This work was supported by an Alfred P. Sloan Research Fellowship (to C.-F.C.) and an NIH R01 grant (5R01GM098026-05 to C.-F.C.). We thank David Crowe for access to the advanced infrared imaging system.

Not: fosforla etiketlenmiş DNA sondaları veya işaretlenmiş DNA diğer formları kullanarak EMSA protein ya da hücre özü hazırlanması, protein-DNA bağlanma reaksiyonu ve PAGE jel hazırlanmasında ve yürütülmesinde (Şekil 1A) için aynı protokol paylaşır. önemli farklılıklar DNA etiketleme prosedürleri, post-run jel işleme aşamaları ve algılama yöntemleridir. 1. Jel Hazırlanması <ol><li> mini protein jel sistemi (8.3 cm genişlik x 7.3 cm uzunluk x 0.75 mm kalınlık) kullanılarak, 0.5x TBE (45 mM Tris-Borate, 1mM EDTA) ve% 2.5 gliserol içeren% 5 yerli poliakrilamid jel hazırlayın. <ol><li> Akrilamid / Bis 4 jeller için jel çözeltisi, 30 mL hazırlanması% 30 5 mL karıştırın (37.5: 1), 3 5x TBE (0.45 M Tris-borat, 10 mM EDTA),% 50, 1.5 mL gliserol mL, % 10 amonyum persülfat 300 uL, TEMED 15 uL ve iyice GKD 2 O 20.2 mi. NOT: Akrilamid zararlı ve toksik uygun kişisel koruyucu ekipman ile anlaştım. </li&gt; </ol></li><li> hemen jel çözümü Cast. Polimerizasyon sonra, şeffaf plastik wrap 0.5x TBE önceden ıslatılmış jeller sarın ve 4 ° C&#39;de saklayın. </li></ol> Kızılötesi floresan boya işaretli problar 2. hazırlanması Not: hazırlama, depolama, ve deneyler sırasında uzak mümkün olduğu kadar hafif kızılötesi fluoresan boya etiketli oligonükleotidler tutun. <ol><li> Tasarım ve sipariş oligonükleotidler. <ol><li> ~ 51-mers uzun oligonükleotidi tasarlayın. Not: LIM-4 / SOX-2 sonda uzun oligonükleotid dizisi TATCATATCTATTCTA TGATTA AATACC TATTCA TTTCAAAATCTTCTCCC olup. Uzun oligonükleotidler SAYFA veya HPLC saflaştırma gerekmez. </li><li> 5 &#39;ucunda (5&#39;Dye) ve 37 ° C&#39;nin üzerinde bir erime sıcaklığı, kızılötesi floresan boya modifikasyonuna ~ 14-mer tamamlayıcı kısa oligonükleotidlerin tasarımlanması. NOT: Kısa oligonükleotid dizisi LIM-4 / SOX-2 prob 5&#39;Dye-GGGAGAAGATTTTG olduğunu. 5&#39;Dye etiketli Kısa oligonükleotitlerin asgari sentezi ölçeği 100 nM&#39;dir. Bu nedenle, oligonükleotidler, HPLC saflaştırma gerektirir. </li></ol></li><li> 100 uM nihai konsantrasyona kadar; (1 mM EDTA, 10 mM Tris-HCI, pH 8.0 TE) 1x Tris-EDTA tampon maddesi içinde yeniden süspanse oligonükleotitler. </li><li> Tavlama Kısa (5&#39;Dye) ve Uzun oligonükleotidler. <ol><li> 0.6 5&#39;Dye-Kısa bir oligo (100 uM) uL, uzun oligo (100 uM), 1.2 ul, sodyum 28.2 uL klorür-tris-EDTA tampon maddesi (karıştırın STE: 100 mM NaCI, 10 mM Tris-HCI, pH 8.0; 1 mM EDTA), bir 1.5 ml bir tüp içinde. </li><li> 5 dakika boyunca kaynayan suda tüp yerleştirin. ısı kaynağı kapatın ve tavlı oligos karanlıkta O / N serin suyu sağlar. </li></ol></li><li> iki şeritli DNA probları yapmak için Klenow DNA polimeraz ile tavlanmış 5&#39;Dye-kısa / uzun oligo 5 &#39;çıkıntısını doldurmak. <ol><li> karıştırılarak reaksiyon hazırlanması5&#39;Dye etiketiyle tavlanmış uzun / kısa oligo 30 uL, 8.5 uL 10x Klenow tamponu, 10 mM dNTP 1.7 ul, 1.7 Klenow uL (3 &#39;-&gt; 5&#39; ekso-) (5 u / uL) ve 0.2 ml PCR tüpünde GKD 2 O 43.1 ul. </li><li> PCR makinesi içerisinde 37 ° C&#39;de 60 dakika kuluçkalayın. </li><li> PCR makinesi içinde 20 dakika süreyle 75 ° C&#39;de reaksiyona ısı devre dışı bırak durdurmak için 3.4 mcL 0.5 M EDTA ekleyin. </li></ol></li><li> 0.1 uM nihai konsantrasyon için STE doldurulmuş sondalar (0.7 uM) ile seyreltilir. </li><li> hazır olana kadar karanlıkta -20 ° C&#39;de saklayın oligos kullanmak için. Oligo Bu durumda, bir yıla kadar depolanabilir. NOT: Mutant bağlayıcı siteleri ile DNA probları oluşturmak için, uzun oligonükleotitlerin mutant sürümleri Klenow ile 5 &#39;çıkıntılar dolgu-in ardından 5&#39;Dye etiketli kısa oligonükleotid ile tavlanır. Bir iplikçik prob