Yazarlar minnetle görüntü Şekil 3 ve PICT Ibisa Görüntüleme Tesisi (Institute Curie) olarak edinme ve işleme için Dr Vasily Gurchenkov (Institut Curie) kabul. In vitro hücre modellerinde Kompleksi - Bu çalışma ANR-09-JCJC0023-01, ARC SFI20111203863 ve PIC 3D tarafından desteklenmiştir.

1. TAMRA-kollajen I Etiketleme <ol><li> Verilen 25 mg TAMRA toz halinde 2.5 ml DMSO eklenerek, 10 mg / ml &#39;TAMRA çözeltisi hazırlayın. Tam çözünme gerçekleşene kadar karıştırın tarafından çözülür. -20 º C&#39;de saklayın ve ışıktan korumak. </li><li> Etiketleme Tampon (0.25 M NaHCO3, 0.4 M NaCl) 2 L hazırlayın. 10 M NaOH çözeltisi ile 9.5 &#39;e pH ayarlayın. 4 º C&#39;de tutun Aksi belirtilen ve floresan malzeme alüminyum folyo kullanarak ışıktan korunan sürece bu noktadan sonra, tüm işlemleri 4 º C&#39;de yapılmaktadır. </li><li> Yüksek ölçüde konsantre, fare kuyruk kolajeni bir çözeltinin 1 ml&#39;si ile bir 1 ml tek kullanımlık şırınga ile doldurun. Yüksek konsantrasyonlu kollajen çözümler, genellikle 10 mg / ml civarında konsantrasyonlarda sağlanır ve çok viskoz vardır. Hava kabarcığı oluşumunu önlemek için yavaş yavaş işlemek için emin olun. </li><li> Bir 21 G derialtı iğne kullanarak, MWCO kesilmiş 10.000 çimlendirilmiş 3 ml diyaliz kaset içine kollajen enjekte. Dama kaçınmak için dikkatli kullanınİğne ile membran dig. Şırınga piston yukarı çekerek diyaliz kaset tüm havayı çıkarın. Etiketleme Tampon 1 L karşı gecede Dialyze. </li><li> Etiketleme Tampon 900 ul 10 mg / ml &#39;TAMRA çözeltisi 100 ul karıştırın. Not: DMSO 4 º C&#39;de donar çünkü bu oda sıcaklığında TAMRA çözüm ve Etiketleme Tampon hem de yapılmalıdır Karıştırma sonra, seyreltilmiş TAMRA çözüm 4 º C geri getirmek </li><li> Dikkatli bir şekilde 21 G derialtı iğne ile bir 2 ml tek kullanımlık şırınga kullanarak diyaliz kasetinden kollajen çıkarın. Pipetleme ile seyreltilmiş TAMRA çözeltinin 1 ml&#39;si ile diyaliz kolajen çözeltisi, 1 ml karıştırın. </li><li> 2 ml mikrosantrifüj tüp içine kollajen / TAMRA karışımı aktarın ve dönme ile gece inkübe edin. </li><li> Bir çimlendirilmiş 3 ml diyaliz kaset içine TAMRA-etiketli kolajen 2 ml aktarın ve ücretsiz boya aşırı kaldırmak için Tampon Etiketleme 1 L karşı gece dialyze. </li><li> TAMRA-lab geri yüklemek içinkollajen orijinal çözeltisine eLED kollajen,% 0.2 &#39;nin 1 L&#39; (v / v) asetik asit solüsyonu, pH 4, içine diyaliz kaseti koyun ve bir gece dialyze. </li><li> TAMRA etiketli kolajen nihai hacim ölçülür ve kullanılan kolajen çözeltisi başlangıç ​​hacmi ve konsantrasyonu dikkate alındığında, nihai konsantrasyonunu hesaplamak. 4 º C&#39;de saklayın </li></ol> 2. Gömülü Tek Hücreler ile 3D TAMRA-kollajen Matrisler <ol><li> Deney için gerekli 2 mg / ml TAMRA-Kollajen Mix hacmi hesaplayın. Her zaman kollajen yüksek viskozite nedeniyle ortaya çıkan kayıpların pipetleme için hesap% 20 daha fazla hazırlamak. </li><li> 10x PBS ve 1 N NaOH arasında bir stok çözelti hazırlayın. 4 º C&#39;de Filtre sterilize ve bakımı Aksi belirtilmedikçe, ve steril koşullar altında sürece bu noktadan itibaren, tüm operasyonları buz üzerinde yürütülmektedir. </li><li> İstenen kollajen konsantrasyonu ve pH 7.4 &#39;elde etmek için uygun hacimleri 10X PBS ve 1 N NaOH karıştırın. Örneğin, 1 ml &#39;lik bir son hacim itibarıylapH 7.4 &#39;te TAMRA-kollajen karıştırın, 1 N NaOH ile 5 ul 10x 100 ul PBS birleştirir. İyice karıştırın. </li><li> TAMRA etiketli kollajen ve 2 mg / ml &#39;lik bir son toplam kollajen konsantrasyonunu elde etmek için bir 01:06 oranında etiketlenmemiş kolajen hem de uygun hacimleri ekleyin. Örneğin, 2 mg / ml &#39;TAMRA-kollajen Karışım 1 ml&#39; lik bir son hacim için, 3.68 mg / ml &#39;TAMRA etiketli kolajen ve 4.01 mg / etiketlenmemiş kollajen ml 415,71 ul 90.48 ul ekleyin. Hava kabarcıklarının oluşumu kaçınarak, pipetleme iyi ve yavaş yavaş karıştırın. </li><li> 10 5 hücre / ml ve 2 mg / ml &#39;lik bir nihai konsantrasyon kollajen bir nihai hücre yoğunluğu elde etmek için TAMRA-Kollajen Mix soğutulmuş FBS&#39;siz hücre orta uygun hacmi içinde süspansiyon hücreleri ekleyin. Örneğin, 2 mg / ml &#39;TAMRA-kollajen Karışım, 1 ml, 10 5 hücreleri ihtiva eden ortam 388,81 ul ekleyin. Hava kabarcıklarının oluşumu kaçınarak, pipetleme iyi ve yavaş yavaş karıştırın. Bir pH test s karışımı 10 ul test ederek pH onaylayıngezi. </li><li> TAMRA-Kollajen cam alt yemekleri üzerine Mix ve 30-45 dakika oda sıcaklığında polimerize izin Pipet 100 ul damla. 