Protetezler, akademik ve endüstriyel araştırmalarda en çok araştırılan biyomoleküler destek gruplarından biridir. Çeşitli fizyolojik ve patolojik süreçlerdeki güçlü rolleri onları uyuşturucu keşfi alanında da önemli bir hedef haline getirmektedir. Onların yoğun araştırma ile ilgili olarak, zaman ve maliyet tasarrufu yüksek iş bölümü tarama uyumlu floresan proteaz araştırma platformlarının geliştirilmesi için büyük ve sürekli bir talep vardır.
Burada, hem mTurquoise2 hem de mApple-erimiş rekombinant füzyon proteaz yüzeyleri kullanarak ayırma tabanlı yüksek iş letme tarama uyumlu floresan test platformunun uygulanması için bir protokol sunmak istiyoruz. Ayrıca, SDS-PAGE'i denadikten sonra substratların jel içi renatürasyonu ve test örneklerinin dekolte parçaları için bir yöntem göstermek istiyoruz. Tüm deneyler HIV-1 virüs proteaz örneği üzerinde yapılır.
Plazmid ifadesi, heksa histedin afinite etiketi ve maltoz bağlayıcı füzyon proteininin kodlama sırasını ve ardından tütün etch virüs proteazı, klonlama kaseti ve C-terminal floresan proteinini kontrol eder. PacI ve NheI restriksiyon endonükleazları ile plazmid ifadesini doğrusallaştırın. Escherichia coli codon optimize ileri ve ters oligonükleotid astarlar bu ilgi ve pakt PacI ve NheI uyumlu biter tarafından alt tabaka dizisi için kod annealing gerçekleştirin.
Ligasyon ile doğrusallaştırılmış ekspresyon plazmidiçine annealize astar ların eklenmesini gerçekleştirin. Protein ekspresyonu için BL21(DE3) çözünür hücreleri ligasyon karışımıile dönüştürün. Floresan proteinler n-terminal füzyon etiketleri ile aynı açık okuma çerçevesi içinde olacak sadece başarılı bir ligasyon sonra.
Dönüşümden birkaç gün sonra, eklenen dekolte alanını kodlayan plazmid ifadesini içeren koloniler, Lacivert Transilluminator ile hatta görünür floresan gösterecektir. BL21 (DE3) hücrelerinin 10 mikrolitre gliserol stok ekleyin 50 mililitre centrifuge tüp mililitre ampisilin başına 100 mikrogram içeren beş mililitre LB orta ilgi bölünme site dizisi için ifade plazmid kodlama taşıyan. Sürekli sallayarak 15 saat boyunca 37 derece süspansiyon kuluçka.
Mililitre ampisilin başına 100 mikrogram içeren 50 mililitre taze LB ortamına beş mililitre bakteri kültürü aktarın. Hücreleri 37 derecede, 600 nanometre dalga boyunda 0,6 ila 0,8'lik bir absorbansa kadar büyütün. Bu noktada, IPTG ilavesi ile protein ekspresyonunu indükleyin.
Bundan sonra, sürekli sallayarak 37 derece üç saat boyunca kültür kuluçka. Kuluçkadan sonra, kültürün 25 mililitresini temiz 50 mililitrelik santrifüj tüplere aktarın ve hücreleri santrifüj le hasat edin. Supernatant atın ve en az bir saat için eksi 70 derece bakteri hücre pelet saklayın.
Başarılı bir şekilde ifade edilen floresan proteinleri içeren hücre peletleri, Koyu Okuyucu mavi transilluminator kullanmadan bile floresan olduğunu açıkça gösterir. Buz üzerinde dondurulmuş hücre pelet yerleştirin ve 15 dakika boyunca çözülmeye bırakın. Pelet iki mililitre lysis tampon ekleyin ve hücreleri askıya.
