Maryland Üniversitesi Tıp Fakültesi Elektron Mikroskopi Çekirdek Tesisi&#39;nden Hsia Ru-ching Doktora programına, tarama elektronik mikroskobu örneklerini işleme konusundaki teknik desteği için teşekkür ediyoruz.

Etik Beyanı: Hayvan taşıma protokolleri Maryland Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmış (protokol numarası 0416009) ve AAALAC-Uluslararası standartlarına göre yürütülmüştür. 1. Cerrahi İşlem <ol><li> Anestezi Tekniği <ol><li> Hayatta kalma cerrahisinde kullanılan tüm cihazları 121 ° C&#39;de 30 dakika boyunca buhar sterilizasyonu ile sterilize edin. </li><li> Anestezi indüksiyon tankı ile% 100 O 2 ve% 2.5 izofluran hassas damla yoluyla sağlayın. İndüksiyon sonrası, izofloranın kesilmesi ve odacığın O 2 ile yıkanması. Yüz maskesi yoluyla % 1.5-2 izofluran ve solunum yoluyla 1 L / dak O ile anestezi uygulayın. </li><li> Personeli korumak için hem indüksiyon odasını hem de yüz maskesini atık gaz adsorpsiyonu için bir kömür toplayıcıya takın. Gösteriyle uygun bir anestezi düzlemi hazırlayınZehirli uyaranlara (toe pinch) tepki olmadığını söyler. </li><li> Ameliyat sırasında termal destek sağlamak için izotermal pedli bir cerrahi tepsi içeren bir operasyon alanı oluşturun. Ek bir izotermik ped, kurtarma kafesindeki hayvanlara termal destek sağlayacaktır. </li></ol></li><li> Hayvan Hazırlama <ol><li> Aşağıdaki araştırmayı 10-12 haftalık erkek C57BL / 6 fareler üzerinde gerçekleştirin. </li><li> Hayvan ventral karın yüzeyindeki kılları sternumdan inguinal bölgeye bir kaşıntı ajanı veya 40 numaralı bıçaklı bir elektrikli kesiciyle çıkarın. <ol><li> Depilasyon ajanı durumunda bu bileşimi cerrahi alana 2-3 dakika uygulayın ve sonra pamukla çıkartın. Ticari olarak bulunan bir kalsiyum hidroksit ve sodyum hidroksit bileşiği kullanıyoruz. </li></ol></li><li> % 70 alkol ile omzun üzerinden alan hazırlayın ve 25 gauge veya daha küçük çaplı iğne ile karprofen (5 mg / kg) enjekte edin. BuTedavi hayvan için postoperatif analjezi sağlayacaktır. </li><li> Hayvanı cerrahi alana aktarın ve sırt üstü yatma pozisyonuna getirin. </li><li> Temiz bir pamuk aplikatörü veya pamuklu gazlı bez ile% 8-12 propidon iyodür fırçalayarak cerrahi alanı hazırlayın. Daha sonra cildi iki kez% 70 alkolle durulayın. </li><li> Kornea kurutması insidansını azaltmak için her iki göze de oküler yağlayıcı yerleştirin. Cerrahi alanı steril bir örtüyle örtün. </li></ol></li><li> Ameliyat tekniği <ol><li> Yaklaşık 2-2.5 cm uzunluğunda medial bir abdominal laparotomi insizyonu yapın, ksilofoid işlemi hemen kaudal başlayıp pelvise doğru uzanan bir neşterle yapın. </li><li> İnce bağırsak ve duodenumu harekete geçirin ve sağa doğru yanlara doğru yansıtın. Sarılı steril pamuklu bir şerit sarın ve pozlamayı iyileştirmek için iç organın paketlenmesine izin vermek için enjeksiyon için steril salinle ıslatılır. </li><li> Sağa doğru harekete geçirilen ince bağırsakRetroperitoneumu ortaya çıkarır ve abdominal aortayı sol böbrek veninden aort bifurkasyona maruz bırakır ( Şekil 1 ). </li><li> Steril pamuk uçlu bir aplikatör ile, her biri beş saniye süresince 30 ardışık öğütme yapın. </li><li> Ambalajı çıkarın ve iç organın yerlerine dönmesine izin verin. </li><li> Çalışan 4-0 emilebilir bir monofilament 봉iyle (poldioksanon) kapatın. Deri 6-0 emilemeyen monofilament sütürle (naylon) kapatılır. </li></ol></li><li> İyileşme ve Prosedür Sonrası Bakım <ol><li> Prosedürden sonra, hayvan normal şekilde ambulate gelene kadar, termal desteğini sürdürmek için, izotermal bir ped üzerinde temiz tabakalı bir kurtarma kafesine yerleştirin. Hayvanı sternal dinlenme kabiliyetini gösterene kadar gözetimsiz bırakmayın. </li><li> Ameliyattan sonraki ilk 4 saat boyunca her saat hayvan izleyin. Hayvan normalde ambulasyon yaparak i<html> T atanmış yetiştirme odasına. Hayvan, tamamen kurtarılana kadar bir başka hayvanın şirketinde bulunmaz. </li><li> Hayvanı ameliyattan sonraki ilk 72 saat boyunca günde iki kez ve bundan sonra da haftada en az 3 kez izleyin. İzleme, haftanın üç günü hayvanın tartımını içerir. </li><li> Ameliyattan sonraki ilk 72 saat boyunca günde iki kez subkütan carpofen (5 mg / kg) uygulayın. </li></ol></li></ol> 2. Doku İhalesi <ol><li> Ötenazi Yöntemi <ol><li> Hayvanları önceden belirlenmiş zaman noktalarından iniltin. </li><li> Anestezi indüksiyon tankı ile% 100 O 2 ve% 2.5 izofluran hassas damla yoluyla sağlayın. <ol><li> Endotelin bütünlüğünü incelemek için Evans Blue boyayı hayvana uygulayın. NOT: Evans Blue, albumin için yüksek bir bağlanma afinitesi olan negatif yüklü bir azo boya olup sadece bozulmamış bir endotelin yokluğunda kan damarlarını lekelemektedirS = &quot;xref&quot;&gt; 6. </li><li> Endotel bütünlüğü çalışmaları için, ötenazi anında 5 mL% 0.3 Evans Blue boyayla hayvanlara perfüze edilmeli ve bunu takiben 5 dakika için fizyolojik basınçta 5 mL PBS uygulayınız. Hayvan perfüzyon prosedürü sırasında cerrahi bir anestezi düzleminde muhafaza edilir. </li></ol></li><li> Derin anestezi düzlemine ulaştıktan sonra göğsünü bir sternotomi ile açın. Hayvandan kan drenajına izin vermek için sağ atriumda bir kesikleştirme yapın ve sol ventriküle erişmek için 21 G&#39;lik bir iğne ile erişin ve sağ atriyumdan çıkan atık berrak olana kadar fosfat tamponlu salin (PBS) enjektörü uygulayın. </li><li> PBS ile perfüzyondan sonra, karın orta hat kesi yoluyla girilir. </li><li> Bir kez daha, ince barsağı infrarenal aortayı ortaya çıkaran karın sağ tarafına hareketlendirin, aortayı bitişik dokulardan keskin bir şekilde parçalayın ve sol böbrek veninden aort bifurkasyona geçirin. </li><li> Kesilen aortayı% 4 paraformaldEhyde solüsyonu doku işleme oluşuncaya kadar çözülür. <ol><li> Endotel bütünlüğü çalışmaları için, aortu uzunlamasına açın ve lümen yüzeyinin 6 tamamını içine alan bir mum sayfasına tutturun. Evans Blue boyasıyla boyama derecesine göre endotel bütünlüğünü niteliksel bir değerlendirme yapın 6 . </li><li> Diğer histolojik tahliller için aortanın enine kesitini alın ve kullanılacak histolojik yöntemle belirlendiği üzere en uygun kesme ısısı (OCT) bileşiklerine yerleştirin 7 . </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Carmeliet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+angiogenesis+and+arteriogenesis.">Mechanisms of angiogenesis and arteriogenesis.</a> Nat Med. 6 (4), 389-395 (2000).</li><li>Carmeliet, P., Moons, L., Collen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+angiogenesis,+arterial+stenosis,+atherosclerosis+and+hemostasis.">Mouse models of angiogenesis, arterial stenosis, atherosclerosis and hemostasis.</a> Cardiovasc Res. 39 (1), 8-33 (1998).</li><li>Baker, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heparanase+Alters+Arterial+Structure,+Mechanics,+and+Repair+Following+Endovascular+Stenting+in+Mice.">Heparanase Alters Arterial Structure, Mechanics, and Repair Following Endovascular Stenting in Mice.</a> Circ Res. 104 (3), 380-387 (2009).</li><li>Petrov, L., Laurila, H., Hayry, P., Vamvakopoulos, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+of+aortic+angioplasty+for+genomic+studies+of+neointimal+hyperplasia.">A mouse model of aortic angioplasty for genomic studies of neointimal hyperplasia.</a> J Vasc Res. 42 (4), 292-300 (2005).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+smooth+muscle+cells+of+recipient+origin+mediate+intimal+expansion+after+aortic+allotransplantation+in+mice.">Vascular smooth muscle cells of recipient origin mediate intimal expansion after aortic allotransplantation in mice.</a> Am J Path. 158 (6), 1943-1947 (2001).</li><li>Radu, M., Chernoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vivo+assay+to+test+blood+vessel+permeability.">An in vivo assay to test blood vessel permeability.</a> J Vis Exp. (73), e50062 (2013).</li><li>Turbett, G. R., Sellner, L. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+optimal+cutting+temperature+compound+can+inhibit+amplification+by+polymerase+chain+reaction.">The use of optimal cutting temperature compound can inhibit amplification by polymerase chain reaction.</a> Diagn Mol Pathol. 6 (5), 298-303 (1997).</li><li>Puchtler, H., Waldrop, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+mechanism+of+Verhoeff's+elastica+stain:+a+convenient+stain+for+myelin+sheaths.">On the mechanism of Verhoeff's elastica stain: a convenient stain for myelin sheaths.</a> Histochem. 62 (3), 233-247 (1979).</li><li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo.">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (7), 2415-2420 (2008).</li><li>Nelson, P. R., Yamamura, S., Mureebe, L., Itoh, H., Kent, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smooth+muscle+cell+migration+and+proliferation+are+mediated+by+distinct+phases+of+activation+of+the+intracellular+messenger+mitogen-activated+protein+kinase.">Smooth muscle cell migration and proliferation are mediated by distinct phases of activation of the intracellular messenger mitogen-activated protein kinase.</a> J Vasc Surg. 27 (1), 117-125 (1998).</li><li>Rzucidlo, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+pathways+regulating+vascular+smooth+muscle+cell+differentiation.">Signaling pathways regulating vascular smooth muscle cell differentiation.</a> Vascular. 17, S15-S20 (2009).</li><li>Aoki, T., Sumii, T., Mori, T., Wang, X., Lo, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier+disruption+and+matrix+metalloproteinase-9+expression+during+reperfusion+injury:+mechanical+versus+embolic+focal+ischemia+in+spontaneously+hypertensive+rats.">Blood-brain barrier disruption and matrix metalloproteinase-9 expression during reperfusion injury: mechanical versus embolic focal ischemia in spontaneously hypertensive rats.</a> Stroke. 33 (11), 2711-2717 (2002).</li><li>Yu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MARCKS+Signaling+Differentially+Regulates+Vascular+Smooth+Muscle+and+Endothelial+Cell+Proliferation+through+a+KIS-,+p27kip1-+Dependent+Mechanism.">MARCKS Signaling Differentially Regulates Vascular Smooth Muscle and Endothelial Cell Proliferation through a KIS-, p27kip1- Dependent Mechanism.</a> PLoS One. 10 (11), e0141397 (2015).</li><li>Banai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rabbit+ear+model+of+injury-induced+arterial+smooth-muscle+cell-proliferation+-+kinetics,+reproducibility,+and+implications.">Rabbit ear model of injury-induced arterial smooth-muscle cell-proliferation - kinetics, reproducibility, and implications.</a> Circ Res. 69 (3), 748-756 (1991).</li></ol>