100 ul kollagen damla 7 mm&#39;lik tipik bir çapa sahiptir ve yüksek 2 mm&#39;dir. Polimerize edildiğinde, kollajen, beyaz bir ish jel haline dönüşür. Not: kollajen çanak kapatmadan polimerize izin camdan dekolmanı azaltarak, kollajen damla etrafında bir su filmi oluşumunu önlemek olacaktır. Yapışma özelliğini arttırmak için, cam tabaklar 100 ug / ml &#39;de poli-L-lisin ile kaplanmış olabilir. </li><li> Dikkatlice kollajen / hücre damla karşılamak için yeterli kültür ortamı ekleyin. Kollajen damla kolayca ayırmak çünkü medya veya ani hareketlerin yüksek akıları kaçının. Matris (genellikle 1-3 gün) göç hücreleri için yeterli zaman için 10% CO 2 nemlendirilmiş havada 37 º C&#39;de tutun. </li></ol> 3. Gömülü Hücre sferoidler ile 3D TAMRA-kollajen Matrisler <ol><li> 2 mg / ml TAMRA-Kollajen M hacmi hesaplayınDeney için gerekli IX. Her zaman kollajen yüksek viskozite nedeniyle ortaya çıkan kayıpların pipetleme için hesap% 20 daha fazla hazırlamak. </li><li> 10x PBS ve 1 N NaOH arasında bir stok çözelti hazırlayın. 4 º C&#39;de Filtre sterilize ve bakımı Aksi belirtilmedikçe, ve steril koşullar altında sürece bu noktadan itibaren, tüm operasyonları buz üzerinde yürütülmektedir. </li><li> 10x PBS karıştırın, uygun hacimleri olarak FBS&#39;siz, 1 N NaOH ve hücre ortamı istenilen kollajen konsantrasyonu ve pH 7.4 &#39;elde etmek. Örneğin, pH değeri 7.4 &#39;de TAMRA-kollajen Karışım 1 ml&#39; lik bir son hacim için, 10x 100 ul PBS, 1 N NaOH ve 5 ul medya 388,81 ul birleştirir. İyice karıştırın. </li><li> TAMRA etiketli kollajen ve 2 mg / ml &#39;lik bir son toplam kollajen konsantrasyonunu elde etmek için bir 01:06 oranında etiketlenmemiş kolajen hem de uygun hacimleri ekleyin. Örneğin, 2 mg / ml &#39;TAMRA-kollajen Karışım 1 ml&#39; lik bir son hacim için, 3.68 mg / ml &#39;TAMRA etiketli kollajen 90.48 ul ve unla içinde 4.01 mg / ml&#39; 415,71 uldiği kollajen. Hava kabarcıklarının oluşumu kaçınarak, pipetleme iyi ve yavaş yavaş karıştırın. PH test şeridi üzerindeki karışımı 10 ul test ederek pH onaylayın. </li><li> TAMRA-Kollajen cam alt yemekleri üzerine Mix ve 2-5 dakika polimerizasyon başlatmak için izin Pipet 100 ul damla. Bu biraz jel viskozite artırarak parçacıklarının batan önlemek için yardımcı olacaktır. 100 ul kollagen damla 7 mm&#39;lik tipik bir çapa sahiptir ve yüksek 2 mm&#39;dir. </li><li> Bir hücre sfero toplayın ve temiz bir Petri kabı üzerine yerleştirin. Sıvı herhangi bir aşırı çıkarın ve TAMRA-Kollajen Mix 10 ul içinde tekrar süspansiyon. Bu, hücre ortamı ile kollajen seyreltme önlemek için önemlidir. </li><li> Bir P20 pipet kullanarak, kollajen sfero askıya toplamak ve 100 ul TAMRA-Kollajen Mix damla ortasına üzerine yerleştirin. Not: işgal ve / veya göç birbirlerine kapasitesini etkileyebilir çünkü, kollajen damla başına birden fazla sfero koymayın. </li><li> Poli için TAMRA-Kollajen Mix izin ver30-45 dakika boyunca oda sıcaklığında Merize. Polimerize edildiğinde, kollajen, beyaz bir ish jel haline dönüşür. Not: kollajen çanak kapatmadan polimerize izin camdan dekolmanı azaltarak, kollajen damla etrafında bir su filmi oluşumunu önlemek olacaktır. Yapışma özelliğini arttırmak için, cam tabaklar 100 ug / ml &#39;de poli-L-lisin ile kaplanmış olabilir. </li><li> Dikkatlice kollajen / parçacıklarının damla karşılamak için yeterli kültür ortamı ekleyin. Kollajen damla kolayca ayırmak çünkü medya veya ani hareketlerin yüksek akıları kaçının. </li><li> Hücreleri matrisi (genellikle 1-3 gün) işgal / göç için yeterli zaman için 10% CO 2 nemlendirilmiş havada 37 º C&#39;de tutun. </li></ol> 4. 