Jill Osborne&#39;a emülsifikasyon prosesi üzerine zemin hazırlama çalışmaları ve teknik destek için Lauren Wilkinson&#39;a teşekkür ediyoruz. Dr. Igor Laçik, Dr. Timothy J. Kieffer ve Dr. James D. Johnson&#39;a girdileri ve işbirlikleri için teşekkür ediyoruz. Diabète Québec, JDRF, ThéCell, CQMF Merkezi, Doğal Bilimler ve Mühendislik Araştırma Konseyi (NSERC), İnsan Isleti Transplantasyonu Merkezi ve Beta Hücre Yenilenmesi Merkezi, Kanadalı Kök Hücre Ağı, Kanada Kök Hücre Şebekesi, Michael Smith Sağlık Araştırmaları Vakfı, mali yardım için COST 865 ve doğa koruma teknolojileri le Fonds québécois de la recherche sur la nature.

1. Aljinat Solüsyonunu, CaCO 3 Süspansiyonu ve Asitlenmiş Yağı&#39;yı hazırlayın <ol><li> İşlem tamponu ve ortamını hazırlayın. <ol><li> 10 mM HEPES, 170 mM NaCl kullanarak yüksek konsantrasyonlu aljinat boncukları oluşturmak için kullanılan tipik işlem tamponunu hazırlayın. PH&#39;ı 7.4&#39;e ayarlayın. </li><li> Tipik kültür ortamı,% 10 fetal sığır serumu (FBS), 6 mM glutamin, 100 U / mL penisilin ve 100 mg / mL streptomisin içeren Dulbecco Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) ile hazırlayın. </li></ol></li><li> Aljinat stok solüsyonunu, boncuklardaki nihai arzu edilen konsantrasyonun 1,17 katı olacak şekilde hazırlayın. <ol><li> İlk olarak, uygun miktarda aljinat tozu tartın. Örneğin, 50:50 LVM ve MVG alginat ile% 5 aljinat nihai konsantrasyonunu elde etmek için, 0.583 g LVM aljinat tozu ve 0.583 g MVG aljinat tozunu birleştirerek toplam 1.17 g sodyum aljinat tartın. </li><li> 20 mL işlem tamponunu otoklav içine yerleştirinManyetik bir karıştırma plakası üzerinde yıkanabilir cam kavanoz ve ~ 200 rpm&#39;de çalkalandı. Sodyum alginat tozunu aşamalı olarak çözeltiye ilave edin. </li><li> Çözeltiyi gece boyunca düşük bir hızda karıştırmaya bırakın. Gerekirse, şişeyi karıştırma plakasına sabitleyin. </li><li> Çözelti tam olarak çözülürse şişeyi bir döner mikser üzerine tutturun ve 24 saat daha 37 ° C&#39;de karıştırmaya devam edin. </li><li> Aljinat solüsyonunu, yarım dolmadan daha az olan bir kapta 30 dakika süreyle otoklavlayarak sterilize edin. Çözümü almadan önce sıcaklığın 60 ° C&#39;nin altına düşmesine izin verin. </li><li> Gerekirse, viskozite yeterince düşük kaldığı sürece, aljinat solüsyonunu oda sıcaklığına ulaşmadan önce otoklavlamadan kısa bir süre filtreleyerek parçacıkları çıkarın. </li></ol></li><li> İç jelleşme için istenen son konsantrasyonun 21 katında kalsiyum karbonat süspansiyonu hazırlayın. <ol><li> CaCO 3 tozunu tartın. Örneğin, reklamD 1 g CaCO3 ila 20 mL işlem tamponu ile son jelleştirici madde konsantrasyonu olarak 24 mM CaCO3 elde edildi. </li><li> CaCO 3 süspansiyonunu 30 dakika süreyle otoklavlayın. NOT: CaCO 3 konsantrasyonu, bikarbonat-CO 2 dengesine bağlı olarak zamanla değişecektir. 10&#39;dan fazla kapsülleme prosedürü için aynı stok CaCO 3 süspansiyonunu kullanmaktan kaçının. </li></ol></li><li> Emülsiyonlaşma işlemi için kullanılan karıştırılmış tekneyi otoklavlayın. Kullanmadan önce, döndürücü şişede kalan yoğunlaşmış su izlerini kaldırın. </li><li> Emülsiyon haline getirme işleminden hemen önce asitlendirilmiş yağ hazırlayın. 50 mL konik tüp içine yerleştirilen 11 mL mineral yağı başına 44 μL asetik asit çözündürün. NOT: Genel bir hata, asetik asidin tam olarak çözülmesidir. Az miktarda asetik asit pipetle atmaktan kaçının ve asetik asitin tekrarlanan vorteksleme ile yağda tamamen çözünmesini sağlayın. DİKKAT: asetik asit toksiktir.