Bu çalışma Gaziler İşleri Kariyer Geliştirme Ödülü (1IK2BX001553-01) (TSM) ve Vasküler Cures EJ Wylie Bursu (TSM) tarafından finanse edildi.

Medial hiperplazi ve endotel bariyer disfonksiyonu ile sonuçlanan bir murin aort yaralanma modelinin etkilerini karakterize ettik. Aort intima boyunca kısmi AT dekolmanı, hücre-hücre teması kaybına ve hücre çıkıntılarının arttırılmasına eşlik etti. Buna paralel olarak, endotel bariyer fonksiyonu önemli ölçüde bozulmuş ve mitojen duyarlı sinyal yollarını uyarmış ve VSMC&#39;lerin çoğalmasına ve damar duvarının kalınlaşmasına yol açmıştır. Bu modelin güçlü yönleri, hastalığın diğer aortik modellerinden daha teknik olarak öğrenilmesinin ve yürütülmesinin daha kolay olması ve hem yaralanma hem de endotel fonksiyonuna karşı proliferatif yanıtı eşzamanlı olarak değerlendirmesine olanak sağlamasıdır. Bu protokoldeki kritik adım asıl eziyet yaralanmasıdır. Ezilme yaralanmasının boyutundaki değişkenlik, çeşitli derecelerde yaralanmaya ve dolayısıyla değişen miktarlarda düz kas hücre çoğalmasına neden olabilir. Laboratuarımızda bu değişkenliği azaltan bir adım,Cientist, tedavi veya deneysel kör olduğunuzda, ezilme yaralanmalarının tümünü gerçekleştirin. Bu modelin bir kısıtlılığı, klinik olarak ilgili insan hastalık süreçlerine genelleştirilebilirliği. Bu modelde VSMC&#39;lerin hızlı proliferatif yanıtına rağmen, restenozun geç olaylarını modellememektedir, yani neointima gelişmemiştir. Sitokinler gibi azalmış inflamatuar mediatörler bu süreci düzenleyebilir. Bu bulgu, kısmi hasardan endotelin hızla iyileşmesinden kaynaklanabilir. Tavşanlarda daha önce bildirilen vasküler ezik yaralanma modeline benzer şekilde, bağışıklık hücrelerinin infiltrasyonu azdı. Mevcut araştırmada profilaktör dizisi ile sahte hayvanlar ve aortik hasar gören hayvanlardaki inflamatuar sitokinlerin profili değerlendirildi. Bununla birlikte, sahte ve yaralı hayvanlar arasındaki proliferatif cevaptaki farkı açıklayan sitokin profilinde anlamlı bir fark yoktu (verilergösterilmemiş). Mevcut raporda anlatılan yaralanma, geçici olarak sınırlıdır. Aortik anjiyoplasti modeli gibi diğer aort yaralanması ve intimal hiperplazi modelleri endotelü tamamen teyit ederken, bu model sadece aorta kısmen denüde olur. Endotelin tamamen delinmesi, iyileşmek için çok daha uzun süre gerektirir ve bu hayvanlar, yaralanmanın etkilerini daha uzun süre deneyimlidir. Bu model, bir haftada morfolojik ve biyokimyasal değişikliklerin miktarının belirlenmesine izin veren yaralanmalara karşı VSMC&#39;lerin ve EC&#39;lerin hızlı tepkisini üretir. Müdahalenin etkisinin belirginleşmesi 14-28 gün süren diğer modellerden daha etkilidir. Bu model klinik olarak ilgili insan damarına yaklaşan tek fare gemi olan murin aortayı kullanır. Bu tekniğin diğer aortik modellere kıyasla önemli avantajı, bu modelin öğrenilmesi nispeten kolaydır ve pahalı ya da elde edilmesi zor olan eq gerektirmezSevkiyat 2 , 3 , 4 , 5 . Sonuç olarak, murin aortik ezici yaralanma modeli, VSMC&#39;lerin ve EC&#39;lerin vasküler hasara karşı cevabını eşzamanlı olarak değerlendirmek için, teknik açıdan açık, ucuz, etkili bir in vivo platform sağlar.

