Bu araştırma, AMED'den JP20am0101077 Hibe Numarası altında İlaç Keşfi ve Yaşam Bilimleri Araştırmalarını Destekleme Platform Projesi (Yenilikçi İlaç Keşfi ve Yaşam Bilimleri Araştırmalarını Destekleme Temeli (BINDS)) tarafından desteklenmiştir. Bu çalışma kısmen JSPS KAKENHI Hibe Numarası 20K05709 tarafından da desteklenmiştir.

1. pEU ekspresyon plazmidinin hazırlanması
NOT: pEU ekspresyon plazmidi başlangıç kodonunu, hedef membran proteininin açık okuma çerçevesini ve fragmandaki durdurma kodonunu içermelidir (bkz. Şekil 1). Gerektiğinde algılama/saflaştırma etiketi dizilerini uygun konuma ekleyin. Subklonlama için ya restriksiyon enzim sindirimi ya da dikişsiz klonlama uygulanabilir. Burada kesintisiz klonlama yöntemi kullanan bir protokolü açıklıyoruz.
<ol><li>DNA parçasını ekleyin.<ol><li>cDNA şablonunu, primer 1 ve primer 2'yi kullanarak PCR ile ilgilenilen geni güçlendirin. Astar 1 ve primer 2, dikişsiz klonlama için sırasıyla 15 bp örtüşme içerir ( bkz. NOT: Hücrelerdeki olgun proteinden işlenecek ve çıkarılacak dizileri (örneğin, sinyal dizisi) dahil etmeyin. Sentezlenmiş proteinin işlenmesi buğday hücresiz sistemde yapılmaz. Kozak dizisi eklemeyin. pEU-E01-MCS vektörü E01 çeviri geliştiricisine sahiptir.</li>
		<li>Şablon plazmid DNA'sını çıkarmak için PCR ürününe 1/25 hacim DpnI kısıtlama enzimi ekleyin. 37 °C'de 30 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>PCR ürününü saflaştırmak ve konsantrasyonu 20-50 ng / μL'de ayarlamak için bir PCR saflaştırma kiti kullanın.</li>
	</ol></li>
	<li>pEU-E01-MCS vektörünü doğrusallaştırın.<ol><li>pEU-E01-MCS, primer 3 ve primer 4 kullanarak ters PCR uygulayın.</li>
		<li>Ters PCR ürününe 1/25 hacim DpnI restriksiyon enzimi ekleyin. 37 °C'de 30 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>PCR ürününü üreticinin tavsiyesine göre saflaştırmak için bir PCR saflaştırma kiti kullanın. Konsantrasyonu 20–50 ng/μL'de ayarlayın.</li>
	</ol></li>
	<li>2 μL ekleme DNA fragmanı, 2 μL doğrusallaştırılmış vektör ve 4 μL 2x dikişsiz klonlama enzim karışımı karıştırın.</li>
	<li>Escherichia coli suşu JM109'u dikişsiz klonlama ürünü ile dönüştürün. Bir yayıcı kullanarak, bakteriyel süspansiyonu bir LB-ampisilin agar plakasına yayın. NOT: pEU vektörünün ampisilin direnç işaretleyicisi vardır.</li>
	<li>pEU plazmidinde MCS'nin 5' ve 3' tarafından sırasıyla primer 5 ve primer 6 kullanılarak oluşturulan ekspresyon plazmidinin sırasını onaylayın.</li>
	<li>Plazmidler ekspresyonunu güçlendirin ve saflaştırın.<ol><li>Plazmid-dönüştürülmüş E. coli suşu JM109'u 37 ° C'de 150 mL LB-ampisilin ortamında ve gece boyunca sallanan dakikada 125 vuruşta kültürleyin.</li>
		<li>Ticari olarak temin edilebilen plazmid hazırlık midi kitini kullanarak plazmidleri çıkarın ve saflaştırın. Plazmidleri 500 μL TE tamponunda çözün. DİKKAT: Plazmid ekstraksiyonu için mini hazırlık kiti kullanmayın. Plazmidin yeterli nitelik ve miktarını sağlamaz.</li>
		<li>500 μL fenol/kloroform/izoamil alkol ekleyin (25:24:1). 5 dakika boyunca kuvvetlice karıştırın ve 17.800 x g ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca santrifüj yapın. Üst plazmid çözeltisini yeni bir tüpe aktarın. DİKKAT: Cildi fenol ve kloroformdan korumak için tek kullanımlık eldiven giyin. NOT: RNaz'ın plazmid ekstraksiyon kitinden kontaminasyonunu gidermek için, fenol-kloroform saflaştırma kullanarak plazmidleri saflaştırın.</li>
		<li>Fenolün tamamen çıkarılması için 500 μL kloroform ekleyin. 5 dakika boyunca kuvvetlice karıştırın ve 17.800 x g ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca santrifüj yapın. Üst plazmid çözeltisini yeni bir tüpe aktarın.</li>
		<li>2,5 hacim etanol ve 1/8 hacim 7,5 M amonyum asetat ekleyin ve 1 saat boyunca -30 °C'de saklayın.</li>
		<li>10 dakika boyunca 4 °C'de 17.800 x g'de santrifüj. Peleti 500 μL% 70 etanol ile yıkayın. Süpernatantı dikkatlice çıkarın ve kuruması için peleti 5 dakika bekletin.</li>
		<li>İfade plazmidlerini 100 μL ultra saf suda tamamen çözün. Plazmidlerin konsantrasyonunu 260 nm'de absorbans ile ölçün. Konsantrasyonu 1 mg / mL'ye ayarlayın.</li>
	</ol></li>
</ol>2. In vitro transkripsiyon
DİKKAT: Transkripsiyon ve çeviri adımlarında DNaz ve nükleaz içermeyen plastik tüpler ve uçlar kullanın. Kontaminasyonu önlemek için plastik eşyaların otoklavlanmasından kaçının.
<ol><li>Yeni bir plastik tüpte ultra saf su toplayın. DİKKAT: DEPC ile arıtılmış su kullanmayın, çünkü artık DEPC reaksiyonu güçlü bir şekilde engeller. Transkripsiyon ve çeviri için taze saflaştırılmış ultra saf su kullanın.</li>
	<li>115.2 μL ultra saf su, 40 μL Transkripsiyon Tamponu LM, 20 μL NTP karışımı, 2.4 μL 80 U/μL RNaz inhibitörü, 2.4 μL 80 U/μL SP6 polimeraz ve 20 μL 1 mg/mL pEU ekspresyon plazmidleri karıştırarak transkripsiyon reaksiyonu karışımını hazırlayın. Reaktifleri ters çevirerek yavaşça karıştırın. Hızlı bir dönüş yapın.</li>
	<li>Transkripsiyon reaksiyonunu 6 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.</li>
	<li>Ters çevirerek reaksiyonu nazikçe karıştırın ve hızla aşağı doğru döndürün. Çeviri için hemen kullanın, aksi takdirde dondurun ve -80 ° C'de saklayın.</li>