<html> D uçucu asit. Bu reaktifi duman kaputunun altında tutun ve asetik asit / yağ solüsyonunu emülsifikasyon aşamasına gelinceye kadar kapalı bir kapta tutun. Daha fazla bilgi için bu reaktife ilişkin MSDS bilgilerine bakın. </li><li> Tüm çözümlerin hücre kapsüllemeye geçmeden önce oda sıcaklığına ulaşmasına izin verin. </li></ol> 2. Aljinat Boncuk Üretimi, Emülsifikasyon ve İç Jelasyon ile <ol><li> 10 mL hafif madeni yağ spinner şişesine yerleştirin ve düşük devir hızında (bu videoda kullanılan spinner şişesi için 250 dev / dak) ajitasyona başlayın. </li><li> Proses için kullanılan hücreler yapışık kültürlerden kaynaklanıyorsa, hücreleri askıya almak için tripsin uygulayın. FBS içeren ortam veya tripsin önleyicisi ekleyerek reaksiyonu durdurun ve hücre sayımı için bir numune toplayın. <ol><li> Daha önce tarif edildiği gibi bir hemositometre veya otomatik bir hücre sayacı kullanarak Tripan mavisi lekelenmesinden sonra hücre konsantrasyonunu ve yaşayabilirliğini belirleyinEşek = &quot;xref&quot;&gt; 32. </li></ol></li><li> Hücreleri 300 xg&#39;de 7 dakika boyunca santrifüjleyin ve hücre immobilizasyonu için arzu edilen ortamda bir kez yıkayın. Bu ortamın, FBS veya sığır serum albümini (BSA) gibi emülsiyon yapıcılar içerdiğinden emin olun. Örneğin,% 10 FBS içeren DMEM kullanın. </li><li> Boncuklarda istenilen nihai konsantrasyonun 10.5 misli elde etmek için hücre ortamını aynı ortamda tekrar süspanse edin. </li><li> 1.1 mL, 10.5 kat konsantre hücre stoğu, 9.9 mL aljinat solüsyonuna ilave edin. Ardından CaCO 3 süspansiyonundan 550 μL ekleyin ve CaCO 3&#39;ün eşit dağılımını sağlamak için steril bir spatula ile karıştırarak karıştırın. </li><li> Alginat, hücre ve CaCO 3 karışımının bir şırınga yardımıyla ajitasyon yağına 10.5 mL&#39;lik derhal aktarılması. NOT: Yüksek derecede yapışkan solüsyonlar için, havadaki kabarcıkları önlemek için karışımı aspire edin ve yavaşça çekin. Bazı durumlarda, ajiteyi önlemek için karışıma şişeyi eklerken ajitasyonun durdurulması tercih edilirAljinat sürüklenmesini çark miline yerleştirin. </li><li> Alginat, hücre ve CaCO 3 karışımını yağa ilave ettikten hemen sonra ajitasyon oranını arttırın. NOT: Burada kullanılan% 5 LVM: MVG aljinat için , in vitro kültür 35 için uygun yaklaşık 900 μm çapında boncuklar üretmek üzere 1025 rpm&#39;lik bir dönüş hızı uygulanmıştır. Daha önceki döngüler 25 , 32&#39;de açıklandığı gibi, daha yüksek dönüş hızları ve daha düşük alginat konsantrasyonları, ortalama boncuk çaplarının daha düşük olmasına yol açacaktır. Çark ve damar geometrisindeki hafif değişiklikler ve alginat özellikleri ortalama boncuk çapını büyük ölçüde etkiler. Gemi konfigürasyonundaki veya aljinat partideki her değişiklik için, yüzey alanı momenti ortalaması boncuk çapı ile dönüş hızına ilişkin standart bir eğri oluşturulmalıdır 32 . </li><li> Zamanlayıcıyı çalıştırın ve alginatı 12 dakika boyunca emülize edin. </li><li> 10 mL tEmülsiyonu asitleştirmek, CaCO 3&#39;ü eritmek ve böylece aljinatı jel haline getirilmiş boncuklara fiziksel olarak çapraz bağlamak için yağ ve asetik asit çözeltisi. Bu asitlendirme basamağı için 8 dakika bekleyin. </li></ol> 3. Boncuk Kurtarma <ol><li> Çalkalama oranını 400 rpm&#39;ye düşürün. PH&#39;ı arttırmak ve faz ters çevirmesine neden olmak için% 10 ortam ile karıştırılmış 40 mL işlem tamponu ekleyin. </li><li> 1 dakika sonra ajitasyonu durdurun ve karışımı 50 mL santrifüj tüplerine aktarın. Eğirici şişeyi ek bir 20 mL ortam ile durulayın ve tüpün içine ekleyin. Yağ fazı ile boncuk temasını en aza indirgemek için yağ fazını aspire