Restenoz (Bypass ameliyatı, anjiyoplasti veya stentleme) kardiyovasküler prosedürlerin ardından bu prosedürlerin dayanıklılığını azaltmakta önemli bir problemdir. Tüm revaskülarizasyon prosedürleri restenoz tarafından engellenmektedir. Restenozu (ilaç salınımlı stentler ve ilaç kaplı balonlar) önlemek için mevcut stratejiler hem vasküler düz kas hücresi (VSMC) hem de endotel hücre proliferasyonunu (EC) inhibe etmektedir. Sonuç olarak, bu müdahaleler VSMC aracılı restenozu engeller, aynı zamanda endotelin yenilenmesini önler. Sağlam bir endotel olmadan, hastaların, kanama komplikasyonları riski altında in situ tromboz riskini azaltmak için güçlü anti-platelet ajanlar üzerinde olması gerekmektedir. İdeal bir terapi, endotelin rejenerasyonunu teşvik ederken VSMC çoğalmasını inhibe eder. Bu nedenle, VSMC çoğalmasını ve endotel bariyer fonksiyonunu aynı anda çalışmak için bir vesikaya ihtiyaç vardır. Halen, sever varRestenosis 1 al fare modelleri. Bu modeller karotis ligasyonu ve femoral arter tel hasarı 2&#39;yi içerir . Aortik modeller arasında stent yerleştirme 3 , balon hasarı 4 ve aortik allograft 5 bulunur . Mevcut modellerin tümü sınırlıdır. Karotis ligasyonu, akış aracılı bir neointimal lezyon oluşturur ve endotel hasarına sahip değildir. Buna ek olarak, hem karotis hem de femoral arterler, insan damarlarına göre çok daha az kat kat daha az hücre katına sahiptir ve translasyonel değerlerini sınırlar. Çapı yaklaşık 1.3 mm olan fare aortu, klinik açıdan alakalı (koroner) bir insan artere yaklaşık tek damartır (3). Kemirgen aortik modellerin translasyonel potansiyeline rağmen, mevcut modellerin kısıtlamaları vardır. Bu modeller gelişmiş mikrocerrahi becerileri ve anjiyoplasti balonları ve stentler gibi özel ekipman gerektirir. Burada,Eşzamanlı olarak VSMC proliferasyonunu uyarmak ve endotel bariyer fonksiyonunu bozmak için yeni, tekrarlanabilir bir teknik.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="920">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:351px;">Ocular lubricant</td>
			<td style="width:160px;">Dechra</td>
			<td style="width:163px;">17033-211-38</td>
			<td style="width:247px;">Pharmaceutical agents</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:351px;">Isoflurane</td>
			<td>VetOne</td>
			<td>502017</td>
			<td>Pharmaceutical agents</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Carprofen</td>
			<td>Zoetis</td>
			<td>26357</td>
			<td>Pharmaceutical agents</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:351px;">Precision vaporizer</td>
			<td>Summit Medical</td>
			<td>10675</td>
			<td>Surgical supplies</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:351px;">Charcoal scavenger</td>
			<td>Bickford Inc.</td>
			<td>80120</td>
			<td>Surgical supplies</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:351px;">Isothermal pad</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>50-7053-R</td>
			<td>Surgical supplies</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:351px;">Sterile cotton-tipped applicator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-400-124</td>
			<td>Surgical supplies</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:351px;">4-0 absorbable monofilament suture&#160;</td>
			<td>Ethicon, Inc</td>
			<td>J310</td>
			<td>Surgical supplies</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:351px;">5-0 non-absorbable monofilament suture</td>
			<td>Ethicon,Inc</td>
			<td>1666</td>
			<td>Surgical supplies</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:351px;">21-gauge x 1 inch needle</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305165</td>
			<td>Surgical supplies</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">25-gauge x 1 inch&#160; needle</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305125</td>
			<td>Surgical supplies</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dry sterilizer</td>
			<td>Cellpoint&#160;</td>
			<td>7770</td>
			<td>Surgical supplies</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fine scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14058-09</td>
			<td>Surgical instruments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Adson forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11006-12</td>
			<td>Surgical instruments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:351px;">Dumont #5 fine forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td>Surgical instruments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:351px;">Vannas Spring Scissors 3mm cutting edge</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-00</td>
			<td>Surgical instruments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Needle driver</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91201-13</td>
			<td>Surgical instruments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Scalpel handle #4</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10004-13</td>
			<td>Surgical instruments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Scalpel blades #10</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10010-00</td>
			<td>Surgical instruments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS&#160;</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-516F</td>
			<td>Reagents for tissue processing</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:351px;">Evans Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E2129</td>
			<td>Reagents for tissue processing</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:351px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td>Reagents for tissue processing</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:351px;">Modeling wax</td>
			<td>Bego</td>
			<td>40001</td>
			<td>Reagents for tissue processing</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">OCT compound</td>
			<td>Tissue-Tek Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td>Reagents for tissue processing</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mayer&#39;s hematoxylin solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>MHS16</td>
			<td>Reagents for immunohistological analysis</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Eosin Y solution alcoholic&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT110316</td>
			<td>Reagents for immunohistological analysis</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:351px;">Elastin stain kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:163px;">HT25A</td>
			<td>Reagents for immunohistological analysis</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Click-it Edu Alexa-488 Imaging Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10337</td>
			<td>Reagents for immunohistological analysis</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:351px;">Anti-Erk1/2 antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4695</td>
			<td>Reagents for immunohistological analysis</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:351px;">Anti-phospho-Erk1/2 antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4370</td>
			<td>Reagents for immunohistological analysis</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:351px;">Anti-p27kip1 antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>3698</td>
			<td>Reagents for immunohistological analysis</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:351px;">Trichloroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9159</td>
			<td>Reagents for immunohistological analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

murine aortic crush injury: an efficient in vivo model of smooth muscle cell proliferation and endothelial function