	<li>Transkripsiyon ürününü elektroforez ile onaylayın.<ol><li>100 mL 1x TAE tamponu ve 1 g agarozu karıştırın. % 1 agaroz TAE jeli hazırlamak için süspansiyonu mikrodalga fırında ısıtın.</li>
		<li>1 μL transkripsiyon reaksiyonu alın ve 3 μL su ve 4 μL 2x yükleme boyası ile karıştırın. NOT: RNA'nın denatüre edilmesi gerekli değildir.</li>
		<li>Agaroz TAE jeline 4 μL karışım ve 2 μL DNA merdiven belirteci yükleyin.</li>
		<li>20 dakika boyunca 100 V'ta elektrofor.</li>
		<li>Jeli ethidium bromür içinde 30 dakika bekletin. UV transilluminatör ve jel görüntüleyici kullanarak mRNA'nın merdiven bandı modelini kontrol edin. NOT: 500 bp'den daha az bulaşmış bir bant gözlendiğinde, mRNA bozunmasından şüphelenilir.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Çeviri için materyallerin hazırlanması
<ol><li>Çeviri arabelleğini hazırlayın.<ol><li>50 mL'lik bir tüpte sırasıyla 27 mL taze hazırlanmış ultra saf su ve S1, S2, S3 ve S4 için her 40x stok çözeltisinin 0,75 mL'sini karıştırın. NOT: Malzeme miktarlarını, gerekli olan son 1x çeviri tamponu miktarına göre ayarlayın. DİKKAT: Fazla 1x çeviri arabelleğini kullandıktan sonra saklamayın veya yeniden dondurmayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Kreatin kinaz stok çözeltisi hazırlayın. Liyofilize kreatin kinaz, ultra saf suda 20 mg / mL'lik son bir konsantrasyona kadar çözülür. Çözeltiyi 0,2 mL 8 şeritli PCR tüplerinde küçük miktarlarda (her biri 10 ila 50 μL) dağıtın. Tüpleri sıvı azotta dondurun ve -80 ° C'de saklayın. DİKKAT: Çözüldükten sonra kreatin kinaz solüsyonunu tekrar dondurmayın.</li>
	<li>Gliserolü diyaliz zarından çıkarmak için diyaliz kaplarını (0.1 mL boyutunda) yıkayın. NOT: Birkaç farklı boyutta diyaliz kabı vardır. Küçük ölçekli bardaklar (0.1 mL) sırasıyla küçük ölçekli test için (bölüm 5.4) ve büyük ölçekli üretim için büyük boyutlu bardaklar (2 mL) (bölüm 5.5) kullanılır. Büyük boy bardakların diyaliz zarının yıkanma adımı önlenebilir.<ol><li>Yeni bir 1,5 mL tüpe 1 mL ultra saf su koyun. Tüpe küçük boyutlu diyaliz kabı (0,1 mL) yerleştirin. Bardağa 0,5 mL ultra saf su ekleyin.</li>
		<li>Oda sıcaklığında 30 dakikadan fazla inkübe edin.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Lipozomların hazırlanması
NOT: Burada lipozomların hazırlanması için iki protokol açıklanmaktadır. Biri kullanıma hazır liyofilize lipozomlar (bölüm 4.1) kullanırken, diğeri ince bir lipit filmi nemlendirerek lipozomlar üretir (bölüm 4.2).
<ol><li>Liyofilize lipozomlar kullanarak lipozomlar hazırlayın. NOT: Proteolipozom üretmenin daha kolay bir yolu, ticari olarak temin edilebilen Asolectin lipozomu kullanmaktır. Aderektin, soya fasulyesinden elde edilen bir tür doğal lipittir.<ol><li>10 mg liyofilize Asolectin lipozomları içeren şişeyi açın ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve şişenin altına 200 μL çeviri tamponu (bölüm 3.1) ekleyin. Şişeyi kapatın ve 10 dakika boyunca kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>Şişeyi vorteks karıştırıcısına 1 dakika boyunca koyarak kuvvetlice karıştırın.</li>
		<li>Şişeyi 50 mL'lik bir tüpe yerleştirin. 1 dakika boyunca 500 x g'de santrifüj yaparak tüpü aşağı doğru döndürün.</li>
		<li>Bir pipet kullanarak, Asolectin lipozom süspansiyonunu (50 mg lipit / mL) yeni bir 1.5 mL tüpe aktarın. Çeviri için hemen lipozom kullanın, aksi takdirde sıvı azotta dondurun ve -80 ° C'de saklayın.</li>
	</ol></li>
	<li>İnce bir lipit filmi nemlendirerek lipozomlar hazırlayın.<ol><li>Bir lipit toz halinde satılırsa, kloroform veya uygun organik çözücü içinde 10-100 mg / mL konsantrasyonuna kadar çözün. NOT: İnce bir lipit filmi, saflaştırılmış ve/veya sentezlenmiş amfifilik lipitler kullanılarak hazırlanabilir. Asolectin'in saflaştırma yöntemi daha önce tarif edilmiştir38. Biyotinile lipidler, floresan lipitler ve adjuvan lipitler gibi fonksiyonel olarak modifiye lipidler, fonksiyonel lipozomlar üretmek için bazal lipitlere eklenebilir.</li>
		<li>50 mg lipit (ler) içeren lipit çözeltisini bir buharlaşma şişesine aktarın.</li>
		<li>Döner bir evaporatör kullanarak, çözücüyü buharlaştırın ve ince bir lipit filmi oluşturmak için lipidi şişe tabanının duvarına eşit şekilde yayın.</li>
		<li>Şişeyi vakumlu bir kurutucuya koyun ve çözücüyü tamamen çıkarmak için gece boyunca negatif basınç altında bırakın.</li>
		<li>Evaporasyon şişesine 1 mL translasyon tamponu ekleyin. Tamponu ince lipit filmi üzerine yaymak için şişeyi döndürün. Filmi nemlendirmek için 5 dakika boyunca inkübe edin.</li>
		<li>Şişeyi ultrasonik homojenleştirici veya ultrasonik temizleyici ile sonikleştirin. Solüsyonun filme iyice dokunmasına izin vermek için şişenin açısını ara sıra değiştirin. İnce lipit filmin alttan soyulduğundan ve tamamen ve homojen bir şekilde emülsifiye edildiğinden emin olun. NOT: Lipozomlar içeren biyotinile lipidlerin elektron mikrografisi Şekil 1'de gösterilmiştir.</li>
		<li>Lipozom süspansiyonunu (50 mg lipitler / mL) yeni bir 1.5 mL tüpe aktarın. Hemen kullanılmayacaksa, lipozomları sıvı azotta dondurun ve -80 ° C'de saklayın.</li>
	</ol></li>
</ol>5. In vitro çeviri