kızılötesi floresan ile etiketlenmiş olduğu gösterilmiştirboya boya ile işaretlenmiş, her iki şerit prob sadece% 30 yoğunluğa sahiptir. Sinyal yoğunluğu güçlendirilmelidir, her iki şerit uzun oligo 5 &#39;termini, kızılötesi floresan boyalar ile etiketlenmiş ve kızıl ötesi floresan boya etiketli problar yapmak için tavlanır. </li></ol> Etiketsiz / Soğuk Sondalar 3. Hazırlama (Yarışmacı) Not: tamamlayıcı diziler (Uzun ve Longr) Uzun oligonükleotidler kızılötesi floresan boya etiketli problar ile rekabet analizi için etiketsiz probları yapmak tavlanmıştır. <ol><li> 1.5 ml bir tüp içinde, 100 mikron uzunluğunda 20 uL, 100 uM Longr oligonükleotid 20 uL ve STE 60 uL karıştırın. </li><li> 5 dakika kaynar suda tüp yerleştirin ısı kaynağını kapatın ve tavlanmış oligos gece boyunca soğumaya suyu sağlar. </li></ol> 4. Bağlanma reaksiyonu ve elektroforez <ol><li> 50 uL karıştırılarak 5x bağlama tamponu, 1 mL hazırlanması60 ° C; 1 M Tris-HCl, pH 7,5; 5 M NaCI, 10 uL; 1 M KCl, MgCl2 1 M 5 uL 200 uL, 0.5 M EDTA, 10 uL, pH 8.0; 1 M DTT 5 uL; GKD 2 O 25, 10 mg / ml BSA uL ve 695 uL Not: 5x bağlama tamponu bölünüp -20 ° C&#39;de saklanabilir. Dikkate alınması gereken diğer bir nokta, farklı transkripsiyon faktörleri bağlama tamponu farklı modifikasyonlara sahip olmasıdır. </li><li> Sağ bağlama reaksiyonları kurmadan önce, 30 80 V amonyum persülfat tüm izlerini silmek için +% 2.5 gliserol 0.5x TBE% 5 yerli poliakrilamid jel önceden işletilen - 60 dk veya geçerli artık zamanla değişir kadar. </li><li> 20 uL nihai hacimde bağlanma reaksiyonuna ayarlayın. <ol><li> 4 5x bağlama tamponu uL, 80 karıştırın - saflaştırılmış protein A 200 ng (örneğin,% 50 gliserol, SOX-2), 0.1 uM Boya ile konjüge edilmiş prob 1 pL (son konsentration: 5 nM) ve GKD 2 O </li><li> İsteğe bağlı: Soğuk sonda rakipler gerektiğinde, çeşitli konsantrasyonlarda soğuk prob (2x, 10x, 25x, 50x, 100x, vs.) ekleyin. </li><li> İsteğe bağlı: proteinler, A ve B arasındaki etkileşimi (örneğin, SOX-2 ve LIM-4) test edildiğinde, 80 ekleyin - saflaştırılmış protein B 200 ng (yani,% 50 gliserol içinde, LIM-4). </li><li> İsteğe bağlı: nükleer ekstre hazırlanması kullanılan doğrulanması için protein A spesifik bağlanma ise, protein A (örneğin, bir anti-6xHis, anti-FLAG, vs.) özel antikor ekleyin. </li><li> 15 dakika süreyle karanlıkta R / T&#39;de bir gece inkübe edin. </li></ol></li><li> jel üzerine bağlanma reaksiyonunun tüm yük ve istenen mesafeye 10 V / cm jel üzerinde çalıştırıldı. </li></ol> 5. Görüntüleme NOT: Jel gelişmiş kızılötesi görüntüleme sistemi ile cam plakalar doğrudan tarandı. Bu nedenle, jel daha çözülebilir ve tekrar tekrar taranan (Şekil 1C ve <stRong&gt; 2). öncelikle Western lekeleme için yakın kızılötesi floresan görüntüleme sistemi de jel taramak için test edilmiştir, ancak gelişmiş kızılötesi görüntüleme sistemi iyi çözünürlüğe sahip jel tarama başardı. diğer yazılım paketleri kullanılabilir, ancak tarif edilen yöntem, belirli bir kızılötesi görüntüleme yazılımı özgüdür. <ol><li> GKD 2 O ile tarayıcı yatağı temizleyin ve taramadan önce iyice kurutun. jel cam plakalar silerek kurutun ve tarayıcı yatağı üzerinde jel içeren plakalar yerleştirin. </li><li> kızılötesi görüntüleme yazılımını açın ve &#39;Edinme&#39; sekmesine gidin. ince plaka (1 mm) tarayıcı yatağına yerleştirildiğinde, Kanal ayarları kullanmak: 700, Yoğunluk: Otomatik, Çözünürlük: 169 um, Kalite: Orta ve Odak Ofset: 1.5 mm. kalın levha (3 mm) tarayıcı yatağına yerleştirildiğinde, Kanal ayarları kullanmak: 700, Yoğunluk: Otomatik, Çözünürlük: 84 um, Kalite: Orta ve Odak Ofset: 3,5 mm. ofset odak bağlıdırcam levha kalınlığı. </li><li> Jel tarayıcıya kapladığı alanı seçin. Taramayı başlatmak için &#39;Başlat&#39; düğmesine tıklayın. </li><li> elektroforez tekrarlayın ve ayrıca gerektiğinde tarayın. </li></ol>