Arteryel rekonstrüksiyon, ister anjiyoplasti ister baypas cerrahisi olsun, iyatrojenik travmayı endotel hasarına ve vasküler düz kas hücresi (VSMC) proliferasyonuna neden olur. Ortak fare modelleri karotis ve femoral arterler gibi küçük damarları inceler. Burada hem VSMC çoğalması hem de endotel bariyer fonksiyonunun aynı anda büyük bir kapta değerlendirilebildiği bir in vivo sistem tanımlanmaktadır. C57BL / 6 farelerde yaralanmaya karşı infrarenal aortik tepki üzerinde çalıştık. Aort, sol böbrek veninden aortik bifurkasyona 5 saniyelik sürtünme ile pamuk uçlu aplikatör ile yaralandı. Morfolojik değişiklikler konvansiyonel histoloji ile değerlendirildi. Aort duvar kalınlığı lüminal yüzeyden adventi- teye kadar ölçüldü. VSUc çoğalmasını göstermek için DUI ve alfa-aktin ile EdU entegrasyonu ve sayaç boyama kullanıldı. İntimal hiperplazi oluşumunun bilinen bir düzenleyicisi olan ERK1 / 2&#39;nin aktivasyonu caydırıcıydıWestern Blot analizi ile çıkarıldı. Enflamasyonun etkisi, B hücreleri, T hücreleri ve makrofajlar için immünhistokimyasal yöntemle belirlendi . Endotelin yüz bölümleri taramalı elektron mikroskobu (SEM) ile görselleştirildi. Evans Blue boyama ile endotel bariyer fonksiyonu belirlendi. Transmural yaralanma aort duvarı kalınlaşmasına neden oldu. Bu hasar, VSMC çoğalmasını, en belirgin şekilde yaralanmadan 3 gün sonra indükledi ve ERK1 / 2&#39;nin erken aktivasyonu ve p27 kip1 ekspresyonunu azalttı. Yaralanma, damar duvarında artmış B-hücreleri, T-hücreleri veya makrofaj infiltrasyonuyla sonuçlanmadı. Yaralanma, kısmi endotel hücresi soyulmasına ve hücre-hücre temasının kaybına neden oldu. Yaralanma, endotel bariyer fonksiyonunda belirgin bir kayıp ile sonuçlandı ve bu, yedi gün sonra başlangıç ​​noktasına döndü. Kemirgen transmüral künt aort yaralanması modeli, VSMC çoğalmasını ve endotel bariyer fonksiyonunu büyük bir kapta eşzamanlı olarak incelemek için etkili bir sistem sağlar.