<ol><li>Tüpleri oda sıcaklığında birkaç dakika boyunca su üzerinde yüzdürerek buğday tohumu ekstraktını hızlı bir şekilde çözün. Çözdükten sonra, tüpleri ters çevirerek hemen hafifçe karıştırın, aşağı doğru çevirin ve kullanana kadar buz üzerinde soğutun. NOT: Buğday tohumu ekstraktını kullandıktan sonra sıvı azotta dondurun ve -80 °C'de saklayın. Birkaç donma/çözülme döngüsüne dayanır.</li>
	<li>20 mg/mL kreatin kinaz stok çözeltisini çözün. 2 mg / mL kreatin kinaz çalışma çözeltisi hazırlamak için 5 μL stok çözeltisi ve 45 μL translasyon tamponunu karıştırın. DİKKAT: Kreatin kinazın yeniden dondurulması önerilmez.</li>
	<li>Gerektiğinde lipozomları veya mRNA'ları çözün.</li>
	<li>Küçük ölçekli bir protein translasyonu yapın.<ol><li>Adım 3.3.2'de hazırlandığı gibi hem tüpten hem de diyaliz kabından (0,1 mL) suyu çıkarın.</li>
		<li>Tüp ve diyaliz kabına sırasıyla 1 mL ve 300 μL translasyon tamponu enjekte edin. DİKKAT: Diyaliz kabının tabanının 1,5 mL tüpteki translasyon tamponunun yüzeyine ulaşmaması durumunda, tüpe ilave 50-100 μL tampon enjekte edin.</li>
		<li>15.6 μL translasyon tamponu, 2.4 μL 2 mg/mL kreatin kinaz, 12 μL 50 mg/mL lipozom, 15 μL buğday tohumu ekstresi ve 15 μL mRNA karıştırarak translasyon reaksiyonu karışımı hazırlayın. Tüpleri ters çevirerek yavaşça karıştırın ve aşağı doğru çevirin.</li>
		<li>200 μL'lik bir pipet kullanarak translasyon reaksiyonu karışımının 60 μL'sini aspire edin.</li>
		<li>Pipet ucunu diyaliz kabındaki translasyon tamponunun alt yüzeyine yerleştirin. Reaksiyon karışımını yavaşça ve nazikçe pipetle çıkarın. Buharlaşmayı önlemek için diyaliz kabını bir kapakla örtün. NOT: Reaksiyon karışımı doğal olarak kabın dibine batar ve bir çift katman oluşturur. Bardağı karıştırarak veya sallayarak çift katmanı rahatsız etmeyin.</li>
	</ol></li>
	<li>Büyük ölçekli bir çeviri yapın (Şekil 1).<ol><li>22 mL çeviri tamponunu 25 mL'lik bir tüpe dökün. Tüpe büyük boyutlu bir diyaliz kabı (2 mL) yerleştirin ve bardağa 2 mL çeviri tamponu ekleyin.</li>
		<li>130 μL translasyon tamponu, 20 μL 2 mg/mL kreatin kinaz, 100 μL 50 mg/mL lipozom, 125 μL buğday tohumu ekstresi ve 125 μL mRNA karıştırarak bir translasyon reaksiyonu karışımı hazırlayın. Pipetleme yaparak nazikçe karıştırın.</li>
		<li>1.000 μL'lik bir pipet kullanarak tüm translasyon reaksiyonu karışımını (500 μL) aspire edin. Translasyon reaksiyonu karışımını diyaliz kabına adım 5.4.5'te açıklandığı şekilde enjekte edin. Buharlaşmayı önlemek için diyaliz kabını kapakla örtün.</li>
	</ol></li>
	<li>Reaksiyonları 24 saat boyunca 15 ° C'de inkübe edin.</li>
	<li>Reaksiyonu diyaliz kabında pipetle iyice karıştırın. Ham proteolipozom süspansiyonunu yeni bir tüpe aktarın. NOT: Proteolipozomu küçük ölçekli çeviriden toplamak için düz tabanlı 1.5 mL'lik bir tüp önerilir. Santrifüjlemeden sonra, lipozomlar tüpün alt köşesinde kompakt ve kolayca görülebilen pelet oluşturur.</li>
</ol>6. Proteolipozomların saflaştırılması
<ol><li>Ham proteolipozom süspansiyonu içeren tüpü 4 ° C'de 17.800 x g'de 10 dakika boyunca santrifüj edin.</li>
	<li>Süper natantı çıkarın. Proteolipozom peletini pipetle pipetleme ile PBS'de (küçük ölçekli: 1 mL, büyük ölçekli: 10 mL) askıya alın.</li>
	<li>Proteolipozomların santrifüjlenmesini ve yıkanmasını iki daire daha tekrarlayın.</li>
	<li>Yıkadıktan sonra, az miktarda PBS ekleyin ve pipetleme ile proteolipozom peletini iyice askıya alın. Mikro pipet kullanarak süspansiyonun hacmini ölçün. Ses seviyesini 60 μL (küçük ölçekli) veya 500 μL (büyük ölçekli) olarak ayarlamak için PBS ekleyin. Süspansiyonu yeni bir 1,5 mL tüpe aktarın.</li>
	<li>10 μL proteolipozom süspansiyonunu SDS-PAGE için yeni bir PCR tüpüne aktarın. Numunelerin geri kalanını gerektiğinde kullanmak üzere daha küçük porsiyonlara bölün. Sıvı azotta dondurun ve -80 °C'de saklayın.</li>
</ol>7. SDS-PAGE ve CBB boyama
<ol><li>10 μL proteolipozom süspansiyonuna 70 μL su ve 40 μL 3x SDS-PAGE numune tamponu ekleyin. DİKKAT: SDS-PAGE numunesini kaynatmayın, çünkü membran proteinleri toplanır ve elektroforezde akrilamid jele neredeyse hiç nüfuz etmez. Ayrıca, oksidasyonu önlemek için SDS-PAGE numune tamponuna yeterli indirgeyici madde ekleyin (örneğin,% 3 nihai konsantrasyonda 2-merkaptoetanol).</li>
	<li>Bir elektroforez odasına% 5-20 gradyan SDS-PAGE jeli ayarlayın. 3 μL, 6 μL, 12 μL proteolipozom numunesi, 2 μL protein boyutu belirteci ve BSA standart serisini de yükleyin.</li>
	<li>52 mA'da elektrofor, 30 dakika boyunca 400 V.</li>
	<li>Jeli 1 saat boyunca CBB boyası ile lekeleyin. Sıcak suda rengi çözün ve jel görüntüsünü tarayın.</li>
	<li>NIH Image J yazılımını (https://imagej.nih.gov/ij/) kullanarak, her şeritteki membran proteininin bant yoğunluğunu ölçün. BSA standart serisi ile sentezlenmiş membran proteinlerinin miktarını tahmin edin.</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Sunulan protokol, membran proteinlerini yüksek başarı oranında üretmek için bir yöntem sağlar. Bu protokol basittir, yüksek oranda yeniden üretilebilir ve ölçeği artırılabilir. Ayrıca, büyük miktarda membran proteini tüketen deneylerin süresini ve maliyetini azaltma potansiyeline sahiptir. Çift katmanlı diyaliz yöntemi, iki katmanlı yönteme veya diyaliz yöntemine kıyasla üretkenliği 4-10 kat artırır (Şekil 2B)45. Aşırı bir durumda, b...