etmeden önce döner cam şişeden mümkün olduğunca fazla sulu faz aspire. NOT: Boncukların hasar görmesini önlemek için bu adımda ve bu noktadan büyük çaplı bir pipet kullanın ( örn. 25 mL pipet). Daha küçük hacimler için boncuk süspansiyonu kesilmiş pipet uçlarıyla da manipüle edilebilir. Bu tür ipuçları elde etmek için, pipet ucunun ucunu kesilen makaslaIle göz koruması giyen. </li><li> Boncuk yerleşimini ve faz ayrımını hızlandırmak için tüpleri 630 xg&#39;de 3 dakika santrifüjleyin. </li><li> Bir Pasteur pipetiyle aspire ederek yağ ve fazla sulu çözeltiyi çıkarın. </li><li> Boncukları orta ile en az bir kez yıkayın. Boncuk süspansiyonunu 40 μm naylon hücre süzgeçleri üzerinde filtreleyin ve süzgeci altındaki boncuklarla ilişkili fazla sıvıyı aspire edin. Boncukları, steril bir spatula kullanarak bilinen bir hacim ortamına aktarın. NOT: Bu adımda hedef minimum boncuk çapına bağlı olarak daha küçük veya daha büyük gözenek boyutu filtreleri kullanılabilir. Bununla birlikte, boncukların hasar görmesini önlemek için sub-micron gözenek boyutlu filtreler ile basınca dayalı filtrasyon yerine gravite filtrasyon önerilmektedir. </li><li> İstenen boncuk elde etmek için hacim yer değiştirmesi (boncuk ekledikten sonra hacim, boncuk eklemeden önce hacim eksi) ve boncuk hacmini ölçün: genel hacim oranı, genellikle 1: 5 veya 1 mL boncuk4 mL ortam. Bu noktadan itibaren, boncuklara zarar vermemek için her zaman büyük çaplı pipetleri kullanın. </li><li> Kapsüllenmiş hücreleri , in vitro kültür veya transplantasyon deneyleri için T-flask içine aktarın. </li></ol> 4. Kalite Kontrol ve Uygulamaları NOT: kapsüllenmiş hücre ve boncuk kalitesini sağlamak için, işlemden sonra boncuk boyutu dağılımı ve hücre sağkalımı nicelenmelidir. Daha ileri analiz için boncuklardan hücreleri kurtarmak için jelin tersine çevrilmesi sıklıkla gerçekleştirilir. <ol><li> Boncuk boyut dağılımını değerlendirmek için, boncukları toluidin mavi-O ile lekeleyin. <ol><li> % 10 komple ortam içeren 4 mL işlem tamponu içine 0.5 mL boncuk yerleştirin. </li><li> İşlem tamponunda hazırlanan 1 g / L toluidin mavisi solüsyonundan 500 uL ekleyin. </li><li> 50 rpm&#39;de döner çalkalayıcıda konik bir tüp içinde 60 dakika inkübe edin. </li><li> % 10 komple ortam ve immed içeren 5 mL işlem tamponu ekleyinIaths boncukları ve çözeltiyi bir Petri kabına aktarın ve düşük büyütmeli bir mikroskopta veya el tipi bir dijital kamerayla görüntü elde edin. Gerekirse, kontrastı artırmak ve gölgeleri önlemek için el tipi bir fotoğraf makinesiyle görüntü elde etmeden önce Petri kabını hafif bir kutuya yerleştirin. </li><li> Daha önce tarif edilen 32 boncuk boyut dağılımını nicelemek için görüntü analizini gerçekleştirin, örneğin 36 görüntü analizini kullanarak. </li></ol></li><li> Niteliksel olarak hücre sağkalımını değerlendirmek için ölü hücreleri tanımlamak için etidyum homodimeri ve canlı hücreleri tanımlamak için kalsein AM&#39;yi kullanarak hücreleri lekeleyin. <ol><li> % 10 komple ortam içeren 4 hacim işlem tamponuna 1 hacim boncuk ekleyin. </li><li> Sırasıyla 4 uM ve 2 uM konsantrasyonlar elde etmek için uygun miktarda kalsein AM ve etidyum homodimer stok solüsyonları ekleyin. Bazı boncuk örneklerine reaktiflerden yalnızca birini ekleyerek tek leke kontrolü oluşturun.