<ol>
	<li>Hellman, L. M., Fried, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+mobility+shift+assay+(EMSA)+for+detecting+protein-nucleic+acid+interactions.">Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions.</a> Nat Protoc. 2, 1849-1861 (2007).</li><li>Ludwig, L. B., Hughes, B. J., Schwartz, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biotinylated+probes+in+the+electrophoretic+mobility+shift+assay+to+examine+specific+dsDNA,+ssDNA+or+RNA-protein+interactions.">Biotinylated probes in the electrophoretic mobility shift assay to examine specific dsDNA, ssDNA or RNA-protein interactions.</a> Nucleic Acids Res. 23, 3792-3793 (1995).</li><li>Engler-Blum, G., Meier, M., Frank, J., Muller, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+background+problems+in+nonradioactive+northern+and+Southern+blot+analyses+enables+higher+sensitivity+than+32P-based+hybridizations.">Reduction of background problems in nonradioactive northern and Southern blot analyses enables higher sensitivity than 32P-based hybridizations.</a> Anal Biochem. 210, 235-244 (1993).</li><li>Jing, D., Agnew, J., Patton, W. F., Hendrickson, J., Beechem, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+two-color+electrophoretic+mobility+shift+assay+for+detecting+both+nucleic+acids+and+protein+in+gels.">A sensitive two-color electrophoretic mobility shift assay for detecting both nucleic acids and protein in gels.</a> Proteomics. 3, 1172-1180 (2003).</li><li>Alqadah, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postmitotic+diversification+of+olfactory+neuron+types+is+mediated+by+differential+activities+of+the+HMG-box+transcription+factor+SOX-2.">Postmitotic diversification of olfactory neuron types is mediated by differential activities of the HMG-box transcription factor SOX-2.</a> EMBO J. 34, 2574-2589 (2015).</li><li>Jullien, N., Herman, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LUEGO:+a+cost+and+time+saving+gel+shift+procedure.">LUEGO: a cost and time saving gel shift procedure.</a> Biotechniques. 51, 267-269 (2011).</li><li>Poulin-Laprade, D., Burrus, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+Mobility+Shift+Assay+Using+Radiolabeled+DNA+Probes.">Electrophoretic Mobility Shift Assay Using Radiolabeled DNA Probes.</a> Methods Mol Biol. 1334, 1-15 (2015).</li><li>Ruscher, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorescence+based+non-radioactive+electrophoretic+mobility+shift+assay.">A fluorescence based non-radioactive electrophoretic mobility shift assay.</a> J Biotechnol. 78, 163-170 (2000).</li><li>Pagano, J. M., Clingman, C. C., Ryder, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+approaches+to+monitor+protein-nucleic+acid+interactions+using+fluorescent+probes.">Quantitative approaches to monitor protein-nucleic acid interactions using fluorescent probes.</a> RNA. 17, 14-20 (2011).</li><li>Alqadah, A., Hsieh, Y. W., Chuang, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox2+goes+beyond+stem+cell+biology.">Sox2 goes beyond stem cell biology.</a> Cell cycle. , (2016).</li><li>Larouche, K., Bergeron, M. J., Leclerc, S., Guerin, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+competitor+poly(dI-dC).poly(dI-dC)+levels+is+advised+in+DNA-protein+interaction+studies+involving+enriched+nuclear+proteins.">Optimization of competitor poly(dI-dC).poly(dI-dC) levels is advised in DNA-protein interaction studies involving enriched nuclear proteins.</a> Biotechniques. 20, 439-444 (1996).</li><li>Sorenson, A. E., Schaeffer, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-gel+detection+of+biotin-protein+conjugates+with+a+green+fluorescent+streptavidin+probe.">In-gel detection of biotin-protein conjugates with a green fluorescent streptavidin probe.</a> Anal. Methods. 7, 2087-2092 (2015).</li><li>Onizuka, T., Endo, S., Hirano, M., Kanai, S., Akiyama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+a+fluorescent+electrophoretic+mobility+shift+assay+improved+for+the+quantitative+and+multiple+analysis+of+protein-DNA+complexes.">Design of a fluorescent electrophoretic mobility shift assay improved for the quantitative and multiple analysis of protein-DNA complexes.</a> Biosci Biotechnol Biochem. 66, 2732-2734 (2002).</li><li>Steiner, S., Pfannschmidt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-based+electrophoretic+mobility+shift+assay+in+the+analysis+of+DNA-binding+proteins.">Fluorescence-based electrophoretic mobility shift assay in the analysis of DNA-binding proteins.</a> Methods Mol Biol. 479, 273-289 (2009).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