Membran proteinleri tanı ve terapötiklerde en önemli ilaç hedeflerinden biridir. Gerçekten de, küçük bileşik ilaçların yarısı, G-proteinine bağlı reseptörler (GPCR'ler) ve iyon kanalları1 gibi membran proteinleridir. Yıllar geçtikçe, araştırmacılar membran proteinlerinin yapılarını ve işlevlerini aydınlatmak için biyokimyasal, biyofiziksel ve yapısal çalışmalar üzerinde çalışıyorlar 2,3. Membran proteinlerine karşı monoklonal antikorların geliştirilmesi, fonksiyonel ve yapısal çalışmaların hızlandırılması, tedavi ve tanısal uygulamaların geliştirilmesi amacıyla da aktif olarak yapılmaktadır 4,5,6,7,8,9. Tüm bu çalışmalar çok miktarda yüksek kaliteli membran proteini gerektirir10. Örneğin, antikor gelişimi için doğal konformasyona sahip birkaç miligram saflaştırılmış membran proteinine ihtiyaç vardır. X-ışını kristalografisi için çok daha fazla miktarda yüksek saflaştırılmış membran proteini gereklidir. Bununla birlikte, membran proteinlerinin seri üretimi, membran proteini araştırmasında bir darboğaz olmaya devam etmektedir11. Membran proteinleri bir veya daha fazla transmembran helis ile karmaşık yapılara sahiptir ve hücre homeostazında önemli roller oynarlar. Membran proteinlerinin heterolog aşırı ekspresyonu, yüksek lokal konsantrasyonlarda biriken membran proteinlerinin toplanması veya hücresel sinyal yollarının bozulması gibi çoklu engellere yol açar. İfade başarılı olsa bile, numune hazırlamanın sonraki adımları da zorlukla karşı karşıyadır. Örneğin, proteolipozomun hazırlanması, membran proteinlerinin çözündürülmesi, saflaştırılması ve stabilizasyonunda üst düzey beceriler ve mesleki deneyimler gerektirir ve ayrıca çok fazla çaba ve zamana mal olur12,13.
Öte yandan, son yıllarda canlı hücreler kullanılmadan protein üretmek için bazı ileri teknolojiler ortaya çıkmıştır 14,15,16,17,18. Hücresiz protein sentez teknolojisi, bir test tüpünde translasyon reaksiyonunu yeniden oluşturur. Hücresel ekspresyon sisteminin sahip olduğu herhangi bir sınırlama olmadığından, hücresiz sistemler, hücrelerde toksisiteyi ifade etmesi veya göstermesi zor olan çeşitli proteinleri sentezleme potansiyeline sahiptir. Saflaştırılmış hücre ekstresi veya yeniden yapılandırılmış translasyonel makine, şablon mRNA'lar, amino asitler ve enerji kaynakları ile karıştırılır ve rekombinant proteinler kısa sürede sentezlenir. Membran protein sentezi ile ilgili olarak, lipozomlar, biseller, nanodiskler veya kopolimerler gibi lipitlerden veya amfifillerden oluşan bazı iskeleler hücresiz reaksiyonaeklenir 19,20,21,22,23,24. Sentezlenmiş membran proteinleri iskelelerle etkileşime girer ve suda stabilize edilebilir. Hücresiz sentezlenmiş membran proteinleri fonksiyonel çalışmalarda ve antikor üretiminde yaygın olarak kullanılmaktadır 25,26,27,28,29,30,31.
Bu protokolde, buğday hücresiz sistem ve lipozomlar kullanılarak etkili bir hücresiz proteolipozom üretim yöntemi tarif ediyoruz. Buğday hücresi içermeyen protein sentez sistemi, buğday tohumu15,32,33'ten ekstrakt kullanan güçlü bir in vitro çeviri sistemidir. Buğday tohumu çok miktarda translasyonel makine ve az sayıda çeviri inhibitörü içerir. Ökaryotların bir üyesi olan buğdaydaki translasyonel makine, ökaryotik proteinleri çevirmek için uygundur ve çeviri verimliliği, mRNA şablonunun kodon kullanımından pek etkilenmez. Buğday hücresiz sistemi kullanarak, protein kinazları 34,35, ubikitin ligazlar 36, transkripsiyon faktörleri37 ve membran proteinleri dahil olmak üzere yüksek başarı oranlarına sahip çeşitli proteinleri sentezledik. Membran protein üretimi için translasyon karışımına lipid vezikül lipozomu iskele19,38 olarak ekliyoruz. Membran proteininin hidrofobik alanları lipid çift katmanlı ile etkileşime girer ve kendiliğinden lipozom ile bütünleşir. Yoğunluk gradyanı santrifüjlemesi, proteolipozomun endojen buğday proteinlerinden kesinlikle ayrılması için kullanılır, ancak translasyon reaksiyonu karışımının ortak bir santrifüjlenmesi, proteolipozom20'nin basit bir saflaştırılması için yeterlidir. Birçok çeşit integral membran proteini buğday hücresiz sistem kullanılarak sentezlenmiş veçeşitli araştırma ve geliştirmeler için uygulanmıştır 25,38,39,40,41,42,43,44. Ayrıca, büyük ölçekli üretim45,46 için "çift katmanlı diyaliz yöntemini" geliştirdik. Bu yöntemde fincan tipi diyaliz cihazı substrat besleme tamponuna daldırılır ve fincan içerisinde Şekil 1'de gösterildiği gibi iki kat translasyon reaksiyonu karışımı ve substrat besleme tamponu oluşturulur. Substratların sürekli temini ve yan ürünün uzaklaştırılması, reaksiyon karışımının hem üstünde hem de altında uzun süre verimli bir şekilde gerçekleştirilebilir, bu da mükemmel çeviri etkinliğine yol açar (Şekil 2A ve Şekil 2B)45.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#215;3 SDS-PAGE sample buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Containing 10% 2-mercaptoethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-20% gradient SDS-PAGE gel</td>
			<td>ATTO</td>
			<td>E-D520L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Diluted ethanol by ultrapure water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium acetate</td>
			<td>Nakalai tesque</td>
			<td>02406-95</td>
			<td>As this reagent is deliquescent, dissolve all of it in water once opened and store it at -30&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin Sodium</td>
			<td>Nakalai tesque</td>
			<td>02739-74</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Asolectin Liposome, lyophilized</td>
			<td>CellFree Sciences</td>
			<td>CFS-PLE-ASL</td>
			<td>A vial contains 10 mg of lyophilized liposomes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA standard</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1000 ng, 500 ng, 250 ng, 125 ng BSA / 10 &#181;L &#215;1 SDS-PAGE sample buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CBB gel stain</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cDNA clone of interest</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Plasmid harboring cDNA clone or synthetic DNA fragment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Nakalai tesque</td>
			<td>08402-84</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cooled incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Temperature ranging from 0 to 40 &#176;C or wider.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine kinase</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>04524977190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis cup (0.1 mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>69570</td>
			<td>Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device, 10K MWCO, 0.1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis cup (2 mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>88404</td>
			<td>Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device, 10K MWCO, 2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA ladder marker</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SM0311</td>
			<td>GeneRuler 1 kb DNA Ladder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DpnI</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FD1703</td>
			<td>FastDigest DpnI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli strain JM109</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis chamber</td>
			<td>ATTO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (99.5%)</td>
			<td>Nakalai tesque</td>
			<td>14713-95</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Evaporation flask, 100 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel imager</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel scanner</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>We use document scanner and LED immuninator as a substitute.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipids of interest</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro centrifuge</td>
			<td>TOMY</td>
			<td>MX-307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTP mix</td>
			<td>CellFree Sciences</td>
			<td>CFS-TSC-NTP</td>
			<td>Mixture of ATP, GTP, CTP, UTP, at 25 mM each</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free 25 mL tube</td>
			<td>IWAKI</td>
			<td>362-025-MYP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucrease-free plastic tubes</td>
			<td>Watson bio labs</td>
			<td></td>
			<td>Do not autoclave. Use them separately from other experiments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucrease-free tips</td>
			<td>Watson bio labs</td>
			<td></td>
			<td>Do not autoclave. Use them separately from other experiments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR purification kit</td>
			<td>MACHEREY-NAGEL</td>
			<td>740609</td>
			<td>NucleoSpin Gel and PCR Clean-up</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEU-E01-MCS vector</td>
			<td>CellFree Sciences</td>
			<td>CFS-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1)</td>
			<td>Nippon Gene</td>
			<td>311-90151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid prep Midi kit</td>
			<td>MACHEREY-NAGEL</td>
			<td>740410</td>
			<td>NucleoBond Xtra Midi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom oligo synthesis</td>
			<td>5&#8217;-CCAAGATATCACTAGnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn-3&#8217; 
			Gene specific primer, forward. Upper case shows overlap sequence to be added for seamless cloning. Lower case nnnn&#8230;. (20-30 bp) shows gene specific sequence.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom oligo synthesis</td>
			<td>5&#39;-CCATGGGACGTCGACnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn-3&#8217; 
			Gene specific primer, reverse. Upper case shows overlap sequence to be added for seamless cloning. Lower case nnnn&#8230;. (20-30 bp) shows gene specific sequence.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 3</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom oligo synthesis</td>
			<td>5&#39;-GTCGACGTCCCATGGTTTTGTATAGAAT-3&#39; 
			Forward primer for vector linearization. Underline works as overlap in seamless cloning.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom oligo synthesis</td>
			<td>5&#39;-CTAGTGATATCTTGGTGATGTAGATAGGTG-3&#39; 
			Reverse primer for vector linearization. Underline works as overlap in seamless cloning.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 5</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom oligo synthesis</td>
			<td>5&#8217;-CAGTAAGCCAGATGCTACAC-3&#8217; 
			Sequencing primer, forward</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 6</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom oligo synthesis</td>
			<td>5&#8217;- CCTGCGCTGGGAAGATAAAC-3&#8217; 
			Sequencing primer, reverse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein size marker</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610394</td>
			<td>Precision Plus Protein Standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary evaporator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>seamless cloning enzyme mixture</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>E2611L</td>
			<td>Gibson Assembly Master Mix 
			Other seamless cloning reagents are also avairable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP6 RNA Polymerase &#38; RNase Inhibitor</td>
			<td>CellFree Sciences</td>
			<td>CFS-TSC-ENZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Submarine Electrophoresis system</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transcription Buffer LM</td>
			<td>CellFree Sciences</td>
			<td>CFS-TSC-5TB-LM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Translation buffer</td>
			<td>CellFree Sciences</td>
			<td>CFS-SUB-SGC</td>
			<td>SUB-AMIX SGC (&#215;40) stock solution (S1, S2, S3, S4). 
			Prepare &#215;1 translation buffer before use by mixing stock S1, S2, S3, S4 stock and ultrapure water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>We recommend to prepare ultrapure water by using ultrapure water production system every time you do experiment. Do not autoclave. 
			We preparaed ultrapure water by using Milli-Q Reference and Elix10 system. 
			Commercially available nuclease-free water (not DEPC-treated water) can be used as a substitute. Take care of contamination after open the bottle.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic homogenizer</td>
			<td>Branson</td>
			<td>SONIFIER model 450D-Advanced</td>
			<td>Ultrasonic cleaner can be used as a substitute.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV transilluminator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum desiccator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheat germ extract</td>
			<td>CellFree Sciences</td>
			<td>CFS-WGE-7240</td>
			<td>WEPRO7240</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell-free production of proteoliposomes for functional analysis and antibody development targeting membrane proteins

