu analit tespiti için bir do-it-yourself yaklaşım sağlayacaktır.

Bu çalışmada, 60 nm altın parçacıkları, UV-Vis spektroskopisi kullanıldı. UV-Vis bir açık kaynak spektral analiz yazılımı 8 kullanılarak belirlenir edildi her AuNP konsantrasyonu için 400 700 toplanmıştır nm ve pik alanları absorpsiyon spektrumları. entegrasyon tepe önce toplandı, spektrumları bir üç nokta polinom uygun kullanılarak esas çizgi düzeltmesi yapıldı. Tepe Alanı, Şekil 4&#39;te gösterildiği gibi, bir logaritmik kalibrasyon eğrisi meydana getirme...

Watch this Scientific Journal Video about Fabricating a UV-Vis and Raman Spectroscopy Immunoassay Platform at JoVE.com

Fabricating a UV-Vis and Raman Spectroscopy Immunoassay Platform

Nanoparticle-based optical probes have been designed as a vehicle for detecting antigens using Raman and UV-Vis spectroscopy. Here we describe a protocol for preparing such probes for a UV-Vis/Raman spectroscopy immunoassay in such a way to incorporate future multiplexing capabilities.

Bir UV-Vis ve Raman Spektroskopisi İmmunoassay Platformu imalatı

Immunoassays are used to detect proteins based on the presence of associated antibodies. Because of their extensive use in research and clinical settings, ...

fabricating-a-uv-vis-and-raman-spectroscopy-immunoassay-platform

Research

JoVE Journal

Biochemistry

10.3K Görüntüleme.  Utah State University. Nanoparticle-based optical probes have been designed as a vehicle for detecting antigens using Raman and UV-Vis spectroscopy. Here we describe a protocol for preparing such probes for a UV-Vis/Raman spectroscopy immunoassay in such a way to incorporate future multiplexing capabilities. 

Video: Fabricating a UV-Vis and Raman Spectroscopy Immunoassay Platform

Combining Raman Imaging and Multivariate Analysis to Visualize Lignin, Cellulose, and Hemicellulose in the Plant Cell Wall

The application of Raman imaging to plant biomass is increasing because it can offer spatial and compositional information on aqueous solutions. The analysis does not usually require extensive sample preparation; structural and chemical information can be obtained without labeling. However, each Raman image contains thousands of spectra; this raises difficulties when extracting hidden information, especially for components with similar chemical structures. This work introduces a multivariate analysis to address this issue. The protocol establishes a general method to visualize the main components, including lignin, cellulose, and hemicellulose within the plant cell wall. In this protocol, procedures for sample preparation, spectral acquisition, and data processing are described. It is highly dependent upon operator skill at sample preparation and data analysis. By using this approach, a Raman investigation can be performed by a non-specialist user to acquire high-quality data and meaningful results for plant cell wall analysis.

This protocol aims to present a general method to visualize lignin, cellulose, and hemicellulose in plant cell walls using Raman imaging and multivariate analysis.

Bitki Hücresi Duvarında Lignin, Selüloz ve Hemiselülozu Görselleştirmek için Raman Görüntüleme ve Çok Değişkenli Analizin Birleştirilmesi

The application of Raman imaging to plant biomass is increasing because it can offer spatial and compositional information on aqueous solutions. The ...

Biyokimya

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. Atomic force microscopy (AFM) can address this problem by enabling stretching and relaxation of single protein molecules, which gives direct evidence of specific unfolding and refolding characteristics. AFM-based single-molecule force-spectroscopy (AFM-SMFS) provides a means to consistently measure high-energy conformations in proteins that are not possible in traditional bulk (biochemical) measurements. Although numerous papers were published to show principles of AFM-SMFS, it is not easy to conduct SMFS experiments due to a lack of an exhaustively complete protocol. In this study, we briefly illustrate the principles of AFM and extensively detail the protocols, procedures, and data analysis as a guideline to achieve good results from SMFS experiments. We demonstrate representative SMFS results of single protein mechanical unfolding measurements and we provide troubleshooting strategies for some commonly encountered problems.