</li><li> Boncuklar buz üzerinde 20 dakika inkübe edin. </li><li> Çözeltiyi bir slayt ve lamel arasına, boncukların sıkışmasını önlemek için bir o-halka gibi bir boşluk kullanarak yerleştirin. </li><li> Floresan mikroskobunda ilerleyin. Floresan kanamayı değerlendirmek için tek leke kontrollerini kullanın. Kalcein AM (494/517 nm) ve DNA&#39;ya bağlı etidyum homodimeri (528/617 nm) ile ilgili uyarılma / emisyon dalga boylarına dayalı uygun floresan filtreleri seçin. </li></ol></li><li> Daha ileri analiz için hücreleri boncuklardan kurtarmak için alginatın sitrat veya başka bir kenetleme solüsyonu kullanılarak degelleştirilmesi. <ol><li> 55 mM sitrat, 10 mM HEPES ve pH 7.4&#39;de 95 mM NaCl içeren bir çözücü çözelti hazırlayın. </li><li> Bu solüsyonu% 10 orta hacimde karıştırın ve daha sonra 9 mL karışıma 1 mL aljinat boncuk ekleyin. </li><li> Boncukları, buz üzerinde, 75 rpm&#39;lik ajitasyonla 20 dakika boyunca püskürtün. NOT: Hücreler şimdi analiz için kullanılabilir veya eritilmiş aljinat çözeltisinden uzaklaştırılabilirIyonu santrifüjleme ile Örneğin, degradasyondan sonra hücre yaşayabilirliği Trypan Blue lekelemesi ile nicelleştirilebilir. Alternatif olarak, hücreler santrifüje tabi tutulabilir ve yıkanabilir, ardından mRNA, DNA ve / veya protein örnekleme ve analizi yapılabilir. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Scharp, D. W., Marchetti, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulated+islets+for+diabetes+therapy%3A+history%2C+current+progress%2C+and+critical+issues+requiring+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Encapsulated islets for diabetes therapy: history, current progress, and critical issues requiring solution.</a> Adv Drug Deliv Rev. 67-68, 35-73 (2014).</li>
<li>Chayosumrit, M., Tuch, B., Sidhu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alginate+microcapsule+for+propagation+and+directed+differentiation+of+hESCs+to+definitive+endoderm%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Alginate microcapsule for propagation and directed differentiation of hESCs to definitive endoderm.</a> Biomaterials. 31 (3), 505-514 (2010).</li>
<li>Sidhu, K., Kim, J., Chayosumrit, M., Dean, S., Sachdev, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alginate+microcapsule+as+a+3D+platform+for+propagation+and+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+%28hESC%29+to+different+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Alginate microcapsule as a 3D platform for propagation and differentiation of human embryonic stem cells (hESC) to different lineages.</a> J Vis Exp. (61), (2012).</li>
<li>Tostoes, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfusion+of+3D+encapsulated+hepatocytes--a+synergistic+effect+enhancing+long-term+functionality+in+bioreactors%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Perfusion of 3D encapsulated hepatocytes--a synergistic effect enhancing long-term functionality in bioreactors.</a> Biotechnol Bioeng. 108 (1), 41-49 (2011).</li>
<li>Duvivier-Kali, V. F., Omer, A., Parent, R. J., O'Neil, J. J., Weir, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+protection+of+islets+against+allorejection+and+autoimmunity+by+a+simple+barium-alginate+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Complete protection of islets against allorejection and autoimmunity by a simple barium-alginate membrane.</a> Diabetes. 50 (8), 1698-1705 (2001).</li>
<li>Omer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+normoglycemia+in+rats+receiving+transplants+with+encapsulated+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Long-term normoglycemia in rats receiving transplants with encapsulated islets.</a> Transplantation. 79 (1), 52-58 (2005).</li>