OCT&#39;de gömülü transvers kesitler aort kesitlendirildi ve hematoksilen ve eozin ile boyandıktan sonra iç ve dış elastik tabakaları tanımlamak için Verhoeff-Van Gieson (VVG) lekesi ile sayaçla boyandı 7 . Bir dolandırıcılık işlemi ile tedavi edilen hayvanların aortalarına (laparotomi ve tek başına ince bağırsak mobilizasyonu) kıyasla yaralanmaya neden olan aort duvar kalınlaşmasını ezin. Adventitia lümene olan uzaklıkla değerlendirilen duvar kalınlığı yaralanmadan sonraki en yüksek üç gündür (tek başına laparotomi için 42.2 ± 1.7 μm vs tek başına laparotomi için) ( Şekil 2A-B ). Yaralanma, hücrelerin daha yuvarlak bir görünüme ve luminal yüzeyin düzensiz konturuna ( Şekil 2C ) sahip olmasına neden oldu. Yaralı aortun artmış duvar kalınlaşması, medial vasküler pürüzsüz musun artmış proliferasyonu ile en azından kısmen arabuluculuk yapmaktadırCle hücreleri. Duvar kalınlaşmasının, hücre hipertrofisine karşı artan çoğalmaya bağlı olduğunu ispatlamak için, bir EdU çoğalma tahlili kullandık. Bu deneyde, timidin analoğu 5-etinil-2&#39;-deoksiüridin (EdU) ötanazi öncesi 24 saat damar yoluyla fare üzerine uygulandı. Edu, sentez sırasında DNA&#39;ya dahil edilir. Edu, bir tıklama reaksiyonu (yeşil-flüoresan boya kullanılarak bakır ile katalize edilmiş azid-alkin siklo-yüklemesi) tarafından tespit edilir 8 . Sadece laparotomiye maruz kalmış sahte fareler, aortun herhangi bir katında flüoresansı gözlememişlerdi. Conversley, aort yaralanmasına maruz bırakılan fareler hem aortanın medyumunda hem de intimaasında floresans gösterdi ( Şekil 3 ). Ezici yaralanmadan sonra aort duvarı kalınlaşması, insanlarda restenozla ilişkili hücre sinyal yollarını aktive eder. Mitojenle aktive olan protein kinaz (MAP Kinaz) ERK1 / 2, intimal hiperplazi oluşumunda ana aracı maddelerden biridirBir mitojenden uyarılmaya yanıt olarak, ERK1 / 2 fosforile edilir ve 9 , 10 aktive edilir. Laboratuvarımızda elde edilen veriler, siklin bağımlı kinaz inhibitörü p27 kip1&#39;in damar duvarında 12 mitojen uyaranlara yanıt olarak azaldığını da göstermiştir. Aortik ezilme yaralanmasından 1, 3, 7 gün ve 1 ay sonra fareler ötenazi yapıldı. İnfrarenal aort izole edildi ve ERK1 / 2, fosfo-ERK1 / 2&#39;nin (aktive edilmiş ERK1 / 2 formu) ve sikline bağlı kinaz inhibitörü p27 kip1&#39;in protein ekspresyonu Western leke analizi ( Şekil 4A ) ile belirlendi. Toplam ERK1 / 2 protein ekspresyonunda zamanla herhangi bir değişiklik gözlenmemiştir. Bununla birlikte, yaralanmadan üç gün sonra, fosfo-ERK1 / 2 (Pi-ERK1 / 2) ifadesi, başlangıçtaki Pi-ERK1 / 2 ekspresyonundan% 200&#39;ün üzerinde olmuştur. P27 kip1 ekspresyonu, erken zaman noktalarında azaldı ve afla¤ıdaki yedi günün aflamas&gt; n&gt; n yaklafl&gt; k % 20&#39;sinde en düflük seviyeye ulaflt&gt;:Ter yaralanması. Pi-ERK1 / 2 ve p27 kip1 ekspresyonu, yaralanmadan bir ay sonra temel seviyelere yaklaştı ( Şekil 4B ). Dolayısıyla aort duvarının kalınlaşması en azından kısmen medial proliferasyonun artmasından kaynaklanmaktadır. Aort yaralanması modeli hem medial düz kas proliferasyonunun hem de endotel bariyer fonksiyonunun aynı anda değerlendirilmesine izin verir. Ezici hasarın endotelin morfolojisi üzerindeki etkisini karakterize etmek için taramalı elektron mikroskobu (SEM) kullanıldı. Aortun luminal yüzeyi, kanla doğan hücrelerin ve moleküllerin yapışmasını önleyen, birleşik bir endotel ile kaplanmıştır ( Şekil 5A , Ölçek çubuğu = 100 μm). Aksine, ezilme yaralanması, endotel hücrelerinin bozulmasına ve endotelin kısmi olarak delinmesine neden olur ( Şekil 5B , Ölçek çubuğu = 100 μm). Yüksek büyütmede görüldüğü gibi, endotelin bozulması yapışkanla sonuçlanırTrombositlerle boyut ve şekil bakımından tutarlı partiküller. Bu parçacıkların yapışması yaralanmanın tüm bölgesi boyunca gerçekleşir ve daha düşük büyütmede gözlemlenen kaba soyma alanlarıyla sınırlı değildir ( Şekil 5C , Ölçek çubuğu = 50 μm). Yapışkan parçacığın morfolojisi en iyi büyütmede daha iyi gözlemlenir. Bu parçacıklar trombosit ve fibrin ile tutarlıdır ( Şekil 5D , Ölçek çubuğu = 10 μm). Endotel morfolojisine ek olarak, vasküler hasarın bu modeli ile endotelin bariyer fonksiyonu değerlendirilebilir. Azo boya Evans Blue, murin aortunun normal, bozulmamış endoteline nüfuz edemez. Endotelin bariyer işlevine zarar verildiğinde, Evans Blue ile temel zarının lekelenmesine izin verilir. Tek başına bir laparotomi (sahte) ile tedavi edilen fareler, endotelin bariyer işlevini sürdürdü ve bu aortlar beyazdı. Ezilme yaralanması,Diffüz endotel bariyer fonksiyon kaybı ve bu aortlar koyu mavi renkliydi. Efüzyon yaralanmasından üç gün sonra Evans Blue ile lekelenme yoğunluğu azaltıldı ve tam bariyer fonksiyonu yaralanmadan sonraki hafta restore edildi ( Şekil 6A ). Endotel bariyer fonksiyonu numuneleri tartarak ve 10 kat hacimli% 50 trikloroasetik asit solüsyonunda homojenleştirerek daha da nicelleştirilebilir. Süpernatantın 4 kat etanol içinde seyreltilmesi, Aoki ve diğerleri tarafından tarif edildiği gibi flüoresan yoğunluğunun (uyarma 620 nm ve emisyon 680 nm) belirlenmesine izin verir. 11 . Infrarenal aortadan çıkan Evans Blue miktarı, yaralanmadan hemen sonra aortlarda sadece laparotomiye (Yaralı - Gün 0) maruz kalan aorta göre üç kat fazladı. Aorta, yaralanmadan bir ve üçüncü günlerde Evans Blue ile lekelenmeye devam etti, ancak yaralanma zamanından daha az yoğunlaştı ve endotel bariyer fonksiyonunun kademeli olarak düzeldiğini düşündürdü. Bir hafta sonra kıçYaralanma nedeni yaralanan aortun, laparotomi ile tedavi edilen aort olarak eşdeğer boyanması vardı ( Şekil 6B ). <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/55201/55201fig1.jpg" /> Şekil 1: Yaralanma, Aortanın Sol Renal Ven&#39;den Aort Bifurkasyona Keskin Şekilde Parçalanmasıyla Oluşmuştur. Şekil Yu ve diğerlerinin izniyle uyarlanmıştır, PLoS One 2015 12 . <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55201/55201fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/55201/55201fig2.jpg" /> Şekil 2: Ezilme Yaralanması Aortik Duvar Kalınlaşmasına Neden olur. ( A ) Aortda hasar gören morfolojik değişiklikleri ezmek. Temsilci 5 um kesitleri 0 ° C&#39;de VVG ile boyandı,Yaralanmadan 1, 3 ve 7 gün sonra. Ölçek çubukları = 100 μm. ( B ) Duvar kalınlığı, yaralanmadan 3 gün sonra en fazla 42.2 ± 1.7 μm idi ve yalnızca laparotomi uygulanan sahte hayvanların aortundan 22.1 ± 1.1 μm. Daha büyüktü. İstatistiksel önem Student&#39;s two-tail t-testi ile belirlendi. Crush yaralanması medial VSMC&#39;lerin (a-düz kas aktımı için yeşil lekelenmiş) ve hücre yönlendirmesini değiştirerek yuvarlak bir görünüm yarattığını gösterdi. Çekirdeklere DAPI (Mavi) ile karşıt boyandılar. Ölçek çubukları = 10 μm. Veriler, ortalamalar ve standart sapmalar olarak sunulmuştur. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55201/55201fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/55201/55201fig3.jpg" /> Şekil 3: Crush Yaralanması Hücre Prolife&#39;sını İndüklerAort duvarındaki rasyon. Fareler ya tek başına laparotomi (sahte) ya da aortik ezilme yaralanması ile laparotomiye maruz bırakıldı. Ötinazinden 24 saat önce timidin analoğu 5-etinil-2&#39;-deoksiüridin (EdU) uygulandı. Edu, sentez sırasında DNA&#39;ya dahil edilir. Edu, bir tıklama reaksiyonu (yeşil-flüoresan boya kullanılarak bakır ile katalize edilmiş azid-alkin siklo-ilavesi) ile tespit edilir. Sahte hayvanların aort duvarında saptanabilir Edu (yeşil) yoktu. Ezici yaralanmaya maruz kalan hayvanlarda, EdU, aort ortamında belirgin olarak lekelenmiş ve intima&#39;da daha az miktarda lekelenmiştir. Vasküler düz kas hücreleri, α-düz kas aktin antikoru (kırmızı) ile boyanarak tespit edildi. Bu bulgu, Şekil 2&#39;de gözlemlenen duvar kalınlaşmasının, hücre proliferasyonundaki bir artıştan kaynaklandığını düşündürmektedir. Ölçek çubukları = 10 μm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55201/55201fig3large.jpg" target="_blank">Bu figürden daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a>e. <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/55201/55201fig4.jpg" /> Şekil 4: Mitojenle aktive olan Protein Kinaz (MAP Kinaz) Yolağı Ezilme Yaralanmasına Karşı Aktive edilir. ( A ) MAP Kinaz ERK1 / 2 aktive olduğunda fosforilatlanmıştır ve intimal hiperplazi ve restenoz ile ilişkilidir. Aortik ezilme yaralanmasından 1, 3, 7 gün ve 1 ay sonra fareler ötenazi yapıldı. Toplam ERK1 / 2, fosfo-ERK1 / 2 ve siklin bağımlı kinaz inhibitörü p27 kip1&#39;in protein ekspresyonunu değerlendirmek için Western blot analizi kullanılmıştır . Protein ekspresyonu, tek başına laparotomi ile tedavi edilen sahte bir hayvana normalleştirildi. ( B ) Toplam ERK1 / 2 protein ekspresyonunda zaman içinde hiç bir değişiklik gözlenmemiştir. Bununla birlikte, yaralanmadan üç gün sonra, fosfo-ERK1 / 2 (Pi-ERK1 / 2) ifadesi, başlangıçtaki Pi-ERK1 / 2 ekspresyonundan% 200&#39;ün üzerinde olmuştur. P27 kip1 ekspresyonu, erken zaman noktalarında azaldı veD yaralanmadan sonraki 7 günün sonunda başlangıçtaki yaklaşık% 20&#39;lik bir dereye ulaştı. Pi-ERK1 / 2 ve p27 kip1 ekspresyonu, yaralanmadan bir ay sonra temel seviyelere yaklaştı. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55201/55201fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5" src="/files/ftp_upload/55201/55201fig5.jpg" /> Şekil 5. Crush Sakatlığı Aort Endotel Hücrelerini Dağıtır. ( A ) Eritme hasarının endotelin morfolojisi üzerindeki etkisini karakterize etmek için taramalı elektron mikroskopisi (SEM) kullanılmıştır. Normal aortun luminal yüzeyi, kan yoluyla doğan hücrelerin ve moleküllerin yapışmasını önleyen bir konfluent endotel ile kaplıdır. ( B ) Ezilme yaralanması, endotel hücrelerinin parçalanmasına ve endotelin kısmi olarak delinmesine neden olur. ( C ) Yüksek magnifica&#39;da görüldüğü gibiEndotelin bozulması, trombositlerle boyut ve şekil bakımından tutarlı parçacıkların yapışmasına neden olur. Bu parçacıkların yapışması tüm yaralanma bölgesi boyunca gerçekleşir ve daha düşük büyütmede gözlemlenen kaba soyma alanlarıyla sınırlı değildir. ( D ) Yüksek büyütmede, bu parçacıklar trombosit ve fibrin ile tutarlıdır. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55201/55201fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 6" src="/files/ftp_upload/55201/55201fig6.jpg" /> Şekil 6: Blunt Aort Yaralanması, Endotel Bariyeri Fonksiyonunun Kantitatifleştirilmesini sağlar. ( A ) Endotelin bariyer fonksiyonunun bozulması, Evans Blue boyası ile temel zarının boyanmasına izin verir. Tek başına bir laparotomi (sahte) ile tedavi edilen fareler, endotelin veEse aortas beyazdı. Ezilme yaralanması, endotel bariyer işlevinde yaygın bir kayıp ile sonuçlandı ve bu aortlar koyu mavi renkliydi. Evans Blue ile lekelenme yoğunluğu ezilme yaralanmasından üç gün sonra azaltıldı ve tam bariyer fonksiyonu yaralanmadan sonraki hafta restore edildi. ( B ) Evans Blue&#39;nın İnfrarenal aortaya bağlanması örnekten Evans Blue çıkartılarak ve flüoresan yoğunluğu ile nicelendirilerek nicelleştirildi. Veriler, ortalamalar ve standart sapmalar olarak sunulmuştur. En Evans Blue, ezilme yaralanmasından hemen sonra aortadan çıkarıldı. Yaralanma anında aort, yalnız laparotomiye tabi tutulmuş olan aorttan üç kat daha fazla Evans Blue ile bağlandı. Aorta iyileşmesine izin verildiğinde, yaralanmadan bir ve üçüncü günlerde daha az bağlanma vardı. Yaralanmadan bir hafta sonra aort, aynı miktarda Evans Blue&#39;yı tek başına laparotomi yapılan aortlarla ilişkilendirir. İstatistiksel önem Student&#39;s two-tail t-testi ile belirlendi. * DeNotlar p &lt;0.05, n = 3, NS anlamlı olmadığı anlamına gelir. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55201/55201fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Murine Aortic Crush Injury: An Efficient In Vivo Model of Smooth Muscle Cell Proliferation and Endothelial Function at JoVE.com

