JDM, INSERM / Région Aquitaine&#39;den bir doktora bursuyla desteklendi ve artık doktora sonrası ARC bursu ve Mount Sinai Tıp Fakültesi&#39;ndeki Tisch Kanser Enstitüsü tarafından desteklenmektedir. EH, Ministère de l&#39;Enseignement Supérieur et de la Recherche&#39;den bir doktora tarafından desteklenmektedir. ZE, Agence Nationale de la Recherche&#39;den (ANR) doktora sonrası bir burs tarafından desteklenmektedir. CM, Mount Sinai Tıp Fakültesi&#39;ndeki Tisch Kanser Enstitüsü tarafından desteklenmektedir ve JJBC, NIH / NCI hibe K22CA196750, TCI Genç Bilim İnsanı Kanseri Araştırma Ödülü JJR Fonu ve Mount Sinai Tıp Fakültesi&#39;nde Tisch Kanser Enstitüsü tarafından desteklenmektedir. Bu çalışma, ANR-13-JJC-JSV1-0005&#39;den bir hibe ile desteklendi. FS, &quot;Ligue nationale contre le cancer&quot; tarafından desteklenmektedir. VM ve FS, &quot;Equipe Labellisée Ligue Nationale contre le Cancer 2016&quot; ve Institut National du Cancer, INCA_8036 ve PLBio2012 fonlarıyla desteklenmektedir.

