Name: using scaffold liposomes to reconstitute lipid-proximal protein-protein interactions in vitro
Uploaded: 2017-01-11T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro at JoVE.com

The authors would like to acknowledge the funding received from the American Heart Association (SDG12SDG9130039).

1. İskele Liposome Hazırlık Not: İdeal olarak, bu ilk uygulamalar DOPC (1,2-dioleoil-sn -glisero-3-fosfokolin veya PC) DGS-NTA (Ni2 +) (1,2-dioleoil oluşan nispeten basit ve idi iskelesi (kullanmalıdır - sn -glisero-3 - [(N - (5-amino-1-karboksipentil) iminodiasetik asit) sukkinil]. (nikel tuzu)) Yapı bu deneylerin rahatsız lipid yük, esneklik ve eğrilik tek tek faktörler olarak dahil edilebilir potansiyeli olan zara yakın etkileşimlerini değiştirmek. Bu değişiklikler, fosfatidilserin veya kardiyolipin (CL), fosfatidiletanolamin (DOPE veya PE) veya galaktosil (β) seramid gibi özel lipit bileşenlerin, belirlenen miktarda eklenmesi ile elde edilebilir. <ol><li> Temiz bir cam test tüpünde kloroform içinde çözündürülmüş olan lipitler birleştirin. ince bir lipid film meydana getirmek üzere tüp dönerken kuru azot gazı ile çözücü buharlaşır. Bir centrifuga olan, kalan solventin çıkması37 ° C&#39;de 1 saat l evaporatör. NOT: Çeşitli lipozom formülasyonları protokollerde kullanılmaktadır aşağıda açıklanan: iskele lipozomlar (3.3 mol% DGS-NTA (Ni 2+) / 96.7 mol% DOPC), kardiyolipine ile iskele lipozomlar (3.3 mol% DGS-NTA (Ni 2+) / 10 mol% &#39;si kardiyolipin / 86.7 mol% DOPC), kardiyolipin esnek iskele lipozomlar (3.3 mol%&#39; si DGS-NTA (Ni2 +) /% 10 mol kardiyolipin / 35 mol% &#39;si DOPE / 51.7 mol% DOPC) ve zenginleştirilmiş bir iskele lipozomlar (% 10 mol DGS-NTA (Ni2 +) / 35 mol% &#39;si DOPE / 40 mol%&#39; si DOPC / 15 mol% &#39;si kardiyolipin). </li><li> 37 ° C&#39;ye ön-ısıtılmış, Tampon A (25 mM HEPES (4- (2-hidroksietil) -1-piperazinetansülfonik asit), KOH ile 7.5 değerine ayarlandı, 150 mM KCI, pH) ilave nihai lipid konsantrasyonu 1 olacak şekilde - 2 mM arasındadır. Tam lipid karışımı (Şekil 1a) tekrar süspansiyon arada sırada burgaç gibi karıştırılarak 37 ° C&#39;de 30 dakika kuluçkalayın. </li><li> tamamen donmuş (Roug kadar sıvı azot tüpü, plastik bir test tüpüne transfer koyunhly 30 s), ve tam çözülmüş (yaklaşık 1 oluncaya kadar 37 ° C su banyosu içinde yer - 2 dakika). 4 dondurma-çözme döngüsü (Şekil 1b) bir toplam tekrar edin. </li><li> 4 filtre destekleri ve tampon maddesi içinde bir polikarbonat filtresi ıslatma ve üretici talimatlarına göre ekstruder araya getirilmesiyle, bir lipid ekstruder hazırlayın. filtre üzerinden 21 kez lipid çözeltisi a&#39;ya. Homojen bir boyut dağılımına (Şekil 1c) sağlamak için yumuşak, sabit basınç kullanın. NOT: Bu protokol açıklanan Bütün deneyler için, bir 1.0 um polikarbonat filtre ekstrüzyon için kullanılmıştır. Anyonik lipidler ile Drp1 etkileşimi 50 nm ile 400 nm arasında, 12 ya da daha büyük 13 arasında lipozom çaplarının çeşitli gözlenebilir. Bu nedenle, 1 um&#39;lik filtre boyutu her iki GTPaz aktivitesi ve elektron mikroskopisi için ideal olarak seçilmiştir. Diğer lipozom çapları istenirse, dev tek lamelli vesiküller 14,15 (GUVs) ya da küçük unilamell hazırlanmasıar kullanılabilir 16 (SUV) vezikülleri. Dinamik ışık saçılım lipozom boyutu heterojen 13 değerlendirmek için de kullanılabilir. </li><li> 4 ° C&#39;de haddelenmiş lipozomlar saklayın ve 3 sonra atın - 5 d. </li></ol> Protein Bağlanma Analizi İskele Lipozomlar 2. Kullanım <ol><li> Örnek hazırlama <ol><li> En az 15 dakika boyunca, skafold lipozomlar (50 uM son% 40 mol PC / 35 mol% &#39;si PE / 15 mol%&#39; si CL /% 10 mol DGS-NTA (Ni2 +)) (5 uM nihai) MffΔTM His ile etiketlenmiş inkübe Tampon A + BME&#39;de oda sıcaklığında (25 mM HEPES, 150 mM KCI, 10 mM β-merkaptoetanol (BME), pH, KOH ile 7.5 değerine ayarlanır). Bir mff içermeyen kontrol için, NTA (Ni2 +) maruz kalan bir His-etiketli kontrol bağlamak için (GFP gibi) protein ve kalkan lipozomlar inkübe edin. Not: Önceki bir çalışmada 2&#39;de tarif edildiği gibi MffΔTM ifade edildi ve saflaştınldı. GFP benzer şekilde saflaştırılmıştır fakat iyon değişim aşaması çıkartılmıştır. BME, bu experimen için gerekli olants Drp1 faaliyet ve montaj özelliklerini değiştirebilir oksidasyona karşı duyarlı olduğu için. </li><li> Drp1 (son 2 uM) ilave edilir ve oda sıcaklığında 1 saat inkübe edilir. Not: Önceki bir çalışmada 2&#39;de tarif edildiği gibi Drp1 ifade edildi ve saflaştınldı. Drp1 ile kuluçkalamadan sonra, membran deformasyon bağlayıcı nükleotid etkisi 2 ile mM MgCI2 ve 1 ya mM GTP, 1 mM GMP-PCP veya Tampon A + BME, bir saat daha inkübe ederek araştırılabilir. </li></ol></li><li> Negatif Leke Transmisyon Elektron Mikroskobu (EM) Analizler <ol><li> Aktarım 5 laboratuar film tabakaya örnek ul ve örnek bir karbon ile kaplanmış Cu / Rh Düzeneği. , Örnek üzerinde ızgara 1 dakika inkübe filtre kağıdı üzerinde aşırı sıvı leke ve% 2 uranil asetat bir damla transfer. 