Murine Aortic Crush Injury: An Efficient In Vivo Model of Smooth Muscle Cell Proliferation and Endothelial Function

Kardiyovasküler prosedürleri takiben yapılan restenoz (baypas cerrahisi, anjiyoplasti veya stentleme) bu prosedürlerin dayanıklılığını azaltmakta önemli bir sorundur. İdeal bir terapi düz kas hücresi (VSMC) proliferasyonunu inhibe ederken endotelin rejenerasyonunu teşvik eder. VSMC çoğalması ve endotel fonksiyonunun in vivo olarak eşzamanlı olarak değerlendirilmesi için bir model tanımlıyoruz.

Murin Aort Kırma Yaralanması: Verimli<emIn vivo</em&gt; Düz Kas Hücresi çoğalması ve Endotel Fonksiyon Modeli

Arterial reconstruction, whether angioplasty or bypass surgery, involves iatrogenic trauma causing endothelial disruption and vascular smooth muscle cell ...

murine-aortic-crush-injury-an-efficient-vivo-model-smooth-muscle-cell

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Murine Aortic Crush Injury: An Efficient In Vivo Model of Smooth Muscle Cell Proliferation and Endothelial Function

8.3K Görüntüleme.  Baltimore Veterans Affairs Medical Center.  Kardiyovasküler prosedürleri takiben yapılan restenoz (baypas cerrahisi, anjiyoplasti veya stentleme) bu prosedürlerin dayanıklılığını azaltmakta önemli bir sorundur. İdeal bir terapi düz kas hücresi (VSMC) proliferasyonunu inhibe ederken endotelin rejenerasyonunu teşvik eder. VSMC çoğalması ve endotel fonksiyonunun in vivo olarak eşzamanlı olarak değerlendirilmesi için bir model tanımlıyoruz. 

Video: Murine Aortic Crush Injury: An Efficient In Vivo Model of Smooth Muscle Cell Proliferation and Endothelial Function

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Ca2+ imaging of smooth muscle provides insight into cellular mechanisms that may not result in changes of membrane potential, such as the release of Ca2+ from internal stores, and allows multiple cells to be monitored simultaneously to assess, for example, coupling in syncytial tissue. Subcellular Ca2+ transients are common in smooth muscle, yet are difficult to measure accurately because of the problems caused by their stochastic occurrence, over an often wide field of view, in an organ that it prone to contract. To overcome this problem, we've developed a series of imaging protocols and analysis routines to acquire and then analyse, in an automated fashion, the frequency, location and amplitude of such events. While this approach may be applied in other contexts, our own work involves the detection of local purinergic Ca2+ transients for locating transmitter release with submicron resolution. 
ATP is released as a cotransmitter from autonomic nerves, where it binds to P2X1 receptors on the smooth muscle of the detrusor and vas deferens. Ca2+ enters the smooth muscle, resulting in purinergic neuroeffector Ca2+ transients (NCTs). The focal Ca2+ transients allow the optical monitoring of neurotransmitter release in a manner that has many advantages over electrophysiology. Apart from the greatly improved spatial resolution, optical recording has the additional advantage of allowing the recording of transmitter release from many distinguishable sites simultaneously. Furthermore, the optical plane of focus is easier to maintain or correct during long recording series than is the repositioning of an intracellular sharp microelectrode. 
In summary, a method for imaging of Ca2+ fluorescence is outlined which details the preparation of tissue, and the acquisition and analysis of data. We outline the use of several scripts for the analysis of such Ca2+ transients.

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Details methods for high-resolution Ca2+ imaging of smooth muscle within isolated organs, including: preparation of the tissue, image acquisition and data analysis.