3D İmmünofloresan Boyama <ol><li> Dikkatlice hücre ortamı çıkarın ve PBS ile hücre / parçacıklarının içeren kollajen matris durulayın. </li><li> Eş zamanlı olarak gidermek ve çıkarma / sabitleme tamponu (% 4 PFA PB,% 0.3 Triton X-100,% 5 sukroz ile inkübe hücreleri ayıklamak5 dakika boyunca s). 2 mcM Phalloidin ve hücre iskeleti veya hücre iskeleti ilişkili proteinlerin görselleştirme için Taxol 2 mcM ile tampon Ek. </li><li> % 4 PFA, 30 dakika boyunca PBS içinde% 5 sükroz ile hücreleri daha düzeltin. PBS içinde% 0.05 Tween-20 ile durulayın. </li><li> PBS içinde birincil antikor çözüm hazırlayın. Oda sıcaklığında ya da gece boyunca 4 ° C&#39;de en az 1 saat boyunca birincil antikor ile inkübe hücreleri Tüm kollajen damla karşılamak için yeterli çözüm eklemek için emin olun. 35 mm cam alt çanak için, çözüm 1.5-2 ml gerekli olacaktır. Not: antikor çözeltisinin hacmi azaltmak için, örneğin silikon yağı ya da bir PDMS halkanın daire hattı gibi suda çözünmeyen bir bariyer, kollajen damla etrafına yerleştirilebilir. </li><li> PBS içinde% 0.05 Tween-20 ile 3 kez 30 dakika yıkayınız. </li><li> Alexa-konjuge sekonder antikorlar, PBS içinde Alexa-konjuge Phalloidin ve DAPI çözümler hazırlayın. Oda sıcaklığında 2 saat için uygun sekonder antikor ile inkübe hücreleri. </li><li> 3x 3 yıkayınPBS içinde% 0.05 Tween-20 ile 0 dak. </li><li> , Sıvı aşan çıkarın cam alt çanak alt (yaklaşık 500 ul) doldurmak ve mühür üstüne bir 24 mm lamel yerleştirmek için medya montaj kadar ekleyin. Kollajen damla sıkıştırmak ve 3D organizasyon zarar vermemek için lamel aşağı bastırmayın. </li></ol> 5. Örnek Görüntüleme Klasik ya da dönen bir disk konfokal mikroskoplar kullanılabilir. Bir ters sistemi tercihen cam alt görüntülü hücrelerin mesafeyi belirlemek için kullanılmalıdır. Bu iş için kullanılan sistem bir 40X/1.3NA ve 60X/1.4NA yağ daldırma hedefleri (sırasıyla mesafeleri 200 mikron ve 130 mikron, çalışma), bir Fotometrik CoolSnap HQ2 kamera 1392 x 1040 ile donatılmış bir Ters Konfokal İplik Disk olan görüntüleme dizi, 6.45 x 6.45 mikron piksel ve Metamorph görüntüleme yazılımı tarafından kontrol edilir. 405 nm, 491 nm, 561 nm ve 633 nm lazerler genellikle% 30-50 güçte kullanılır, 1 kazanmak ve 2 binningx 2 pozlama süreleri azaltmak. , FITC (hariç 478-495; em 510-555) ve Texas Kırmızı (hariç 560-580,, mikroskop da DAPI (em 450-465 hariç 400-418 nm) için Hg lamba ve filtre küpler ile donatılmıştır em 600 -650) göz parça ile kullanmak için. <ol><li> Floresan lamba kullanarak, kollajen damla ortasında 40X objektif yerleştirin. Xy ekseni ve z-ekseni hem de örnek bir bakış, alın. Kenar etkileri önlemek için görüntüleri satın alırken xy ekseni üzerinde jel kenarından fazla 100 mikron sapma değil emin olun. Ne zaman görüntüleme parçacıklarının, onlar objektif çalışma mesafesi altında olduğundan emin olun. Uygunsa hedefi değiştirin. </li><li> Konfokal canlı görüntüleme moduna geçin. Kollajen lifleri görünmeye başlar hangi z değerini belirlemek cam alt başlayarak, TAMRA-etiketli kollajen görselleştirmek için 561 nm lazer kullanarak. Bu alt tabaka ve z = 0 dır. </li><li> Odak düğmesini kullanarak, z = 0 ile 100 mikron kadar gidin. Z = 100 mikron ancak hücreleriveya üzeri sert cam alt gerilim etkileri önlemek için görüntülü olmalıdır. </li><li> Görüntü hücreleri seçin. Her dalga boyu için kamera pozlama süreleri ve lazer güç optimize edin. DAPI ve Alexa-488 Phalloidin için tipik pozlama süreleri 100-200 milisaniye arasındadır. Antikor boyama için pozlama süreleri değişebilir. </li><li> Boyama ve odak düğmesini kullanarak Phalloidin görselleştirmek için uygun lazer kullanarak konfokal canlı modu, mevcut üst ve alt z değerleri ayarlayarak z serisi aralığı tanımlar. </li><li> Z adım boyutunu tanımlayın. 40X hedefleri için, 1 mikron kullanın. 60X için, 0.5 mikron kullanın. Satın alma başlayın. </li></ol>

<ol>
	<li>Schiro, J. A., Chan, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+alpha+2+beta+1+(VLA-2)+mediates+reorganization+and+contraction+of+collagen+matrices+by+human+cells.">Integrin alpha 2 beta 1 (VLA-2) mediates reorganization and contraction of collagen matrices by human cells.</a> Cell. 67 (2), 403-410 (1991).</li><li>Klein, C. E., Dressel, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+alpha+2+beta+1+is+upregulated+in+fibroblasts+and+highly+aggressive+melanoma+cells+in+three-dimensional+collagen+lattices+and+mediates+the+reorganization+of+collagen+I+fibrils.">Integrin alpha 2 beta 1 is upregulated in fibroblasts and highly aggressive melanoma cells in three-dimensional collagen lattices and mediates the reorganization of collagen I fibrils.</a> J. Cell Biol. 115 (5), 1427-1436 (1991).</li><li>Friedl, P., Maaser, K., Klein, C. E., Niggemann, B., Krohne, G., Z&#228;nker, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migration+of+highly+aggressive+MV3+melanoma+cells+in+3-dimensional+collagen+lattices+results+in+local+matrix+reorganization+and+shedding+of+alpha2+and+beta1+integrins+and+CD44.">Migration of highly aggressive MV3 melanoma cells in 3-dimensional collagen lattices results in local matrix reorganization and shedding of alpha2 and beta1 integrins and CD44.</a> Cancer Res. 57 (10), 2061-2070 (1997).</li><li>Wirtz, D., Konstantopoulos, K., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physics+of+cancer:+the+role+of+physical+interactions+and+mechanical+forces+in+metastasis.">The physics of cancer: the role of physical interactions and mechanical forces in metastasis.</a> Nat. Rev. Cancer. 11 (7), 512-522 (2011).</li><li>Zaman, M. H., Trapani, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migration+of+tumor+cells+in+3D+matrices+is+governed+by+matrix+stiffness+along+with+cell-matrix+adhesion+and+proteolysis.">Migration of tumor cells in 3D matrices is governed by matrix stiffness along with cell-matrix adhesion and proteolysis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103 (29), 10889-10894 (2006).</li><li>Doyle, A. D., Wang, F. W., Matsumoto, K., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-dimensional+topography+underlies+three-dimensional+fibrillar+cell+migration.">One-dimensional topography underlies three-dimensional fibrillar cell migration.</a> J. Cell Biol. 184 (4), 481-490 (2009).</li><li>Fraley, S. I., Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+distinctive+role+for+focal+adhesion+proteins+in+three-dimensional+cell+motility.">A distinctive role for focal adhesion proteins in three-dimensional cell motility.</a> Nat. Cell Biol. 12 (6), 598-604 (2010).</li><li>Harunaga, J. S., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-matrix+adhesions+in+3D.">Cell-matrix adhesions in 3D.</a> Matrix Biol. 30 (7-8), 363-368 (2011).</li><li>Raub, C. B., Suresh, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+assessment+of+collagen+gel+microstructure+and+mechanics+using+multiphoton+microscopy.">Noninvasive assessment of collagen gel microstructure and mechanics using multiphoton microscopy.</a> Biophys. J. 92 (6), 2212-2222 (2007).</li><li>Geraldo, S., Simon, A., Elkhatib, N., Louvard, D., Fetler, L., Vignjevic, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do+cancer+cells+have+distinct+adhesions+in+3D+collagen+matrices+and+in+vivo?.">Do cancer cells have distinct adhesions in 3D collagen matrices and in vivo?.</a> Eur. J. Cell Biol. 91 (11-12), 930-937 (2012).</li><li>Geraldo, S., Gordon-Weeks, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoskeletal+dynamics+in+growth-cone+steering.">Cytoskeletal dynamics in growth-cone steering.</a> J. Cell Sci. 122 (Pt 20), 3595-3604 (2009).</li><li>Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+generation+of+homogeneous+multicellular+tumor+spheroids+applicable+to+a+wide+variety+of+cell+types.">Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types.</a> Biotechnol. Bioeng. 83 (2), 173-180 (2003).</li><li>Foty, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+hanging+drop+cell+culture+protocol+for+generation+of+3D+spheroids.">A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids.</a> J. Vis. Exp. (51), (2011).</li><li>Haji-Karim, M., Carlsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation+and+viability+in+cellular+spheroids+of+human+origin.">Proliferation and viability in cellular spheroids of human origin.</a> Cancer Res. 38 (5), 1457-1464 (1978).</li><li>Eyre, D. R., Paz, M. A., Gallop, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-linking+in+collagen+and+elastin.">Cross-linking in collagen and elastin.</a> Ann. Rev. Biochem. 53, 717-748 (1984).</li><li>Baici, A., Cohen, G., Fehr, K., B&#246;ni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+handy+assay+for+collagenase+using+reconstituted+fluorescein-labeled+collagen+fibrils.">A handy assay for collagenase using reconstituted fluorescein-labeled collagen fibrils.</a> Anal. Biochem. 108 (2), 230-232 (1980).</li><li>Stein, A. M., Vader, D. A., Jawerth, L. M., Weitz, D. A., Sander, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+algorithm+for+extracting+the+network+geometry+of+three-dimensional+collagen+gels.">An algorithm for extracting the network geometry of three-dimensional collagen gels.</a> J. Microsc. 232 (3), 463-475 (2008).</li><li>Sabeh, F., Ota, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+cell+traffic+through+the+extracellular+matrix+is+controlled+by+the+membrane-anchored+collagenase+MT1-MMP.">Tumor cell traffic through the extracellular matrix is controlled by the membrane-anchored collagenase MT1-MMP.</a> J. Cell Biol. 167 (4), 769-781 (2004).</li><li>Artym, V. V., Matsumoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+cells+in+three-dimensional+collagen+matrix.">Imaging cells in three-dimensional collagen matrix.</a> Curr. Prot. Cell Biol. Chapter 10, Unit 10.18.1-Unit 10.18.20 (2010).</li><li>Jawerth, L. M., M&#252;nster, S., Vader, D. A., Fabry, B., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+blind+spot+in+confocal+reflection+microscopy:+the+dependence+of+fiber+brightness+on+fiber+orientation+in+imaging+biopolymer+networks.">A blind spot in confocal reflection microscopy: the dependence of fiber brightness on fiber orientation in imaging biopolymer networks.</a> Biophys. J. 98 (3), L1-L3 (2010).</li><li>Cicchi, R., Vogler, N., Kapsokalyvas, D., Dietzek, B., Popp, J., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+molecular+structure+to+tissue+architecture:+collagen+organization+probed+by+SHG+microscopy.">From molecular structure to tissue architecture: collagen organization probed by SHG microscopy.</a> J. Biophotonics. 6 (2), 129-142 (2013).</li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

Protokol floresan bir 561 nm lazer ile donatılmış bir standart konfokal mikroskop kullanarak, kollajen ağ organizasyonu kolay görselleştirme izin için mükemmel bir yöntem sağlar TAMRA kullanarak kollajen etiketlemek için burada açıklanan. Yansıma konfokal mikroskopi ile karşılaştırıldığında, bu tekniğin bir avantajı, 3D matris derinliklerine dosyasını kolajen lifleri yeteneğidir. Liflerin yansıma yoğunluğuna ve kontrast lazer ışığı emme ve saçılma bağlı derinliği ile esas olarak a...

Hücre göçü alanında yepyeni üçüncü boyut dünyasına braving edilmiştir. Bu en yakından andıran bir fizyolojik ve (3 boyutlu) bu nedenle, üç boyutlu bir ortamda hücre göçü çalışma sezgiseldir. Ancak, teknik sınırlamalar nedeniyle, çoğu cep göç çalışmaları işlenmemiş veya uygun hücre dışı matriks (ECM) proteinleri ile kaplanmış ya, sert iki boyutlu (2D) yüzeyler boyunca hücre hareketi analiz yapılmıştır. Üç boyutlu kollajen kafesler içinde hücre göçü adanmış ilk çalışmalar 20 yıl 1-3 geçirin. Ancak, son 5 yılda bu göçmen hücreler önemli ölçüde kendi morfolojisi ve yüzey boyutluluk bağlı olarak göç modunda farklı olabilir netlik kazandı. 2D, hücreler yalnızca geniş düz çıkıntılar oluşumu (lamellipodia) ile sonuçlanan, fokal yapışıklıklar kullanarak ventral yüzeyi ile yüzeye temasonların öncü gömülü parmak şeklinde çıkıntılar (filopodia). Bu yapılar, bir araya firar kenarı için hücre ön bağlantı stres lifleri ile, 2 hücre hareketi için önemli olduğuna inanılmaktadır. 3D matrisleri olarak, hücre formasyonu ve bu yapıların birçok fonksiyonel önemi önemli değişikliklere yol açan, ECM ile temas eden tüm hücre yüzeyi ile birlikte, genel olarak daha uzun vardır. Tersine, diğer hücresel özellikleri, ECM yeniden 4 dahil nükleer deformasyon ve yapıları gibi 3D göç alaka, kazanmak. Bu bilinen morfolojik değişiklikler, hem de ECM ve hücre tipleri, 3 boyutlu matris içinde gömülü hücrelerinin yapısal ve fonksiyonel analizi bağlı olarak değişebilir 5-7 geçiş modları farklılıklara rağmen yine de alışılmadık kalır. Kalın ve yoğun 3D matrisler çalışma teknik, yüksek çözünürlüklü mikroskopi görüntüleme gibi zorluklar, ve en sta uyumsuzluğa taşırndard protokolleri endojen proteinlerin immunofluorescent etiketleme gibi, 2D kültürler için optimize edilmiş. 3D matris kullanımı nispeten yeni bir yaklaşımdır çünkü Ayrıca, araştırmacılar hala yakından farklı doku organların normal stromal mimarisi veya tümör etrafında ECM örgütü olarak in vivo durumlarda, belirli benzemeye en iyi koşulları araştırıyor. Ilgili farklı gruplar tarafından sonuçlarında farklılıklar, örneğin, kanser hücresi göç modları veya fokal yapışıklıklar varlığı, bazı tartışmalara 8 yarattı. Çaba Bir çok yakın zamanda ECM kimyasal yapısı, gözenek boyutu, lif kalınlığı, ve matris sertlik açısından bir uzlaşma ithaf edilmiştir. 3D ECMlerin birçok farklı türde anda hücre türetilmiş matrislerden ticari olarak temin Matrigel pepsinized sığır kollagen I ya da nonpepsinized, fare kuyruk kolajeni I. Bu matrislerden her biri belirli fiziksel ve kimyasal özelliklere sahiptir ve gerçek bir ihtiyaç değişen, kullanılante fizyolojik sürecine tercih matris çalışılmaktadır. Buna ek olarak, gözenek boyutu ve lif kalınlığı, pH ve sıcaklık gibi 9,10 polimerizasyon koşulları, bağlıdır. Cam gibi sert yüzeyler, dan ve mesafe bağlama da matris 10,11 elastik özelliklerini değiştirebilirsiniz. Bu makalede, tek bir hücre ya da sferoidlerinde hazırlanması ve 3D-kanser hücresi kültürlerinin görüntüleme yöntemleri açıklanır. Kanser hücresi parçacıklarının üretilmesi için yöntemler, daha önce Asılı damla yönteminde, 12,13 ve agaroz kaplı plaka yöntemi 14 olan en popüler olanlar tarif edilmiştir. Kanser hücresi göç için uygun bir ECM substrat olarak, oda-sıcaklığında polimerize nonpepsinized, fare kuyruk kolajeni 2 mg / ml &#39;de kullanılmıştır. Nonpepsinized asitle ekstre kollajen sıçan kuyruk her ikisi de N-ve C-terminal telopeptid, doğal kolajen intermolec sorumlu kollajen molekülü nonhelical bölümleri korurular çapraz ve fibriller istikrar 15. Bununla birlikte, bu, in vivo koşullarda en yakın 10 gözlenen benzer olanlar kollajen ağların oluşmasına izin verir. Sabit ve oturma kültürlerde hem kolajen lifleri, görselleştirme izin vermek için, ayrıntılı bir protokol floresan 5 kullanılarak in vitro 10 kolajen etiketlemek için sağlanmaktadır - (and-6)-carboxytetramethylrhodamine (TAMRA), süksinimidil ester. Bu protokol, Baici ark adapte edilmiştir. Floresein izotiosiyanat çözülebilir kolajen molekülü etiketlemek için kullanılır 16,17. Floresein gibi, TAMRA, örneğin N-terminalinde bulunan serbest amino grubu ve daha da önemlisi, lisinlerin yan amino grubu gibi proteinlerin nonprotonated alifatik amino grupları ile reaksiyona giren bir amino-reaktif bir floresan boya. Lisin amino grubu nonprotonated biçiminde olduğunda Bu reaksiyon, sadece temel bir pH değerinde meydana gelir. TAMRA fazla floresein daha kararlı olmasının yanı sıra,zaman, kendi emisyon spektrumları yararlı GFP etiketli proteinlerin canlı hücre görüntüleme için kombine edilebilir kırmızı / turuncu aralığı (ex / em = 555/518 nm), düşüyor. Amino-reaktif boyalar ile çözülebilir kolajen etiketli moleküller kullanılarak polimerizasyon işlemi ya yoğunluğu, gözenek büyüklüğü ve kollajen matris 10,16,18,19 arasında çapraz bağlanma durumunu etkilemez. Bu protokol aynı zamanda daha iskeleti veya hücre iskeleti ilişkili protein etiketlemek için optimize edilmiştir endojen protein, 3 boyutlu immunofluorescent etiketleme için bir yöntem içerir. Bu protokolün son odak kollajen matriks gerginlik sert cam lamelleri gelen düşük katkı ile konfokal mikroskopi kullanılarak 3D kültürlerin yüksek çözünürlüklü görüntüler elde etmek için yöntemler üzerinde.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="603">
	<colgroup>
		<col span="2" />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">TAMRA, SE</td>
			<td style="width:195px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:136px;">C-1171</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rat tail Collagen High Concentration</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rat tail Collagen</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phalloidin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Taxol (Paxitel)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T7402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse anti-alpha Tubulin antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa 488 Phalloidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa 633 Goat anti-Mouse antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mounting media</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>106 226 89 </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"> </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Name of Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dialysis Cassette</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>66380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass bottom dishes</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>FD35-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MetaMorph Microscopy Automation &#38; Image Analysis Software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Imaris 7.2.3</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

revealing the cytoskeletal organization of invasive cancer cells in 3d

Hücre göçü geleneksel 2 boyutlu yüzeyler çalışılmıştır. Bununla birlikte, daha iyi bir soru olarak fizyolojik süreçlerin boyutluluk benzer daha uygun 3D ortamlar, hücre göçü incelemek için bir ihtiyaç olduğu giderek daha belirgin hale gelmiştir. Göçmen hücreleri ölçüde onlar 2D veya 3D yüzeylerde hareket ediyor olmasına bağlı olarak kendi morfolojisi ve göç modunda farklı olabilir. En standart protokoller, 3D matris içinde gömülü hücrelerin yapısal ve fonksiyonel analiz ile teknik zorluklar ve uyumsuzluklar nedeniyle hala yaygın olmaya devam etmektedir. Bu makalede, tek bir hücre ya da sferoidlerinde hazırlanması ve 3D-kanser hücresi kültürlerinin görüntüleme yöntemleri açıklanır. Kanser hücresi göç için uygun bir ECM substrat olarak, I oda sıcaklığında polimerize ve floresan standart konfokal mikroskop kullanarak vizüalizasyon etiketli nonpepsinized, fare kuyruk kolajeni kullanın. Bu çalışma aynı zamanda bir protoc içerirendojen hücre hücre iskeletinin 3D immunofluorescent etiketleme için ol. Biz moleküler kompozisyon, lokalizasyonu ve 3D hücresel yapıların fonksiyonları daha iyi bir açıklama katkıda bulunmayı umuyoruz bu protokolleri kullanarak.

TAMRA ile fare kuyruğu kollajen I Etiketleme 3D kollajen ağları kolay hazırlanması ve görselleştirme sağlar. In vivo 10 bulunan olanlarla karşılaştırılabilir organizasyon ile kollajen ağların oluşması ile, oda sıcaklığında sonuçlar yavaş polimerizasyonu. Burada sferoidler olarak ve tek bir hücre olarak, hem CT26 kanser hücrelerinin hücre iskeletinin immünofloresan boyama için bir protokol mevcut. Daha iyi hücre iskeleti korum...

Watch this Scientific Journal Video about Revealing the Cytoskeletal Organization of Invasive Cancer Cells in 3D at JoVE.com

Revealing the Cytoskeletal Organization of Invasive Cancer Cells in 3D

Bu makalede, floresan daha düzeltme ve 3D-hücre kültürleri canlı görüntüleme için kullanılabilir kollajen etiketlemek için bir yöntem sunar. Ayrıca 3D ortamlarda kültür hücrelerinin endojen iskelet proteinleri görselleştirmek için optimize edilmiş bir protokol sağlar.

3D İnvaziv Kanser Hücrelerinin Sitoskeletal Örgütü ortaya

Cell migration has traditionally been studied in 2D substrates. However, it has become increasingly evident that there is a need to study cell migration ...

revealing-the-cytoskeletal-organization-of-invasive-cancer-cells-in-3d

Research

JoVE Journal

Medicine

15.6K Görüntüleme.  Institut Curie.  Bu makalede, floresan daha düzeltme ve 3D-hücre kültürleri canlı görüntüleme için kullanılabilir kollajen etiketlemek için bir yöntem sunar. Ayrıca 3D ortamlarda kültür hücrelerinin endojen iskelet proteinleri görselleştirmek için optimize edilmiş bir protokol sağlar. 

Video: Revealing the Cytoskeletal Organization of Invasive Cancer Cells in 3D

Biomarkers in an Animal Model for Revealing Neural, Hematologic, and Behavioral Correlates of PTSD

Identification of biomarkers representing the evolution of the pathophysiology of Post Traumatic Stress Disorder (PTSD) is vitally important, not only for objective diagnosis but also for the evaluation of therapeutic efficacy and resilience to trauma. Ongoing research is directed at identifying molecular biomarkers for PTSD, including traumatic stress induced proteins, transcriptomes, genomic variances and genetic modulators, using biologic samples from subjects' blood, saliva, urine, and postmortem brain tissues. However, the correlation of these biomarker molecules in peripheral or postmortem samples to altered brain functions associated with psychiatric symptoms in PTSD remains unresolved. Here, we present an animal model of PTSD in which both peripheral blood and central brain biomarkers, as well as behavioral phenotype, can be collected and measured, thus providing the needed correlation of the central biomarkers of PTSD, which are mechanistic and pathognomonic but cannot be collected from people, with the peripheral biomarkers and behavioral phenotypes, which can.
Our animal model of PTSD employs restraint and tail shocks repeated for three continuous days - the inescapable tail-shock model (ITS) in rats. This ITS model mimics the pathophysiology of PTSD 17, 7, 4, 10. We and others have verified that the ITS model induces behavioral and neurobiological alterations similar to those found in PTSD subjects 17, 7, 10, 9. Specifically, these stressed rats exhibit (1) a delayed and exaggerated startle response appearing several days after stressor cessation, which given the compressed time scale of the rat's life compared to a humans, corresponds to the one to three months delay of symptoms in PTSD patients (DSM-IV-TR PTSD Criterian D/E 13), (2) enhanced plasma corticosterone (CORT) for several days, indicating compromise of the hypothalamopituitary axis (HPA), and (3) retarded body weight gain after stressor cessation, indicating dysfunction of metabolic regulation.
The experimental paradigms employed for this model are: (1) a learned helplessness paradigm in the rat assayed by measurement of acoustic startle response (ASR) and a charting of body mass; (2) microdissection of the rat brain into regions and nuclei; (3) enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for blood levels of CORT; (4) a gene expression microarray plus related bioinformatics tools 18. This microarray, dubbed rMNChip, focuses on mitochondrial and mitochondria-related nuclear genes in the rat so as to specifically address the neuronal bioenergetics hypothesized to be involved in PTSD.

We describe a rat model of post traumatic stress disorder (PTSD) that reveals the persistent alterations in neuroendocrine function and the delayed long-term, exaggerated fear response, characteristic of PTSD patients. The animal model and methods described here are useful for correlating biomarkers in brain nuclei, which are mechanistic but cannot be measured in patients, with biomarkers in peripheral white blood cells, which can.

TSSB, Nöral Hematolojik ve Davranış Bağlantılı Revealing için Hayvan Modelinde Biyobelirteçler

Identification of biomarkers representing the evolution of the pathophysiology of Post Traumatic Stress Disorder (PTSD) is vitally important, not only for ...

Tıp

Molecular Profiling of the Invasive Tumor Microenvironment in a 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells and Ex vivo Fibroblasts

Invading colorectal cancer (CRC) cells have acquired the capacity to break free from their sister cells, infiltrate the stroma, and remodel the extracellular matrix (ECM). Characterizing the biology of this phenotypically distinct group of cells could substantially improve our understanding of early events during the metastatic cascade.