Membran proteinleri çeşitli hücresel süreçlerde önemli roller oynar ve hayati işlevleri yerine getirir. Membran proteinleri, ilaç keşfinde tıbbi olarak önemlidir, çünkü tüm ilaçların yarısından fazlasının hedefidirler. Membran proteinlerinin biyokimyasal, biyofiziksel ve yapısal çalışmalarının yanı sıra antikor gelişiminin önündeki bir engel, doğru konformasyon ve aktiviteye sahip büyük miktarlarda yüksek kaliteli membran proteini üretmenin zorluğu olmuştur. Burada, membran proteinlerini verimli bir şekilde sentezlemek ve saflaştırılmış proteolipozomları kısa sürede yüksek bir başarı oranıyla hazırlamak için buğday tohumu hücresiz bir sistem, lipozomlar ve diyaliz kapları kullanan bir "çift katmanlı diyaliz yöntemi" ni tanımlamaktayız. Membran proteinleri, GPCR'ler, iyon kanalları, taşıyıcılar ve tetraspaninler gibi birkaç miligramda olduğu kadar üretilebilir. Bu hücresiz yöntem, yüksek kaliteli proteolipozomların hazırlanması için zamanın, maliyetin ve çabanın azaltılmasına katkıda bulunur ve membran proteinlerinin fonksiyonel analizi, ilaç hedeflerinin taranması ve antikor gelişimi için uygun araçlar sağlar.