fEMSAs protein-DNA etkileşimlerini araştırmak için etkili bir araçtır ve DNA radyoaktif etiketleme bir alternatiftir. kızıl ötesi boyalar gibi floresan boyalar ticari olarak temin edilebilir, ve radyoaktif bir DNA etiketleme kıyasla çevre dostu daha güvenli ve daha yöntem sağlar. Kızılötesi floresan boya etiketli oligonükleotidler kullanılarak EMSA postrun jel işleme adımlar gerektirir ve bu nedenle diğer DNA etiketleme teknikleri ile karşılaştırıldığında zaman ve maliyet tasarrufu yoktur. ...

EMSA ilgi konusu bir protein ve protein 1 potansiyel hedef sitesi ihtiva eden bir işaretli DNA sondası bir karışımını çözmek için yerel poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE) kullanılarak DNA ve protein arasındaki etkileşimi analiz etmek için kullanılır. protein ile bağlı bir DNA probu yavaş serbest DNA probu ile karşılaştırılır ve bir poliakrilamit matris boyunca, geçiş nedenle geciktirilir değiştirecektir. 32 P DNA Radyo-etiketlenmesi EMSA tespiti için baskın bir yöntem olmuştur. biyokimyasal araştırmalarda radyo sınıflandırılmasıyla uygulama yararlı olmasına rağmen, benzer hassasiyetle alternatif DNA etiketleme yöntemleri nedeniyle radyoaktivite taşıma ile ilgili sağlık ve güvenlik risklerine istihdam edilmektedir. Bu alternatif yöntemler, biyotin 2 veya digoksijenin (DIG) 3 (her ikisi de daha sonra kimyasal olarak ışık veren sistemler tarafından tespit edilir) olan DNA konjügasyon PAGE jelleri 4 SYBR yeşil boyama dahilya da jel 5,6 tarayarak DNA floresan boya konjügatlarının doğrudan tespiti. Radyoaktif olarak etiketlenmiş DNA sondaları kullanılarak EMSA çözülmesi jeller postrun otoradyografi filmler içinden işleme veya radyoaktif sinyaller 1,7 tespit etmek için, bir Phosphorimager sistemi gerektirmektedir. Biotin-2 veya DIG-konjuge 3 DNA sondaları kullanılarak EMSA ve jeller de işlenebilir ve uygun bir membran üzerine aktarıldı ve kemiluminesans 6 tarafından tespit edilmelidir. Jelin SYBR yeşil boyama postrun jel boyama ve floresan tarayıcı 4 gerektirir. postrun jel işlem adımları, bu DNA etiketleme teknikleri kullanılarak EMSA için gerekli olması nedeniyle, giderilmiş jel bir kez analiz edilebilir. Bunun aksine, floroforlar ile etiketlenmiş DNA probları Bir tarayıcıdan cam plakalar içindeki jelde tespit edilebilir. Böylece, DNA-protein etkileşimleri izlenebilir ve çalışma sırasında farklı zaman noktalarında birkaç kez deneye tabi olanönemli ölçüde zaman ve maliyeti azaltır. EMSA kullanılmaktadır DNA fluoresan boya konjügatları Cy3 6,8, Cy5 6,8, fluoresein 9 ve kızıl ötesi floresan boyalar 4-6 içerir. Transkripsiyonal düzenleme transkripsiyon faktörleri ve hedef genlerin protein-DNA etkileşim gerektirir. Bu etkileşimlerin Koordinasyon hayvan gelişimi sırasında ortak bir progenitör gelen farklı hücre tipleri oluşturur. Tarafsız bir ileri genetik ekranı Caenorhabditis elegans transkripsiyon faktörü SOX-2 yüksek derecede korunmuş HMG DNA-bağlama etki, yanlış anlamlı bir mutasyon, G73E tespit edilmiştir. , Moleküler morfolojik ve fonksiyonel düzeyde 5,10 at AWC koku nöronlar içine AWB koku nöronların hücre kimliği dönüşümünde mutasyon sonuçları. SOX-2 farklı şekilde bağlam-bağımlı ortak transkripsiyon faktörlerinin ve ilgili etkileşerek AWB ve AWC nöronların terminal farklılaşmasını düzenleyenDNA hedef site 5,10. SOX-2 terminali AWB nöronal farklılaşma LIM-4 (LHX) işbirliği, SOX-2 terminali AWC nöron farklılaşma CEH-36 (OTX / OTD) ile işbirliği yapmaktadır. Lusiferaz raportör testleri gösterirken bu SOX-2 ve mutant SOX-2 G73E proteinleri AWB ve AWC nöronlarda ifade edilen bir promotör etkinleştirmek için transkripsiyonel kofaktörler LIM-4 ve CEH-36 ile işbirliği etkileşimleri vardır. Bununla birlikte, SOX-2 ve mutant SOX-2 G73E promoteri ayırıcı etkinleştirme özelliklerine gösterilir. SOX-2 ve SOX-2 G73E ayırıcı bir DNA bağlama aktivitesi moleküler temelini araştırmak için, fEMSAs bu proteinlerin ve olası hedef alanlan ile yapıldı. İlk olarak, biyoenformatik yaklaşımı lusiferaz tahlilde kullanılan 1 kb promoter bölgesi içinde bağlama dizileri biyolojik ilgili DNA tespit alındı. Birden fazla potansiyel SOX-2 bağlayıcı siteler promotör boyunca mevcut olduğundan, biz odaklıfarazi CEH-36 ya da LIM-4 bağlanma yerleri bitişik ve evrimsel çeşitli nematod türlerinin arasında korunan tahmin SOX-2 bağlayıcı sitelerde. Bu diziler, silinmiş ya da mutasyona uğramış, ve daha sonra AWB veya AWC nöronlarda GFP raportör transgenleri ifade etme aktivitesi için in vivo olarak test edilmiştir. Bu yaklaşım sayesinde, özellikle AWB ve AWC nöronlar, sırasıyla, 5 GFP ekspresyonu için gerekli olan LIM-4 / SOX-2 potansiyeli ve CEH-36 / SOX-2 bitişik hedef sitesi belirlenmiştir. Biz SOX-2 ve SOX-2 LIM-4 / SOX-2 tespit ve CEH-36 / SOX-2 bitişik hedef siteleri ile FEMSA kullanarak G73E bağlayıcı DNA potansiyel farklılıkları araştırıldı. Bizim EMSA analizi SOX-2 G73E kadar etkin WT SOX-2 gibi (AWB gen ifadesi için gerekli olan) LIM-4 / SOX-2 bitişik hedef sitesi ihtiva eden DNA probu bağlamak olmadığını gösterdi. Bununla birlikte, SOX-2 ve SOX-2 G73E içeren DNA probu bağlama fark vardı CEH-36 / SOX-25,10 (AWC gen ifadesi için gerekli olan) djacent hedef bölge. Bizim FEMSA AWB-to-AWC hücre kimlik dönüşümü fenotip için spesifik DNA bağlama aktivitesini etkileyen SOX-2 G73E mutasyonunun doğaya mekanik bilgiler sağlayabilir analiz eder. Burada, saflaştırılmış 6xHis-SOX-2 veya 6xHis-SOX-2 çözmek için bir vaka çalışması olarak LIM-4 / SOX-2 bitişik hedef siteleri içeren kızılötesi floresan boya etiketli DNA probları ile birlikte G73E kullanarak FEMSA optimize edilmiş bir protokol tarif önemli bir biyolojik bir soru.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1019">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1&#160;</td>
			<td style="width:199px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:207px;">1610158</td>
			<td style="width:281px;">Acrylamide is harmful and toxic.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">6x-His Epitope Tag Antibody (HIS.H8)</td>
			<td style="width:199px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:207px;">MA1-21315</td>
			<td style="width:281px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Anti Flag M2 antibody&#160;</td>
			<td style="width:199px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:207px;">F3165-.2MG</td>
			<td style="width:281px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Bovine Serum Albumin molecular-biology-grade</td>
			<td style="width:199px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:207px;">B9000S</td>
			<td style="width:281px;"></td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:332px;">5&#39;IRDye700-labeled DNA Oligos</td>
			<td style="width:199px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:207px;">Custom DNA oligo</td>
			<td style="width:281px;">These are referred as 5&#39;Dye-labeled or infrared fluorescent dye-labeled DNA oligos in the manuscript. The company will custom synthesize 5&#39; IRDye labeled DNA oligonucleotides.&#160; Requires minimum 100&#956;M scale synthesis and HPLC purification.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Klenow Fragment (3&#39;--&#62;5&#39; exo-)</td>
			<td style="width:199px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:207px;">M0212S</td>
			<td style="width:281px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">LightShif Poly (dI-dC)</td>
			<td style="width:199px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:207px;">20148E</td>
			<td style="width:281px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:332px;">Mini-PROTEAN&#160;Vertical Electrophoresis Cell&#160;</td>
			<td style="width:199px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:207px;">1658000FC&#160;</td>
			<td style="width:281px;">This is referred as a mini protein gel system in the manuscript. Any electrophoretic system can be used as long as they are clear glass plates of less than 25cm x 25cm in size.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:332px;">Odyssey CLx Infrared Imaging System</td>
			<td style="width:199px;">LI-COR Biotechnology</td>
			<td style="width:207px;">Odyssey CLx Infrared Imagng System</td>
			<td style="width:281px;">This is referred as an advanced infrared imaging system in the mansucript.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Odyssey Fc Imaging System&#160;</td>
			<td style="width:199px;">LI-COR Biotechnology</td>
			<td style="width:207px;">Odyssey Fc Dual-Mode Imaging System</td>
			<td style="width:281px;">This is referred as a near-infrared fluorescent imaging system primarily for Western blots in the mansucript.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:332px;">Image Studio software (version 4.0)</td>
			<td style="width:199px;">LI-COR Biotechnology</td>
			<td style="width:207px;">Image Studio software&#160;</td>
			<td style="width:281px;">This is referred as a particular imaging software in the mansucript.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Orange G</td>
			<td style="width:199px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:207px;">O3756-25G</td>
			<td style="width:281px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">6x Orange loading dye</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td>0.25% Orange G; 30% Glycerol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.5x TBE</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td>45 mM Tris-Borate; 1 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">1x TE</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td>10 mM Tris-HCl; 1 mM EDTA, pH8.0</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:332px;">1x STE</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td style="width:281px;">100 mM NaCl; 10 mM Tris-HCl, pH8.0; 1 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">5x Binding Buffer</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td style="width:281px;">50 mM Tris-HCl, pH7.5; 50 mM NaCl; 200 mM KCl; 5 mM MgCl2; 5 mM EDTA, pH8.0; 5 mM DTT; 250 ug/ml BSA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an optimized protocol for electrophoretic mobility shift assay using infrared fluorescent dye-labeled oligonucleotides

