This work was supported by an Alfred P. Sloan Research Fellowship (to C.-F.C.) and an NIH R01 grant (5R01GM098026-05 to C.-F.C.). We thank David Crowe for access to the advanced infrared imaging system.

HINWEIS: EMSAs fluoreszenzmarkierten DNA - Sonden oder andere Formen von markierten DNA die gleichen Protokolle für Protein oder Zellextraktzubereitung, Protein-DNA - Bindungsreaktion und PAGE Gelzubereitung und Ausführen (1A) verwendet wird . Die wichtigsten Unterschiede sind DNA-Markierungsverfahren, post-run Gel Verarbeitungsschritte und Nachweismethoden. 1. Gel Zubereitung <ol><li> Bereiten 5% nativen Polyacrylamidgel, enthaltend 0,5 × TBE (45 mM Tris-Borat, 1 mM EDTA) und 2,5% Glycerin, ein Mini-Protein-Gel-System (8,3 cm Breite x 7,3 cm Länge x 0,75 mm Dicke). <ol><li> Zur Herstellung von 30 ml Gel-Lösung für 4 Gele, mischen 5 ml 30% Acrylamid / Bis (37,5: 1), 3 ml 5-fach TBE (0,45 M Tris-Borat, 10 mM EDTA), 1,5 ml 50% Glycerol, 300 &amp; mgr; l von 10% Ammoniumpersulfat, 15 &amp; mgr; l TEMED und 20,2 ml ddH 2 O gründlich. HINWEIS: Acrylamid schädlich und giftig ist, Griff mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung. </li&gt; </ol></li><li> Cast der Gel-Lösung sofort. Nach der Polymerisation wickeln die Gele in klaren Plastikfolie mit 0,5x TBE vorbenetzt und lagern Sie sie bei 4 ° C. </li></ol> 2. Herstellung von Infrarot-Fluoreszenzfarbstoff-markierten Sonden HINWEIS: Halten Sie die Infrarot-Fluoreszenz-Farbstoff-markierten Oligonukleotiden weg von Licht so viel wie möglich während der Herstellung, Lagerung und Experimente. <ol><li> Gestalten und bestellen Oligonukleotide. <ol><li> Entwerfen Sie lange Oligonukleotid für ~ 51-mere. HINWEIS: Die lange Oligonukleotid - Sequenz des LIM-4 / SOX-2 - Sonde ist TATCATATCTATTCTA TGATTA AATACC TATTCA TTTCAAAATCTTCTCCC. Lange Oligonukleotide erfordern keine PAGE oder HPLC-Reinigung. </li><li> Entwerfen komplementäre kurze Oligonukleotide für ~ 14-mers mit Infrarot-Fluoreszenzfarbstoff-Modifikation am 5&#39;-Terminus (5&#39;Dye) und eine Schmelztemperatur über 37 ° C. HINWEIS: Die kurze Oligonukleotid-Sequenz des LIM-4 / SOX2 Sonde ist 5&#39;Dye-GGGAGAAGATTTTG. Die Mindestsynthesemaßstab von 5&#39;Dye-markierte kurze Oligonukleotide ist 100 nM. Daher erfordern die Oligonucleotide HPLC-Reinigung. </li></ol></li><li> Resuspendieren Oligonukleotiden in 1x Tris-EDTA-Puffer (TE: 10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 1 mM EDTA) auf eine Endkonzentration von 100 uM. </li><li> Anneal Short (5&#39;Dye) und lange Oligonukleotide. <ol><li> Mischungs 0,6 ul 5&#39;Dye-Short Oligo (100 uM), 1,2 ul Oligo Lange (100 uM), und 28,2 &amp; mgr; l Natriumchlorid-Tris-EDTA-Puffer (STE: 100 mM NaCl; 10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 1 mM EDTA) in einem 1,5 ml-Röhrchen. </li><li> Das Röhrchen wird Wasser für 5 min in kochendem. Schalten Sie die Wärmequelle aus und lassen Sie das Wasser mit dem geglüht Oligos O / N kühlen im Dunkeln. </li></ol></li><li> Füllen Sie das 5&#39;-Überhang von vergütetem 5&#39;Dye-kurz / lang Oligos mit Klenow-DNA-Polymerase doppelsträngigen DNA-Sonden zu machen. <ol><li> Bereiten Sie die Reaktion durch Vermischen30 ul geglüht kurz / lang Oligos mit 5&#39;Dye Tag, 8,5 ul 10x Klenow-Puffer, 1,7 ul 10 mM dNTPs, 1,7 ul Klenow (3 &#39;-&gt; 5&#39; exo) (5 u / ul) und von 43,1 &amp; mgr; l ddH 2 O in einem 0,2 ml PCR - Röhrchen. </li><li> Inkubieren 60 min bei 37 ° C in einer PCR-Maschine. </li><li> Hinzufügen, 3,4 &amp; mgr; l 0,5 M EDTA die Reaktion und Wärme inactivate für 20 min in einer PCR-Maschine bei 75 ° C zu beenden. </li></ol></li><li> Verdünnte eingefüllte in Sonden (0,7 uM) in STE für Endkonzentration von 0,1 uM. </li><li> Shop Oligos bei -20 ° C im Dunkeln bis zur Verwendung. Oligos kann für bis zu einem Jahr in diesem Zustand gelagert werden. HINWEIS: Um die DNA-Sonden mit mutierten Bindungsstellen, mutierten Versionen von langen Oligonukleotiden geglüht mit 5&#39;Dye-markierte kurze Oligonukleotide, gefolgt von Fill-in von 5&#39;-Überhänge mit Klenow erzeugen. Es hat sich gezeigt, daß die Sonde mit einem Strang mit einem Infrarot fluoreszierenden markierten gezeigtFarbstoff nur 