<li>Rayat, G. R., Rajotte, R. V., Ao, Z., Korbutt, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microencapsulation+of+neonatal+porcine+islets%3A+protection+from+human+antibody%2Fcomplement-mediated+cytolysis+in+vitro+and+long-term+reversal+of+diabetes+in+nude+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Microencapsulation of neonatal porcine islets: protection from human antibody/complement-mediated cytolysis in vitro and long-term reversal of diabetes in nude mice.</a> Transplantation. 69 (6), 1084-1090 (2000).</li>
<li>Korbutt, G. S., Mallett, A. G., Ao, Z., Flashner, M., Rajotte, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+survival+of+microencapsulated+islets+during+in+vitro+culture+and+enhanced+metabolic+function+following+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Improved survival of microencapsulated islets during in vitro culture and enhanced metabolic function following transplantation.</a> Diabetologia. 47 (10), 1810-1818 (2004).</li>
<li>Luca, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+function+of+rat+islets+upon+co-microencapsulation+with+Sertoli%27s+cells+in+alginate%2Fpoly-L-ornithine%5BTitle%5D)+AND+%22AAPS+PharmSciTech%22%5BJournal%5D)">Improved function of rat islets upon co-microencapsulation with Sertoli's cells in alginate/poly-L-ornithine.</a> AAPS PharmSciTech. 2 (3), E15(2001).</li>
<li>Omer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+and+maturation+of+microencapsulated+porcine+neonatal+pancreatic+cell+clusters+transplanted+into+immunocompetent+diabetic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Survival and maturation of microencapsulated porcine neonatal pancreatic cell clusters transplanted into immunocompetent diabetic mice.</a> Diabetes. 52 (1), 69-75 (2003).</li>
<li>Schneider, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+graft+function+of+adult+rat+and+human+islets+encapsulated+in+novel+alginate-based+microcapsules+after+transplantation+in+immunocompetent+diabetic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Long-term graft function of adult rat and human islets encapsulated in novel alginate-based microcapsules after transplantation in immunocompetent diabetic mice.</a> Diabetes. 54 (3), 687-693 (2005).</li>
<li>Cui, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+metabolic+control+of+autoimmune+diabetes+in+spontaneously+diabetic+nonobese+diabetic+mice+by+nonvascularized+microencapsulated+adult+porcine+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Long-term metabolic control of autoimmune diabetes in spontaneously diabetic nonobese diabetic mice by nonvascularized microencapsulated adult porcine islets.</a> Transplantation. 88 (2), 160-169 (2009).</li>
<li>Krishnan, R., Alexander, M., Robles, L., Foster, C. E. 3rd, Lakey, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+and+stem+cell+encapsulation+for+clinical+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Diabet+Stud%22%5BJournal%5D)">Islet and stem cell encapsulation for clinical transplantation.</a> Rev Diabet Stud. 11 (1), 84-101 (2014).</li>
<li>Robles, L., Storrs, R., Lamb, M., Alexander, M., Lakey, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+status+of+islet+encapsulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Current status of islet encapsulation.</a> Cell Transplant. 23 (11), 1321-1348 (2014).</li>
<li>Desai, T., Shea, L. D. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/nrd/journal/v16/n5/full/nrd.2016.232.html">Advances in islet encapsulation technologies.</a> Nat Rev Drug Discov. , (2016).</li>