Odak Ca 2 +</supDüz kas> Geçici Algılama

Ca2+ imaging of smooth muscle provides insight into cellular mechanisms that may not result in changes of membrane potential, such as the release of Ca2+ ...

Biyoloji

Exploring Arterial Smooth Muscle Kv7 Potassium Channel Function using Patch Clamp Electrophysiology and Pressure Myography

Contraction or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries determines the artery diameter and thereby controls flow of blood through the vessel and contributes to systemic blood pressure. The contraction process is regulated primarily by cytosolic calcium concentration ([Ca2+]cyt), which is in turn controlled by a variety of ion transporters and channels. Ion channels are common intermediates in signal transduction pathways activated by vasoactive hormones to effect vasoconstriction or vasodilation. And ion channels are often targeted by therapeutic agents either intentionally (e.g. calcium channel blockers used to induce vasodilation and lower blood pressure) or unintentionally (e.g. to induce unwanted cardiovascular side effects).
Kv7 (KCNQ) voltage-activated potassium channels have recently been implicated as important physiological and therapeutic targets for regulation of smooth muscle contraction. To elucidate the specific roles of Kv7 channels in both physiological signal transduction and in the actions of therapeutic agents, we need to study how their activity is modulated at the cellular level as well as evaluate their contribution in the context of the intact artery.
The rat mesenteric arteries provide a useful model system. The arteries can be easily dissected, cleaned of connective tissue, and used to prepare isolated arterial myocytes for patch clamp electrophysiology, or cannulated and pressurized for measurements of vasoconstrictor/vasodilator responses under relatively physiological conditions. Here we describe the methods used for both types of measurements and provide some examples of how the experimental design can be integrated to provide a clearer understanding of the roles of these ion channels in the regulation of vascular tone.

Measurements of Kv7 (KCNQ) potassium channel activity in isolated arterial myocytes (using patch clamp electrophysiological techniques) in parallel with measurements of constrictor/dilator responses (using pressure myography) can reveal important information about the roles of Kv7 channels in vascular smooth muscle physiology and pharmacology.

Patch Clamp Elektrofizyoloji ve Basınç kasılmaların kâğıda çizilmesi kullanarak arteriyel düz kas KV7 Potasyum Kanal Fonksiyon Exploring

Contraction  or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries  determines the artery diameter and thereby controls flow of ...

Evaluation of Muscle Function of the Extensor Digitorum Longus Muscle Ex vivo and Tibialis Anterior Muscle In situ in Mice

Body movements are mainly provided by mechanical function of skeletal muscle. Skeletal muscle is composed of numerous bundles of myofibers that are sheathed by intramuscular connective tissues. Each myofiber contains many myofibrils that run longitudinally along the length of the myofiber. Myofibrils are the contractile apparatus of muscle and they are composed of repeated contractile units known as sarcomeres. A sarcomere unit contains actin and myosin filaments that are spaced by the Z discs and titin protein. Mechanical function of skeletal muscle is defined by the contractile and passive properties of muscle. The contractile properties are used to characterize the amount of force generated during muscle contraction, time of force generation and time of muscle relaxation. Any factor that affects muscle contraction (such as interaction between actin and myosin filaments, homeostasis of calcium, ATP/ADP ratio, etc.) influences the contractile properties. The passive properties refer to the elastic and viscous properties (stiffness and viscosity) of the muscle in the absence of contraction. These properties are determined by the extracellular and the intracellular structural components (such as titin) and connective tissues (mainly collagen) 1-2. The contractile and passive properties are two inseparable aspects of muscle function. For example, elbow flexion is accomplished by contraction of muscles in the anterior compartment of the upper arm and passive stretch of muscles in the posterior compartment of the upper arm. To truly understand muscle function, both contractile and passive properties should be studied.
The contractile and/or passive mechanical properties of muscle are often compromised in muscle diseases. A good example is Duchenne muscular dystrophy (DMD), a severe muscle wasting disease caused by dystrophin deficiency 3. Dystrophin is a cytoskeletal protein that stabilizes the muscle cell membrane (sarcolemma) during muscle contraction 4. In the absence of dystrophin, the sarcolemma is damaged by the shearing force generated during force transmission. This membrane tearing initiates a chain reaction which leads to muscle cell death and loss of contractile machinery. As a consequence, muscle force is reduced and dead myofibers are replaced by fibrotic tissues 5. This later change increases muscle stiffness 6. Accurate measurement of these changes provides important guide to evaluate disease progression and to determine therapeutic efficacy of novel gene/cell/pharmacological interventions. Here, we present two methods to evaluate both contractile and passive mechanical properties of the extensor digitorum longus (EDL) muscle and the contractile properties of the tibialis anterior (TA) muscle.

Evaluation of Muscle Function of the Extensor Digitorum Longus Muscle Ex vivo and Tibialis Anterior Muscle In situ in Mice

Changes in limb muscle contractile and passive mechanical properties are important biomarkers for muscle diseases. This manuscript describes physiological assays to measure these properties in the murine extensor digitorum longus and tibialis anterior muscles.

Ekstansör digitorum longus kas ve kas Fonksiyonunun Değerlendirilmesi<em&gt; Ex vivo</em&gt; Ve tibialis anterior kas<em&gt; Yerinde</em&gt; Farelerde

Body  movements are mainly provided by mechanical function of skeletal muscle. Skeletal  muscle is composed of numerous bundles of myofibers that are ...

Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues. While this technique has been implemented for over 100 years, the versatility, simplicity and reproducibility of this assay helps it to remain an indispensable tool for pharmacologists and physiologists alike. Tissue bath systems are available in a wide array of shapes and sizes, allowing a scientist to evaluate samples as small as murine mesenteric arteries and as large as porcine ileum &#8211; if not larger. Central to the isolated tissue bath assay is the ability to measure concentration-dependent changes to isometric contraction, and how the efficacy and potency of contractile agonists can be manipulated by increasing concentrations of antagonists or inhibitors. Even though the general principles remain relatively similar, recent technological advances allow even more versatility to the tissue bath assay by incorporating computer-based data recording and analysis software. This video will demonstrate the function of the isolated tissue bath to measure the isometric contraction of an isolated smooth muscle (in this case rat thoracic aorta rings), and share the types of knowledge that can be created with this technique. Included are detailed descriptions of aortic tissue dissection and preparation, placement of aortic rings in the tissue bath and proper tissue equilibration prior to experimentation, tests of tissue viability, experimental design and implementation, and data quantitation. Aorta will be connected to isometric force transducers, the data from which will be captured using a commercially available analog-to-digital converter and bridge amplifier specifically designed for use in these experiments. The accompanying software to this system will be used to visualize the experiment and analyze captured data.

This protocol describes the measurement of isometric contraction in an isolated smooth muscle preparation, using an isolated tissue bath system and computer-based data acquisition.

Farmakoloji Araştırma İzole Doku Banyo-uygulamalarda Düz Kas Fonksiyon Ölçümü

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues.  ...

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on changes in intracellular calcium ([Ca2+]i) and nitric oxide (NO). In order to understand how [Ca2+]i, NO and downstream molecules are handled by a blood vessel in response to vasoconstrictors and vasodilators, we developed a novel technique that applies calcium-labeling (or NO-labeling) dyes with two photon microscopy to measure calcium handling (or NO production) in isolated blood vessels. Described here is a detailed step-by-step procedure that demonstrates how to isolate an aorta from a rat, label calcium or NO within the endothelial or smooth muscle cells, and image calcium transients (or NO production) using a two photon microscope following physiological or pharmacological stimuli. The benefits of using the method are multi-fold: 1) it is possible to simultaneously measure calcium transients in both endothelial cells and smooth muscle cells in response to different stimuli; 2) it allows one to image endothelial cells and smooth muscle cells in their native setting; 3) this method is very sensitive to intracellular calcium or NO changes and generates high resolution images for precise measurements; and 4) described approach can be applied to the measurement of other molecules, such as reactive oxygen species. In summary, application of two photon laser emission microscopy to monitor calcium transients and NO production in the endothelial and smooth muscle cells of an isolated blood vessel has provided high quality quantitative data and promoted our understanding of the mechanisms regulating vascular function.

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Vascular cell functiondepends on activity of intracellular messengers. Described here is an ex vivo two photon imaging method that allows the measurement of intracellular calcium and nitric oxide levels in response to physiological and pharmacological stimuli in individual endothelial and smooth muscle cells of an isolated aorta.

Hücre içi Ca İki foton Görüntüleme<sup&gt; 2+</sup&gt; Bir İzole Sıçan Aort Kullanım ve Endotel Nitrik Oksit Üretimi ve düz kas hücreleri

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

İzolasyon ve Fare aort endotel hücreleri İlköğretim Kültür

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs from the coronary circulation. Hearts with intact aortic arches were removed and perfused via retrograde Langendorff with digestion solution containing 300 Units/ml of collagenase type II, 0.1 mg/ml soybean trypsin inhibitor and 1 M CaCl2. The perfusates were collected at 15 min intervals for 90 min, pelleted by centrifugation, resuspended in plating media, and plated on tissue culture dishes. VSMCs were characterized by presence of SM22&#945;, &#945;-SMA, and vimentin. One of the main advantages of using this technique is the ability to isolate VSMCs from the coronary circulation of mice. Although the small number of cells obtained can limit some of the applications for which the cells can be utilized, isolated coronary VSMCs can be used in a variety of well-established cell culture techniques and assays. Studies investigating VSMCs from genetically modified mice can provide further information about structure-function and signaling processes associated with vascular pathologies.

The purpose of this protocol is to demonstrate the isolation and culture techniques of murine primary vascular smooth muscle cells (VSMCs) from the coronary circulation. Once VSMCs have been isolated, they can be used for many standard culture techniques.

Murin Koroner Damar düz kas hücrelerinin izolasyonu

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

Measuring Proliferation of Vascular Smooth Muscle Cells Using Click Chemistry

The ability of a cell to proliferate is integral to the normal function of most cells, and dysregulation of proliferation is at the heart of many disease processes. For these reasons, measuring proliferation is a common tool used to assess cell function. Cell proliferation can be measured simply by counting; however, this is an indirect means of measuring proliferation. One common means of directly detecting cells preparing to divide is by incorporation of labeled nucleoside analogs. These include the radioactive nucleoside analog 3H-thymidine plus non-radioactive nucleoside analogs such as 5-bromo-2&#8217; deoxyuridine (BrdU) and 5-ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine (EdU). Incorporation of EdU is detected by click chemistry, which has several advantages when compared to BrdU. In this report, we provide a protocol for measuring proliferation by the incorporation of EdU. This protocol includes options for various readouts, along with the advantages and disadvantages of each. We also discuss places where the protocol can be optimized or altered to meet the specific needs of the experiment planned. Finally, we touch on the ways that this basic protocol can be modified for measuring other cell metabolites.

Proliferation is a critical part of cellular function, and a common readout used to assess potential toxicity of new drugs. Measuring proliferation is, therefore, a frequently used assay in cell biology. Here we present a simple, versatile method of measuring proliferation that can be used in adherent and non-adherent cells.

Click Kimya kullanarak Vasküler Düz Kas Hücrelerinin Çoğalmasını Ölçme

The ability of a cell to proliferate is integral to the normal function of most cells, and dysregulation of proliferation is at the heart of many disease ...

In vivo Measurement of Knee Extensor Muscle Function in Mice

Skeletal muscle plasticity in response to countless conditions and stimuli mediates concurrent functional adaptation, both negative and positive. In the clinic and the research laboratory, maximal muscular strength is widely measured longitudinally in humans, with knee extensor musculature the most reported functional outcome. Pathology of the knee extensor muscle complex is well documented in aging, orthopedic injury, disease, and disuse; knee extensor strength is closely related to functional capacity and injury risk, underscoring the importance of reliable measurement of knee extensor strength. Repeatable, in vivo assessment of knee extensor strength in pre-clinical rodent studies offers valuable functional endpoints for studies exploring osteoarthritis or knee injury. We report an in vivo and non-invasive protocol to repeatedly measure isometric peak tetanic torque of the knee extensors in mice across time. We demonstrate consistency using this novel method to measure knee extensor strength with repeated assessment in multiple mice producing similar results.

Quantification of knee extensor maximal strength is imperative to understand functional adaptations to aging, disease, injury, and rehabilitation. We present a novel method to repeatedly measure in vivo knee extension isometric peak tetanic torque.

Farelerde Diz Ekstensör Kas fonksiyonunun in vivo ölçümü

Skeletal muscle plasticity in response to countless conditions and stimuli mediates concurrent functional adaptation, both negative and positive. In the ...

Isolation of Primary Patient-specific Aortic Smooth Muscle Cells and Semiquantitative Real-time Contraction Measurements In Vitro

Smooth muscle cells (SMCs) are the predominant cell type in the aortic media. Their contractile machinery is important for the transmission of force in the aorta and regulates vasoconstriction and vasodilation. Mutations in genes encoding for the SMC contractile apparatus proteins are associated with aortic diseases, such as thoracic aortic aneurysms. Measuring SMC contraction in vitro is challenging, especially in a high-throughput manner, which is essential for screening patient material. Currently available methods are not suitable for this purpose. This paper presents a novel method based on electric cell-substrate impedance sensing (ECIS). First, an explant protocol is described to isolate patient-specific human primary SMCs from aortic biopsies and patient-specific human primary dermal fibroblasts for the study of aortic aneurysms. Next, a detailed description of a new contraction method is given to measure the contractile response of these cells, including the subsequent analysis and suggestion for comparing different groups. This method can be used to study the contraction of adherent cells in the context of translational (cardiovascular) studies and patient and drug screening studies.

Isolation of Primary Patient-specific Aortic Smooth Muscle Cells and Semiquantitative Real-time Contraction Measurements In Vitro

This paper describes an explant culture-based method for the isolation and culturing of primary, patient-specific human aortic smooth muscle cells and dermal fibroblasts. Furthermore, a novel method is presented for measuring cell contraction and subsequent analysis, which can be used to study patient-specific differences in these cells.

Primer Hastaya Özgü Aort Düz Kas Hücrelerinin İzolasyonu ve Yarı Kantitatif Gerçek Zamanlı Kasılma Ölçümleri In Vitro

Smooth muscle cells (SMCs) are the predominant cell type in the aortic media. Their contractile machinery is important for the transmission of force in ...