30% Intensität der Sonde mit den beiden mit dem Farbstoff markierten Stränge. Wenn die Signalintensität verstärkt werden muss, sind lange Oligos beider Stränge mit Infrarot-Fluoreszenzfarbstoffen an 5&#39;-Enden markiert und geglüht Infrarot-Fluoreszenz-Farbstoff-markierten Sonden machen. </li></ol> 3. Herstellung von unbeschriftet / kalt Probes (Wettbewerber) Hinweis: Lange Oligonukleotide komplementäre Sequenzen (Long und LongR) mit unmarkierten Sonden zur Wettbewerbsanalyse zu machen geglüht wurden Infrarot-Fluoreszenz-Farbstoff-markierten Sonden. <ol><li> Mix 20 ul 100 uM lang, 20 ul 100 uM LongR Oligonukleotiden und 60 &amp; mgr; l STE in einem 1,5-ml-Röhrchen. </li><li> Das Röhrchen wird Wasser für 5 min in kochendem, schalten Sie die Wärmequelle aus und lassen Sie das Wasser mit dem geglüht Oligos über Nacht abkühlen. </li></ol> 4. Bindungsreaktion und Elektrophorese <ol><li> Vorbereitung 1 ml 5x Bindungspuffer um 50 &amp; mgr; l Misch60; 1 M Tris-HCl, pH 7,5; 10 ul 5 M NaCl; 200 ul 1 M KCl, 5 ul 1 M MgCl 2, 10 ul 0,5 M EDTA, pH 8,0; 5 ul 1 M DTT; 25 ul 10 mg / ml BSA und 695 &amp; mgr; l ddH 2 O. HINWEIS: Der 5x Bindungspuffer kann bei -20 ° C aliquotiert und gelagert werden. Ein weiterer Punkt zu beachten ist, dass verschiedene Transkriptionsfaktoren verschiedene Modifikationen an den Bindungspuffer haben. </li><li> Kurz vor dem Bindungsreaktionen einrichten, Vorlauf 5% nativen Polyacrylamidgel in 0,5x TBE + 2,5% Glycerin alle Spuren von Ammoniumpersulfat bei 80 V für 30 zu entfernen - 60 min, oder bis der Strom nicht ändert länger mit der Zeit. </li><li> Legen Sie die Bindungsreaktion in Endvolumen von 20 &amp; mgr; l auf. <ol><li> Mischungs 4 ul 5x Bindungspuffer, 80 bis 200 ng gereinigtem Protein A (in 50% Glycerin, dh SOX-2), 1 ul 0,1 uM Farbstoff-konjugierten Sonde (Endkonzentrationentration: 5 nM) und ddH 2 O. </li><li> Optional: Wenn kalte Sonde Konkurrenten erforderlich sind, fügen verschiedene Konzentrationen (2x, 10x, 25x, 50x, 100x, etc.) von kalten Sonden. </li><li> Optional: Wenn die Wechselwirkung zwischen den Proteinen A und B (dh SOX-2 und LIM-4) geprüft wird, hinzufügen von 80 bis 200 ng gereinigtem Protein B (in 50% Glycerin, dh LIM-4). </li><li> Optional: Wenn Kernextraktzubereitung verwendet wird , und spezifische Bindung von Protein A ist , validiert werden, Antikörper , der spezifisch an Protein A addieren (dh anti-6xHis, anti-FLAG, etc.). </li><li> Inkubieren bei R / T in Dunkelheit für 15 min. </li></ol></li><li> Legen Sie alle der Bindungsreaktion auf das Gel, und führen Sie das Gel bei 10 V / cm auf den gewünschten Abstand. </li></ol> 5. Imaging HINWEIS: Das Gel wurde direkt in den Glasplatten mit einer erweiterten Infrarot-Abbildungssystem abgetastet. Daher kann das Gel weiter aufgelöst werden und wiederholt (1C gescannt und <strong&gt; 2). Eine Nahinfrarot-Fluoreszenzabbildungssystem in erster Linie für Western-Blots wurde auch getestet, das Gel zu scannen, sondern nur die erweiterten Infrarot-Abbildungssystem konnte das Gel mit guter Auflösung zu scannen. Die beschriebene Methodik ist spezifisch für ein bestimmtes Infrarot-Abbildungssoftware, obwohl andere Software-Pakete verwendet werden können. <ol><li> Reinigen Sie das Bett des Scanners mit ddH 2 O und gut trocknen vor dem Scannen. Wischen Sie die Glasplatten des Gels trocknen und legen Sie die Platten, die das Gel auf dem Scannerbett. </li><li> Öffnen Sie die Infrarot-Imaging-Software und gehen Sie auf die &quot;Acquire&quot; Tab. Wenn die dünnere Platte (1 mm) auf dem Scanner-Bett gelegt wird, verwenden Sie die Einstellungen von Kanal: 700, Intensität: Auto, Auflösung: 169 &amp; mgr; m, Qualität: mittel, und Focus-Offset: 1,5 mm. Wenn die dickere Platte (3 mm) auf dem Scanner-Bett gelegt wird, verwenden Sie die Einstellungen von Kanal: 700, Intensität: Auto, Auflösung: 84 &amp; mgr; m, Qualität: mittel, und Focus-Offset: 3,5 mm. Fokus-Offset ist abhängig von derDicke der Glasplatte. </li><li> Wählen Sie den Bereich, der das Gel auf dem Scanner einnimmt. Klicken Sie auf &#39;Start&#39;, um den Scanvorgang zu starten. </li><li> Wiederholen Sie die Elektrophorese und scannen zusätzlich nach Bedarf. </li></ol>