Bu protokol kullanılarak kısa sürede kısmen saflaştırılmış proteolipozomlar elde edilebilir. Temsili sonuçlar Şekil 2A'da gösterilmiştir. Sınıf A, B ve C'nin yirmi beş GPCR'si, çift katmanlı diyaliz yöntemi (küçük ölçekli) kullanılarak başarıyla sentezlendi ve santrifüjleme ve tampon yıkama ile kısmen saflaştırıldı. Sentezlenen proteinlerin miktarı protein türüne göre değişmekle birlikte, büyük diyaliz kapları kullanıldığında reaksiyon başına ...

Watch this Scientific Journal Video about Cell-Free Production of Proteoliposomes for Functional Analysis and Antibody Development Targeting Membrane Proteins at JoVE.com

Cell-Free Production of Proteoliposomes for Functional Analysis and Antibody Development Targeting Membrane Proteins

Bu protokol, buğday hücresiz sistem ve lipozomlar kullanılarak çift katmanlı diyaliz yöntemiyle yüksek kaliteli proteolipozom üretimi için etkili bir hücresiz yöntemi tanımlamaktadır. Bu yöntem, membran proteinlerinin fonksiyonel analizi, ilaç hedeflerinin taranması ve antikor gelişimi için uygun araçlar sağlar.

Membran Proteinlerini Hedefleyen Fonksiyonel Analiz ve Antikor Gelişimi için Proteolipozomların Hücresiz Üretimi

Membrane proteins play essential roles in a variety of cellular processes and perform vital functions. Membrane proteins are medically important in drug ...

cell-free-production-proteoliposomes-for-functional-analysis-antibody

Research

JoVE Journal

Biochemistry

3.7K Görüntüleme.  Ehime University. Bu protokol, buğday hücresiz sistem ve lipozomlar kullanılarak çift katmanlı diyaliz yöntemiyle yüksek kaliteli proteolipozom üretimi için etkili bir hücresiz yöntemi tanımlamaktadır. Bu yöntem, membran proteinlerinin fonksiyonel analizi, ilaç hedeflerinin taranması ve antikor gelişimi için uygun araçlar sağlar.

Video: Cell-Free Production of Proteoliposomes for Functional Analysis and Antibody Development Targeting Membrane Proteins

Bacterial Inner-membrane Display for Screening a Library of Antibody Fragments

Antibodies engineered for intracellular function must not only have affinity for their target antigen, but must also be soluble and correctly folded in the cytoplasm. Commonly used methods for the display and screening of recombinant antibody libraries do not incorporate intracellular protein folding quality control, and, thus, the antigen-binding capability and cytoplasmic folding and solubility of antibodies engineered using these methods often must be engineered separately. Here, we describe a protocol to screen a recombinant library of single-chain variable fragment (scFv) antibodies for antigen-binding and proper cytoplasmic folding simultaneously. The method harnesses the intrinsic intracellular folding quality control mechanism of the Escherichia coli twin-arginine translocation (Tat) pathway to display an scFv library on the E. coli inner membrane. The Tat pathway ensures that only soluble, well-folded proteins are transported out of the cytoplasm and displayed on the inner membrane, thereby eliminating poorly folded scFvs prior to interrogation for antigen-binding. Following removal of the outer membrane, the scFvs displayed on the inner membrane are panned against a target antigen immobilized on magnetic beads to isolate scFvs that bind to the target antigen. An enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)-based secondary screen is used to identify the most promising scFvs for additional characterization. Antigen-binding and cytoplasmic solubility can be improved with subsequent rounds of mutagenesis and screening to engineer antibodies with high affinity and high cytoplasmic solubility for intracellular applications.

We provide a method to simultaneously screen a library of antibody fragments for binding affinity and cytoplasmic solubility by using the Escherichia coli twin-arginine translocation pathway, which has an inherent quality control mechanism for intracellular protein folding, to display the antibody fragments on the inner membrane.