We describe the detailed procedures and strategies to measure the mechanical properties and mechanical unfolding pathways of single protein molecules using an atomic force microscope. We also show representative results as a reference for selection and justification of good single protein molecule recordings.

Kuvvet spektroskopisi bir Atomik kuvvet mikroskobu kullanılarak tek Protein moleküllerinin

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Multiplexed Isothermal Amplification Based Diagnostic Platform to Detect Zika, Chikungunya, and Dengue 1

Zika, dengue, and chikungunya viruses are transmitted by mosquitoes, causing diseases with similar patient symptoms. However, they have different downstream patient-to-patient transmission potentials, and require very different patient treatments. Thus, recent Zika outbreaks make it urgent to develop tools that rapidly discriminate these viruses in patients and trapped mosquitoes, to select the correct patient treatment, and to understand and manage their epidemiology in real time.
Unfortunately, current diagnostic tests, including those receiving 2016 emergency use authorizations and fast-track status, detect viral RNA by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), which requires instrumentation, trained users, and considerable sample preparation. Thus, they must be sent to &#34;approved&#34; reference laboratories, requiring time. Indeed, in August 2016, the Center for Disease Control (CDC) was asking pregnant women who had been bitten by a mosquito and developed a Zika-indicating rash to wait an unacceptable 2 to 4 weeks before learning whether they were infected. We very much need tests that can be done on site, with few resources, and by trained but not necessarily licensed personnel.
This video demonstrates an assay that meets these specifications, working with urine or serum (for patients) or crushed mosquito carcasses (for environmental surveillance), all without much sample preparation. Mosquito carcasses are captured on paper carrying quaternary ammonium groups (Q-paper) followed by ammonia treatment to manage biohazards. These are then directly, without RNA isolation, put into assay tubes containing freeze-dried reagents that need no chain of refrigeration. A modified form of reverse transcription loop-mediated isothermal amplification with target-specific fluorescently tagged displaceable probes produces readout, in 30 min, as a three-color fluorescence signal. This is visualized with a handheld, battery-powered device with an orange filter. Forward contamination is prevented with sealed tubes, and the use of thermolabile uracil DNA glycosylase (UDG) in the presence of dUTP in the amplification mixture.

Current multiplexed diagnostics to detect Zika, chikungunya, and dengue viruses require complex sample preparation and expensive instrumentation, and are difficult to use in low resource environments. We show a diagnostic that uses isothermal amplification with target-specific strand displaceable probes to detect and differentiate these viruses with high sensitivity and specificity.

Çoğaltılmış izotermal amplifikasyon Zika, Chikungunya ve dang 1 tespit etmek için teşhis platformu dayalı

Zika, dengue, and chikungunya viruses are transmitted by mosquitoes, causing diseases with similar patient symptoms. However, they have different ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring cells. Of interest, only few assays are capable of specifically probing such interactions directly in living cells. Here, we present an assay to measure the binding of proteins expressed at the surfaces of neighboring cells, at cell-cell contacts. This assay consists of two steps: mixing of cells expressing the proteins of interest fused to different fluorescent proteins, followed by fluorescence fluctuation spectroscopy measurements at cell-cell contacts using a confocal laser scanning microscope. We demonstrate the feasibility of this assay in a biologically relevant context by measuring the interactions of the amyloid precursor-like protein 1 (APLP1) across cell-cell junctions. We provide detailed protocols on the data acquisition using fluorescence-based techniques (scanning fluorescence cross-correlation spectroscopy, cross-correlation number and brightness analysis) and the required instrument calibrations. Further, we discuss critical steps in the data analysis and how to identify and correct external, spurious signal variations, such as those due to photobleaching or cell movement.
In general, the presented assay is applicable to any homo- or heterotypic protein-protein interaction at cell-cell contacts, between cells of the same or different types and can be implemented on a commercial confocal laser scanning microscope. An important requirement is the stability of the system, which needs to be sufficient to probe diffusive dynamics of the proteins of interest over several minutes.