<ol>
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The authors have nothing to disclose.

fEMSAs sind ein leistungsfähiges Werkzeug Protein-DNA-Wechselwirkungen, und sind eine Alternative zur radioaktiven Markierung von DNA zu untersuchen. Fluoreszenzfarbstoffe, wie beispielsweise Infrarot-Farbstoffe sind im Handel erhältlich und bieten einen sicheren und umweltfreundlichen Verfahren im Vergleich zur radioaktiven DNA-Markierung. EMSA unter Verwendung von Infrarot-Fluoreszenz-Farbstoff-markierten Oligonukleotiden erfordern keine Nachlauf Gel Verarbeitungsschritte und somit Zeit und Kosten im Vergleich zu an...

EMSAs verwendet , durch Verwendung nativer Polyacrylamid - Gelelektrophorese (PAGE) Wechselwirkungen zwischen DNA und Proteinen zu analysieren , um eine Mischung aus einem Protein von Interesse und eine markierte DNA - Sonde enthält , potentielle Zielstellen des Proteins 1 zu lösen. Eine DNA-Sonde mit Protein gebunden langsamer wandert mit einer freien DNA-Sonde verglichen wird, und daher verzögert in seine Wanderung durch eine Polyacrylamid-Matrix. Die radioaktive Markierung von DNA durch 32 P hat die vorherrschende Methode zur Detektion in EMSA gewesen. Obwohl die Anwendung von radioaktiven Markierung in der biochemischen Forschung vorteilhaft war, sind Methoden der alternativen DNA-Markierung mit vergleichbarer Empfindlichkeit wird aufgrund der Risiken Gesundheit und Sicherheit beschäftigt im Umgang mit Radioaktivität in Verbindung gebracht. Diese alternativen Verfahren umfassen die Konjugation von DNA mit Biotin 2 oder Digoxigenin (DIG) 3 (beide werden dann durch Chemilumineszenzsystemen erkannt), SYBR Grün - Färbung der PAGE - Gels 4,oder direkte Detektion von DNA-Fluoreszenzfarbstoff - Konjugate durch das Gel 5,6 scannen. Die aufgelösten Gele von EMSA unter Verwendung von radioaktiv markierten DNA - Sonden erfordern Nachlauf Verarbeitung durch Autoradiographie Filme oder ein Phosporimager System radioaktiven Signale 1,7 erfassen. Gele EMSAs Biotin- 2 oder DIG-konjugierten 3 DNA - Sonden müssen ebenfalls verarbeitet und auf eine geeignete Membran übertragen und dann durch Chemilumineszenz 6 detektiert. SYBR grüne Färbung des Gels erfordert Nachlauf Gel - Färbung und einen fluoreszierenden Scanner 4. Da Nachlauf Gel Verarbeitungsschritte zur EMSAs unter Verwendung dieser DNA-Markierungstechniken benötigt werden, kann die aufgelöste Gel nur einmal getestet werden. Im Gegensatz dazu markierten DNA-Sonden mit Fluorophoren direkt in dem Gel in den Glasplatten durch einen Scanner detektiert werden kann. Daher können die DNA-Protein-Wechselwirkungen mehrmals zu verschiedenen Zeitpunkten während des Laufs überwacht und analysiert werden, diedeutlich reduziert Zeit und Kosten. Die DNA-Fluoreszenzfarbstoff - Konjugate , die für EMSAs verwendet wurden , umfassen Cy3 6,8, 6,8 Cy5, Fluorescein 9 und Infrarot - Fluoreszenzfarbstoffe 4-6. Transkriptionelle Regulation erfordert Protein-DNA-Wechselwirkungen von Transkriptionsfaktoren und ihre Zielgene. Die Koordination dieser Interaktionen erzeugt diverse Zelltypen aus einem gemeinsamen Vorläufer bei Tierentwicklung. Eine unvoreingenommene vorwärts genetisches Screening identifizierten eine Missense - Mutation, G73E, in der hochkonservierten HMG DNA-Bindungsdomäne des SOX-2 Caenorhabditis elegans Transkriptionsfaktor. Die Mutation führt zu einer Zellidentität Transformation von AWB olfaktorischen Neuronen in AWC Riechzellen auf molekularer, morphologischen und funktionellen Ebenen 5,10. SOX-2 regelt differentiell die terminale Differenzierung von AWB und AWC Neuronen mit kontextabhängigen Partner Transkriptionsfaktoren interagieren und die jeweiligenDNA - Zielstellen 5,10. SOX-2 Partner mit LIM-4 (LHX) in Terminal AWB neuronale Differenzierung, während SOX-2 Partner mit CEH-36 (OTX / OTD) in Terminal AWC neuronale Differenzierung. Luziferase - Reporter - Assays zeigen , dass SOX-2 und mutierten SOX-2 G73E Proteine haben kooperative Wechselwirkungen mit Transkriptions Cofaktoren LIM-4 und CEH-36 einen Promotor in AWB und AWC Neuronen zu aktivieren. Allerdings SOX-2 und mutierten SOX-2 G73E angezeigt Differentialaktivierungseigenschaften des Promotors. Um die molekulare Basis der differentiellen DNA - Bindungsaktivitäten von SOX-2 und SOX-2 G73E untersuchen, fEMSAs wurden mit diesen Proteinen und deren potentielle Zielstellen durchgeführt. Zunächst wurde ein Ansatz Bioinformatics die biologisch relevante DNA-Bindungssequenzen innerhalb des 1 kb-Promotorregion in der Luciferase-Assay verwendet, zu identifizieren. Da mehrere potenzielle SOX-2 Bindungsstellen im gesamten Promotor anwesend waren, konzentrierten wir unsauf den vorhergesagten SOX-2-Bindungsstellen neben mutmaßlichen CEH-36 oder LIM-4-Bindungsstellen und evolutionär zwischen verschiedenen Nematodenarten konserviert. Diese Sequenzen wurden deletiert oder mutiert und anschließend in vivo auf ihre Aktivität getestet , um GFP reporter Transgenen in AWB oder AWC Neuronen exprimieren. Durch diesen Ansatz identifizierten wir Potential LIM-4 / SOX-2 und CEH-36 / SOX-2 benachbarte Zielstellen , die speziell die für die Expression von GFP in AWB und AWC Neuronen sind jeweils 5. Wir untersuchten die möglichen Unterschiede in der DNA - Bindung von SOX-2 und SOX-2 G73E mit FEMSA mit den identifizierten LIM-4 / SOX-2 und CEH-36 / SOX-2 benachbarte Zielstellen. Unsere EMSA - Analyse zeigte , dass SOX-2 G73E nicht die