1 dakika kuluçkalayın filtre kağıdı üzerinde aşırı leke leke ve bir ızgara kutusuna aktarılır. Vakum O / N altında saklayın tam kuruma sağlamak. </li><li> Bir transmisyon elektron Microsc kullanarak görüntü örnekleri18.500 at ope - 30,000X büyütme protein ve lipozom morfolojileri 17 ultrastrüktürel değişiklikleri gözlemek için. Not: ultrastrüktürel değişiklikler, ImageJ 13 gibi, görüntü analizi yazılımı kullanılarak belirlenebilir (http://imagej.nih.gov/ij/). Protein dekorasyon çıplak lipit şablonları ile karşılaştırıldığında ölçülebilir. Buna ek olarak, boru biçimli bölümlerin çapları düzenekleri 13 en dış kısmından ölçülebilir. Daha detaylı analiz cryo-elektron mikroskobu 17 kullanılarak yapılabilir. Bu yöntem, bu kaplama örneği, ağır metal lekeleri kullanılmadan çözücünün görüntü doğal protein-yağ derlemeler için kullanılabilir. Bu şekilde, altta yatan lipit morfolojisi değişiklikler dahil olmak üzere negatif leke, belirgin olmayan ayrıntılı yapısal özellikler, incelenir ve ölçülebilir. </li></ol></li></ol> Enzimatik Deneyi ilişkin yapı lipozomların 3. Not: A Colorimetrik GTPaz tahlil 18 GTP hidrolizi yoluyla fosfat kurtuluş ölçmek için kullanılmıştır. Alternatif GTPaz deneyleri 19 mevcuttur ve gerektiğinde uygulanabilir. <ol><li> (150 uM nihai) iskele lipozomlar Tampon A + BME (hacim = 30 ul) içinde, oda sıcaklığında 15 dakika boyunca birlikte His-etiketli MffΔTM (mff) Fis1ΔTM (Fis1), veya GFP (tüm 5 uM nihai) inkübe edin. Drp1 (500 nM nihai) ilave edin ve oda sıcaklığında (hacim = 80 ul) ilave bir 15 dakika kuluçkalayın. Not: Fis1 mff 2&#39;ye benzer şekilde saflaştırılmıştır, fakat iyon değişim kromatografisi adımı atlandı. His-etiketli GFP amacı NTA (Ni2 +) baş gruplarım korumak ve diğer proteinler ile spesifik olmayan yük etkileşimleri önlemektir. herhangi bir etki GFP yokluğunda gözlemlenen ise, o zaman bu denetim gerekmeyebilir. (Ilgilenilen proteine ​​benzer boyutta) alternatif bloke proteinler de kullanılabilir, ancak GFP SCAF etkileşimlerin doğrudan görselleştirme sağlarlipozomlar katlayın. </li><li> Bir ısıl transfer tüpleri, 37 ° C olarak ayarlanmış ve GTP ve MgCI2 ilave reaksiyonları başlatmak (sırasıyla 1 mM, 2 mM son; hacim = 120 uL). </li><li> İstenen zaman noktalarında (örneğin, t = 5, 10, 20, 40, 60 dakika), Mg + 2 ve kenetlenmesi reaksiyonu durdurmak için 0.5 M EDTA 5 uL ihtiva eden bir mikro-titre plaka çukurlarına reaksiyon 20 ul transfer. </li><li> Sonuçları kalibre etmek için Tampon A + BME içinde KH 2 PO 4 sulandırarak fosfat standartlar kümesi hazırlayın. standartlar yararlı bir dizi 100, 80, 60, 40, 20, 10, 5 ve 0 uM&#39;dir. 0.5 M EDTA 5 uL ihtiva eden çukurlara, her biri 20 uL ekleyin. </li><li> Her bir oyuğa 150 ul malakit yeşil maddesi (1 mM malakit yeşili karbinol, 10 mM amonyum molibdat tetrahidrat, ve 1 N HCl) ekleyin ve OD ilave edildikten sonra 650 5 dakika okuyun. Not: GTP kararsız asittir ve malakit yeşili maddesi varlığında hidrolize olur. Bu t sağlamakmalakit reaktifi ekleme ve okuma arasındaki o zaman tekrarlanabilir sonuçlar sağlamak için sabittir. </li><li> Fosfat konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak aykırı OD 650 işaretlenmesiyle standart bir eğri oluşturur. Bir numunede OD 650 ve fosfat konsantrasyonu arasındaki ilişkiyi belirlemek için lineer regresyon kullanın. </li><li> Doğrusal regresyon kullanılarak uM fosfat protein Reaksiyon numunelerin OD 650 dönüştürün. Zamanın bir fonksiyonu olarak, fosfat konsantrasyon çizilerek her reaksiyon karışımı, fosfat üretimi oranını belirlemek ve Drp1 konsantrasyonu (0.5 uM) ile hızının bölünmesiyle kedi k dönüştürmek. NOT: Sadece ilk doğrusal oran fosfat nesil oranını belirlemek için kullanılması gerektiğini ve 3 veri noktalarının en az kullanılmalıdır. Reaksiyonun oranı, ilk üç veri noktası doğrusal değildir yeterince hızlı olması halinde bir işaret (örneğin, doğrusal bir uyum R2 az 0.9)en az 3 zaman noktaları ile ificantly kısa zaman süreci yapılmalıdır. </li></ol>