Elektroforetik hareket kayma deneyleri (EMSA) proteinler ve hedef DNA dizileri arasındaki etkileşimi karakterize eden bir aracı bir araçtır. Radyoaktivite EMSA DNA etiketleme baskın yöntem olmuştur. Ancak, floresan boyalar ve tarama yöntemleri son gelişmeler, zaman tasarrufu maliyetini azaltarak ve güvenliğini geliştirmek, kolay kullanım avantajları için radyoaktivite alternatif olarak DNA floresan etiketleme kullanımı teşvik etmiştir. Biz son zamanlarda başarıyla önemli bir biyolojik soruyu ele almak için floresan EMSA (FEMSA) kullandık. Bizim FEMSA analizi yüksek derecede korunmuş HMG transkripsiyon faktörü SOX-2 koku nöron tipi çeşitlendirilmesi üzerinde, bir missense mutasyon, G73E yürürlüğe mekanik görmemizi sağlar. Mutantını SOX-2 G73E proteini ve böylece koku nöron kimlik dönüşümü neden spesifik DNA bağlanma aktivitesi değiştirir bulundu. Burada, mevcut olan bir iyileştirilmiş ve adım adım protokolü maliyetliFEMSA biyolojik örnek olarak LIM-4 / SOX-2 bitişik hedef sitesi ve saflaştırılmış SOX-2 proteinleri (WT ve mutant SOX-2 G73E proteinler) içeren kızıl ötesi floresan boya etiketli oligonükleotidler kullanılarak.

Portakal Rengi G yükleme boyası (6x 100 mL% 30 gliserol içinde 0.12 g turuncu G) Electrophoresis ilerlemesini görselleştirmek için yükleme öncesi bağlanma reaksiyona ilave edilebilir. Bromofenol mavisi gibi diğer yükleme boyalar tarama sırasında tespit edilir ve bu nedenle görüntü analizi (Şekil 1B) müdahale edilir. EMSA Bazı durumlarda, nükleer ekstre hazırlanması kullanılan, özellikle...

Watch this Scientific Journal Video about An Optimized Protocol for Electrophoretic Mobility Shift Assay Using Infrared Fluorescent Dye-labeled Oligonucleotides at JoVE.com

An Optimized Protocol for Electrophoretic Mobility Shift Assay Using Infrared Fluorescent Dye-labeled Oligonucleotides

Biz burada önemli bir biyolojik soruyu çözmek için bir vaka çalışması olarak kızılötesi floresan boya etiketli DNA probları ile birlikte saflaştırılmış SOX-2 proteinleri kullanılarak floresan Elektroforetik Hareketlilik Kaydırma Tahliller (FEMSA) optimize edilmiş bir protokol açıklar.