This protocol describes a fluorescence fluctuation spectroscopy-based approach to investigate interactions among proteins mediating cell-cell interactions, i.e. proteins localized in cell junctions, directly in living cells. We provide detailed guidelines on instrument calibration, data acquisition and analysis, including corrections to possible artefact sources.

Bir floresan dalgalanma spektroskopisi tahlil Protein-Protein etkileşimlerinin hücre-hücre kişiler

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

A Rat Methyl-Seq Platform to Identify Epigenetic Changes Associated with Stress Exposure

As genomes of a wider variety of animals become available, there is an increasing need for tools that can capture dynamic epigenetic changes in these animal models. The rat is one particular model animal where an epigenetic tool can complement many pharmacological and behavioral studies to provide insightful mechanistic information. To this end, we adapted the SureSelect Target Capture System (referred to as Methyl-Seq) for the rat, which can assess DNA methylation levels across the rat genome. The rat design targeted promoters, CpG islands, island shores, and GC-rich regions from all RefSeq genes. 
To implement the platform on a rat experiment, male Sprague Dawley rats were exposed to chronic variable stress for 3 weeks, after which blood samples were collected for genomic DNA extraction. Methyl-Seq libraries were constructed from the rat DNA samples by shearing, adapter ligation, target enrichment, bisulfite conversion, and multiplexing. Libraries were sequenced on a next-generation sequencing platform and the sequenced reads were analyzed to identify DMRs between DNA of stressed and unstressed rats. Top candidate DMRs were independently validated by bisulfite pyrosequencing to confirm the robustness of the platform.
Results demonstrate that the rat Methyl-Seq platform is a useful epigenetic tool that can capture methylation changes induced by exposure to stress.

Here, we describe the protocol and implementation of Methyl-Seq, an epigenomic platform, using a rat model to identify epigenetic changes associated with chronic stress exposure. Results demonstrate that the rat Methyl-Seq platform is capable of detecting methylation differences that arise from stress exposure in rats.

Stres pozlama ile ilişkili epigenetik değişiklikleri tanımlamak için bir fare metil-Seq Platform

As genomes of a wider variety of animals become available, there is an increasing need for tools that can capture dynamic epigenetic changes in these ...

Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, they are important drug targets. We have developed a magnetic-agarose-bead-based assay platform for the investigation of proteolytic activity, which is based on the use of recombinant fusion protein substrates. In order to demonstrate the use of this assay system, a protocol is presented on the example of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) protease. The introduced assay platform can be utilized efficiently in the biochemical characterization of proteases, including enzyme activity measurements in mutagenesis, kinetic, inhibition, or specificity studies, and it may be suitable for high-throughput substrate screening or may be adapted to other proteolytic enzymes.
In this assay system, the applied substrates contain N-terminal hexahistidine (His6) and maltose-binding protein (MBP) tags, cleavage sites for tobacco etch virus (TEV) and HIV-1 proteases, and a C-terminal fluorescent protein. The substrates can be efficiently produced in Escherichia coli cells and easily purified using nickel (Ni)-chelate-coated beads. During the assay, the proteolytic cleavage of bead-attached substrates leads to the release of fluorescent cleavage fragments, which can be measured by fluorimetry. Additionally, cleavage reactions can be analyzed by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). A protocol for the in-gel renaturation of assay components is also described, as partial renaturation of fluorescent proteins enables their detection based on molecular weight and fluorescence.

Here, we present the detailed procedure of a recently developed protease assay platform utilizing N-terminal hexahistidine/maltose-binding protein and fluorescent protein-fused recombinant substrates attached to the surface of nickel-nitrilotriacetic acid magnetic agarose beads. A subsequent in-gel analysis of the assay samples separated by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis is also presented.

Rekombinant füzyon protein flüoresan proteaz tahlil Platform ve onların jel Renaturation kullanımı

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, ...