<li>Anilkumar, A. V., Lacik, I., Wang, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+reactor+for+making+uniform+capsules%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">A novel reactor for making uniform capsules.</a> Biotechnol Bioeng. 75 (5), 581-589 (2001).</li>
<li>Wolters, G. H., Fritschy, W. M., Gerrits, D., van Schilfgaarde, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+alginate+droplet+generator+applicable+for+microencapsulation+of+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Biomater%22%5BJournal%5D)">A versatile alginate droplet generator applicable for microencapsulation of pancreatic islets.</a> J Appl Biomater. 3 (4), 281-286 (1991).</li>
<li>Heinzen, C., Marison, I., Berger, A., von Stockar, U. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/228747123_Use_of_Vibration_Technology_for_Jet_Break-Up_for_Encapsulation_of_Cells_and_Liquids_in_Monodisperse_Microcapsules">Use of vibration technology for jet break-up for encapsulation of cells, microbes and liquids in monodisperse microcapsules.</a> Practical Aspects of Encapsulation Technologies. , 19-25 (2002).</li>
<li>Poncelet, D., et al. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/226582802_A_Parallel_Plate_Electrostatic_Droplet_Generator_Parameters_Affecting_Microbead_Size">A Parallel plate electrostatic droplet generator: Parameters affecting microbead size.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 42 (2-3), 251-255 (1994).</li>
<li>Prüße, U., Dalluhn, J., Breford, J., Vorlop, K. D. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/243803372_Production_of_Spherical_Beads_by_JetCutting">Production of Spherical Beads by JetCutting.</a> Chemical Engineering & Technology. 23 (12), 1105-1110 (2000).</li>
<li>Hoesli, C. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Bioprocess+development+for+the+cell-based+treatment+of+diabetes+%28+%29%22">Bioprocess development for the cell-based treatment of diabetes (PhD thesis)</a>. , University of British Columbia. (2010).</li>
<li>Brandenberger, H., Widmer, F. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0168165698000777">A new multinozzle encapsulation/immobilisation system to produce uniform beads of alginate.</a> J Biotechnol. 63 (1), 73-80 (1998).</li>
<li>Merani, S., Toso, C., Emamaullee, J., Shapiro, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+implantation+site+for+pancreatic+islet+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Surg%22%5BJournal%5D)">Optimal implantation site for pancreatic islet transplantation.</a> Br J Surg. 95 (12), 1449-1461 (2008).</li>
<li>Reis, C. P., Neufeld, R. J., Vilela, S., Ribeiro, A. J., Veiga, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+and+current+status+of+emulsion%2Fdispersion+technology+using+an+internal+gelation+process+for+the+design+of+alginate+particles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microencapsul%22%5BJournal%5D)">Review and current status of emulsion/dispersion technology using an internal gelation process for the design of alginate particles.</a> J Microencapsul. 23 (3), 245-257 (2006).</li>
<li>Poncelet, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+alginate+beads+by+emulsification%2Finternal+gelation.+I.+Methodology%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Microbiol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Production of alginate beads by emulsification/internal gelation. I. Methodology.</a> Appl Microbiol Biotechnol. 38 (1), 39-45 (1992).</li>