DNA - Sonde hat binden die LIM-4 / SOX-2 benachbarte Zielstellen (erforderlich für die Genexpression in AWB) so effizient wie WT SOX-2 tat enthält. Allerdings SOX-2 und SOX-2 G73E hatte keinen Unterschied in der Bindung der DNA - Sonde die CEH-36 / SOX-2 a enthält ,djacent Zielstelle (erforderlich für die Genexpression in AWC) 5,10. Unsere FEMSA Analysen für die AWB-to-AWC Zellidentität Phänotyp Transformation in beeinflussen spezifische DNA - Bindungsaktivität mechanistischen Einblick in die Natur des SOX-2 G73E - Mutation bereitstellen. Hier beschreiben wir ein optimiertes Protokoll von FEMSA unter Verwendung von gereinigtem 6xHis-SOX-2 oder 6 × His-SOX-2 G73E zusammen mit Infrarot - Fluoreszenzfarbstoff-markierten DNA - Sonden mit den LIM-4 / SOX-2 benachbarte Zielstellen als Fallstudie in Angriff zu nehmen eine wichtige biologische Frage.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1019">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1&#160;</td>
			<td style="width:199px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:207px;">1610158</td>
			<td style="width:281px;">Acrylamide is harmful and toxic.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">6x-His Epitope Tag Antibody (HIS.H8)</td>
			<td style="width:199px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:207px;">MA1-21315</td>
			<td style="width:281px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Anti Flag M2 antibody&#160;</td>
			<td style="width:199px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:207px;">F3165-.2MG</td>
			<td style="width:281px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Bovine Serum Albumin molecular-biology-grade</td>
			<td style="width:199px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:207px;">B9000S</td>
			<td style="width:281px;"></td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:332px;">5&#39;IRDye700-labeled DNA Oligos</td>
			<td style="width:199px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:207px;">Custom DNA oligo</td>
			<td style="width:281px;">These are referred as 5&#39;Dye-labeled or infrared fluorescent dye-labeled DNA oligos in the manuscript. The company will custom synthesize 5&#39; IRDye labeled DNA oligonucleotides.&#160; Requires minimum 100&#956;M scale synthesis and HPLC purification.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Klenow Fragment (3&#39;--&#62;5&#39; exo-)</td>
			<td style="width:199px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:207px;">M0212S</td>
			<td style="width:281px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">LightShif Poly (dI-dC)</td>
			<td style="width:199px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:207px;">20148E</td>
			<td style="width:281px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:332px;">Mini-PROTEAN&#160;Vertical Electrophoresis Cell&#160;</td>
			<td style="width:199px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:207px;">1658000FC&#160;</td>
			<td style="width:281px;">This is referred as a mini protein gel system in the manuscript. Any electrophoretic system can be used as long as they are clear glass plates of less than 25cm x 25cm in size.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:332px;">Odyssey CLx Infrared Imaging System</td>
			<td style="width:199px;">LI-COR Biotechnology</td>
			<td style="width:207px;">Odyssey CLx Infrared Imagng System</td>
			<td style="width:281px;">This is referred as an advanced infrared imaging system in the mansucript.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Odyssey Fc Imaging System&#160;</td>
			<td style="width:199px;">LI-COR Biotechnology</td>
			<td style="width:207px;">Odyssey Fc Dual-Mode Imaging System</td>
			<td style="width:281px;">This is referred as a near-infrared fluorescent imaging system primarily for Western blots in the mansucript.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:332px;">Image Studio software (version 4.0)</td>
			<td style="width:199px;">LI-COR Biotechnology</td>
			<td style="width:207px;">Image Studio software&#160;</td>
			<td style="width:281px;">This is referred as a particular imaging software in the mansucript.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Orange G</td>
			<td style="width:199px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:207px;">O3756-25G</td>
			<td style="width:281px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">6x Orange loading dye</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td>0.25% Orange G; 30% Glycerol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.5x TBE</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td>45 mM Tris-Borate; 1 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">1x TE</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td>10 mM Tris-HCl; 1 mM EDTA, pH8.0</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:332px;">1x STE</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td style="width:281px;">100 mM NaCl; 10 mM Tris-HCl, pH8.0; 1 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">5x Binding Buffer</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td style="width:281px;">50 mM Tris-HCl, pH7.5; 50 mM NaCl; 200 mM KCl; 5 mM MgCl2; 5 mM EDTA, pH8.0; 5 mM DTT; 250 ug/ml BSA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an optimized protocol for electrophoretic mobility shift assay using infrared fluorescent dye-labeled oligonucleotides

Elektrophoretische Mobilität Shift-Assays (EMSA) sind eine instrumentale Werkzeug, um die Wechselwirkungen zwischen Proteinen und deren Ziel-DNA-Sequenzen zu charakterisieren. Die Radioaktivität ist die vorherrschende Methode der DNA-Markierung in EMSA gewesen. Allerdings haben jüngste Fortschritte in der Fluoreszenzfarbstoffe und Scanverfahren die Verwendung von Fluoreszenzmarkierung von DNA als Alternative zu den Radioaktivität für den Vorteilen der leichten Handhabung Aufforderung, Zeitersparnis und reduziert die Kosten und die Verbesserung der Sicherheit. Wir haben vor kurzem fluoreszierende EMSA (FEMSA) erfolgreich adressieren eine wichtige biologische Frage verwendet. Unsere Analyse liefert FEMSA mechanistischen Einblick in die Wirkung einer Missense-Mutation, G73E, in der hochkonservierten HMG Transkriptionsfaktor SOX-2 auf olfaktorische Neuronen Typ Streuung. Wir fanden , dass mutierte SOX-2 G73E Protein spezifische DNA - Bindungsaktivität verändert, wodurch olfaktorischen Neuronen Identität Transformation verursacht. Hier stellen wir ein optimiertes und kostengünstiges Schritt-für-Schritt-Protokollfür FEMSA mit Infrarot - Fluoreszenz - Farbstoff-markierten Oligonukleotiden , die LIM-4 / SOX-2 benachbarte Zielstellen und gereinigt SOX-2 - Proteine (WT und Mutanten - SOX-2 G73E Proteine) als biologisches Beispiel enthält.

Orange G loading dye (6x: 0.12 g Orange G in 100 ml 30% Glycerol) können vor dem Laden in die Bindungsreaktion zugesetzt werden, um das Fortschreiten der Elektrophorese sichtbar zu machen. Weitere Lade- Farbstoffe Bromphenolblau einschließlich wird während des Scannens und daher interferieren Bildanalyse (1B) detektiert werden. In einigen Fällen von EMSAs, insbesondere wenn die Kernextraktzubereitung verwe...

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An Optimized Protocol for Electrophoretic Mobility Shift Assay Using Infrared Fluorescent Dye-labeled Oligonucleotides

Wir beschreiben hier ein optimiertes Protokoll von fluoreszierenden elektrophoretische Mobilitäts-Shift-Assays (FEMSA) gereinigtes SOX-2-Proteine ​​zusammen mit Infrarot-Fluoreszenzfarbstoff-markierten DNA-Sonden als Fallstudie eine wichtige biologische Frage zu bekämpfen.

Ein optimiertes Protokoll für die elektrophoretische Mobilitäts-Shift-Assay unter Verwendung von Infrarot-Fluoreszenzfarbstoff-markierten Oligonukleotide

Electrophoretic Mobility Shift Assays (EMSA) are an instrumental tool to characterize the interactions between proteins and their target DNA sequences. ...

an-optimized-protocol-for-electrophoretic-mobility-shift-assay-using

Research

JoVE Journal

Biochemistry

15.5K Aufrufe.  University of Illinois at Chicago.  Wir beschreiben hier ein optimiertes Protokoll von fluoreszierenden elektrophoretische Mobilitäts-Shift-Assays (FEMSA) gereinigtes SOX-2-Proteine ​​zusammen mit Infrarot-Fluoreszenzfarbstoff-markierten DNA-Sonden als Fallstudie eine wichtige biologische Frage zu bekämpfen. 

Serie: An Optimized Protocol for Electrophoretic Mobility Shift Assay Using Infrared Fluorescent Dye-labeled Oligonucleotides

Optimized Protocol for the Extraction of Proteins from the Human Mitral Valve

Analysis of the cellular proteome can help to elucidate the molecular mechanisms underlying diseases due to the development of technologies that permit the large-scale identification and quantification of the proteins present in complex biological systems.The knowledge gained from a proteomic approach can potentially lead to a better understanding of the pathogenic mechanisms underlying diseases, allowing for the identification of novel diagnostic and prognostic disease markers, and, hopefully, of therapeutic targets. However, the cardiac mitral valve represents a very challenging sample for proteomic analysis because of the low cellularity in proteoglycan and collagen-enriched extracellular matrix. This makes it challenging to extract proteins for a global proteomic analysis. This work describes a protocol that is compatible with subsequent protein analysis, such as quantitative proteomics and immunoblotting. This can allow for the correlation of data concerning protein expression with data on quantitative mRNA expression and non-quantitative immunohistochemical analysis. Indeed, these approaches, when performed together, will lead to a more comprehensive understanding of the molecular mechanisms underlying diseases, from mRNA to post-translational protein modification. Thus, this method can be relevant to researchers interested in the study of cardiac valve physiopathology.