<ol>
	<li>Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+proteins,+lipids+and+detergents:+not+just+a+soap+opera.">Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera.</a> Biochim Biophys Acta (BBA) - Biomembranes. 1666 (1-2), 105-117 (2004).</li><li>Clinton, R. W., Francy, C. A., Ramachandran, R., Qi, X., Mears, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamin-related+Protein+1+Oligomerization+in+Solution+Impairs+Functional+Interactions+with+Membrane-anchored+Mitochondrial+Fission+Factor.">Dynamin-related Protein 1 Oligomerization in Solution Impairs Functional Interactions with Membrane-anchored Mitochondrial Fission Factor.</a> J Biol Chem. 291 (1), 478-492 (2016).</li><li>Chan, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Fusion+and+Fission+in+Mammals.">Mitochondrial Fusion and Fission in Mammals.</a> Annual Review of Cell and Dev Biol. 22 (1), 79-99 (2006).</li><li>Bui, H. T., Shaw, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamin+Assembly+Strategies+and+Adaptor+Proteins+in+Mitochondrial+Fission.">Dynamin Assembly Strategies and Adaptor Proteins in Mitochondrial Fission.</a> Curr Biol. 23 (19), R891-R899 (2013).</li><li>Elgass, K., Pakay, J., Ryan, M. T., Palmer, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+into+the+understanding+of+mitochondrial+fission.">Recent advances into the understanding of mitochondrial fission.</a> Biochim Biophys Acta (BBA) - Mol Cell Res. 1833 (1), 150-161 (2013).</li><li>Los&#243;n, O. C., Song, Z., Chen, H., Chan, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fis1,+Mff,+MiD49,+and+MiD51+mediate+Drp1+recruitment+in+mitochondrial+fission.">Fis1, Mff, MiD49, and MiD51 mediate Drp1 recruitment in mitochondrial fission.</a> Mol Biol Cell. 24 (5), 659-667 (2013).</li><li>Otera, H., Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mff+is+an+essential+factor+for+mitochondrial+recruitment+of+Drp1+during+mitochondrial+fission+in+mammalian+cells.">Mff is an essential factor for mitochondrial recruitment of Drp1 during mitochondrial fission in mammalian cells.</a> J Cell Biol. 191 (6), 1141-1158 (2010).</li><li>Gandre-Babbe, S., van der Bliek, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Novel+Tail-anchored+Membrane+Protein+Mff+Controls+Mitochondrial+and+Peroxisomal+Fission+in+Mammalian+Cells.">The Novel Tail-anchored Membrane Protein Mff Controls Mitochondrial and Peroxisomal Fission in Mammalian Cells.</a> Mol Biol Cell. 19 (6), 2402-2412 (2008).</li><li>Koirala, S., Guo, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interchangeable+adaptors+regulate+mitochondrial+dynamin+assembly+for+membrane+scission.">Interchangeable adaptors regulate mitochondrial dynamin assembly for membrane scission.</a> Proc Natl Acad Sci. 110 (15), E1342-E1351 (2013).</li><li>Macdonald, P. J., Stepanyants, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dimeric+equilibrium+intermediate+nucleates+Drp1+reassembly+on+mitochondrial+membranes+for+fission.">A dimeric equilibrium intermediate nucleates Drp1 reassembly on mitochondrial membranes for fission.</a> Mol Biol Cell. 25 (12), 1905-1915 (2014).</li><li>Macdonald, P. J., Francy, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+Splice+Variants+of+Dynamin-related+Protein+1+Differentially+Utilize+Mitochondrial+Fission+Factor+as+an+Effector+of+Cooperative+GTPase+Activity.">Distinct Splice Variants of Dynamin-related Protein 1 Differentially Utilize Mitochondrial Fission Factor as an Effector of Cooperative GTPase Activity.</a> J Biol Chem. 291 (1), 493-507 (2016).</li><li>Bustillo-Zabalbeitia, I., Montessuit, S., Raemy, E., Basa&#241;ez, G., Terrones, O., Martinou, J. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+Interaction+with+Cardiolipin+Triggers+Functional+Activation+of+Dynamin-Related+Protein+1.">Specific Interaction with Cardiolipin Triggers Functional Activation of Dynamin-Related Protein 1.</a> PLoS ONE. 9 (7), (2014).</li><li>Francy, C. A., Alvarez, F. J. D., Zhou, L., Ramachandran, R., Mears, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mechanoenzymatic+Core+of+Dynamin-Related+Protein+1+Comprises+the+Minimal+Machinery+Required+for+Membrane+Constriction.">The Mechanoenzymatic Core of Dynamin-Related Protein 1 Comprises the Minimal Machinery Required for Membrane Constriction.</a> J Biol Chem. 290 (18), 11692-11703 (2015).</li><li>Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+Vesicles:+Preparations+and+Applications.">Giant Vesicles: Preparations and Applications.</a> ChemBioChem. 11 (7), 848-865 (2010).</li><li>Moscho, A., Orwar, O., Chiu, D. T., Modi, B. P., Zare, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+preparation+of+giant+unilamellar+vesicles.">Rapid preparation of giant unilamellar vesicles.</a> Proc Natl Acad Sci. 93 (21), 11443-11447 (1996).</li><li>Klingler, J., Vargas, C., Fiedler, S., Keller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+ready-to-use+small+unilamellar+phospholipid+vesicles+by+ultrasonication+with+a+beaker+resonator.">Preparation of ready-to-use small unilamellar phospholipid vesicles by ultrasonication with a beaker resonator.</a> Anal Biochem. 477, 10-12 (2015).</li><li>Mears, J. A., Hinshaw, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+13+Visualization+of+Dynamins.">Chapter 13 Visualization of Dynamins.</a> Methods Cell Biol. 88, 237-256 (2008).</li><li>Leonard, M., Doo Song, B., Ramachandran, R., Schmid, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+Colorimetric+Assays+for+Dynamin's+Basal+and+Stimulated+GTPase+Activities.">Robust Colorimetric Assays for Dynamin's Basal and Stimulated GTPase Activities.</a> Methods Enzymol. 404, 490-503 (2005).</li><li>Ingerman, E., Perkins, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dnm1+forms+spirals+that+are+structurally+tailored+to+fit+mitochondria.">Dnm1 forms spirals that are structurally tailored to fit mitochondria.</a> J Cell Biol. 170 (7), 1021-1027 (2005).</li><li>Fr&#246;hlich, C., Grabiger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+oligomerization+and+mitochondrial+remodelling+of+dynamin+1-like+protein.">Structural insights into oligomerization and mitochondrial remodelling of dynamin 1-like protein.</a> EMBO J. 32 (9), 1280-1292 (2013).</li><li>James, D. I., Parone, P. A., Mattenberger, Y., Martinou, J. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hFis1,+a+Novel+Component+of+the+Mammalian+Mitochondrial+Fission+Machinery.">hFis1, a Novel Component of the Mammalian Mitochondrial Fission Machinery.</a> J Biol Chem. 278 (38), 36373-36379 (2003).</li><li>Yoon, Y., Krueger, E. W., Oswald, B. J., McNiven, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mitochondrial+Protein+hFis1+Regulates+Mitochondrial+Fission+in+Mammalian+Cells+through+an+Interaction+with+the+Dynamin-Like+Protein+DLP1.">The Mitochondrial Protein hFis1 Regulates Mitochondrial Fission in Mammalian Cells through an Interaction with the Dynamin-Like Protein DLP1.</a> Mol Cell Biol. 23 (15), 5409-5420 (2003).</li><li>Osellame, L. D., Singh, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+and+independent+roles+of+Drp1+adaptors+Mff+and+MiD49/51+in+mitochondrial+fission.">Cooperative and independent roles of Drp1 adaptors Mff and MiD49/51 in mitochondrial fission.</a> J Cell Sci. 129 (11), 2170-2181 (2016).</li><li>Esposito, E. A., Shrout, A. L., Weis, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Template-Directed+Self-Assembly+Enhances+RTK+Catalytic+Domain+Function.">Template-Directed Self-Assembly Enhances RTK Catalytic Domain Function.</a> J Biomol Screen. 13 (8), 810-816 (2008).</li><li>Shrout, A. L., Esposito, E. A., Weis, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Template-directed+Assembly+of+Signaling+Proteins:+A+Novel+Drug+Screening+and+Research+Tool.">Template-directed Assembly of Signaling Proteins: A Novel Drug Screening and Research Tool.</a> Chem Biol Drug Des. 71 (3), 278-281 (2008).</li><li>Celia, H., Wilson-Kubalek, E., Milligan, R. A., Teyton, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+a+membrane-bound+murine+MHC+class+I+molecule.">Structure and function of a membrane-bound murine MHC class I molecule.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A. 96 (10), 5634-5639 (1999).</li><li>Li, E., Wimley, W. C., Hristova, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmembrane+helix+dimerization:+Beyond+the+search+for+sequence+motifs.">Transmembrane helix dimerization: Beyond the search for sequence motifs.</a> Biochim Biophys Acta (BBA) - Biomembranes. 1818 (2), 183-193 (2012).</li><li>Zhang, F., Crise, B., Su, B., Hou, Y., Rose, J. K., Bothwell, A., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+diffusion+of+membrane-spanning+and+glycosylphosphatidylinositol-+linked+proteins:+toward+establishing+rules+governing+the+lateral+mobility+of+membrane+proteins.">Lateral diffusion of membrane-spanning and glycosylphosphatidylinositol- linked proteins: toward establishing rules governing the lateral mobility of membrane proteins.</a> J Cell Biol. 115 (1), 75-84 (1991).</li><li>Ramadurai, S., Holt, A., Krasnikov, V., van den Bogaart, G., Killian, J. A., Poolman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+diffusion+of+membrane+proteins.">Lateral diffusion of membrane proteins.</a> J Am Chem Soc. 131 (35), 12650-12656 (2009).</li><li>Gambin, Y., Reffay, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+of+the+lateral+mobility+of+transmembrane+peptides+with+hydrophobic+mismatch.">Variation of the lateral mobility of transmembrane peptides with hydrophobic mismatch.</a> J Phys Chem. B. 114 (10), 3559-3566 (2010).</li><li>Wilson-Kubalek, E. M., Brown, R. E., Celia, H., Milligan, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+nanotubes+as+substrates+for+helical+crystallization+of+macromolecules.">Lipid nanotubes as substrates for helical crystallization of macromolecules.</a> Proc Natl Acad Sci. 95 (14), 8040-8045 (1998).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Bu protokol, yekpare zar proteinleri içeren, protein-protein etkileşimlerinin araştırılması için bir yöntem sunmaktadır. modüler lipozom iskele kullanarak, araştırmacılar lipid yakın bir ortamda bir veya daha fazla protein aktivitesini değerlendirmek yeteneğine sahiptirler. 26 - Daha önce yapılan çalışmalar, plazma zarının 24 reseptör enzim için de benzer bir yöntem gösterilmiştir. Biz lipit kofaktör birleştirmek ve mitokondriyal fisyon makine mechanoenzymat...