Antikor parçalarının bir kütüphanenin taranması için bakteriyel iç zar görüntü

Antibodies engineered for intracellular function must not only have affinity for their target antigen, but must also be soluble and correctly folded in ...

Biyokimya

Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the antibody genes followed by stable transfection into a suitable cell line. The stable clones are subjected to screening in order to select those clones with desired production and growth characteristics. This is a critical albeit time-consuming step in the process. This protocol considers vector selection and sourcing of antibody sequences for the expression of a therapeutic antibody. The methods describe preparation of vector DNA for stable transfection of a suspension variant of human embryonic kidney 293 (HEK-293) cell line, using polyethylenimine (PEI). The cells are transfected as adherent cells in serum-containing media to maximize transfection efficiency, and afterwards adapted to serum-free conditions. Large scale production, setup as batch overgrow cultures is used to yield antibody protein that is purified by affinity chromatography using an automated fast protein liquid chromatography (FPLC) instrument. The antibody yields produced by this method can provide sufficient protein to begin initial characterization of the antibody. This may include in vitro assay development or physicochemical characterization to aid in the time-consuming task of clonal screening for lead candidates. This method can be transferable to the development of an expression system for the production of biosimilar antibodies.

This protocol describes the production of a therapeutic antibody in a mammalian expression system. The methods described include preparation of vector DNA, stable transfection and serum-free adaptation of a human embryonic kidney 293 cell line, set up of large scale cultures and purification using affinity chromatography.

Laboratuar ölçekli üretim ve terapötik bir antikor ile saflaştırılması

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the ...

Analysis of Histone Antibody Specificity with Peptide Microarrays

Post-translational modifications (PTMs) on histone proteins are widely studied for their roles in regulating chromatin structure and gene expression. The mass production and distribution of antibodies specific to histone PTMs has greatly facilitated research on these marks. As histone PTM antibodies are key reagents for many chromatin biochemistry applications, rigorous analysis of antibody specificity is necessary for accurate data interpretation and continued progress in the field. This protocol describes an integrated pipeline for the design, fabrication and use of peptide microarrays for profiling the specificity of histone antibodies. The design and analysis aspects of this procedure are facilitated by ArrayNinja, an open-source and interactive software package we recently developed to streamline the customization of microarray print formats. This pipeline has been used to screen a large number of commercially available and widely used histone PTM antibodies, and data generated from these experiments are freely available through an online and expanding Histone Antibody Specificity Database. Beyond histones, the general methodology described herein can be applied broadly to the analysis of PTM-specific antibodies.

This manuscript describes methods for applying peptide microarray technology to specificity profiling of antibodies that recognize histones and their post-translational modifications.

Histon Antikor Özgüllüğünün Peptit Mikroarraylerle Analizi

Post-translational modifications (PTMs) on histone proteins are widely studied for their roles in regulating chromatin structure and gene expression. The ...

Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes.

Detergents are indispensable for delivery of membrane proteins into 30-100 nm small unilamellar vesicles, while more complex, larger model lipid bilayers are less compatible with detergents.
Here we describe a strategy for bypassing this fundamental limitation using fusogenic oppositely charged liposomes bearing a membrane protein of interest. Fusion between such vesicles occurs within 5 min in a low ionic strength buffer. Positively charged fusogenic liposomes can be used as simple shuttle vectors for detergent-free delivery of membrane proteins into biomimetic target lipid bilayers, which are negatively charged. We also show how to reconstitute membrane proteins into fusogenic proteoliposomes with a fast 30-min protocol.
Combining these two approaches, we demonstrate a fast assembly of an electron transport chain consisting of two membrane proteins from E. coli, a primary proton pump bo3-oxidase and F1Fo ATP synthase, in membranes of vesicles of various sizes, ranging from 0.1 to &#62;10 microns, as well as ATP production by this chain.

Here we present two ultrafast protocols for reconstitution of membrane proteins into fusogenic proteoliposomes, and fusion of such proteoliposomes with target lipid bilayers for detergent-free delivery of these membrane proteins into the postfusion bilayer. The combination of these approaches enables fast and easily controlled assembly of complex multi-component membrane systems.

Deterjan-Alerjik membran proteinlerinin Ultrafast sulandırma tamamlayıcı-Proteoliposomes ücret Fusogenic kullanarak Lipid Bilayers içine.

Detergents are indispensable for delivery of membrane proteins into 30-100 nm small unilamellar vesicles, while more complex, larger model lipid bilayers ...

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used strategy for RBP capture exploits the polyadenylation [poly(A)] of target RNAs, which mostly occurs on eukaryotic mature mRNAs, leaving most binding proteins of non-poly(A) RNAs unidentified. Here we describe the detailed procedures of a recently reported method termed click chemistry-assisted RNA-interactome capture (CARIC), which enables the transcriptome-wide capture of both poly(A) and non-poly(A) RBPs by combining the metabolic labeling of RNAs, in vivo UV cross-linking, and bioorthogonal tagging.

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture CARIC Strategy

A detailed protocol for applying the click chemistry-assisted RNA-interactome capture (CARIC) strategy to identify proteins binding to both coding and noncoding RNAs is presented.

Yakalama ve tıklama Kimya destekli RNA-interactome kullanarak RNA bağlanıcı proteinler tanımlaması (CARIC) strateji yakalama

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring cells. Of interest, only few assays are capable of specifically probing such interactions directly in living cells. Here, we present an assay to measure the binding of proteins expressed at the surfaces of neighboring cells, at cell-cell contacts. This assay consists of two steps: mixing of cells expressing the proteins of interest fused to different fluorescent proteins, followed by fluorescence fluctuation spectroscopy measurements at cell-cell contacts using a confocal laser scanning microscope. We demonstrate the feasibility of this assay in a biologically relevant context by measuring the interactions of the amyloid precursor-like protein 1 (APLP1) across cell-cell junctions. We provide detailed protocols on the data acquisition using fluorescence-based techniques (scanning fluorescence cross-correlation spectroscopy, cross-correlation number and brightness analysis) and the required instrument calibrations. Further, we discuss critical steps in the data analysis and how to identify and correct external, spurious signal variations, such as those due to photobleaching or cell movement.
In general, the presented assay is applicable to any homo- or heterotypic protein-protein interaction at cell-cell contacts, between cells of the same or different types and can be implemented on a commercial confocal laser scanning microscope. An important requirement is the stability of the system, which needs to be sufficient to probe diffusive dynamics of the proteins of interest over several minutes.