Kızılötesi Floresan Boya-etiketli oligonükleotidler kullanılarak Elektroforetik Hareketlilik Kaydırma Testi için optimize Protokol

Electrophoretic Mobility Shift Assays (EMSA) are an instrumental tool to characterize the interactions between proteins and their target DNA sequences. ...

an-optimized-protocol-for-electrophoretic-mobility-shift-assay-using

Research

JoVE Journal

Biochemistry

15.5K Görüntüleme.  University of Illinois at Chicago.  Biz burada önemli bir biyolojik soruyu çözmek için bir vaka çalışması olarak kızılötesi floresan boya etiketli DNA probları ile birlikte saflaştırılmış SOX-2 proteinleri kullanılarak floresan Elektroforetik Hareketlilik Kaydırma Tahliller (FEMSA) optimize edilmiş bir protokol açıklar. 

Video: An Optimized Protocol for Electrophoretic Mobility Shift Assay Using Infrared Fluorescent Dye-labeled Oligonucleotides

Optimized Protocol for the Extraction of Proteins from the Human Mitral Valve

Analysis of the cellular proteome can help to elucidate the molecular mechanisms underlying diseases due to the development of technologies that permit the large-scale identification and quantification of the proteins present in complex biological systems.The knowledge gained from a proteomic approach can potentially lead to a better understanding of the pathogenic mechanisms underlying diseases, allowing for the identification of novel diagnostic and prognostic disease markers, and, hopefully, of therapeutic targets. However, the cardiac mitral valve represents a very challenging sample for proteomic analysis because of the low cellularity in proteoglycan and collagen-enriched extracellular matrix. This makes it challenging to extract proteins for a global proteomic analysis. This work describes a protocol that is compatible with subsequent protein analysis, such as quantitative proteomics and immunoblotting. This can allow for the correlation of data concerning protein expression with data on quantitative mRNA expression and non-quantitative immunohistochemical analysis. Indeed, these approaches, when performed together, will lead to a more comprehensive understanding of the molecular mechanisms underlying diseases, from mRNA to post-translational protein modification. Thus, this method can be relevant to researchers interested in the study of cardiac valve physiopathology.

The protein composition of the human mitral valve is still partially unknown, because its analysis is complicated by low cellularity and therefore by low protein biosynthesis. This work provides a protocol to efficiently extract protein for the analysis of the mitral valve proteome.

İnsan Mitral Valfinden Proteinlerin Çıkarılması İçin Optimize Edilmiş Protokol

Analysis of the cellular proteome can help to elucidate the molecular mechanisms underlying diseases due to the development of technologies that permit ...

Biyokimya

DNA Polymerase Activity Assay Using Near-infrared Fluorescent Labeled DNA Visualized by Acrylamide Gel Electrophoresis

For any enzyme, robust, quantitative methods are required for characterization of both native and engineered enzymes. For DNA polymerases, DNA synthesis can be characterized using an in vitro DNA synthesis assay followed by polyacrylamide gel electrophoresis. The goal of this assay is to quantify synthesis of both natural DNA and modified DNA (M-DNA). These approaches are particularly useful for resolving oligonucleotides with single nucleotide resolution, enabling observation of individual steps during enzymatic oligonucleotide synthesis. These methods have been applied to the evaluation of an array of biochemical and biophysical properties such as the measurement of steady-state rate constants of individual steps of DNA synthesis, the error rate of DNA synthesis, and DNA binding affinity. By using modified components including, but not limited to, modified nucleoside triphosphates (NTP), M-DNA, and/or mutant DNA polymerases, the relative utility of substrate-DNA polymerase pairs can be effectively evaluated. Here, we detail the assay itself, including the changes that must be made to accommodate nontraditional primer DNA labeling strategies such as near-infrared fluorescently labeled DNA. Additionally, we have detailed crucial technical steps for acrylamide gel pouring and running, which can often be technically challenging.

This protocol describes the characterization of DNA polymerase synthesis of modified DNA through observation of changes to near-infrared fluorescently labeled DNA using gel electrophoresis and gel imaging. Acrylamide gels are used for high resolution imaging of the separation of short nucleic acids, which migrate at different rates depending on size.

DNA polimeraz etkinliği tahlil Akrilamid Jel Elektroforez tarafından görüntülenmiştir yakın kızılötesi floresan etiketli DNA'yı kullanarak

For any enzyme, robust, quantitative methods are required for characterization of both native and engineered enzymes. For DNA polymerases, DNA synthesis ...

Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins

Here we are presenting a novel method to study the sumoylation of proteins and their sub-cellular localization in mammalian cells and nematode oocytes. This method utilizes a recombinant modified SUMO-trapping protein fragment, kmUTAG, derived from the Ulp1 SUMO protease of the stress-tolerant budding yeast Kluyveromyces marxianus. We have adapted the properties of the kmUTAG for the purpose of studying sumoylation in a variety of model systems without the use of antibodies. For the study of SUMO, KmUTAG has several advantages when compared to antibody-based approaches. This stress-tolerant SUMO-trapping reagent is produced recombinantly, it recognizes native SUMO isoforms from many species, and unlike commercially available antibodies it shows reduced affinity for free, unconjugated SUMO. Representative results shown here include the localization of SUMO conjugates in mammalian tissue culture cells and nematode oocytes.

SUMO is an essential and highly conserved, small ubiquitin-like modifier protein. In this protocol we are describing the use of a stress-tolerant recombinant SUMO-trapping protein (kmUTAG) to visualize native, untagged SUMO conjugates and their localization in a variety of cell types.

Floresan Sumo-bindirme proteinleri kullanarak SUMO-modifiye proteinlerin lokalizasyonu

Here we are presenting a novel method to study the sumoylation of proteins and their sub-cellular localization in mammalian cells and nematode oocytes. ...

Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy

The phenomenon of protein misfolding and aggregation results in the formation of highly heterogeneous protein aggregates, which are associated with neurodegenerative conditions such as Alzheimer&#8217;s and Parkinson&#8217;s diseases. In particular low molecular weight aggregates, amyloid oligomers, have been shown to possess generic cytotoxic properties and are implicated as neurotoxins in many forms of dementia. We illustrate the use of methods based on atomic force microscopy (AFM) to address the challenging task of characterizing the morphological, structural and chemical properties of these aggregates, which are difficult to study using conventional structural methods or bulk biophysical methods because of their heterogeneity and transient nature. Scanning probe microscopy approaches are now capable of investigating the morphology of amyloid aggregates with sub-nanometer resolution. We show here that infrared (IR) nanospectroscopy (AFM-IR), which simultaneously exploits the high resolution of AFM and the chemical recognition power of IR spectroscopy, can go further and enable the characterization of the structural properties of individual protein aggregates, and thus offer insights into the aggregation mechanisms. Since the approach that we describe can be applied also to the investigations of the interactions of protein assemblies with small molecules and antibodies, it can deliver fundamental information to develop new therapeutic compounds to diagnose or treat neurodegenerative disorders.

We describe the application of infrared nanospectroscopy and high-resolution atomic force microscopy to visualize the process of protein self-assembly into oligomeric aggregates and amyloid fibrils, which is closely associated with the onset and development of a wide range of human neurodegenerative disorders.

Bireysel Protein Agregalarının Kızılötesi Nanospektroskopi ve Atomik Kuvvet Mikroskobu ile Karakterizeleştirilmesi

The phenomenon of protein misfolding and aggregation results in the formation of highly heterogeneous protein aggregates, which are associated with ...

Acyl-PEGyl Exchange Gel Shift Assay for Quantitative Determination of Palmitoylation of Brain Membrane Proteins

Activity-dependent alterations in the levels of synaptic AMPA receptors (AMPARs) within the postsynaptic density (PSD) is thought to represent a cellular mechanism for learning and memory. Palmitoylation regulates localization and function of many synaptic proteins including AMPA-Rs, auxiliary factors and synaptic scaffolds in an activity-dependent manner. We identified the synapse differentiation induced gene (SynDIG) family of four genes (SynDIG1-4) encoding brain-specific transmembrane proteins that associate with AMPARs and regulate synapse strength. SynDIG1 is palmitoylated at two cysteine residues located at positions 191 and 192 in the juxta-transmembrane region important for activity-dependent excitatory synapse development. Here, we describe an innovative biochemical approach, the acyl-PEGyl exchange gel shift (APEGS) assay, to investigate the palmitoylation state of any protein of interest and demonstrate its utility with the SynDIG family of proteins in mouse brain lysates.

Palmitoylation entails the incorporation of a 16-carbon palmitate moiety to cysteine residues of target proteins in a reversible manner. Here, we describe a biochemical approach, the acyl-PEGyl exchange gel shift (APEGS) assay, to investigate the palmitoylation state of any protein of interest in mouse brain lysates.

Beyin Zarı Proteinlerinin Palmitoylarasyonunun Kantitatif Tayini için Acyl-PEGyl Exchange Jel Shift Tayini

Activity-dependent alterations in the levels of synaptic AMPA receptors (AMPARs) within the postsynaptic density (PSD) is thought to represent a cellular ...

An Electrochemiluminescence-Based Assay for MeCP2 Protein Variants

The ECLIA is a versatile method which is able to quantify endogenous and recombinant protein amounts in a 96-well format. To demonstrate ECLIA efficiency, this assay was used to analyze intrinsic levels of MeCP2 in mouse brain tissue and the uptake of TAT-MeCP2 in human dermal fibroblasts. The MeCP2-ECLIA produces highly accurate and reproducible measurements with low intra- and inter-assay error. In summary, we developed a quantitative method for the evaluation of MeCP2 protein variants that can be utilized in high-throughput screens.

The electrochemiluminescence immunoassay (ECLIA) is a novel approach for quantitative detection of endogenous and exogenously applied MeCP2 protein variants, which produces highly quantitative, accurate and reproducible measurements with low intra- and inter-assay error over a wide working range. Here, the protocol for the MeCP2-ECLIA in a 96-well format is described.

MeCP2 Protein Varyantları için Elektrokemilüminesans Bazlı Bir Test

The ECLIA is a versatile method which is able to quantify endogenous and recombinant protein amounts in a 96-well format. To demonstrate ECLIA efficiency, ...

Assessment of Cellular Oxidation using a Subcellular Compartment-Specific Redox-Sensitive Green Fluorescent Protein

Measuring the intracellular oxidation/reduction balance provides an overview of the physiological and/or pathophysiological redox status of an organism. Thiols are especially important for illuminating the redox status of cells via their reduced dithiol and oxidized disulfide ratios. Engineered cysteine-containing fluorescent proteins open a new era for redox-sensitive biosensors. One of them, redox-sensitive green fluorescent protein (roGFP), can easily be introduced into cells with adenoviral transduction, allowing the redox status of subcellular compartments to be evaluated without disrupting cellular processes. Reduced cysteines and oxidized cystines of roGFP have excitation maxima at 488 nm and 405 nm, respectively, with emission at 525 nm. Assessing the ratios of these reduced and oxidized forms allows the convenient calculation of redox balance within the cell. In this method article, immortalized human triple-negative breast cancer cells (MDA-MB-231) were used to assess redox status within the living cell. The protocol steps include MDA-MB-231 cell line transduction with adenovirus to express cytosolic roGFP, treatment with H2O2, and assessment of cysteine and cystine ratio with both flow cytometry and fluorescence microscopy.

This protocol describes the assessment of subcellular compartment-specific redox status within the cell. A redox-sensitive fluorescent probe allows convenient ratiometric analysis in intact cells.

Hücre altı kompartmana özgü Redoksduyarlı Yeşil Floresan Protein kullanılarak Hücresel Oksidasyonun Değerlendirilmesi

Measuring the intracellular oxidation/reduction balance provides an overview of the physiological and/or pathophysiological redox status of an organism. ...