Bundan sonra, proteaz inhibitörü ekleyin, lyzozyme ve DNase ile süspansiyon ücretsiz, hücreleri askıya, ve 15 dakika boyunca buz üzerinde süspansiyon kuluçka. 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpleriçine iki kez bir mililitre süspansiyon aktarın ve sonication 10 saniye ve beş saniye mola turlarında üç dakika boyunca süspansiyonlar sonicate. Tüpleri 10,000 g'de oda sıcaklığında 20 dakika santrifüj edin.
Floresan substrat içeren temizlenmiş bakteri hücresi lizatesi, Koyu Okuyucu mavi transilluminator ile hatta görünür floresan gösterir. Geliştirilen proteaz test prosedürü, test numunelerinin hazırlanması ile başlar. İlk olarak, rekombinant substratlar yakınlık manyetik boncuklar ile kuluçkaya yatırılır ve samb solarak kısaltılmış substrat bağlı manyetik boncuklar oluşur.
SAMB'ler birkaç kez yıkanır ve son olarak SAMB stok çözeltisi, test numunelerinin oluşturulduğu aliquoting tarafından hazırlanır. Reaksiyonlar proteaz çözeltisinin eklenmesiyle başlatEdilir. Proteaz tarafından dekolte üzerine, proteolitik parçalar supernatant içine serbest bırakılır.
Reaksiyon, manyetik boncukların floresan dekolte ürünleri ve enzim içeren reaksiyon tamponundan ayrılması yla sonlandırılır. Süpernatanlar mikrotiter plakanın kuyularına uygulanır ve floresan florimetri ile belirlenir. Kalibrasyon eğrileri, her bir ispat arabelleklerinde çözülmüş saflaştırılmış floresan yüzeyler kullanılarak oluşturulur.
C-terminal floresan dekolte ürünlerinin ve ayrıca test numunelerinde uygulanan substratın konsantrasyonu kalibrasyon eğrilerinin eğimine göre belirlenir. Yeni veya geri dönüştürülmüş nikel-NPA manyetik agarose boncukiçeren tüpü manyetik parçacık konsantratörüne yerleştirin. Boncuklar duvara ve/veya mikrosantrifüj tüpünün kapağına yapışabilir.
Bu nedenle, tüm boncuklar toplanır emin olmak için her yönde konsantratörü ters çevirin. Supernatant çıkarın ve atın. Boncuklara 1,8 mililitre likis tampon u ekleyin ve kapalı tüpleri konsantratörüçıkarın.
Boncuklar tamamen homojen olana kadar tüpü sallayarak ve/veya ters çevirerek tüpteki boncukları askıya alın. Tüpleri konsantratörün içine geri yerleştirin ve tüm boncukların toplandıklarından emin olmak için her yöne ters çevirin. Tüpü açın ve supernatant atın.
İlgi nin alt tabakasını içeren temizlenmiş bakteri-steril lysate ekleyin ve kapalı tüpü konsantratörden çıkarın. Boncuklar tamamen homojen olana kadar tüpleri ters çevirin ve tüpleri 30 dakika oda sıcaklığında yavaşça rotator ile döndürün. SAMB'ler, Koyu Okuyucu mavi transilluminator ile görünür floresan gösterir.
SAMB'leri üç kez 1,8 mililitre 1%20, yıkama tamponu ve dekolte tamponu ile yıkayın. SamB stok çözümü oluşturmak için yıkanmış SAMB'lere dekolte arabelleği ekleyin. İki mililitrelik protein-düşük bağlayıcı mikrosantrifüj tüpler ikullanıyorsanız, uygulanan dekolte tamponhacmi kadar 1.9 mililitre.
Tampon ilaveden sonra tüpü ters yüz etmeyin veya ters çevirmeyin. Tüpü kapatın ve konsantratöründen çıkarın. Test numuneleri için iki mililitrelik protein-düşük bağlayıcı mikrosantrifüj tüpleri hazırlayın.
TAMAMEN homojen olana kadar SAMB stok çözeltisini askıya alın ve SAMB stok çözeltisini numune şişelerine hemen aktararak reaksiyonlarda analiz edilecek substrat miktarını ölçün. Aktarılacak SAMB stok çözeltisinin hacminin 25 ila 300 mikrolitre olması tavsiye edilir, ancak bireysel deneysel tasarıma göre ayarlanmalıdır. Aliquoted SAMB süspansiyonları içeren örnek tüpleri konsantratöre yerleştirin.
Supernatant'ı SAMB'lerden dikkatlice çıkarın ve atın. Tüpleri konsantratörü çıkarın ve sambs için reaksiyon tampon dikkatle ekleyin. Eklenen reaksiyon tamponhacmi bireysel deneysel tasarıma göre hesaplanacak, ancak iki mililitrelik tüpler kullanılırsa 50 ve 150 mikrolitre arasında reaksiyon karışımıson hacmi ayarlamak için tavsiye edilir.
Tüplerin kapaklarını kapatın. Şimdi, örnekler baş harfe batılmaya hazır. Reaksiyon örneklerine enzim çözeltisi ekleyin.
Tüpleri hafifçe hareket ettirerek boncukları dikkatlice karıştırın ve tüpleri hemen sallayarak zaten sallanan termshaker'a yerleştirin. Substrat boş örnekleri ve substrat kontrol örnekleri durumunda, sırasıyla dekolte tampon ve elüsyon tampon ekleyin. Kuluçka süresinin bitiminden 30 saniye önce, numuneyi termoshaker'dan alın ve hemen döndürün.
Tüpü konsantratörün üzerine yerleştirin ve tüpün 15 saniye bekletin. SAMB'lerin toplanması, konsantratörü nitrecinin ileri geri hafifçe hareket ettirilmesiyle kolaylaştırılabilir. Kapağı açın ve supernatant dikkatle bir tabak veya yeni bir tüp içine aktarın.
Konsantre boncuklar pipetin ucuna dokunmayın. Substrat kontrol örneklerinin toplanmış süpernatantı ve yüksek derecede dekolteye sahip reaksiyon örnekleri, Koyu Okuyucu mavi transilluminator ile veya hatta olmadan görünür floresan gösterebilir. Ayrılmış numune süpernatantlarının iki katı 30 mikrolitresini siyah yarım alanmikroplakasına aktarın.
Uygulanan floresan proteine göre uygun filtreleri kullanarak floresanölçer ile ölçün. Floresan yüzeylerin arınması için, daha önce açıklandığı gibi aynı çözümü hazırlayın ve supernatant atın. SAMB'lere 400 ila 600 mikrolitre elüsyon tamponu ekleyin ve tüpleri oda sıcaklığında beş dakika döndürülerek yavaşça döndürün.
Eluat yeni protein-düşük bağlayıcı mikrosantrifüj tüpler içine transfer. Koyu Okuyucu mavi transilluminator ile veya kullanmadan açıkça görülebilir floresan gösterir. Arınma, tampon değişimi ve protein içeriğinin ölçümünden sonra, seyreltme için sırasıyla elüsyon veya dekolte tamponu kullanarak, hem elüsasyon-tampon-hem de dekolte-tampon-çözülmüş substrat çözeltilerinden olmak üzere en az sekiz adımda iki aşamalı seri seyreltme hazırlayın.
Her seyreltme noktasının 30 mikrolitresini siyah bir yarım alan mikroplakasına aktarın. Test numunesi süpernatantlarının ölçümünde uygulanan ayarları kullanarak floresanölçerile ölçün. Veri işlemeye örnek olarak, HIV-1 proteazın substrat bağımlı kinetik ölçümleri, doğal boşluklu protein öncülündeki dekolte ve kapsid proteinleri arasındaki dekolte bölgesini kodlayan rekombinant substratın mTurquoise2-erimiş formunda gerçekleştirildi.
Düzeltilmiş göreli floresan yoğunluk değerlerini saflaştırılmış yüzeylerin molar konsantrasyonuna göre çizin, bölünme veya elüsiyon tamponunu çözün ve doğrusal regresyon gerçekleştirin. Dekolte-tampon tabanlı kalibrasyon eğrisinin eğimini kullanarak reaksiyon numunelerinde C-terminal dekolte ürünlerinin molar konsantrasyonu hesaplayın. Ayrıca, elütion-tampon esaslı kalibrasyon eğrisinin eğimini kullanarak substrat kontrol numunelerinde eluted substrat molar konsantrasyonu dayalı reaksiyon örneklerinde uygulanan substrat konsantrasyonu hesaplamak.
İlk hız değerleri C-terminal bölünme parçalarının miktarından hesaplandı ktan sonra uygulanan substrat konsantrasyonuna karşı çizildi. Ayrıca kinetik parametreler Michaelis-Menten doğrusal olmayan regresyon analizi ile belirlendi. Nikel-NTA manyetik boncuk bazlı test yaptıktan sonra, test süpernatantları poliakrilamid jel elektroforez ilerler.
Ancak, tahlil numunelerinin analizinin yanı sıra, çözelti içi sindirim sonrası saflaştırılmış floresan yüzeyleri ve/veya dekolte parçalarını analiz etmek de mümkündür. Çözelti içi sindirim için, 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpleriçine dekolte tamponunda çözünmüş olarak sindirilecek saflaştırılmış floresan yüzeyleri aliquote ve numunelere enzim çözeltisi ekleyin. Numuneleri deneysel tasarıma göre kuluçkaya yatırın ve PAGE için numune hazırlama prosedürü ile reaksiyonları sonlandırın.
Nondenatured numune hazırlama için, hiçbir indirgeyici maddeler içeren nondenaturing numune yükleme tamponu ile analiz edilecek numuneleri karıştırın. Denatüre numune hazırlama durumunda, analiz edilecek numuneleri numune yükleme tamponu ile karıştırın ve numuneleri 10 dakika boyunca 95 derecede ısıl işlem le tarar. Denatüre olmayan ve denatüre edilmiş numuneleri SDS-poliakrilamid jelin kuyularına uygulayın ve elektroforez uygulayın.
Jel kaseti çalışan modülden çıkarın. Denatüre olmayan örnekler jelde çıplak gözle veya Lacivert Transilluminator ile bile görülebilir. Transilluminator üzerinde denatüre numunelerin floresan bileşenlerini tespit etmek için, Jel'den SDS'yi yıkayarak jel içi renatürasyonu gerçekleştirin.
Jel için 100 mililitre distile su ekleyin ve en az 30 dakika durulayın. Lekesiz jeli Lacivert Transilluminator'a yerleştirerek floresan proteinleri görselleştirin. Rekombinant floresan füzyon proteinleri proteolitik tahlillerde substrat olarak kullanılmak üzere tasarlandı.
Spesifik dekolte yerindeki proteaz ile bölünme üzerine C-terminal floresan dekolte parçası serbest bırakılır ve floresan saptanır. Nikel-NTA manyetik boncuk bazlı tahlil ve PAGE analizi ile floresan tespiti kullanımı HIV-1 proteaz kullanılarak optimize edilmiştir. Ancak, gelişmiş asay platformu diğer proteteses için de uygun olabilir.
Dekolte veya elüsyon tamponu nda çözülen saflaştırılmış substratların kalibrasyon eğrileri, doğal HIV anekoik proteininin kapsid proteinleri ile matriks arasındaki dekolte tarafını kodlayan rekombinant substratların hem mTurquoise2 hem de mEYFP-erimiş formu örneklerinde gösterilmiştir. Nikel-NTA manyetik boncuk bazlı test, substrat konsantrasyonunun reaksiyon hızı üzerindeki etkisini incelemek için yararlı bir araçtır ve bu nedenle Vmax ve Km gibi enzim kinetik parametrelerinin belirlenmesini mümkün kılar. Diyagram A, mApple'da erimiş bir substrat üzerinde substrata bağımlı etkinliğin başarıyla gerçekleştirildiği analizden sonra elde edilen en uygun sonucu gösterir.
Buna karşılık, B diyagramı, SAMB stok çözeltisinin yetersiz homojenizasyonunun uygun substrat konsantrasyonlarının ayarlanmasında sorunlara yol açtığı, reaksiyon örneklerinin yanlış sonlandırılmasının ise nispeten yüksek hatalara yol açtığı bir alt-optimal sonuç sunar. Teşp aynı zamanda zaman-ders ve inhibitör çalışmalar yapmak için de uygun bir araç sağlar. Diyagram A, HIV-1 proteolitik dekoltesinin mEYFP-erimiş substrat üzerindeki zaman adabının zamana bağımlılığını gösterirken, B diyagramı amprenavir'in dekolte reaksiyonu üzerindeki inhibitör etkisini temsil eder.
İnhibitör çalışması ile elde edilen verilerden hem aktif enzim konsantrasyonu hem de inhibitör sabiti belirlenebilir. Tütün etch virüs proteaz örneğinde diyagram A ile temsil edildiği gibi, tsay da pH enzim aktivitesinin bağımlılığı nı incelemek için optimize edilebilir. Diyagram B, pH ile yapılan bir töz sınırlamasını gösterir ve nötr veya hafif alkali pH'ın ölçümlerle tam uyumlu olduğunu gösterirken, asidik pH manyetik boncukların yüzeyinden substratların spontan ayrıştırılmasını kolaylaştırır.
Bu rakam saflaşmış bozulmamış floresan yüzeyleri gösterir, floresan C-terminal bölünme parçaları, HIV-1 proteaz tarafından çözelti içinde sindirim tarafından oluşturulan. Floresan komponentler, numune hazırlama sırasında denatüre olmayan koşullar uygulandığı takdirde elektroforezden hemen sonra mavi ışık transillumination ile SDS içeren poliakrilamid jelde tespit edilebilir. Farklı floresan proteinler renklerine göre ayırt edilebilir.
Manyetik boncuk bazlı testten sonra, örnek süpernatantlarda denatüre olmayan floresan proteinler uv aydınlatma sı tarafından jel de tespit edilebilir. Buna karşılık, numune hazırlama sırasında denatüre koşulları uygulanırsa, denatüre proteinler SDS PAGE'den hemen sonra jelde tespit edilemez. Ancak, denatüre floresan proteinler kısmen jel SDS kaldırılması ile renatured olabilir ve tespit edilebilir hale.
Bu nedenle, SDS PAGE in-gel renaturation prosedürü tarafından takip edilir. Floresan proteinlerin renatürasyon yeteneği, sadece floresanlarına değil, aynı zamanda moleküler ağırlıklarına da bağlı olarak tanımlanmasını mümkün kılar. Burada, yakın zamanda geliştirilen manyetik boncuk bazlı floresan proteaz test platformunun kullanımına yönelik protokolü gösterdik.
Bu sistemin HIV-1 proteaz enzim kinetik çalışmaları örneğinde kullanıldığını gösterdik. Biz proteaz dekolte site dizisi içeren rekombinant test substrat, mTurquoise ve mApple-erimiş formları kullanılır. Florimetrik analizin yanı sıra tahlil örnekleri daha sonra SDS PAGE tarafından da analiz edildi.
Denatüre floresan proteinlerin, substrat ve proteolitik parçaların hem floresan hem de molekül ağırlıklı olarak tanımlanmasını sağlayan SDS PAGE'den sonra jelde kısmen yenilenebilen bir protein olduğunu gösterdik.