NOT: Sabitlemeden önce, tüm basamaklar steril bir laminer akış davlumbazında tamamlanır. 1. 2D matris NOT: 2B matrisler, invadozom oluşturan hücrelerin yüzdesini ve hücre başına matris bozunum alanını belirlemek için kullanılır. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54911/54911fig1.jpg" /> Şekil 1: Protokol. Jelatin ve kollajen I matrislerini hazırlamak için kullanılan protokolün özeti. Sadece jelatin matrisi veya bir jelatin ve kollajen I karışık matris yapmak mümkündür. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54911/54911fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <ol><li> Jelatin matrisi NOT: Floresan jelatin matrisleri, matris bozunumunu nicelemek için kullanılır ve floresan olmayan jelatin, kollajen I liflerinin yapışmasını arttırmak için kullanılır. Floresan jelatinli matPirinç podozom ve invadopodia çalışmaları için de kullanılır (bkz. Şekil 1 ). <ol><li> Steril bir laminer akış kaputunun altında, çalışma alanına bir parça parafilm (20 cm x 15 cm) yerleştirin ve% 70 etanol ile dezenfekte edin. </li><li> Yaklaşık 1 cm aralıklarla bir çizgi halinde, 1 mg / mL jelatin parçacıkları 20 uL&#39;lik damlacıklar; Damlacık organizasyonu için Şekil 1&#39;e bakın. </li><li> Otoklavlanmış bir cam lamel (çap 12 mm) ile her 20 mcL jelatin damlacık örtün. </li><li> Oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. Jelatin floresan ise ışığa karşı koruyun. </li><li> Her biri, adım 1.1.3&#39;teki lamellerin hattının yaklaşık 1 cm altında bir aralıkla 1x fosfat tamponlu salin (PBS) içerisinde% 0.5 glutaraldehit damlalıkları 40 uL&#39;lik damlacıklar. DİKKAT: Glutaraldehit toksik bir sabitleyici maddedir. Eldiven kullanın ve nefes almayın. </li><li> Mücevherli forseps kullanarak, her jelatin kaplı lamel bir glutaraldehit damla aktarın. NOT: BuParafilm üzerinde küçük bir jelatin damlasının kalması normaldir. Bunu başka bir deney için tekrar kullanmayın. </li><li> Oda sıcaklığında 40 dakika inkübe edin. Floresan lamelleri için onları ışıktan koruyun. </li><li> 24 yuvalı bir hücre kültürü plakası alın ve steril 1x PBS 500 mcL ile her kuyu doldurun. Lamelleri, jelatin tarafı yukarıya her kuyuya yerleştirin. </li><li> Her biri için 5 dakika boyunca iki kez 1x PBS&#39;de yıkayın. NOT: Bu adımda, lamelleri deneme için kullanılabilir veya 1 ° C PBS&#39;de 4 ° C&#39;de saklanabilir. Floresansız lamelleri bir hafta boyunca saklanabilir ve floresan lamelleri 48 saat boyunca saklanabilir. </li></ol></li><li> Fibriler kollajen tip I matris NOT: Fibriler kollajen tip I matrisi, lineer invadozom oluşumunu ve buna bağlı matris bozunumunu incelemek için kullanılır. Florasan kollajen I ve floresan olmayan jelatin lamelleri bir kombinasyonu, invadozom belirteçlerini kollajen liflerle ( örn., F-aktin i) birlikte yerelleştirmek için kullanılırKırmızı kanala, kırmızı kanalı I kolajenine, yeşil kanalda Tks5&#39;e ve nükleer bir leke için Hoechst boyasına). Öte yandan, floresan olmayan jelatin lamelleri ile floresan olmayan bir kolajenin I kombinasyonu lekelenmiş invadozom belirteçlerinin sayısını en üst düzeye çıkarmak için kullanılır ( örn., Kırmızı-kırmızı kanada F-aktin, kırmızı kanada kortaktin, Tks5&#39;de Yeşil kanal ve bir nükleer leke için Hoechst boyası). Son olarak, floresan jelatin lamelleri ile floresan olmayan bir kollajenin bir kombinasyonu, jelatin ile ilişkili bozulmayı ölçmek için kullanılır ( örneğin, kırmızı kanada F-aktin, kırmızı kanada, yeşil kanalda Tks5 ve Hoechst boyası Nükleer bir leke için) (bakınız Şekil 1). Çekirge boyası, çekirdeği leke yapmak için kullanılır ve kullanılan hücre hatlarında düzenli olarak yapılan bir PCR testine ek olarak, mycoplasma kontaminasyonunu kontrol eder. <ol><li> Floresan kollajen I <ol><li> 0.02 N asetik asitte sıçan-kuyruk tendonundan çıkarılan ticari kollajen kullanınd. 0.4 mg / mL kollajen I nihai konsantrasyonunda lamel başına 500 μL solüsyon hazırlamak için gerekli kolajen miktarını geri çekin. </li><li> Kollajen I solüsyonunun nihai hacmi (nx 500 uL) için hesaplanan 10 ug / mL nihai konsantrasyonda 5-karboksi x rhodamin sukkinimidil esteri ilave edin. </li><li> Pipetleme ile yukarı ve aşağı çözümü karıştırın ve ışıktan korunarak oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. </li><li> 1X Dulbecco&#39;nun kalsiyum ve magnezyum içeren Fosfat Tamponlu Tuz (DPBS) ile son hacme kadar seyreltin ve doğrudan kullanın. </li></ol></li><li> Fibrillar collagen I lamelleri <ol><li> Daha önce 1.1 adımında hazırlanan floresan veya floresan jelatin lamelleri kullanın. </li><li> Kalsiyum ve magnezyum içeren 1X DPBS&#39;de 0.4 mg / mL son konsantrasyonda floresan veya floresan olmayan bir kollajen I çözeltisi hazırlayın. </li><li> Floresan veya floresan olmayan kollajen I çözeltisi başına 500 μL ekleyin.24 yuvalı bir hücre kültürü plakasındaki lamelleri. </li><li> Kollajen I polimerizasyonu için 37 ° C&#39;de 4 saat inkübe edin. </li><li> İnkübasyondan sonra, plakayı eğip matrisin zarar görmesini önlemek için kuyunun (doğrudan lamel üzeri) pipetleme yaparak aşırı kolajen I&#39;i alın. NOT: Bu matris saklanamaz. Fazla kolajen I çıkardıktan hemen sonra hücreleri tohumladım. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Hücre ekimi, kültür zamanı ve fiksasyon <ol><li> Hücre türüne bağlı olarak, hücreleri uygun kültür ortamında hazırlayın ve göz başına 500 uL&#39;lik nihai hacim için hücreler ekleyin. </li><li> Bir hücre çizgisinin lineer invadozom oluşturabilme ve matrisi bozma kabiliyetini karakterize etmek için lineer invadozom oluşumunun kinetiğini ve bununla ilişkili parçalanma aktivitesini belirlemek için hücreleri plakaları 4 saat, 12 saat ve 24 saat boyunca kollajen I matrisi üzerine yerleştirin. NOT: Tablo 1 , hücre hatlarının örneklerini içerirLaboratuarda test edilmiştir. <table border="1"><tbody><tr><td> Hücre çizgisi </td><td> Lamel başına hücre sayısı </td><td> Lineer invadozom nicelemesi için matriste temas süresi </td><td> Lineer invadozom bozulma aktivitesinin nicelleştirilmesi için matriste temas süresi </td></tr><tr><td> MDA MB 231 </td><td> 40.000 </td><td> 4 saat </td><td> 12 saat </td></tr><tr><td> Huh7 </td><td> 40.000 </td><td> 12 saat </td><td> 24 saat </td></tr><tr><td> HEP 3B </td><td> 40.000 </td><td> 12 saat </td><td> 24 saat </td></tr><tr><td> SNU 398 </td><td> 40.000 </td><td> 12 saat </td><td> 24 saat </td></tr><tr><td> NIH 3T3 src </td><td> 30.000 </td><td> 4 saat </td><td> 12 saat </td></tr><tr><td> A431 </td><td> 50,000 </td><td> 6 saat </td><td> 24 saat </td></tr><tr><td> A549 </td><td> 40.000 </td><td> 12 saat </td><td> 24 saat &amp;# 160; </td></tr><tr><td> ÇİĞ </td><td> 40.000 </td><td> 12 saat </td><td> 12 saat </td></tr><tr><td> PAE </td><td> 40.000 </td><td> 12 saat </td><td> 12 saat </td></tr></tbody></table> Tablo 1: Hücre tohumlama ve kuluçka süresi referans. Bu tablo, lineer invadozomaları incelemek için kullanılan hücre çizgilerinin kapsamlı olmayan bir listesini sunmaktadır. Matriste tohumlanacak hücre sayısını, doğrusal invadozomları gözlemlemek için gerekli süreyi ve ilişkili matris bozulmasını gözlemlemek için gerekli süreyi belirtir. Doğrusal invadozomların ömrü kısadır. Maksimum sayıda hücrede doğrusal invadozomları gözlemleyebilmek için, hücrelerin kısa bir süre için kollajen I matrisi ile temas halinde olması gerekir. Öte yandan, bildirilen jelatin parçalanmasını görselleştirebilmek için, hücrelerin, yukarıda listelenenlerden daha uzun süre, kollajen I matrisi ile temas halinde olması gerekir. </li><li> Hücre kültür ortamının çıkarılmasından sonra,1X PBS 500 mcL% 4 paraformaldehid 10 dakika lamelleri sabitleyin. </li><li> 1x PBS ile iki kez yıkayın. </li><li> Işıktan korunarak 4 ° C&#39;de saklayın. </li></ol> 3. İmmünofloresans <ol><li> Hücreleri, taze hazırlanmış bir solüsyon ile 10 dakika boyunca geçirgen hale getirin 1x PBS içerisinde% 0.2 Triton X-100 ile yıkandı. Bu çözümü tekrar kullanmayın. </li><li> Lamelleri iki kez 1x PBS ile yıkayın. </li><li> Tezgah üzerine bir parafilm parçası (20 cm x 15 cm) yerleştirin. </li><li> Birinci antikoru, Malzeme Tablosunda açıklandığı gibi 1x PBS içinde% 4 sığır serum albümininde (BSA) seyreltin . </li><li> Herbiri yaklaşık 1 cm aralıklarla birer birer birincil antikor çözeltisinin 50 uL damlacıkları. </li><li> Her lamel bir damla yerleştirin. </li><li> Oda sıcaklığında 40 dakika inkübe edin, ışığa karşı koruyun. </li><li> Kuluçka döneminden sonra, iki kez 1x PBS ile yıkayın. </li><li> İkincil antikor, phalloidin ve Hoechst boyasını% 1 BSA içinde 1x&#39;de seyreltinPBS. </li><li> Karışımın 50 uL&#39;lik damlaları, her biri daha önce yapıldığı gibi lamellerin birinci satırının yaklaşık 1 cm altında aralıklarla yerleştirildi. </li><li> Her lamel bir damla yerleştirin. </li><li> Oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin, ışığa karşı koruyun. </li><li> Kuluçkadan sonra, iki kez 1x PBS ile yıkayın. </li><li> Tuzları çıkarmak için bir kez distile su ile yıkayın. </li><li> Lamelleri, polimerize edici montaj ortamı olan bir cam slayt üzerine monte edin. </li><li> Lamelleri gece boyunca oda sıcaklığında kurumaya bırakın, mikroskopi öncesi ışıktan koruyun. </li></ol> 4. Nicelikler <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54911/54911fig2.jpg" /> Şekil 2: Doğrusal invadozom nicelemesi. Makro, F-aktin ve Tks5 boyanmasının konform görüntülerini gerektirir (format: 1,024 x 1,024). ( A ) Önce, F-aktin resmini açın ve bir maske yapın. ( B ) Daha sonra açıkTks5 resmi ve eşik. Makroyu uygulayın. ( C ) Analiz edilen sonuçlar iki tabloda görünecektir. Hücre başına doğrusal invadozom sayısı ve hücredeki doğrusal invadozomlar tarafından kullanılan yüzdelik alan gibi diğer bilgiler, Özet tablosunda yer alır. Her doğrusal invadozomun boyutu Sonuçlar tablosunda olacaktır. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54911/54911fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <ol><li> Lineer invadozom oluşturan hücrelerin yüzdesi <ol><li> Lineer invadozom oluşturan hücreleri sayın, lamel başına yaklaşık 100 hücre (teknik triplit kullan). N = 3 ile n başına en az 300 hücrenin nicelendirilmesi. </li><li> Üç bağımsız deneyin ortalaması alınarak doğrusal invadozom oluşturan hücrelerin yüzdesini hesaplayarak, 900 sayılı hücre elde edin. </li></ol></li><li> Doğrusal invadozom boyutu ve hücre başına sayısı <li> Ek makro ile ImageJ&#39;yi kullanın. </li></ol></li><li> Hücre başına düşüş <ol><li> Her durum için üç lamel kullanın. </li><li> Floresan jelatin ve Hoechst lekeli çekirdek lamelleri başına 30 görüntüleri alın. </li><li> ImageJ yazılımını Martin KH ve ark. 9 . </li></ol></li></ol> 5. 3D Kollajen İşgali Testi <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/54911/54911fig3.jpg" /> Şekil 3: Invasion assay şeması. İstilâsyon tahlil protokolünün özeti. Kollajen I sukkinimidil ester boya ile çapraz bağlanır ve 1 saat boyunca 37 ° C&#39;de polimerleştirilir. Hücreler serum içermeyen besiyerinde kolajen I eklenir. Ek parça orta ağırlıkta% 10 FBS. Kollajen I fişleri, hücre tohumlamasından 1 saat sonra ve hücre ekiminden 3 gün sonra hücrelerin işgal kapasitesini belirlemek için deneye tabi tutulur. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54911/54911fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <ol><li> Collagen I fiş hazırlığı <ol><li> Hücre türüne göre jel içine işgali kinetiğini belirlemek için ilk deney için 4 saat, 12 saat, 24 saat, 48 saat ve 72 saatlik bir zaman rotası yapın. Her deney için, bir istila olmadığında bir referans zaman noktası olarak 1 saat zaman noktası ekleyin. </li><li> Kollajen I solüsyonunu steril bir laminar akış kaputunun altına hazırlayın. 3 Boyden oda ekleri için 500 μL solüsyon hazırlayın. </li><li> 2 mg / mL kollajen I&#39;in son konsantrasyonu ile bir çözelti hazırlamak için 1 mg ticari rat-kuyruk kollajeni I aspire edin. </li><li> 5-karboksi x Rhodamine suksinimidil esteri,Kollajen I çözeltisinin nihai hacmi için hesaplanan nihai konsantrasyon 1 μg / mL (bu durumda, 500 uL). </li><li> Iyi bir şekilde karıştırın ve ışığa karşı korunmuş steril laminer akış kaputunun altında buz üzerinde 5 dakika inkübe edin. </li><li> Buzla soğutulmuş 50 μL, süzülmüş 10X PBS ve buz soğukluğunda 1 M sodyum hidroksit (NaOH) 6.25 μL ekleyin. </li><li> 443.75 - x mcL kollajen I formülüne göre steril su ekleyin. </li><li> Boyden oda girişi başına 100 μL çözelti ekleyin. </li><li> Polimerizasyona izin vermek için 1 saat süreyle 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Yeni kuyucuklara fetüs sığır serumu (FBS) ile zenginleştirilmiş hücre kültürü ortamı ekleyin; Ek yerleri bu kuyulara yerleştirin. </li><li> FBS içermeyen ortamda kolajen I&#39;in üzerine 30.000 hücre tohum ekti. </li><li> Hücreleri 37 ° C&#39;de kültürledikten sonra, kollajen I fişi, 1x PBS içerisinde% 4 paraformaldehit içinde 30 dakika sabitleyin. </li><li> Aşama 3&#39;de olduğu gibi komple immünofloresans, aşağıdaki adımlar haricinde: permeabiliZe 10 dakika değil 30 dakika için 1x PBS içerisinde% 0.2 Triton X-100 ile; Primer ve sekonder antikor çözeltileriyle sırasıyla 40 dakika ve 30 dakika yerine 1.5 saat inkübe edin. F-aktin veya hücreleri lokalize etmek için çekirdekler lekeli. </li><li> İmmün floresans sonrasında, eklentinin membranını kesmek için bir neşter kullanın ve kollajen I fişini bir cam altı tabağa aktarın. Kolajen I fişinin üst kısmının camla temas ettiğinden emin olun. Tapanın bütünlüğünü korumak için insert membranı kolajen I tıpasının altına tutun. NOT: Cam tabağında kolajen I fişi kalır. Cam tabanı ve cam tabanı çevreleyen plastik arasındaki derinlik, tapanın kalınlığına eşdeğerdir. </li><li> Takılan kollajene lamel yerleştirin ve tıpanın kurumasını önlemek için polimerize edici montaj ortamı ile monte edin. </li><li> Taktığım kolajeni imgelemek için ters konfokal mikroskop kullanın; Üst kısmıTıpa tabağın cam altıyla temas halindedir. <ol><li> Hücrenin istilasını görselleştirmek için üstten alttan kollajen I fişine bir z-yığıtı bulun. Hücrelerin görüntüleme alanını ne kadar derine işgal ettiğini inceleyerek z-yığınının kalınlığını belirleyin. Z-adım boyutu 0.25 μm olan 512 x 512 formatında 40X yağ hedefi ile satın almalar yapın. NOT: Referans için, tohumlamadan 3 gün sonra MDA-MB-231 hücreleri için ortalama z-yığını 30 μm&#39;dir. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Ramaswamy, S., Ross, K. N., Lander, E. S., Golub, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+signature+of+metastasis+in+primary+solid+tumors.">A molecular signature of metastasis in primary solid tumors.</a> Nat. Genet. 33, 49-54 (2003).</li><li>Gilkes, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+prolyl+hydroxylases+are+essential+for+breast+cancer+metastasis.">Collagen prolyl hydroxylases are essential for breast cancer metastasis.</a> Cancer Res. 73, 3285-3296 (2013).</li><li>Linder, S., Wiesner, C., Himmel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degrading+Devices:+Invadosomes+in+Proteolytic+Cell+Invasion.">Degrading Devices: Invadosomes in Proteolytic Cell Invasion.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 27, 185-211 (2011).</li><li>Murphy, D. A., Courtneidge, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+'ins'+and+'outs'+of+podosomes+and+invadopodia:+characteristics,+formation+and+function.">The 'ins' and 'outs' of podosomes and invadopodia: characteristics, formation and function.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 12, 413-426 (2011).</li><li>Di Martino, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdc42+and+Tks5:+a+minimal+and+universal+molecular+signature+for+functional+invadosomes.">Cdc42 and Tks5: a minimal and universal molecular signature for functional invadosomes.</a> Cell Adh. Migr. 8, 280-292 (2014).</li><li>Poincloux, R., Lizarraga, F., Chavrier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+invasion+by+tumour+cells:+a+focus+on+MT1-MMP+trafficking+to+invadopodia.">Matrix invasion by tumour cells: a focus on MT1-MMP trafficking to invadopodia.</a> J. Cell Sci. 122, 3015-3024 (2009).</li><li>Juin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+type+I+collagen+organization+induces+the+formation+of+a+novel+class+of+linear+invadosomes.">Physiological type I collagen organization induces the formation of a novel class of linear invadosomes.</a> Mol. Biol. Cell. 23, 297-309 (2012).</li><li>Juin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discoidin+domain+receptor+1+controls+linear+invadosome+formation+via+a+Cdc42-Tuba+pathway.">Discoidin domain receptor 1 controls linear invadosome formation via a Cdc42-Tuba pathway.</a> J. Cell Biol. 207, 517-533 (2014).</li><li>Martin, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+measurement+of+invadopodia-mediated+extracellular+matrix+proteolysis+in+single+and+multicellular+contexts.">Quantitative measurement of invadopodia-mediated extracellular matrix proteolysis in single and multicellular contexts.</a> J. Vis. Exp. , e4119 (2012).</li><li>Diaz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invadopodia+detection+and+gelatin+degradation+assay.">Invadopodia detection and gelatin degradation assay.</a> Bio-protocol. 3, 1-8 (2013).</li><li>Artym, V. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dense+fibrillar+collagen+is+a+potent+inducer+of+invadopodia+via+a+specific+signaling+network.">Dense fibrillar collagen is a potent inducer of invadopodia via a specific signaling network.</a> J. Cell Biol. 208, 331-350 (2015).</li><li>Schachtner, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Megakaryocytes+assemble+podosomes+that+degrade+matrix+and+protrude+through+basement+membrane.">Megakaryocytes assemble podosomes that degrade matrix and protrude through basement membrane.</a> Blood. 121, 2542-2552 (2013).</li><li>Schoumacher, M., Glentis, A., Gurchenkov, V. V., Vignjevic, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basement+membrane+invasion+assays:+native+basement+membrane+and+chemoinvasion+assay.">Basement membrane invasion assays: native basement membrane and chemoinvasion assay.</a> Methods Mol. Biol. 1046, 133-144 (2013).</li><li>Wolf, K., Muller, R., Borgmann, S., Brocker, E. B., Friedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amoeboid+shape+change+and+contact+guidance:+T-lymphocyte+crawling+through+fibrillar+collagen+is+independent+of+matrix+remodeling+by+MMPs+and+other+proteases.">Amoeboid shape change and contact guidance: T-lymphocyte crawling through fibrillar collagen is independent of matrix remodeling by MMPs and other proteases.</a> Blood. 102, 3262-3269 (2003).</li><li>Geraldo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do+cancer+cells+have+distinct+adhesions+in+3D+collagen+matrices+and+in+vivo?.">Do cancer cells have distinct adhesions in 3D collagen matrices and in vivo?.</a> Eur. J. Cell Biol. 91, 930-937 (2012).</li><li>Monteiro, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endosomal+WASH+and+exocyst+complexes+control+exocytosis+of+MT1-MMP+at+invadopodia.">Endosomal WASH and exocyst complexes control exocytosis of MT1-MMP at invadopodia.</a> J. Cell Biol. 203, 1063-1079 (2013).</li><li>Wolf, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen-based+cell+migration+models+in+vitro+and+in+vivo.">Collagen-based cell migration models in vitro and in vivo.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 20, 931-941 (2009).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Klasik olarak, invadozomlar, mikro ortam ve hücrelerin kaplandığı matrise bakılmaksızın in vitro olarak incelenir. Şu anda, jelatin, fibronektin, vitronektin veya yüksek yoğunluklu fibriler kollajen (HDFC) 7 , 11 dahil çeşitli matris türleri kullanılmaktadır; Bununla birlikte, bunlar genellikle hücrelerin bulunduğu mikro çevreyi temsil etmez ve fizyolojik olarak uygun değildir. Burada, jelatin ile fibriler tip I kollajen arasındaki i...