Zara yakın protein-protein etkileşimlerini incelemek bağlı 1 dahil bütün zar proteinlerinin doğal ortamından yansıtan zorluk zorlu bir çalışmadır. Bu deterjan, çözündürme gerekliliği ve proteoliposomes protein tutarsız yönlendirmesine bağlıdır. Bu sorunları önlemek için amacıyla, bütün zar proteinlerinin çözünür etki His-Tag füzyon proteinleri olarak ifade edilmiştir, burada bir strateji bulunmaktadır ve bu bu çözünür fragmanları lipid de NTA (Ni2 +) ana grupları ile etkileşimler yoluyla iskele lipozomlara tutturulmuş yüzey. Bu iskeleler kullanılarak, lipid yakın protein etkileşimleri, lipid ve protein bileşimlerinin bir aralığı üzerinde araştırılabilir. Biz etkili bu pr modüle lipit etkileşimleri mitokondriyal fisyon kompleksinin montajını yöneten kritik protein-protein etkileşimleri araştırmak ve incelemek için bu yöntemi uyguladıkkapsayabilecektir 2. Mitokondriyal parçalanma sırasında Dynamin-ilişkili protein 1 (Drp1) 3 adı verilen bir korunmuş membran yeniden modelleme proteini, enerji homeostazı, apoptotik sinyali ve diğer birçok düzenleyen hücresel sinyallere yanıt olarak dış mitokondriyal zarın (OMM) yüzeyi için görevlendirilir İntegral mitokondrial süreçler. 8 - Bu büyük, sitozolik GTPaz ayrılmaz OMM proteinleri 4 etkileşim yoluyla mitokondri yüzeyine işe alınır. Bu tür bir protein rolü Mitokondrial Fizyon Faktörü (mff), in vitro olarak Drp1 ile belirgin bir zayıf etkileşim aydınlatmak için zor olmuştur. Bununla birlikte, genetik çalışmalar net bir şekilde mff başarılı bir mitokondriyal fisyon 7,8 için gerekli olduğunu göstermiştir. Bu yazıda anlatılan yöntem Drp1-MFF etkileşimleri teşvik eşzamanlı lipit etkileşimleri tanıtarak önceki eksikliklerin üstesinden gelmek başardı. Genel olarak, bu yeni tahlil reveamitokondriyal fisyon kompleksinin montajını rehberlik temel etkileşimleri açtı ve bu temel moleküler makinenin devam eden yapısal ve işlevsel çalışmalar için yeni bir aşama sağladı. Bugüne kadar, Drp1 ve mff arasındaki etkileşimlerin incelenmesi mff 9, esneklikleri ile komplike olan, Drp1 heterojenitesi 2,10 polimerler, ve zorluk arındırıcı ve sağlam bir transmembran alanı 11, tam uzunlukta mff yeniden yapılandırmak. Biz onun transmembran (MffΔTM-His 6) eksik His-etiketli MFF sulandırmak için NTA (Ni 2+) iskele lipozomlar kullanarak bu zorlukların ele. E aşırı ifade edildiğinde MffΔTM derece çözünür olduğunu, bu strateji, avantajlı olmuştur. E. coli ve bu izole protein kolayca iskele lipozomlar üzerinde yeniden çözüldü. Bu lipit şablonlarına gergin olduğunda, MFF membran yüzeyinde aynı, dışa bakan yönünü üstlendi.Bu avantajlar, örneğin kardiyolipin gibi mitokondriyal lipidler, ek olarak, membran 11 mff katlama ve sağlam bir yapıya eklenmiştir. Kardiyolipin de bu bozukluğu bölge stabilize etmek ve fisyon makine aksamını kolaylaştırabilir Drp1 2,12 değişken alanı ile etkileşime girer. Bu sağlam yöntem zara yakın protein etkileşimlerini değerlendirmek istiyoruz gelecek çalışmalar için yaygın olarak uygulanabilir. Ek bağlantısı / afinite etkileşimler kullanımı sayesinde, bu membran yeniden oluşturma çalışmaları sofistike hücreleri içinde membran yüzeyinde bulunan ek karmaşıklık taklit etmek için arttırılabilir. Aynı zamanda, lipid bileşimleri, daha doğru bir şekilde, bu makromoleküler kompleksler doğal ortamları taklit etmek için modifiye edilebilir. Özet olarak, bu yöntem, kritik hücresel proc sırasında membran morfolojileri şekillendirmede göre proteinlerin katkı ve lipidler incelemek için bir araç sağlaresses.