Measuring Interactions between Fluorescent Probes and Lignin in Plant Sections by sFLIM Based on Native Autofluorescence

In lignocellulosic biomass (LB), the activity of enzymes is limited by the appearance of non-specific interactions with lignin during the hydrolysis process, which maintains enzymes far from their substrate. Characterization of these complex interactions is thus a challenge in complex substrates such as LB. The method here measures molecular interactions between fluorophore-tagged molecules and native autofluorescent lignin, to be revealed by F&#246;rster resonance energy transfer (FRET). Contrary to FRET measurements in living cells using two exogenous fluorophores, FRET measurements in plants using lignin is not trivial due to its complex autofluorescence. We have developed an original acquisition and analysis pipeline with correlated observation of two complementary properties of fluorescence: fluorescence emission and lifetime. sFLIM (spectral and fluorescent lifetime imaging microscopy) provides the quantification of these interactions with high sensitivity, revealing different interaction levels between biomolecules and lignin.

This protocol describes an original setup combining spectral and fluorescence lifetime measurements to evaluate F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) between rhodamine-based fluorescent probes and lignin polymer directly in thick plant sections.

Floresan Problar ve Lignin Bitki Kesitlerinde Doğal Otofloresan Dayalı SFLIM Ile Etkileşimlerinin Ölçülmesi

In lignocellulosic biomass (LB), the activity of enzymes is limited by the appearance of non-specific interactions with lignin during the hydrolysis ...

An Integrated Raman Spectroscopy and Mass Spectrometry Platform to Study Single-Cell Drug Uptake, Metabolism, and Effects

Cells are known to be inherently heterogeneous in their responses to drugs. Therefore, it is essential that single-cell heterogeneity is accounted for in drug discovery studies. This can be achieved by accurately measuring the plethora of cellular interactions between a cell and drug at the single-cell level (i.e., drug uptake, metabolism, and effect). This paper describes a single-cell Raman spectroscopy and mass spectrometry (MS) platform to monitor metabolic changes of cells in response to drugs. Using this platform, metabolic changes in response to the drug can be measured by Raman spectroscopy, while the drug and its metabolite can be quantified using mass spectrometry in the same cell. The results suggest that it is possible to access information about drug uptake, metabolism, and response at a single-cell level.

This protocol presents an integrated Raman spectroscopy-mass spectrometry (MS) platform that is capable of achieving single-cell resolution. Raman spectroscopy can be used to study cellular response to drugs, while MS can be used for targeted and quantitative analysis of drug uptake and metabolism.

Tek Hücreli İlaç Alımı, Metabolizması ve Etkileri Üzerine Entegre Raman Spektroskopisi ve Kütle Spektrometresi Platformu

Cells are known to be inherently heterogeneous in their responses to drugs. Therefore, it is essential that single-cell heterogeneity is accounted for in ...

A Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry (HDX-MS) Platform for Investigating Peptide Biosynthetic Enzymes

Hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry (HDX-MS) is a powerful method for the biophysical characterization of enzyme conformational changes and enzyme-substrate interactions. Among its many benefits, HDX-MS consumes only small amounts of material, can be performed under near native conditions without the need for enzyme/substrate labeling, and can provide spatially resolved information on enzyme conformational dynamics&#8722;even for large enzymes and multiprotein complexes. The method is initiated by the dilution of the enzyme of interest into buffer prepared in D2O. This triggers the exchange of protium in peptide bond amides (N-H) with deuterium (N-D). At the desired exchange time points, reaction aliquots are quenched, the enzyme is proteolyzed into peptides, the peptides are separated by ultra-performance liquid chromatography (UPLC), and the change in mass of each peptide (due to the exchange of hydrogen for deuterium) is recorded by MS. The amount of deuterium uptake by each peptide is strongly dependent on the local hydrogen bonding environment of that peptide. Peptides present in very dynamic regions of the enzyme exchange deuterium very rapidly, whereas peptides derived from well-ordered regions undergo exchange much more slowly. In this manner, the HDX rate reports on local enzyme conformational dynamics. Perturbations to deuterium uptake levels in the presence of different ligands can then be used to map ligand binding sites, identify allosteric networks, and to understand the role of conformational dynamics in enzyme function. Here, we illustrate how we have used HDX-MS to better understand the biosynthesis of a type of peptide natural products called lanthipeptides. Lanthipeptides are genetically encoded peptides that are post-translationally modified by large, multifunctional, conformationally dynamic enzymes that are difficult to study with traditional structural biology approaches. HDX-MS provides an ideal and adaptable platform for investigating the mechanistic properties of these types of enzymes.

A Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry HDX-MS Platform for Investigating Peptide Biosynthetic Enzymes

Lanthipeptide synthetases catalyze multistep reactions during the biosynthesis of peptide natural products. Here, we describe a continuous, bottom-up, hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry (HDX-MS) workflow that can be employed to study the conformational dynamics of lanthipeptide synthetases, as well as other similar enzymes involved in peptide natural product biosynthesis.

Peptit Biyosintetik Enzimleri Araştırmak için Hidrojen-Döteryum Değişim Kütle Spektrometresi (HDX-MS) Platformu

Hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry (HDX-MS) is a powerful method for the biophysical characterization of enzyme conformational changes and ...

Spectrophotometric Screening for Potential Inhibitors of Cytosolic Glutathione S-Transferases

Glutathione S-transferases (GSTs) are metabolic enzymes responsible for the elimination of endogenous or exogenous electrophilic compounds by glutathione (GSH) conjugation. In addition, GSTs are regulators of mitogen-activated protein kinases (MAPKs) involved in apoptotic pathways. Overexpression of GSTs is correlated with decreased therapeutic efficacy among patients undergoing chemotherapy with electrophilic alkylating agents. Using GST inhibitors may be a potential solution to reverse this tendency and augment treatment potency. Achieving this goal requires the discovery of such compounds, with an accurate, quick, and easy enzyme assay. A spectrophotometric protocol using 1-chloro-2,4-dinitrobenzene (CDNB) as the substrate is the most employed method in the literature. However, already described GST inhibition experiments do not provide a protocol detailing each stage of an optimal inhibition assay, such as the measurement of the Michaelis-Menten constant (Km) for CDNB or indication of the employed enzyme concentration, crucial parameters to assess the inhibition potency of a tested compound. Hence, with this protocol, we describe each step of an optimized spectrophotometric GST enzyme assay, to screen libraries of potential inhibitors. We explain the calculation of both the half-maximal inhibitory concentration (IC50) and the constant of inhibition (Ki)&#8212;two characteristics used to measure the potency of an enzyme inhibitor. The method described can be implemented using a pool of GSTs extracted from cells or pure recombinant human GSTs, namely GST alpha 1 (GSTA1), GST mu 1 (GSTM1) or GST pi 1 (GSTP1). However, this protocol cannot be applied to GST theta 1 (GSTT1), as CDNB is not a substrate for this isoform. This method was used to test the inhibition potency of curcumin using GSTs from equine liver. Curcumin is a molecule exhibiting anti-cancer properties and showed affinity towards GST isoforms after in silico docking predictions. We demonstrated that curcumin is a potent competitive GST inhibitor, with an IC50 of 31.6 &#177; 3.6 &#181;M and a Ki of 23.2 &#177; 3.2 &#181;M. Curcumin has potential to be combined with electrophilic chemotherapy medication to improve its efficacy.

Glutathione S-transferases (GSTs) are detoxification enzymes involved in the metabolism of numerous chemotherapeutic drugs. Overexpression of GSTs is correlated with cancer chemotherapy resistance. One way to counter this phenotype is to use inhibitors. This protocol describes a method using a spectrophotometric assay to screen for potential GST inhibitors.

Sitosolion Glutatyon S-Transferazlarının Potansiyel Inhibitörleri için Spektrofotometrik Tarama

Glutathione S-transferases (GSTs) are metabolic enzymes responsible for the elimination of endogenous or exogenous electrophilic compounds by glutathione ...