Tumor invasion is a dynamic process facilitated by bidirectional interactions between malignant epithelium and the cancer associated stroma. In order to examine cell-specific responses at the tumor stroma-interface we have combined organotypic co-culture and laser micro-dissection techniques.
Organotypic models, in which key stromal constituents such as fibroblasts are 3-dimentioanally co-cultured with cancer epithelial cells, are highly manipulatable experimental tools which enable invasion and cancer-stroma interactions to be studied in near-physiological conditions.

Laser microdissection (LMD) is a technique which entails the surgical dissection and extraction of the various strata within tumor tissue, with micron level precision.
By combining these techniques with genomic, transcriptomic and epigenetic profiling we aim to develop a deeper understanding of the molecular characteristics of invading tumor cells and surrounding stromal tissue, and in doing so potentially reveal novel biomarkers and opportunities for drug development in CRC.&#160;&#160;&#160;

Molecular Profiling of the Invasive Tumor Microenvironment in a 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells and Ex vivo Fibroblasts

Molecular profiling of laser microdissected cells and stroma from synthetic, tissue-engineered colorectal cancer models represents a novel and manipulatable approach to characterize and dissect the distinctive biology at the interface between tumor cells at the invasive front and cancer associated stromal cells. &#160;

Moleküler Kolorektal Kanser Hücrelerinin bir 3-Boyutlu Modeli İnvaziv tümör mikro Profili ve<em&gt; Ex vivo</em&gt; Fibroblastlar

Invading colorectal cancer (CRC) cells have acquired the capacity to break free from their sister cells, infiltrate the stroma, and remodel the ...

Non-invasive Assessment of the Efficacy of New Therapeutics for Intestinal Pathologies Using Serial Endoscopic Imaging of Live Mice

Animal models of inflammatory bowel disease (IBD) and colorectal cancer (CRC) have provided significant insight into the cell intrinsic and extrinsic mechanisms that contribute to the onset and progression of intestinal diseases. The identification of new molecules that promote these pathologies has led to a flurry of activity focused on the development of potential new therapies to inhibit their function. As a result, various pre-clinical mouse models with an intact immune system and stromal microenvironment are now heavily used. Here we describe three experimental protocols to test the efficacy of new therapeutics in pre-clinical models of (1) acute mucosal damage, (2) chronic colitis and/or colitis-associated colon cancer, and (3) sporadic colorectal cancer. We also outline procedures for serial endoscopic examination that can be used to document the therapeutic response of an individual tumor and to monitor the health of individual mice. These protocols provide complementary experimental platforms to test the effectiveness of therapeutic compounds shown to be well tolerated by mice.

We describe methods for longitudinal monitoring of the efficacy of therapeutics for the treatment of colonic pathologies in mice using a rigid endoscope. This protocol can be readily used for the characterization of the therapeutic response of an individual tumor in live mice and also for monitoring potential disease relapse.

Canlı Fareler Seri endoskopik Görüntüleme kullanma Bağırsak Patolojilerde Yeni Therapeutics Etkinliğinin Non-invaziv Değerlendirme

Animal models of inflammatory bowel disease (IBD) and colorectal cancer (CRC) have provided significant insight into the cell intrinsic and extrinsic ...

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in particular (e.g., brain tumors such as glioblastoma multiforme and squamous cell carcinoma of the head and neck &#8211; SCCHN) it is a cause of severe morbidity and can be life-threatening even in the absence of distant metastases. In addition, cancers which have relapsed following treatment unfortunately often present with a more aggressive phenotype. Therefore, there is an opportunity to target the process of invasion to provide novel therapies that could be complementary to standard anti-proliferative agents. Until now, this strategy has been hampered by the lack of robust, reproducible assays suitable for a detailed analysis of invasion and for drug screening. Here we provide a simple micro-plate method (based on uniform, self-assembling 3D tumor spheroids) which has great potential for such studies. We exemplify the assay platform using a human glioblastoma cell line and also an SCCHN model where the development of resistance against targeted epidermal growth factor receptor (EGFR) inhibitors is associated with enhanced matrix-invasive potential. We also provide two alternative methods of semi-automated quantification: one using an imaging cytometer and a second which simply requires standard microscopy and image capture with digital image analysis.

Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is a defining characteristic of malignant tumors. We provide here a simple, semi-automated micro-plate assay of invasion into a natural 3D biomatrix that has been exemplified with a number of models of advanced human cancers.

Üç boyutlu (3D) Tümör Sfero Yayılması deneyindeki

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...

Chick Heart Invasion Assay for Testing the Invasiveness of Cancer Cells and the Activity of Potentially Anti-invasive Compounds

The goal of the chick heart assay is to offer a relevant organ culture method to study tumor invasion in three dimensions. The assay can distinguish between invasive and non-invasive cells, and enables study of the effects of test compounds on tumor invasion. Cancer cells - either as aggregates or single cells - are confronted with fragments of embryonic chick heart. After organ culture in suspension for a few days or weeks the confronting cultures are fixed and embedded in paraffin for histological analysis. The three-dimensional interaction between the cancer cells and the normal tissue is then reconstructed from serial sections stained with hematoxylin-eosin or after immunohistochemical staining for epitopes in the heart tissue or the confronting cancer cells. The assay is consistent with the recent concept that cancer invasion is the result of molecular interactions between the cancer cells and their neighbouring stromal host elements (myofibroblasts, endothelial cells, extracellular matrix components, etc.). Here, this stromal environment is offered to the cancer cells as a living tissue fragment. Supporting aspects to the relevance of the assay are multiple. Invasion in the assay is in accordance with the criteria of cancer invasion: progressive occupation and replacement in time and space of the host tissue, and invasiveness and non-invasiveness in vivo of the confronting cells generally correlates with the outcome of the assay. Furthermore, the invasion pattern of cells in vivo, as defined by pathologists, is reflected in the histological images in the assay. Quantitative structure-activity relation (QSAR) analysis of the results obtained with numerous potentially anti-invasive organic congener compounds allowed the study of structure-activity relations for flavonoids and chalcones, and known anti-metastatic drugs used in the clinic (e.g., microtubule inhibitors) inhibit invasion in the assay as well. However, the assay does not take into account immunological contributions to cancer invasion.

Here, we present a protocol to study the invasion of tumor cells into living normal tissue fragments in three dimensions. This organ culture technique is mainly applied to test potentially anti-invasive drugs in vitro.

Test Chick Kalp Invasion Testi Kanser hücrelerinin invazivliğini ve Potansiyel Anti-invaziv Bileşikler Etkinlik

The goal of the chick heart assay is to offer a relevant organ culture method to study tumor invasion in three dimensions. The assay can distinguish ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

Pankreas Kanseri Yeni Tedavi Stratejileri Geliştirme Hücre Özellikleri Kök incelenmesi

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Encapsulation Thermogenic Preadipocytes for Transplantation into Adipose Tissue Depots

Cell encapsulation was developed to entrap viable cells within semi-permeable membranes. The engrafted encapsulated cells can exchange low molecular weight metabolites in tissues of the treated host to achieve long-term survival. The semipermeable membrane allows engrafted encapsulated cells to avoid rejection by the immune system. The encapsulation procedure was designed to enable a controlled release of bioactive compounds, such as insulin, other hormones, and cytokines. Here we describe a method for encapsulation of catabolic cells, which consume lipids for heat production and energy dissipation (thermogenesis) in the intra-abdominal adipose tissue of obese mice. Encapsulation of thermogenic catabolic cells may be potentially applicable to the prevention and treatment of obesity and type 2 diabetes. Another potential application of catabolic cells may include detoxification from alcohols or other toxic metabolites and environmental pollutants.

Here, we present a protocol for encapsulation of catabolic cells, which consume lipids for heat production in intra-abdominal adipose tissue and increase energy dissipation in obese mice.

Yağ Dokusu Depolarında içine Nakli Enkapsülasyon termojenik Preadipositler

Cell encapsulation was developed to entrap viable cells within semi-permeable membranes. The engrafted encapsulated cells can exchange low molecular ...

Isolation and Propagation of Circulating Tumor Cells from a Mouse Cancer Model

Cancer metastasis is the foremost cause of cancer-associated deaths. Recent studies have shown that circulating tumor cells (CTCs) are important in cancer metastasis. Indeed, the number of CTCs correlates with tumor size. Here, a detailed description is provided of a methodology for isolation and propagation of CTCs from a syngeneic mouse model of hepatocellular carcinoma (HCC) which allows for downstream analysis of potentially important molecular mechanisms of solid organ tumor metastasis. This method is efficient and reproducible. It is a non-invasive technique and, therefore, has potential to replace the invasive biopsy of tissues from humans which may be associated with complications. Therefore, the method discussed here allows for the isolation and propagation of CTCs from whole blood samples such that they can be examined and characterized. This has potential for future adaptation for clinical applications such as diagnosis, and personalized targeted therapy.

Circulating tumor cells (CTCs) have been shown to play an important role in tumor metastasis. Here, a method for the isolation and propagation of CTCs from the whole blood of a syngeneic mouse tumor model of hepatocellular carcinoma (HCC) metastasis is described.

Fare Kanser Modeli Tümör Hücreleri Sirkülasyon İzolasyonu ve Yayılım

Cancer metastasis is the foremost cause of cancer-associated deaths. Recent studies have shown that circulating tumor cells (CTCs) are important in cancer ...

A Cancer Cell Spheroid Assay to Assess Invasion in a 3D Setting

The invasive nature of cancer cell lines is thought to correlate with their metastatic potential. Most traditional assays, however, do not examine these invasive features in a three-dimensional environment and the resulting data suffer from reduced biological applicability. Here an approach is presented to visualize the invasive ability of cell lines in a physiologically relevant setting. The cancer cell spheroid invasion assay first utilizes gravity to generate spheroids within drops of media that hang from the lid of a cell culture dish. Next, these spheroids are embedded in a 3D matrix consisting of a mixture of basement membrane materials and type I collagen. Cancer cell egression from the spheroids into the surrounding matrix is then monitored over time. The method described here can be modified to examine invasion after coculture of different cell types, inclusion of drugs/inhibitors, or alterations in extracellular matrix (ECM) constituents.

This method evaluates cancer cell invasion from spheroids into a surrounding 3D matrix. Spheroids are generated via the hanging drop culture method and then embedded in a matrix comprised of basement membrane materials and type I collagen. Invasion out of the spheroids is subsequently monitored.

Bir Kanseri Hücre Sfero Testi 3D ortamda Invasion Değerlendirmek için

The invasive nature of cancer cell lines is thought to correlate with their metastatic potential.  Most traditional assays, however, do not examine these ...

Minimally Invasive Transverse Aortic Constriction in Mice

Minimally invasive transverse aortic constriction (MTAC) is a more desirable method for the constriction of the transverse aorta in mice than standard open-chest transverse aortic constriction (TAC). Although transverse aortic constriction is a highly functional method for the induction of high pressure in the left ventricle, it is a more difficult and lengthy procedure due to its use of artificial ventilation with tracheal intubation. TAC is oftentimes also less survivable, as the newer method, MTAC, neither requires the cutting of the ribs and intercostal muscles nor tracheal intubation with a ventilation setup. In MTAC, as opposed to a thoracotomy to access to the chest cavity, the aortic arch is reached through a midline incision in the anterior neck. The thyroid is pulled back to reveal the sternal notch. The sternum is subsequently cut down to the second rib level, and the aortic arch is reached simply by separating the connective tissues and thymus. From there, a suture can be wrapped around the arch and tied with a spacer, and then the sternal cut and skin can be closed. MTAC is a much faster and less invasive way to induce left ventricular hypertension and enables the possibility for high-throughput studies. The success of the constriction can be verified using high-frequency trans-thoracic echocardiography, particularly color Doppler and pulsed-wave Doppler, to determine the flow velocities of the aortic arch and left and right carotid arteries, the dimension of the blood vessels, and the left ventricular function and morphology. A successful constriction will also trigger significant histopathological changes, such as cardiac muscle cell hypertrophy with interstitial and perivascular fibrosis. Here, the procedure of MTAC is described, demonstrating how the resulting flow changes in the carotid arteries can be examined with echocardiography, gross morphology, and histopathological changes in the heart.

Minimally invasive transverse aortic constriction (MTAC) conserves the essentials of regular transverse aortic constriction (TAC) while eliminating the use of a ventilator with tracheal intubation. It proves to be a highly desirable method for high-throughput studies on left ventricular overload, particularly in translational studies.

Farelerde Minimal İnvaziv Enine Aort Konstrüksiyon

Minimally invasive transverse aortic constriction (MTAC) is a more desirable method for the constriction of the transverse aorta in mice than standard ...