<table><tbody><tr><td>Phosphatidylcholine (DOPC)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850375</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatidylethanolamine (DOPE)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850725</td><td></td></tr><tr><td>DGS-NTA(Ni&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>790404</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Heart Cardiolipin (CL)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840012</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Acros Organics</td><td>268320010</td><td></td></tr><tr><td>Liposome Extruder</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610023</td><td></td></tr><tr><td>Cu/Rh Negative Stain Grids</td><td>Ted Pella</td><td>79712</td><td></td></tr><tr><td>Microfuge Tube</td><td>Beckman</td><td>357448</td><td></td></tr><tr><td>GTP</td><td>Jena Biosciences</td><td>NU-1012</td><td></td></tr><tr><td>GMP-PCP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3509</td><td></td></tr><tr><td>Microtiter Plate strips</td><td>Thermo Scientific</td><td>469949</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Acros Organics</td><td>40993-0010</td><td></td></tr><tr><td>Instant Blue Coomassie Dye</td><td>Expedeon</td><td>ISB1L</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310</td><td></td></tr><tr><td>BME</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>P330</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Fisher Scientific</td><td>P250</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Chloride</td><td>Acros Organics</td><td>223211000</td><td></td></tr><tr><td>4 - 20% SDS-PAGE Gel</td><td>Bio Rad</td><td>456-1096</td><td></td></tr><tr><td>4x Laemmli Loading Dye</td><td>Bio Rad</td><td>161-0747</td><td></td></tr><tr><td>HCL</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144S</td><td></td></tr><tr><td>Malachite Green Carbinol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>229105</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Molybdate Tetrahydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7302</td><td></td></tr><tr><td>Laboratory Film</td><td>Parafilm</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>Uranyl Acetate</td><td>Polysciences</td><td>21447</td><td></td></tr><tr><td>Tecnai T12 100 keV Microscope</td><td>FEI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optima MAX</td><td>Beckman</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TLA-55 Rotor</td><td>Beckman</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Refrigerated CentriVap Concentrator</td><td>Labconico</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mastercycler Pro Thermocycler</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VersaMax Microplate reader</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

using scaffold liposomes to reconstitute lipid-proximal protein-protein interactions in vitro

In vitro bütün zar proteinlerinin çalışmalar sıklıkla bir hidrofobik zar geçiş alanına varlığı ile karmaşıktır. Dahası bu çalışmaları komplike, lipozomlar içine deterjan-çözünmüş membran proteinlerinin yeniden birleştirilmesi protein topoloji zorlamak için imkansız bir stokastik süreçtir. Bu kağıt bir lipozom tabanlı iskele kullanan bu zorlu tekniklere alternatif bir yöntem sunuyor. Protein çözünürlüğü transmembran alanının silinmesi ile arttırılır ve bu amino asitler, bir His-etiketi olarak bir bağlama yarımı ile değiştirilir. Bu bağlama Lipozomun yüzeyinde üniform bir protein topoloji zorlar, (nitrilotriasetik asit His-etiketli proteinleri (NTA (Ni2 +)) tarafından koordine Ni 2+) bir ankraj grubu ile etkileşime girer. bütünsel zar proteini, mitokondriyal Fizyon Faktörü (mff) ile Dynamin ilişkili protein 1 (Drp1) arasındaki etkileşim, inve olarak, burada bir örnek sunulmuşturBu yapı iskelesi lipozom yöntemiyle stigated. Bu çalışmada, verimli bir şekilde GTPaz aktivitesi stimüle lipozom yüzeyine çözünebilir Drp1 işe mff yeteneğini göstermiştir. Ayrıca, Drp1 belirli lipid mevcudiyetinde mff dekore edilmiş lipit şablonu tubulate edebildi. Bu örnek, yapısal ve işlevsel tahliller kullanılarak iskele lipozomlar etkinliğini göstermektedir ve Drp1 aktivitesinin düzenlenmesinde mff rolü vurgulamaktadır.

Drp1 ve mff arasındaki etkileşim mitokondriyal reaksiyonu için önemli olduğu gösterilmiştir, ancak bu etkileşim, in vitro olarak özetlemek zor olmuştur. Amacımız daha iyi Drp1 ve MFF etkileşim burada hücresel ortamı taklit etmek oldu. Bu amaçla, lipozomlar NTA (Ni2 +) ana grupları arasında sınırlayıcı konsantrasyonlarını ihtiva eden yukarıda tarif edildiği gibi bir lipid filmi rehidre ile hazırlanmıştır. Çözeltisi (Şekil 1a)</s...

Watch this Scientific Journal Video about Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro at JoVE.com

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

This paper describes a method for assessing the interactions and assemblies of integral membrane proteins in vitro with various partner factors in a lipid-proximal environment.

İskele Lipozomlar kullanarak Lipid-proksimal protein-protein etkileşimleri Sulandırın için<em&gt; İn Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

using-scaffold-liposomes-to-reconstitute-lipid-proximal-protein

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

8.8K Görüntüleme.  Case Western Reserve University School of Medicine. This paper describes a method for assessing the interactions and assemblies of integral membrane proteins in vitro with various partner factors in a lipid-proximal environment. 

Video: Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes.

Detergents are indispensable for delivery of membrane proteins into 30-100 nm small unilamellar vesicles, while more complex, larger model lipid bilayers are less compatible with detergents.
Here we describe a strategy for bypassing this fundamental limitation using fusogenic oppositely charged liposomes bearing a membrane protein of interest. Fusion between such vesicles occurs within 5 min in a low ionic strength buffer. Positively charged fusogenic liposomes can be used as simple shuttle vectors for detergent-free delivery of membrane proteins into biomimetic target lipid bilayers, which are negatively charged. We also show how to reconstitute membrane proteins into fusogenic proteoliposomes with a fast 30-min protocol.
Combining these two approaches, we demonstrate a fast assembly of an electron transport chain consisting of two membrane proteins from E. coli, a primary proton pump bo3-oxidase and F1Fo ATP synthase, in membranes of vesicles of various sizes, ranging from 0.1 to &#62;10 microns, as well as ATP production by this chain.

Here we present two ultrafast protocols for reconstitution of membrane proteins into fusogenic proteoliposomes, and fusion of such proteoliposomes with target lipid bilayers for detergent-free delivery of these membrane proteins into the postfusion bilayer. The combination of these approaches enables fast and easily controlled assembly of complex multi-component membrane systems.

Deterjan-Alerjik membran proteinlerinin Ultrafast sulandırma tamamlayıcı-Proteoliposomes ücret Fusogenic kullanarak Lipid Bilayers içine.

Detergents are indispensable for delivery of membrane proteins into 30-100 nm small unilamellar vesicles, while more complex, larger model lipid bilayers ...

Biyokimya

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Membrane fusion is a crucial process in the eukaryotic cell. Specialized proteins are necessary to catalyze fusion. Atlastins are endoplasmic reticulum (ER) resident proteins implicated in homotypic fusion of the ER. We detail here a method for purifying a glutathione S-transferase (GST) and poly-histidine tagged Drosophila atlastin by two rounds of affinity chromatography. Studying fusion reactions in vitro requires purified fusion proteins to be inserted into a lipid bilayer. Liposomes are ideal model membranes, as lipid composition and size may be adjusted. To this end, we describe a reconstitution method by detergent removal for Drosophila atlastin into preformed liposomes. While several reconstitution methods are available, reconstitution by detergent removal has several advantages that make it suitable for atlastins and other similar proteins. The advantage of this method includes a high reconstitution yield and correct orientation of the reconstituted protein. This method can be extended to other membrane proteins and for other applications that require proteoliposomes. Additionally, we describe a FRET based lipid mixing assay of proteoliposomes used as a measurement of membrane fusion.

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Biological membrane fusion is catalyzed by specialized fusion proteins. Measuring the fusogenic properties of proteins can be achieved by lipid mixing assays. We present a method for purifying recombinant Drosophila atlastin, a protein that mediates homotypic fusion of the ER, reconstituting it to preformed liposomes, and testing for fusion capacity.

Rekombinant Drosophila , lipid karıştırıcılar Için lipozomlar halinde deterjan destekli yeniden yapılanma

Membrane fusion is a crucial process in the eukaryotic cell. Specialized proteins are necessary to catalyze fusion. Atlastins are endoplasmic reticulum ...

A Model Membrane Platform for Reconstituting Mitochondrial Membrane Dynamics

Mitochondrial dynamics is essential for the organelle&#8217;s diverse functions and cellular responses. The crowded, spatially complex, mitochondrial membrane is a challenging environment to distinguish regulatory factors. Experimental control of protein and lipid components can help answer specific questions of regulation. Yet, quantitative manipulation of these factors is challenging in cellular assays. To investigate the molecular mechanism of mitochondria inner-membrane fusion, we introduced an in vitro reconstitution platform that mimics the lipid environment of the mitochondrial inner-membrane. Here we describe detailed steps for preparing lipid bilayers and reconstituting mitochondrial membrane proteins. The platform allowed analysis of intermediates in mitochondrial inner-membrane fusion, and the kinetics for individual transitions, in a quantitative manner. This protocol describes the fabrication of bilayers with asymmetric lipid composition and describes general considerations for reconstituting transmembrane proteins into a cushioned bilayer. The method may be applied to study other membrane systems.

Mitochondrial fusion is an important homeostatic reaction underlying mitochondrial dynamics. Described here is an in vitro reconstitution system to study mitochondrial inner-membrane fusion that can resolve membrane tethering, docking, hemifusion, and pore opening. The versatility of this approach in exploring cell membrane systems is discussed.

Mitokondriyal Membran Dinamiğinin Yeniden İkasini için Model Membran Platformu

Mitochondrial dynamics is essential for the organelle&#8217;s diverse functions and cellular responses. The crowded, spatially complex, mitochondrial ...

Cell-Free Production of Proteoliposomes for Functional Analysis and Antibody Development Targeting Membrane Proteins

Membrane proteins play essential roles in a variety of cellular processes and perform vital functions. Membrane proteins are medically important in drug discovery because they are the targets of more than half of all drugs. An obstacle to conducting biochemical, biophysical, and structural studies of membrane proteins as well as antibody development has been the difficulty in producing large amounts of high-quality membrane protein with correct conformation and activity. Here we describe a &#8220;bilayer-dialysis method&#8221; using a wheat germ cell-free system, liposomes, and dialysis cups to efficiently synthesize membrane proteins and prepare purified proteoliposomes in a short time with a high success rate. Membrane proteins can be produced as much as in several milligrams, such as GPCRs, ion channels, transporters, and tetraspanins. This cell-free method contributes to reducing the time, cost and effort for preparing high-quality proteoliposomes, and provides suitable means for functional analysis of membrane proteins, drug targets screening, and antibody development.

This protocol describes an efficient cell-free method for production of high-quality proteoliposome by bilayer-dialysis method using wheat cell-free system and liposomes. This method provides suitable means for functional analysis of membrane proteins, drug targets screening, and antibody development.

Membran Proteinlerini Hedefleyen Fonksiyonel Analiz ve Antikor Gelişimi için Proteolipozomların Hücresiz Üretimi

Membrane proteins play essential roles in a variety of cellular processes and perform vital functions. Membrane proteins are medically important in drug ...

Reconstitution of Septin Assembly at Membranes to Study Biophysical Properties and Functions

Most cells can sense and change their shape to carry out fundamental cell processes. In many eukaryotes, the septin cytoskeleton is an integral component in coordinating shape changes like cytokinesis, polarized growth, and migration. Septins are filament-forming proteins that assemble to form diverse higher-order structures and, in many cases, are found in different areas of the plasma membrane, most notably in regions of micron-scale positive curvature. Monitoring the process of septin assembly in vivo is hindered by the limitations of light microscopy in cells, as well as the complexity of interactions with both membranes and cytoskeletal elements, making it difficult to quantify septin dynamics in living systems. Fortunately, there has been substantial progress in the past decade in reconstituting the septin cytoskeleton in a cell-free system to dissect the mechanisms controlling septin assembly at high spatial and temporal resolutions. The core steps of septin assembly include septin heterooligomer association and dissociation with the membrane, polymerization into filaments, and the formation of higher-order structures through interactions between filaments. Here, we present three methods to observe septin assembly in different contexts: planar bilayers, spherical supports, and rod supports. These methods can be used to determine the biophysical parameters of septins at different stages of assembly: as single octamers binding the membrane, as filaments, and as assemblies of filaments. We use these parameters paired with measurements of curvature sampling and preferential adsorption to understand how curvature sensing operates at a variety of length and time scales.

Cell-free reconstitution has been a key tool to understand the cytoskeleton assembly, and work in the last decade has established approaches to study septin dynamics in minimal systems. Presented here are three complementary methods to observe septin assembly in different membrane contexts: planar bilayers, spherical supports, and rod supports.

Biyofiziksel Özellikleri ve İşlevleri İncelemek için Membranlarda Septin Düzeneğinin Yeniden Sulandırılması

Most cells can sense and change their shape to carry out fundamental cell processes. In many eukaryotes, the septin cytoskeleton is an integral component ...

Kompleks Protein Ağları için Lipid Vezikül Kapsülleme Protokolü

Construction of Out&#45;of&#45;Equilibrium Metabolic Networks in Nano&#45; and Micrometer&#45;Sized Vesicles

We present a method to incorporate into vesicles complex protein networks, involving integral membrane proteins, enzymes, and fluorescence-based sensors, using purified components. This method is relevant for the design and construction of bioreactors and the study of complex out-of-equilibrium metabolic reaction networks. We start by reconstituting (multiple) membrane proteins into large unilamellar vesicles (LUVs) according to a previously developed protocol. We then encapsulate a mixture of purified enzymes, metabolites, and fluorescence-based sensors (fluorescent proteins or dyes) via freeze-thaw-extrusion and remove non-incorporated components by centrifugation and/or size-exclusion chromatography. The performance of the metabolic networks is measured in real time by monitoring the ATP/ADP ratio, metabolite concentration, internal pH, or other parameters by fluorescence readout. Our membrane protein-containing vesicles of 100-400 nm diameter can be converted into giant-unilamellar vesicles (GUVs), using existing but optimized procedures. The approach enables the inclusion of soluble components (enzymes, metabolites, sensors) into micrometer-size vesicles, thus upscaling the volume of the bioreactors by orders of magnitude. The metabolic network containing GUVs are&#160;trapped in microfluidic devices for analysis by optical microscopy.

Yazar Spotlight: Sentetik Hücre Mühendisliğinde Zorlukların Üstesinden Gelmek

We present a protocol for reconstituting membrane proteins and encapsulating enzymes and other water-soluble components in lipid vesicles of sub-micrometer and micrometer size.

Nano ve Mikrometre Boyutlu Veziküllerde Denge Dışı Metabolik Ağların İnşası

We present a method to incorporate into vesicles complex protein networks, involving integral membrane proteins, enzymes, and fluorescence-based sensors, ...

SNARE-mediated Fusion of Single Proteoliposomes with Tethered Supported Bilayers in a Microfluidic Flow Cell Monitored by Polarized TIRF Microscopy

In the ubiquitous process of membrane fusion the opening of a fusion pore establishes the first connection between two formerly separate compartments. During neurotransmitter or hormone release via exocytosis, the fusion pore can transiently open and close repeatedly, regulating cargo release kinetics. Pore dynamics also determine the mode of vesicle recycling; irreversible resealing results in transient, &#34;kiss-and-run&#34; fusion, whereas dilation leads to full fusion. To better understand what factors govern pore dynamics, we developed an assay to monitor membrane fusion using polarized total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy with single molecule sensitivity and ~15 msec time resolution in a biochemically well-defined in vitro system. Fusion of fluorescently labeled small unilamellar vesicles containing v-SNARE proteins (v-SUVs) with a planar bilayer bearing t-SNAREs, supported on a soft polymer cushion (t-SBL, t-supported bilayer), is monitored. The assay uses microfluidic flow channels that ensure minimal sample consumption while supplying a constant density of SUVs. Exploiting the rapid signal enhancement upon transfer of lipid labels from the SUV to the SBL during fusion, kinetics of lipid dye transfer is monitored. The sensitivity of TIRF microscopy allows tracking single fluorescent lipid labels, from which lipid diffusivity and SUV size can be deduced for every fusion event. Lipid dye release times can be much longer than expected for unimpeded passage through permanently open pores. Using a model that assumes retardation of lipid release is due to pore flickering, a pore &#34;openness&#34;, the fraction of time the pore remains open during fusion, can be estimated. A soluble marker can be encapsulated in the SUVs for simultaneous monitoring of lipid and soluble cargo release. Such measurements indicate some pores may reseal after losing a fraction of the soluble cargo.

Here, we present a protocol to detect single, SNARE-mediated fusion events between liposomes and supported bilayers in microfluidic channels using polarized TIRFM, with single molecule sensitivity and ~15 msec time resolution. Lipid and soluble cargo release can be detected simultaneously. Liposome size, lipid diffusivity, and fusion pore properties are measured.

Polarize TIRF Mikroskopi tarafından İzlenen mikroakışkan Akış Hücredeki Gergin Desteklenen Bilayers Tek Proteoliposomes ve tuzak aracılı Fusion

In the ubiquitous process of membrane fusion the opening of a fusion pore establishes the first connection between two formerly separate compartments. ...

Nörobilim

Assembly of Cell Mimicking Supported and Suspended Lipid Bilayer Models for the Study of Molecular Interactions

Model cell membranes are a useful screening tool with applications ranging from early drug discovery to toxicity studies. The cell membrane is a crucial protective barrier for all cell types, separating the internal cellular components from the extracellular environment. These membranes are composed largely of a lipid bilayer, which contains outer hydrophilic head groups and inner hydrophobic tail groups, along with various proteins and cholesterol. The composition and structure of the lipids themselves play a crucial role in regulating biological function, including interactions between cells and the cellular microenvironment, which may contain pharmaceuticals, biological toxins, and environmental toxicants. In this study, methods to formulate uni-lipid and multi-lipid supported and suspended cell mimicking lipid bilayers are described. Previously, uni-lipid phosphatidylcholine (PC) lipid bilayers as well as multi-lipid placental trophoblast-inspired lipid bilayers were developed for use in understanding molecular interactions. Here, methods for achieving both types of bilayer models will be presented. For cell mimicking multi-lipid bilayers, the desired lipid composition is first determined via lipid extraction from primary cells or cell lines followed by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS). Using this composition, lipid vesicles are fabricated using a thin-film hydration and extrusion method and their hydrodynamic diameter and zeta potential are characterized. Supported and suspended lipid bilayers can then be formed using quartz crystal microbalance with dissipation monitoring (QCM-D) and on a porous membrane for use in a parallel artificial membrane permeability assay (PAMPA), respectively. The representative results highlight the reproducibility and versatility of in vitro cell membrane lipid bilayer models. The methods presented can aid in rapid, facile assessment of the interaction mechanisms, such as permeation, adsorption, and embedment, of various molecules and macromolecules with a cell membrane, helping in the screening of drug candidates and prediction of potential cellular toxicity.

This protocol describes the formation of cell mimicking uni-lipid and multi-lipid vesicles, supported lipid bilayers, and suspended lipid bilayers. These in vitro models can be adapted to incorporate a variety of lipid types and can be used to investigate various molecule and macromolecule interactions.

Moleküler Etkileşimlerin Çalışması için Desteklenen ve Askıya Alınan Lipid Bilayer Modellerinin Hücre Taklit Montajı

Model cell membranes are a useful screening tool with applications ranging from early drug discovery to toxicity studies. The cell membrane is a crucial ...

İskele Lipozomlar kullanarak Lipid-proksimal protein-protein etkileşimleri Sulandırın için

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Deterjan-Alerjik membran proteinlerinin Ultrafast sulandırma tamamlayıcı-Proteoliposomes ücret Fusogenic kullanarak Lipid Bilayers içine.

Rekombinant Drosophila , lipid karıştırıcılar Için lipozomlar halinde deterjan destekli yeniden yapılanma

Mitokondriyal Membran Dinamiğinin Yeniden İkasini için Model Membran Platformu

Membran Proteinlerini Hedefleyen Fonksiyonel Analiz ve Antikor Gelişimi için Proteolipozomların Hücresiz Üretimi

Biyofiziksel Özellikleri ve İşlevleri İncelemek için Membranlarda Septin Düzeneğinin Yeniden Sulandırılması

Nano ve Mikrometre Boyutlu Veziküllerde Denge Dışı Metabolik Ağların İnşası

Nano ve Mikrometre Boyutlu Veziküllerde Denge Dışı Metabolik Ağların İnşası

Nano ve Mikrometre Boyutlu Veziküllerde Denge Dışı Metabolik Ağların İnşası

Polarize TIRF Mikroskopi tarafından İzlenen mikroakışkan Akış Hücredeki Gergin Desteklenen Bilayers Tek Proteoliposomes ve tuzak aracılı Fusion

Moleküler Etkileşimlerin Çalışması için Desteklenen ve Askıya Alınan Lipid Bilayer Modellerinin Hücre Taklit Montajı