The protein composition of the human mitral valve is still partially unknown, because its analysis is complicated by low cellularity and therefore by low protein biosynthesis. This work provides a protocol to efficiently extract protein for the analysis of the mitral valve proteome.

Optimiertes Protokoll zur Extraktion von Proteinen aus dem menschlichen Mitralventil

Analysis of the cellular proteome can help to elucidate the molecular mechanisms underlying diseases due to the development of technologies that permit ...

Forschung

Biochemie

DNA Polymerase Activity Assay Using Near-infrared Fluorescent Labeled DNA Visualized by Acrylamide Gel Electrophoresis

For any enzyme, robust, quantitative methods are required for characterization of both native and engineered enzymes. For DNA polymerases, DNA synthesis can be characterized using an in vitro DNA synthesis assay followed by polyacrylamide gel electrophoresis. The goal of this assay is to quantify synthesis of both natural DNA and modified DNA (M-DNA). These approaches are particularly useful for resolving oligonucleotides with single nucleotide resolution, enabling observation of individual steps during enzymatic oligonucleotide synthesis. These methods have been applied to the evaluation of an array of biochemical and biophysical properties such as the measurement of steady-state rate constants of individual steps of DNA synthesis, the error rate of DNA synthesis, and DNA binding affinity. By using modified components including, but not limited to, modified nucleoside triphosphates (NTP), M-DNA, and/or mutant DNA polymerases, the relative utility of substrate-DNA polymerase pairs can be effectively evaluated. Here, we detail the assay itself, including the changes that must be made to accommodate nontraditional primer DNA labeling strategies such as near-infrared fluorescently labeled DNA. Additionally, we have detailed crucial technical steps for acrylamide gel pouring and running, which can often be technically challenging.

This protocol describes the characterization of DNA polymerase synthesis of modified DNA through observation of changes to near-infrared fluorescently labeled DNA using gel electrophoresis and gel imaging. Acrylamide gels are used for high resolution imaging of the separation of short nucleic acids, which migrate at different rates depending on size.

DNA-Polymerase-Aktivität Assay mit Nahinfrarot-Leuchtstoff beschrifteten DNA durch Acrylamid Gelelektrophorese sichtbar gemacht

For any enzyme, robust, quantitative methods are required for characterization of both native and engineered enzymes. For DNA polymerases, DNA synthesis ...

Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins

Here we are presenting a novel method to study the sumoylation of proteins and their sub-cellular localization in mammalian cells and nematode oocytes. This method utilizes a recombinant modified SUMO-trapping protein fragment, kmUTAG, derived from the Ulp1 SUMO protease of the stress-tolerant budding yeast Kluyveromyces marxianus. We have adapted the properties of the kmUTAG for the purpose of studying sumoylation in a variety of model systems without the use of antibodies. For the study of SUMO, KmUTAG has several advantages when compared to antibody-based approaches. This stress-tolerant SUMO-trapping reagent is produced recombinantly, it recognizes native SUMO isoforms from many species, and unlike commercially available antibodies it shows reduced affinity for free, unconjugated SUMO. Representative results shown here include the localization of SUMO conjugates in mammalian tissue culture cells and nematode oocytes.

SUMO is an essential and highly conserved, small ubiquitin-like modifier protein. In this protocol we are describing the use of a stress-tolerant recombinant SUMO-trapping protein (kmUTAG) to visualize native, untagged SUMO conjugates and their localization in a variety of cell types.

Lokalisierung von SUMO-modifizierten Proteinen mit fluoreszierenden Sumo-Fallen Proteinen

Here we are presenting a novel method to study the sumoylation of proteins and their sub-cellular localization in mammalian cells and nematode oocytes. ...

Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy

The phenomenon of protein misfolding and aggregation results in the formation of highly heterogeneous protein aggregates, which are associated with neurodegenerative conditions such as Alzheimer&#8217;s and Parkinson&#8217;s diseases. In particular low molecular weight aggregates, amyloid oligomers, have been shown to possess generic cytotoxic properties and are implicated as neurotoxins in many forms of dementia. We illustrate the use of methods based on atomic force microscopy (AFM) to address the challenging task of characterizing the morphological, structural and chemical properties of these aggregates, which are difficult to study using conventional structural methods or bulk biophysical methods because of their heterogeneity and transient nature. Scanning probe microscopy approaches are now capable of investigating the morphology of amyloid aggregates with sub-nanometer resolution. We show here that infrared (IR) nanospectroscopy (AFM-IR), which simultaneously exploits the high resolution of AFM and the chemical recognition power of IR spectroscopy, can go further and enable the characterization of the structural properties of individual protein aggregates, and thus offer insights into the aggregation mechanisms. Since the approach that we describe can be applied also to the investigations of the interactions of protein assemblies with small molecules and antibodies, it can deliver fundamental information to develop new therapeutic compounds to diagnose or treat neurodegenerative disorders.