This protocol describes a fluorescence fluctuation spectroscopy-based approach to investigate interactions among proteins mediating cell-cell interactions, i.e. proteins localized in cell junctions, directly in living cells. We provide detailed guidelines on instrument calibration, data acquisition and analysis, including corrections to possible artefact sources.

Bir floresan dalgalanma spektroskopisi tahlil Protein-Protein etkileşimlerinin hücre-hücre kişiler

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Fluorescent Silver Staining of Proteins in Polyacrylamide Gels

Silver staining is a colorimetric technique widely used to visualize protein bands in polyacrylamide gels following sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). The classic silver stains have certain drawbacks, such as high background staining, poor protein recovery, low reproducibility, a narrow linear dynamic range for quantification, and limited compatibility with mass spectrometry (MS). Now, with the use of a fluorogenic Ag+ probe, TPE-4TA, we developed a fluorescent silver staining method for the total protein visualization in polyacrylamide gels. This new stain avoids the troublesome silver reduction step in traditional silver stains. Moreover, the fluorescent silver stain demonstrates good reproducibility, sensitivity, and linear quantification in protein detection, making it a useful and practical protein gel stain.

Here, we describe a detailed protocol outlining a new fluorescent staining technique for total protein detection in polyacrylamide gels. The protocol utilizes a silver ion-specific fluorescence turn-on probe, which detects Ag+-protein complexes, and eliminates certain limitations of traditional chromogenic silver stains.

Floresan gümüş Polyacrylamide jeller proteinlerin boyama

Silver staining is a colorimetric technique widely used to visualize protein bands in polyacrylamide gels following sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide ...

Identification of Functional Protein Regions Through Chimeric Protein Construction

The goal of this protocol encompasses the design of chimeric proteins in which distinct regions of a protein are replaced by their corresponding sequences in a structurally similar protein, in order to determine the functional importance of these regions. Such chimeras are generated by means of a nested PCR protocol using overlapping DNA fragments and adequately designed primers, followed by their expression within a mammalian system to ensure native secondary structure and post-translational modifications. 
The functional role of a distinct region is then indicated by a loss of activity of the chimera in an appropriate readout assay. In consequence, regions harboring a set of critical amino acids are identified, which can be further screened by complementary techniques (e.g. site-directed mutagenesis) to increase molecular resolution. Although limited to cases in which a structurally related protein with differing functions can be found, chimeric proteins have been successfully employed to identify critical binding regions in proteins such as cytokines and cytokine receptors. This method is particularly suitable in cases in which the protein's functional regions are not well defined, and constitutes a valuable first step in directed evolution approaches to narrow down the regions of interest and reduce the screening effort involved.

Structurally related proteins frequently exert distinct biological functions. The exchange of equivalent regions of these proteins in order to create chimeric proteins constitutes an innovative approach to identify critical protein regions that are responsible for their functional divergence.

Fonksiyonel Protein bölgeleri Chimeric Protein inşaat aracılığıyla tanımlaması

The goal of this protocol encompasses the design of chimeric proteins in which distinct regions of a protein are replaced by their corresponding sequences ...

Activated Cross-linked Agarose for the Rapid Development of Affinity Chromatography Resins - Antibody Capture as a Case Study

The purification of monoclonal antibodies (mAbs) is commonly achieved by Protein A affinity chromatography, which can account for up to 25% of the overall process costs. Alternative, cost-effective capture steps are therefore valuable for industrial-scale manufacturing, where large quantities of a single mAb are produced. Here we present a method for the immobilization of a DsRed-based epitope ligand to a cross-linked agarose resin allowing the selective capture of the HIV-neutralizing antibody 2F5 from crude plant extracts without using Protein A. The linear epitope ELDKWA was first genetically fused to the fluorescent protein DsRed and the fusion protein was expressed in transgenic tobacco (Nicotiana tabacum) plants before purification by immobilized metal-ion affinity chromatography. Furthermore, a method based on activated cross-linked agarose was optimized for high ligand density, efficient coupling and low costs. The pH and buffer composition and the soluble ligand concentration were the most important parameters during the coupling procedure, which was improved using a design-of-experiments approach. The resulting affinity resin was tested for its ability to selectively bind the target mAb in a crude plant extract and the elution buffer was optimized for high mAb recovery, product activity and affinity resin stability. The method can easily be adapted to other antibodies with linear epitopes. The new resins allow gentler elution conditions than Protein A and could also reduce the costs of an initial capture step for mAb production.

In this procedure, a DsRed-based epitope ligand is immobilized to produce a highly selective affinity resin for the capture of monoclonal antibodies from crude plant extracts or cell culture supernatants, as an alternative to Protein A.

Affinity Kromatografi Reçiyatlarının Hızlı Gelişimi İçin Aktif Çapraz Bağlantılı Agarose - Örnek Olay Olarak Antikor Yakalama

The purification of monoclonal antibodies (mAbs) is commonly achieved by Protein A affinity chromatography, which can account for up to 25% of the overall ...

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine exchangers in plants have not been identified. Here, we outline a method to characterize polyamine antiporters using membrane vesicles generated from the lysis of Escherichia coli cells heterologously expressing a plant antiporter. First, we heterologously expressed AtBAT1 in an E. coli strain deficient in polyamine and arginine exchange transporters. Vesicles were produced using a French press, purified by ultracentrifugation and utilized in a membrane filtration assay of labeled substrates to demonstrate the substrate specificity of the transporter. These assays demonstrated that AtBAT1 is a proton-mediated transporter of arginine, &#947;-aminobutyric acid (GABA), putrescine and spermidine. The mutant strain that was developed for the assay of AtBAT1 may be useful for the functional analysis of other families of plant and animal polyamine exchangers. We also hypothesize that this approach can be used to characterize many other types of antiporters, as long as these proteins can be expressed in the bacterial cell membrane. E. coli is a good system for the characterization of novel transporters, since there are multiple methods that can be employed to mutagenize native transporters.

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

We describe a method for the characterization of proton-driven membrane transporters in membrane vesicle preparations produced by heterologous expression in E. coli and lysis of cells using a French press.

E. coli'de Heterolog Ekspresyon ile Membran Taşıyıcılarının Karakterizasyonu ve Membran Veziküllerinin Üretimi

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine ...