3D Kültürlerin İn Vitro Hücre İnvazyonunu Analiz Etmek İçin Alternatif Strateji

Araştırma grubumuz öncelikle kanser ve bağışıklık hücreleri arasındaki karışmaya odaklanmaktadır. Tümör bağışıklığının modülasyonu yoluyla çeşitli biyolojik mekanizmaların baş ve boyun kanserinin evrimi üzerindeki etkisini araştırmayı amaçlıyoruz. Bu protokolün amacı, hücre dışı matriks içindeki invazyonu ve çok katmanlı bir bağlamda farklı hücre tiplerinin mekansal kolokalizasyonunu değerlendirmektir.

Bu protokolün avantajı, hem mikro gözenekli bir membrana hem de kemotaksis uyaranlarına doğru ekstraselüler matriks ile invazyonu analiz etmek için kanser hücrelerinin yanı sıra iki ilgili neoplastik olmayan hücre tipini içeren heterosferoidlerin kullanılmasıdır. Başlamak için, hücre süspansiyonuna manyetik nanopartiküller ekleyin ve 10 kez karıştırın. Hücreleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca 400G'de santrifüjleyin ve hücreleri yeniden süspanse etmek için 10 kez karıştırın.

Daha sonra, birlikte kültürleme için tüm hücreleri yeni bir tüpe aktarın ve karıştırın ve 100 mikrolitre birlikte kültürlenmiş hücreleri ultra düşük bir bağlantı plakasının her bir oyuğuna dağıtın. Topaklanmayı ve küresel oluşumu indüklemek için küresel sürücü manyetik alanını plakanın altına yerleştirin ve üç saat boyunca inkübatöre yerleştirin. 200 mikrolitrelik bir uç kullanarak, 24 oyuklu mikro gözenekli bir zarın ortasına 50 mikrolitre ECM ekleyin.

Matrisin zar yüzeyini eşit şekilde kapladığından emin olarak steril bir iğne ile kabarcıkları çıkarın. Jel oluşumu için zarı 37 santigrat derecede bir saat inkübe edin. Başlamak için, 3D hücre kültürünü ve hücre dışı matris kaplı mikro gözenekli zarı hazırlayın.

Kemoterapi cezbedici olarak mikro gözenekli zarın alt odasına %10 fetal sığır serumu ile desteklenmiş 500 mikrolitre kültür ortamı ekleyin. Daha sonra ortamı oluşturulan heterosferoidlerden dikkatlice çıkarın ve sferoidin üzerine her oyuk için 50 mikrolitre taze takviye edilmemiş ortam ekleyin. Steril makas kullanarak, 200 mikrolitrelik düşük tutma ucunun kenarını kesin ve 50 mikrolitre ortamla birlikte sferoidi toplayın.

Sferoidi nazikçe hücre dışı matrisin üzerine yerleştirin. Daha sonra, toplam 200 mikrolitre hacme ulaşmak için dikkatlice 150 mikrolitre takviye edilmemiş orta damla ekleyin. Plakayı 48 saat boyunca inkübatöre yerleştirin.

Analiz yazılımındaki dosyaya tıklayın. Aç'ı seçin, ardından resmi seçin ve Tamam'a tıklayın. Ardından analize tıklayın, ardından alanı, entegre yoğunluğu ve ekran etiketini seçmek için ölçümleri ayarlayın.

Tamam'a tıklayın. Son olarak, analiz et'e tıklayın ve ardından ölçün. Parlak alan görüntüleri, koyu veya siyah konglomeralarla tanımlanan küresel veya hücre lokalizasyonunu temsil eder.

Farklı hücrelerin görüntüleri, Z ekseni boyunca farklı görüntüler arasında floresan yoğunluğu ve miktarında farklılıklar sergiledi, bu da hücreler arasında farklı çoğalma ve istila modellerini gösterdi. Konfokal mikroskopi kullanılarak, invazyon sırasında kolokalizasyon modellerini görselleştirmek için farklı kanallar üst üste bindirildi. Sunulan temsili sonuçların görüntü analizi, önce monositlerin istila ettiğini, ardından neoplastik hücrelerin geldiğini ve fibroblastların hücre dışı matrisi istila eden son hücreler olduğunu gösterdi.