We describe the application of infrared nanospectroscopy and high-resolution atomic force microscopy to visualize the process of protein self-assembly into oligomeric aggregates and amyloid fibrils, which is closely associated with the onset and development of a wide range of human neurodegenerative disorders.

Charakterisierung einzelner Proteinaggregate durch Infrarot-Nanospektroskopie und Atomkraftmikroskopie

The phenomenon of protein misfolding and aggregation results in the formation of highly heterogeneous protein aggregates, which are associated with ...

Acyl-PEGyl Exchange Gel Shift Assay for Quantitative Determination of Palmitoylation of Brain Membrane Proteins

Activity-dependent alterations in the levels of synaptic AMPA receptors (AMPARs) within the postsynaptic density (PSD) is thought to represent a cellular mechanism for learning and memory. Palmitoylation regulates localization and function of many synaptic proteins including AMPA-Rs, auxiliary factors and synaptic scaffolds in an activity-dependent manner. We identified the synapse differentiation induced gene (SynDIG) family of four genes (SynDIG1-4) encoding brain-specific transmembrane proteins that associate with AMPARs and regulate synapse strength. SynDIG1 is palmitoylated at two cysteine residues located at positions 191 and 192 in the juxta-transmembrane region important for activity-dependent excitatory synapse development. Here, we describe an innovative biochemical approach, the acyl-PEGyl exchange gel shift (APEGS) assay, to investigate the palmitoylation state of any protein of interest and demonstrate its utility with the SynDIG family of proteins in mouse brain lysates.

Palmitoylation entails the incorporation of a 16-carbon palmitate moiety to cysteine residues of target proteins in a reversible manner. Here, we describe a biochemical approach, the acyl-PEGyl exchange gel shift (APEGS) assay, to investigate the palmitoylation state of any protein of interest in mouse brain lysates.

Acyl-PEGyl Exchange Gel Shift Assay zur quantitativen Bestimmung der Palmitoylierung von Gehirnmembranproteinen

Activity-dependent alterations in the levels of synaptic AMPA receptors (AMPARs) within the postsynaptic density (PSD) is thought to represent a cellular ...

An Electrochemiluminescence-Based Assay for MeCP2 Protein Variants

The ECLIA is a versatile method which is able to quantify endogenous and recombinant protein amounts in a 96-well format. To demonstrate ECLIA efficiency, this assay was used to analyze intrinsic levels of MeCP2 in mouse brain tissue and the uptake of TAT-MeCP2 in human dermal fibroblasts. The MeCP2-ECLIA produces highly accurate and reproducible measurements with low intra- and inter-assay error. In summary, we developed a quantitative method for the evaluation of MeCP2 protein variants that can be utilized in high-throughput screens.

The electrochemiluminescence immunoassay (ECLIA) is a novel approach for quantitative detection of endogenous and exogenously applied MeCP2 protein variants, which produces highly quantitative, accurate and reproducible measurements with low intra- and inter-assay error over a wide working range. Here, the protocol for the MeCP2-ECLIA in a 96-well format is described.

Ein Electrochemilumineszenz-basierter Assay für MeCP2-Proteinvarianten

The ECLIA is a versatile method which is able to quantify endogenous and recombinant protein amounts in a 96-well format. To demonstrate ECLIA efficiency, ...

Assessment of Cellular Oxidation using a Subcellular Compartment-Specific Redox-Sensitive Green Fluorescent Protein

Measuring the intracellular oxidation/reduction balance provides an overview of the physiological and/or pathophysiological redox status of an organism. Thiols are especially important for illuminating the redox status of cells via their reduced dithiol and oxidized disulfide ratios. Engineered cysteine-containing fluorescent proteins open a new era for redox-sensitive biosensors. One of them, redox-sensitive green fluorescent protein (roGFP), can easily be introduced into cells with adenoviral transduction, allowing the redox status of subcellular compartments to be evaluated without disrupting cellular processes. Reduced cysteines and oxidized cystines of roGFP have excitation maxima at 488 nm and 405 nm, respectively, with emission at 525 nm. Assessing the ratios of these reduced and oxidized forms allows the convenient calculation of redox balance within the cell. In this method article, immortalized human triple-negative breast cancer cells (MDA-MB-231) were used to assess redox status within the living cell. The protocol steps include MDA-MB-231 cell line transduction with adenovirus to express cytosolic roGFP, treatment with H2O2, and assessment of cysteine and cystine ratio with both flow cytometry and fluorescence microscopy.

This protocol describes the assessment of subcellular compartment-specific redox status within the cell. A redox-sensitive fluorescent probe allows convenient ratiometric analysis in intact cells.

Bewertung der zellulären Oxidation mit einem subzellulären Kompartiment-spezifischeredox-sensitivegrüne fluoreszierende Protein

Measuring the intracellular oxidation/reduction balance provides an overview of the physiological and/or pathophysiological redox status of an organism. ...

Fluorescent Leakage Assay to Investigate Membrane Destabilization by Cell-Penetrating Peptide

Cell-penetrating peptides (CPPs) are defined as carriers that are able to cross the plasma membrane and to transfer a cargo into cells. One of the main common features required for this activity resulted from the interactions of CPPs with the plasma membrane (lipids) and more particularly with components of the extracellular matrix of the membrane itself (heparan sulphate). Indeed, independent of the direct translocation or the endocytosis-dependent internalization, lipid bilayers are involved in the internalization process both at the level of the plasma membrane and at the level of intracellular traffic (endosomal vesicles). In this article, we present a detailed protocol describing the different steps of a large unilamellar vesicles (LUVs) formulation, purification, characterization, and application in fluorescence leakage assay in order to detect possible CPP-membrane destabilization/interaction and to address their role in the internalization mechanism. LUVs with a lipid composition reflecting the plasma membrane content are generated in order to encapsulate both a fluorescent dye and a quencher. The addition of peptides in the extravesicular medium and the induction of peptide-membrane interactions on the LUVs might thus induce in a dose-dependent manner a significant increase in fluorescence revealing a leakage. Examples are provided here with the recently developed tryptophan (W)- and arginine (R)-rich Amphipathic Peptides (WRAPs), which showed a rapid and efficient siRNA delivery in various cell lines. Finally, the nature of these interactions and the affinity for lipids are discussed to understand and to improve the membrane translocation and/or the endosomal escape.

The fluorescence leakage assay is a simple method that enables the investigation of peptide/membrane interactions in order to understand their involvement in several biological processes and especially the ability of cell-penetrating peptides to disturb phospholipids bilayers during a direct cellular translocation process.

Fluoreszenz-Leckage-Assay zur Untersuchung der Membrandestabilisierung durch zelldurchdringendes Peptid

Cell-penetrating peptides (CPPs) are defined as carriers that are able to cross the plasma membrane and to transfer a cargo into cells. One of the main ...

Optimized Incorporation of Alkynyl Fatty Acid Analogs for the Detection of Fatty Acylated Proteins using Click Chemistry

Fatty acylation, the covalent addition of saturated fatty acids to protein substrates, is important in regulating a myriad of cellular functions in addition to its implications in cancer and neurodegenerative diseases. Recent developments in fatty acylation detection methods have enabled efficient and non-hazardous detection of fatty acylated proteins, particularly through the use of click chemistry with bio-orthogonal labeling. However, click chemistry detection can be limited by the poor solubility and potential toxic effects of adding long chain fatty acids to cell culture. Described here is a labeling approach with optimized delivery using saponified fatty acids in combination with fatty-acid free BSA, as well as delipidated media, which can improve detection of hard to detect fatty acylated proteins. This effect was most pronounced with the alkynyl-stearate analog, 17-ODYA, which has been the most commonly used fatty acid analog in click chemistry detection of acylated proteins. This modification will improve cellular incorporation and increase sensitivity to acylated protein detection. In addition, this approach can be applied in a variety of cell types and combined with other assays such as pulse-chase analysis, stable isotope labeling with amino acids in cell culture, and mass spectrometry for quantitative profiling of fatty acylated proteins.

The study of fatty acylation has important implications in cellular protein interactions and diseases. Presented here is a modified protocol to improve click chemistry detection of fatty acylated proteins, which can be applied in various cell types and combined with other assays, including pulse-chase and mass spectrometry.

Optimierter Einbau von Alkynyl-Fettsäure-Analoga zum Nachweis von fettacylierten Proteinen mittels Klickchemie

Fatty acylation, the covalent addition of saturated fatty acids to protein substrates, is important in regulating a myriad of cellular functions in ...

Pure Shift Nuclear Magnetic Resonance: a New Tool for Plant Metabolomics

Nuclear Magnetic Resonance (NMR) is one of the most powerful tools used in metabolomics. It stands as a highly accurate and reproducible method that not only provides quantitative data but also permits structural identification of the metabolites present in complex mixtures.
Metabolic profiling by 1H NMR has proven useful in the study of various types of plant scenarios, which include the evaluation of crop&#160;conditions, harvest and post- harvest treatments, metabolic phenotyping, metabolic pathways, gene regulation, identification of biomarkers, chemotaxonomy, quality control, denomination of origin, among others. However, signal overlapping of the large number of resonances with expanded J-coupling multiplicities complicates the spectra analysis and its interpretation, and represents a limitation for classical 1H NMR profiling.
In the last decade, novel NMR broadband homonuclear decoupling techniques through which multiplet signals collapse into single resonance lines - commonly called Pure Shift methods - have been developed to overcome the spectra resolution problem inherent to 1H NMR classical spectra.
Here a step-by-step protocol of the plant extract preparation and the procedure to record optimal Pure Shift PSYCHE and SAPPHIRE-PSYCHE spectra in three different plant matrices - Vanilla plant&#160;leaves, potato tubers (S. tuberosum), and Cape gooseberries (P. peruviana) - is presented. The effect of the gain in resolution in metabolic identification, correlation analysis and multivariate analyses, as compared against classical spectra, is discussed.

<meta charset="utf8"></head><body>Reine Shift-Kernspinresonanz: ein neues Werkzeug für die pflanzliche Metabolomik

This paper presents the use of PSYCHE and SAPPHIRE-PSYCHE in the metabolic profiling of plants and includes detailed procedures for sample preparation and optimal Pure Shift NMR spectra recording. Examples through which the gain in resolution achieved by homonuclear decoupling allows a more comprehensive understanding of the system are discussed.

Reine Shift-Kernspinresonanz: ein neues Werkzeug für die pflanzliche Metabolomik

Nuclear Magnetic Resonance (NMR) is one of the most powerful tools used in metabolomics. It stands as a highly accurate and reproducible method that not ...