Ekstraselüler matriks (ECM) yeniden şekillenmesi, anjiyogenez ve tümör hücresi invazyonu gibi fizyolojik ve patolojik süreçler sırasında ortaya çıkar. Fizyolojik koşullarda, çoğunlukla hematopoietik soytan gelen birçok hücre türü ECM elementlerini parçalayabilir. Örneğin, makrofajlar dokulara ulaşmak için anatomik engelleri aşabilir ve osteoklastlar kalsiyum homeostazını sağlamak için kemik matriksini parçalayabilir. Daha genel olarak, vücudun tüm matrisleri fiziksel ve kimyasal özelliklerini korumak için yenilenir. Kanser dokularında tümör mikro çevre bileşimi değişir. Örneğin göğüs ve akciğer kanserinde tip I kollajen aşırı eksprese edilir ve tümörün çevresinde birikir. Üstelik bu birikim, metastaz gelişme riski 1 , 2 ile ilişkilidir. Kanser metastazı, kanser hücrelerinin ECM&#39;yi bozma ve bitişik dokuları istila etme kabiliyetine bağlıdır. Hücrelerin invaziv aktivitesi invadosomes olarak bilinen özel aktin bakımından zengin yapılara atfedilir. Bu terim, normal ve kanser hücrelerinde ( örn., Makrofajlar, endotel hücreleri ve MDA-MB-231 meme kanseri hücre hattı gibi kanser hücreleri) bulunan podozomları ve invadopodiyi içerir. In vitro olarak , invadozomlar farklı şekillerde organize edilebilir: noktalar, agregalar veya rozetler 3 . Klasik olarak, invadozomlar, integrinler ve vinculin 4 gibi adezyon plak molekülleri ile çevrili İskele proteini Tks5 ve kortaktin gibi birkaç protein ihtiva eden bir F-aktin çekirdeğinden oluşur. Son zamanlarda, Tks5 ve RhoGTPase Cdc42&#39;nin fonksiyonel invadozomlar için minimum bir moleküler imza olarak kullanılabileceği gösterildi 5 . Bu yapılar, MT1-MMP ve MMP-2 gibi spesifik metalloproteaz proteinlerinin işe alınması ve aktivasyonu yoluyla ECM&#39;yi bozabilmektedir. Önceki bir çalışmada, tip I kollajen fibrillerin spesifik bir reseptörü olan diskoidin alan reseptörü 1 (DDR1) arasındaki tip I kollajen fibrilleri arasındaki etkileşimin, lineer invadozomlar olarak adlandırılan invadozomların yeni bir sınıfının oluşumuna yol açtığını bildirdik. Doğrusal invadozomlar tip I kollajen fibriller boyunca oluşur 7 . Bu yapılar MT1-MMP / MMP2 alımında ve aktivasyonuyla tip I kollajen fibrillerini bozabilmektedir. Dahası, bunların oluşumu Tks5 ve Cdc42 5&#39;e bağlıdır. İn vitro olarak doğrusal invadozomların varlığını ve DDR1&#39;in oluşum ve aktivitelerine 8 dahil çeşitli matris elementlerinin kombinasyonundan oluşan farklı stratejileri kullanarak gösterdiklerini göstermiştir: i) flüoresan jelatin kaplı lamelleri, ii) flüoresan tip I kollajen fibril Kaplamalı lamelleri ve iii) 3D tip I kollajen fişleri. Farklı matrislerin kullanımı nedeniyle, çalışmak ve karakterLineer invadozom oluşumu ve parçalanma aktiviteleri 7,8. Son olarak, invaziv hücrelerin biyolojisini daha iyi anlamak için, 2D ve 3D kültür sistemlerindeki tüm ECM bileşenleri kombinasyonu kullanıldı ve tümör mikro çevre bileşiminin karmaşıklığını taklit etti. Aşağıda, 2D ve 3D kültür sistemlerinde jelatin / tip I kollajene sahip lamelleri kaplama protokolleri bulunmaktadır.

<table><tbody><tr><td>Gelatin solution</td><td>Sigma</td><td>G1393</td><td>Stock 20 mg/ml used at 1 mg/ml</td></tr><tr><td>Gelatin from pig skin Oregon green 488 conjugate</td><td>Molecular probe life technologies</td><td>G13186</td><td>5mg dilute at 1 mg/ml in sterile water</td></tr><tr><td>Microscope cover glasses</td><td>Marlenfeld GmbH &amp;amp; Co</td><td>111520</td><td>&amp;Oslash;12mm No.1</td></tr><tr><td>2.5% Glutaraldehyd in 0.1M sodium cacodylate buffer pH 7.4</td><td>Electron microscopy science</td><td>15960</td><td>Dilute at 0.5 % in sterile water</td></tr><tr><td>1x PBS pH 7.4</td><td>Gibco by life technologies</td><td>10010-015</td><td>Use this PBS in all steps before fixation</td></tr><tr><td>Collagen I Rat tail</td><td>Corning</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>5 carboxy X rhodamin siccinimidyl ester</td><td>Life technologies</td><td>C-6125</td><td></td></tr><tr><td>DPBS 1x + calcium + magnesium</td><td>Gibco by life technologies</td><td>14040-091</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde 16% solution</td><td>Electron microscopy science</td><td>15710</td><td>Dilute at 4% in 1X PBS</td></tr><tr><td>Triton X 100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS buffer pH 7.4</td><td>Ambion</td><td>AM9625</td><td>Dilute at 1X in water Use in steps after fixation</td></tr><tr><td>Tks5 antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-30122</td><td>Invadosome markers Dilution : 1/100</td></tr><tr><td>Cortactin 4F11 antibody</td><td>Millipore</td><td>5180</td><td>Invadosome markers Dilution :1/100</td></tr><tr><td>DDR1 antibody</td><td>Cell signaling</td><td>5583</td><td>Linear invadosome receptor</td></tr><tr><td>Dilution :1/100</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin FluoProbes</td><td>Interchim</td><td>FT-AZ0330</td><td>Fibrillary actin marker Dilution :1/200</td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Sigma</td><td>33258</td><td>Nucleus marker Dilution :1/200</td></tr><tr><td>Secondary antibodies FluoProbes</td><td>Interchim</td><td>FP-488 FP-547H or FP-647H</td><td></td></tr><tr><td>Albumin from bovine serum</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td>Dilute at 4% in 1X PBS</td></tr><tr><td>Fluoromount G mounting medium</td><td>Interchim</td><td>FP 483331</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ software</td><td>Public domain</td><td></td><td>http://www.macbiophotonics.ca/imagej/</td></tr><tr><td>Cell culture insert</td><td>Corning</td><td>353097</td><td>8.0&amp;micro;m pore size / 24 wells</td></tr><tr><td>Sodium hydroxide (NaOH)</td><td>Sigma</td><td>221465</td><td></td></tr></tbody></table>

2d and 3d matrices to study linear invadosome formation and activity

Hücre yapışması, migrasyonu ve istilası birçok fizyolojik ve patolojik süreçte yer alır. Örneğin, metastaz oluşumu sırasında, tümör hücreleri, kan veya lenfatik damarlara ulaşmak için çevresindeki dokuya istila etmek ve göç etmek için anatomik engelleri aşmak zorundadır. Bu, hücreler ile ekstrasellüler matriks (ECM) arasındaki etkileşimi gerektirir. Hücresel seviyede, kanser hücrelerinin çoğunluğu da dahil olmak üzere pek çok hücre, ECM&#39;yi düşürebilen F-aktin esaslı yapılar olan invadozomlar oluşturabilir. Invadozomlar, matriks metaloproteinazları (MMP&#39;ler) işe alıp aktive eden protrusif aktin yapılardır. ECM&#39;nin moleküler kompozisyonu, yoğunluğu, düzenlenmesi ve sertliği, invadozom oluşumunun ve aktivasyonunun düzenlenmesinde çok önemlidir. İn vitro olarak , bir jelatin testi, invadozom yıkım aktivitesini gözlemek ve ölçmek için kullanılan standart tahlildir. Bununla birlikte, denatüre kolajen I olan jelatin, fizyolojik bir matris değildir eelemanının net. Tip I kollajen fibriller kullanan yeni bir deney geliştirildi ve bu fizyolojik matrisin invadozomların güçlü bir uyarıcısı olduğunu göstermek için kullanıldı. Kollajen fibriller boyunca oluşan invadozomlar, fiberler üzerindeki lineer organizasyonu nedeniyle doğrusal invadozomlar olarak bilinirler. Dahası, lineer invadozomların moleküler analizi, diskoidin alan reseptör 1&#39;in (DDR1) oluşumunda yer alan reseptör olduğunu gösterdi. Bu veriler, hücreler ile ECM arasındaki karmaşık etkileşimleri anlamak için fizyolojik olarak önemli bir matrisin kullanılmasının önemini açıkça göstermektedir.

İki tip matris, jelatin ve tip I kollajen kombinasyonunu kullanarak ( Şekil 1 ve 4 ) doğrusal invadozomlar olarak bilinen yeni bir invadozom türüne dikkat çektik. Bu matrislerin etiketlenmesi, kollajen I lifleri boyunca doğrusal invadozom oluşumunun gözlemlenmesine ve bozunma kabiliyetlerine izin verir ( Şekil 5 ). Daha sonra invazif yapıların sayısı, daha önce açıklanan makro (adım 4.2) ile nicelleştirilebilir ve degr...

Watch this Scientific Journal Video about 2D and 3D Matrices to Study Linear Invadosome Formation and Activity at JoVE.com

2D and 3D Matrices to Study Linear Invadosome Formation and Activity

Bu protokol, jelatin ve kollajen I&#39;den oluşan bir 2D karışık matristin nasıl hazırlanacağını ve lineer invadozomaları incelemek için bir 3D kolajen I fünyesinin nasıl hazırlandığını açıklamaktadır. Bu protokoller lineer invadozom oluşumunun, matris bozulma aktivitesinin ve birincil hücrelerin ve kanser hücre çizgilerinin invazyon yeteneklerinin incelenmesine izin verir.

Doğrusal Invadozom Oluşumu ve Aktivitesi Çalışmak İçin 2D ve 3D Matrisler

Cell adhesion, migration, and invasion are involved in many physiological and pathological processes. For example, during metastasis formation, tumor ...

2d-and-3d-matrices-to-study-linear-invadosome-formation-and-activity

Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.9K Görüntüleme.  INSERM U1053.  Bu protokol, jelatin ve kollajen I'den oluşan bir 2D karışık matristin nasıl hazırlanacağını ve lineer invadozomaları incelemek için bir 3D kolajen I fünyesinin nasıl hazırlandığını açıklamaktadır. Bu protokoller lineer invadozom oluşumunun, matris bozulma aktivitesinin ve birincil hücrelerin ve kanser hücre çizgilerinin invazyon yeteneklerinin incelenmesine izin verir. 

Video: 2D and 3D Matrices to Study Linear Invadosome Formation and Activity

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. Traditional 3D assays such as the Boyden Chamber require that cells are displaced from the original culture location and moved to a new environment. Not only does this disrupt the cellular processes that are intrinsic to the microenvironment, but it often results in a loss of cells. These problems are especially challenging when dealing with cells that are either rare, or extremely sensitive to their microenvironment. Here, we describe the development of a 3D invasion assay that avoids both concerns. In this assay, cells are plated within a small well and an ECM matrix containing a chemoattractant is laid atop the cells. This requires no cell displacement, and allows the cells to invade upwards into the matrix. In this assay, cell invasion as well as cell morphology can be assessed within the collagen gel. Using this assay, we characterize the invasive capacity of rare and sensitive cells; the hybrid cells resulting from fusion between breast cancer cells MCF7 and mesenchymal/multipotent stem/stroma cells (MSCs).

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

This protocol describes an inverted vertical invasion assay that could be used to quantify the migration and invasion capabilities of cells in a three-dimensional setting while preserving the cell microenvironment. This assay is suitable for rare and/or sensitive cells.

Yukarı doğru hareket: Bir basit ve esnek Vitro üç boyutlu işgali tahlil iletişim kuralı

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

Kanser Araştırmaları

Modeling and Imaging 3-Dimensional Collective Cell Invasion

A defining characteristic of cancer malignancy is invasion and metastasis 1. In some cancers (e.g. glioma 2), local invasion into surrounding healthy tissue is the root cause of disease and death. For other cancers (e.g. breast, lung, etc.), it is the process of metastasis, in which tumor cells move from a primary tumor mass, colonize distal sites and ultimately contribute to organ failure, that eventually leads to morbidity and mortality 3. It has been estimated that invasion and metastasis are responsible for 90&#37; of cancer deaths 4. As a result, there has been intense interest in identifying the molecular processes and critical protein mediators of invasion and metastasis for the purposes of improving diagnosis and treatment 5.
A challenge for cancer scientists is to develop invasion assays that sufficiently resemble the in vivo situation to enable accurate disease modeling 6. Two-dimensional cell motility assays are only informative about one aspect of invasion and do not take into account extracellular matrix (ECM) protein remodeling which is also a critical element. Recently, research has refined our understanding of tumor cell invasion and revealed that individual cells may move by elongated or rounded modes 7. In addition, there has been greater appreciation of the contribution of collective invasion, in which cells invade in strands, sheets and clusters, particularly in highly differentiated tumors that maintain epithelial characteristics, to the spread of cancer 8.
We present a refined method 9 for examining the contributions of candidate proteins to collective invasion 10. In particular, by engineering separate pools of cells to express different fluorescent proteins, it is possible to molecularly dissect the activities and proteins required in leading cells versus those required in following cells. The use of RNAi provides the molecular tool to experimentally disassemble the processes involved in individual cell invasion as well as in different positions of collective invasion. In this procedure, mixtures of fluorescently-labeled cells are plated on the bottom of a Transwell insert previously filled with Matrigel ECM protein, then allowed to invade "upwards" through the filter and into the Matrigel. Reconstruction of z-series image stacks, obtained by confocal imaging, into three-dimensional representations allows for visualization of collectively invading strands and analysis of the representation of fluorescently-labeled cells in leading versus following positions.

Models of tumor cell invasion into three-dimensional extracellular matrix better reflect the in vivo situation than two-dimensional motility assays. Using matrix invasion assays combined with confocal imaging of fluorescently-labeled cells, detailed information on invasion modes and the distinct contributions of leading versus following cells can be obtained.

Modelleme ve Görüntüleme 3-Boyutlu Toplu Hücre Invasion

A defining characteristic of cancer malignancy is invasion and metastasis 1. In some cancers (e.g. glioma 2), local invasion into surrounding healthy ...

Tıp

A Simple Migration/Invasion Workflow Using an Automated Live-cell Imager

Cancer cell mobility is crucial for the initiation of metastasis. Therefore, investigation of the cell movement and invasive capacity is of great significance. Migration assays provide basic insight of cell movement at a 2D level, whereas invasion assays are more physiologically relevant, mimicking in vivo cancer cell dislodgment from the original site and invading through the extracellular matrix. The current protocol provides a single workflow for migration and invasion assays. Together with the integrated automated microscopic camera for real-time HD images and built-in analysis module, it gives researchers a time-efficient, simple and reproducible experimental option. This protocol also includes substitutions for the consumables and alternative analysis methods for users to choose from.

The current protocol describes an integrated method investigating cancer cell migration and invasion on a single platform in real-time, providing an easily reproducible and time-efficient option to study cell mobility and morphology.

Otomatik bir canlı hücre Imager kullanarak basit geçiş/işgali iş akışı

Cancer cell mobility is crucial for the initiation of metastasis. Therefore, investigation of the cell movement and invasive capacity is of great ...

Fully Human Tumor-based Matrix in Three-dimensional Spheroid Invasion Assay

Two-dimensional cell culture-based assays are commonly used in in vitro cancer research. However, they lack several basic elements that form the tumor microenvironment. To obtain more reliable in vitro results, several three-dimensional (3D) cell culture assays have been introduced. These assays allow cancer cells to interact with the extracellular matrix. This interaction affects cell behavior, such as proliferation and invasion, as well as cell morphology. Additionally, this interaction could induce or suppress the expression of several pro- and anti-tumorigenic molecules. Spheroid invasion assay was developed to provide a suitable 3D in vitro method to study cancer cell invasion. Currently, animal-derived matrices, such as mouse sarcoma-derived matrix (MSDM) and rat tail type I collagen, are mainly used in the spheroid invasion assays. Taking into consideration the differences between the human tumor microenvironment and animal-derived matrices, a human myoma-derived matrix (HMDM) was developed from benign uterus leiomyoma tissue. It has been shown that HMDM induces migration and invasion of carcinoma cells better than MSDM. This protocol provided a simple, reproducible, and reliable 3D human tumor-based spheroid invasion assay using the HMDM/fibrin matrix. It also includes detailed instructions on imaging and analysis. The spheroids grow in a U-shaped ultra-low attachment plate within the HMDM/fibrin matrix and invade through it. The invasion is daily imaged, measured, and analyzed using ilastik and Fiji ImageJ software. The assay platform was demonstrated using human laryngeal primary and metastatic squamous cell carcinoma cell lines. However, the protocol is suitable also for other solid cancer cell lines.

Tumor microenvironment is an essential part of cancer growth and invasion. To mimic carcinoma progression, a biologically relevant human matrix is needed. This protocol introduces an improvement for the in vitro three-dimensional spheroid invasion assay by applying a human leiomyoma-based matrix. The protocol also introduces a computer-based cell invasion analysis.

Üç boyutlu Küroid Istilası tahlil tam ınsan tümör tabanlı matris

Two-dimensional cell culture-based assays are commonly used in in vitro cancer research. However, they lack several basic elements that form the tumor ...

Revealing the Cytoskeletal Organization of Invasive Cancer Cells in 3D

Cell migration has traditionally been studied in 2D substrates. However, it has become increasingly evident that there is a need to study cell migration in more appropriate 3D environments, which better resemble the dimensionality of the physiological processes in question. Migratory cells can substantially differ in their morphology and mode of migration depending on whether they are moving on 2D or 3D substrates. Due to technical difficulties and incompatibilities with most standard protocols, structural and functional analysis of cells embedded within 3D matrices still remains uncommon. This article describes methods for preparation and imaging of 3D cancer cell cultures, either as single cells or spheroids. As an appropriate ECM substrate for cancer cell migration, we use nonpepsinized rat tail collagen I polymerized at room-temperature and fluorescently labeled to facilitate visualization using standard confocal microscopes. This work also includes a protocol for 3D immunofluorescent labeling of endogenous cell cytoskeleton. Using these protocols we hope to contribute to a better description of the molecular composition, localization, and functions of cellular structures in 3D.

This article presents a method to fluorescently label collagen that can be further used for both fix and live imaging of 3D cell cultures. We also provide an optimized protocol to visualize endogenous cytoskeletal proteins of cells cultured in 3D environments.

3D İnvaziv Kanser Hücrelerinin Sitoskeletal Örgütü ortaya

Cell migration has traditionally been studied in 2D substrates. However, it has become increasingly evident that there is a need to study cell migration ...

Kanser Biyolojisinde 3 Boyutlu Modeller: Heterosferoidlerde İnvazyon Dinamiği

Alternative Strategy to Analyze In Vitro Cell Invasion of 3D Cultures

Spheroid culture is a 3D model that provides an improved replication of the in vivo microenvironment compared to traditional two-dimensional (2D) cultures. Invasion is a cellular outcome of utmost interest in cancer biology. In this protocol, we have devised an alternative strategy for evaluating cancer cell invasion in vitro, employing heterospheroids comprised of oral squamous cell carcinoma (OSCC), cancer-associated fibroblasts (CAF), and monocytes. These heterospheroids aim to mimic the tumor microenvironment (TME), including two relevant non-neoplastic cell types alongside the cancer cells. Each cell type was labeled with vital fluorescent markers emitting in distinct wavelengths before spheroid formation. Once formed, heterospheroids were seeded onto a layer of human leiomyoma-derived extracellular matrix in the upper compartment of a microporous membrane. Invasion was assessed in the z-axis using confocal microscopy. Digital images were obtained in the corresponding fluorescent channels at 10 &#181;m intervals, covering a depth of 90 &#181;m in the z-axis. Analysis was performed using freeware image software by calculating the integrated fluorescence intensity in each image and fluorescence channel. This approach enables a more dynamic analysis of cell invasion patterns in a multilayered context, as well as the examination of spatial co-localization of different cell types during invasion.

Yazar Spotlight: Baş ve Boyun Kanseri İlerlemesi Sırasında Kanser ve Bağışıklık Hücreleri Arasındaki Karışmanın Deşifre Edilmesi

Invasion is a major biological phenomenon in the development and progression of cancer. This process is influenced by non-neoplastic cells and components of the tumor microenvironment. The purpose of this study is to describe an alternative method for analyzing tumor cell invasion in vitro using three-dimensional (3D) cultures.

3D Kültürlerin İn Vitro Hücre İnvazyonunu Analiz Etmek İçin Alternatif Strateji

Spheroid culture is a 3D model that provides an improved replication of the in vivo microenvironment compared to traditional two-dimensional (2D) ...

Mammalian Cell Division in 3D Matrices via Quantitative Confocal Reflection Microscopy

The study of how mammalian cell division is regulated in a 3D environment remains largely unexplored despite its physiological relevance and therapeutic significance. Possible reasons for the lack of exploration are the experimental limitations and technical challenges that render the study of cell division in 3D culture inefficient. Here, we describe an imaging-based method to efficiently study mammalian cell division and cell-matrix interactions in 3D collagen matrices. Cells labeled with fluorescent H2B are synchronized using the combination of thymidine blocking and nocodazole treatment, followed by a mechanical shake-off technique. Synchronized cells are then embedded into a 3D collagen matrix. Cell division is monitored using live-cell microscopy. The deformation of collagen fibers during and after cell division, which is an indicator of cell-matrix interaction, can be monitored and quantified using quantitative confocal reflection microscopy. The method provides an efficient and general approach to study mammalian cell division and cell-matrix interactions in a physiologically relevant 3D environment. This approach not only provides novel insights into the molecular basis of the development of normal tissue and diseases, but also allows for the design of novel diagnostic and therapeutic approaches.

This protocol efficiently studies mammalian cell division in 3D collagen matrices by integrating synchronization of cell division, monitoring of division events in 3D matrices using live-cell imaging technique, time-resolved confocal reflection microscopy and quantitative imaging analysis.

Memeli hücre bölünmesi yılında niceliksel Confocal yansıma mikroskobu ile 3D matrisler

The study of how mammalian cell division is regulated in a 3D environment remains largely unexplored despite its physiological relevance and therapeutic ...

Biyomühendislik

Quantitative Measurement of Invadopodia-mediated Extracellular Matrix Proteolysis in Single and Multicellular Contexts 

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis. Malregulated invasion and subsequent cell movement is characteristic of multiple pathological processes, including inflammation, cardiovascular disease and tumor cell metastasis1. Focalized proteolytic degradation of extracellular matrix (ECM) components in the epithelial or endothelial basement membrane is a critical step in initiating cellular invasion. In tumor cells, extensive in vitro analysis has determined that ECM degradation is accomplished by ventral actin-rich membrane protrusive structures termed invadopodia2,3. Invadopodia form in close apposition to the ECM, where they moderate ECM breakdown through the action of matrix metalloproteinases (MMPs). The ability of tumor cells to form invadopodia directly correlates with the ability to invade into local stroma and associated vascular components3. 
Visualization of invadopodia-mediated ECM degradation of cells by fluorescent microscopy using dye-labeled matrix proteins coated onto glass coverslips has emerged as the most prevalent technique for evaluating the degree of matrix proteolysis and cellular invasive potential4,5. Here we describe a version of the standard method for generating fluorescently-labeled glass coverslips utilizing a commercially available Oregon Green-488 gelatin conjugate. This method is easily scaled to rapidly produce large numbers of coated coverslips. We show some of the common microscopic artifacts that are often encountered during this procedure and how these can be avoided. Finally, we describe standardized methods using readily available computer software to allow quantification of labeled gelatin matrix degradation mediated by individual cells and by entire cellular populations. The described procedures provide the ability to accurately and reproducibly monitor invadopodia activity, and can also serve as a platform for evaluating the efficacy of modulating protein expression or testing of anti-invasive compounds on extracellular matrix degradation in single and multicellular settings.

Quantitative Measurement of Invadopodia-mediated Extracellular Matrix Proteolysis in Single and Multicellular Contexts

We describe the prototypical method for producing microscope coverslips coated with fluorescent gelatin for visualizing invadopodia-mediated matrix degradation. Computational techniques using available software are presented for quantifying the resultant levels of matrix proteolysis by single cells within a mixed population and for multicellular groups encompassing entire microscopic fields.

Doğrusal Invadozom Oluşumu ve Aktivitesi Çalışmak İçin 2D ve 3D Matrisler

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Yukarı doğru hareket: Bir basit ve esnek Vitro üç boyutlu işgali tahlil iletişim kuralı

Modelleme ve Görüntüleme 3-Boyutlu Toplu Hücre Invasion

Otomatik bir canlı hücre Imager kullanarak basit geçiş/işgali iş akışı

Üç boyutlu Küroid Istilası tahlil tam ınsan tümör tabanlı matris

3D İnvaziv Kanser Hücrelerinin Sitoskeletal Örgütü ortaya

3D Kültürlerin İn Vitro Hücre İnvazyonunu Analiz Etmek İçin Alternatif Strateji

3D Kültürlerin İn Vitro Hücre İnvazyonunu Analiz Etmek İçin Alternatif Strateji

3D Kültürlerin İn Vitro Hücre İnvazyonunu Analiz Etmek İçin Alternatif Strateji

Memeli hücre bölünmesi yılında niceliksel Confocal yansıma mikroskobu ile 3D matrisler

Tek ve Çok hücreli Bağlamlarda Invadopodia aracılı Ekstrasellüler Matriks Proteoliz Kantitatif Ölçümü