Fluorescent Leakage Assay to Investigate Membrane Destabilization by Cell-Penetrating Peptide

Cell-penetrating peptides (CPPs) are defined as carriers that are able to cross the plasma membrane and to transfer a cargo into cells. One of the main common features required for this activity resulted from the interactions of CPPs with the plasma membrane (lipids) and more particularly with components of the extracellular matrix of the membrane itself (heparan sulphate). Indeed, independent of the direct translocation or the endocytosis-dependent internalization, lipid bilayers are involved in the internalization process both at the level of the plasma membrane and at the level of intracellular traffic (endosomal vesicles). In this article, we present a detailed protocol describing the different steps of a large unilamellar vesicles (LUVs) formulation, purification, characterization, and application in fluorescence leakage assay in order to detect possible CPP-membrane destabilization/interaction and to address their role in the internalization mechanism. LUVs with a lipid composition reflecting the plasma membrane content are generated in order to encapsulate both a fluorescent dye and a quencher. The addition of peptides in the extravesicular medium and the induction of peptide-membrane interactions on the LUVs might thus induce in a dose-dependent manner a significant increase in fluorescence revealing a leakage. Examples are provided here with the recently developed tryptophan (W)- and arginine (R)-rich Amphipathic Peptides (WRAPs), which showed a rapid and efficient siRNA delivery in various cell lines. Finally, the nature of these interactions and the affinity for lipids are discussed to understand and to improve the membrane translocation and/or the endosomal escape.

The fluorescence leakage assay is a simple method that enables the investigation of peptide/membrane interactions in order to understand their involvement in several biological processes and especially the ability of cell-penetrating peptides to disturb phospholipids bilayers during a direct cellular translocation process.

Hücre Delici Peptit ile Membran Dengesizleşmesini Araştırmak için Floresan Sızıntı Tahlil

Cell-penetrating peptides (CPPs) are defined as carriers that are able to cross the plasma membrane and to transfer a cargo into cells. One of the main ...

Optimized Incorporation of Alkynyl Fatty Acid Analogs for the Detection of Fatty Acylated Proteins using Click Chemistry

Fatty acylation, the covalent addition of saturated fatty acids to protein substrates, is important in regulating a myriad of cellular functions in addition to its implications in cancer and neurodegenerative diseases. Recent developments in fatty acylation detection methods have enabled efficient and non-hazardous detection of fatty acylated proteins, particularly through the use of click chemistry with bio-orthogonal labeling. However, click chemistry detection can be limited by the poor solubility and potential toxic effects of adding long chain fatty acids to cell culture. Described here is a labeling approach with optimized delivery using saponified fatty acids in combination with fatty-acid free BSA, as well as delipidated media, which can improve detection of hard to detect fatty acylated proteins. This effect was most pronounced with the alkynyl-stearate analog, 17-ODYA, which has been the most commonly used fatty acid analog in click chemistry detection of acylated proteins. This modification will improve cellular incorporation and increase sensitivity to acylated protein detection. In addition, this approach can be applied in a variety of cell types and combined with other assays such as pulse-chase analysis, stable isotope labeling with amino acids in cell culture, and mass spectrometry for quantitative profiling of fatty acylated proteins.

The study of fatty acylation has important implications in cellular protein interactions and diseases. Presented here is a modified protocol to improve click chemistry detection of fatty acylated proteins, which can be applied in various cell types and combined with other assays, including pulse-chase and mass spectrometry.

Click Kimya Kullanarak Yağ Asillenmiş Proteinlerin Tespiti için Alkinil Yağ Asidi Analoglarının Optimize Edilmiş Birleştirilmesi

Fatty acylation, the covalent addition of saturated fatty acids to protein substrates, is important in regulating a myriad of cellular functions in ...

Pure Shift Nuclear Magnetic Resonance: a New Tool for Plant Metabolomics

Nuclear Magnetic Resonance (NMR) is one of the most powerful tools used in metabolomics. It stands as a highly accurate and reproducible method that not only provides quantitative data but also permits structural identification of the metabolites present in complex mixtures.
Metabolic profiling by 1H NMR has proven useful in the study of various types of plant scenarios, which include the evaluation of crop&#160;conditions, harvest and post- harvest treatments, metabolic phenotyping, metabolic pathways, gene regulation, identification of biomarkers, chemotaxonomy, quality control, denomination of origin, among others. However, signal overlapping of the large number of resonances with expanded J-coupling multiplicities complicates the spectra analysis and its interpretation, and represents a limitation for classical 1H NMR profiling.
In the last decade, novel NMR broadband homonuclear decoupling techniques through which multiplet signals collapse into single resonance lines - commonly called Pure Shift methods - have been developed to overcome the spectra resolution problem inherent to 1H NMR classical spectra.
Here a step-by-step protocol of the plant extract preparation and the procedure to record optimal Pure Shift PSYCHE and SAPPHIRE-PSYCHE spectra in three different plant matrices - Vanilla plant&#160;leaves, potato tubers (S. tuberosum), and Cape gooseberries (P. peruviana) - is presented. The effect of the gain in resolution in metabolic identification, correlation analysis and multivariate analyses, as compared against classical spectra, is discussed.

<meta charset="utf8"></head><body>Saf Vardiya Nükleer Manyetik Rezonans: Bitki Metabolomikleri için Yeni Bir Araç

This paper presents the use of PSYCHE and SAPPHIRE-PSYCHE in the metabolic profiling of plants and includes detailed procedures for sample preparation and optimal Pure Shift NMR spectra recording. Examples through which the gain in resolution achieved by homonuclear decoupling allows a more comprehensive understanding of the system are discussed.

Saf Vardiya Nükleer Manyetik Rezonans: Bitki Metabolomikleri için Yeni Bir Araç

Nuclear Magnetic Resonance (NMR) is one of the most powerful tools used in metabolomics. It stands as a highly accurate and reproducible method that not ...