<li>Poncelet, D., et al. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/BF00164768">Production of alginate beads by emulsification/internal gelation. II. Physicochemistry.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 43 (4), 644-650 (1995).</li>
<li>Alexakis, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microencapsulation+of+DNA+within+alginate+microspheres+and+crosslinked+chitosan+membranes+for+in+vivo+application%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Biochem+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Microencapsulation of DNA within alginate microspheres and crosslinked chitosan membranes for in vivo application.</a> Appl Biochem Biotechnol. 50 (1), 93-106 (1995).</li>
<li>Vandenberg, G. W., De La Noue, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+protein+release+from+chitosan-alginate+microcapsules+produced+using+external+or+internal+gelation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microencapsul%22%5BJournal%5D)">Evaluation of protein release from chitosan-alginate microcapsules produced using external or internal gelation.</a> J Microencapsul. 18 (4), 433-441 (2001).</li>
<li>Silva, C. M., Ribeiro, A. J., Figueiredo, I. V., Goncalves, A. R., Veiga, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alginate+microspheres+prepared+by+internal+gelation%3A+development+and+effect+on+insulin+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Pharm%22%5BJournal%5D)">Alginate microspheres prepared by internal gelation: development and effect on insulin stability.</a> Int J Pharm. 311 (1-2), 1-10 (2006).</li>
<li>Larisch, B. C., Poncelet, D., Champagne, C. P., Neufeld, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microencapsulation+of+Lactococcus+lactis+subsp.+cremoris%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microencapsul%22%5BJournal%5D)">Microencapsulation of Lactococcus lactis subsp. cremoris.</a> J Microencapsul. 11 (2), 189-195 (1994).</li>
<li>Hoesli, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversal+of+diabetes+by+betaTC3+cells+encapsulated+in+alginate+beads+generated+by+emulsion+and+internal+gelation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res+B+Appl+Biomater%22%5BJournal%5D)">Reversal of diabetes by betaTC3 cells encapsulated in alginate beads generated by emulsion and internal gelation.</a> J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 100 (4), 1017-1028 (2012).</li>
<li>Hoesli, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+cell+immobilization+in+alginate+beads+produced+by+emulsion+and+internal+gelation%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Pancreatic cell immobilization in alginate beads produced by emulsion and internal gelation.</a> Biotechnol Bioeng. 108 (2), 424-434 (2011).</li>
<li>Reinsel, M. A., Borkowski, J. J., Sears, J. T. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/je00015a026">Partition Coefficients for Acetic, Propionic, and Butyric Acids in a Crude Oil/Water System.</a> Journal of Chemical & Engineering Data. 39 (3), 513-516 (1994).</li>
<li>Xiu-Dong, L., Wei-Ting, Y., Jun-Zhang, L., Xiao-Jun, M., Quan, Y. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/229223488_Diffusion_of_Acetic_Acid_Across_OilWater_Interface_in_Emulsification-Internal_Gelation_Process_for_Preparation_of_Alginate_Gel_Beads">Diffusion of acetic acid across oil/water interface in emulsification-internal gelation process for preparation of alginate gel beads.</a> Chemical Research in Chinese Universities. 23 (5), 579-584 (2007).</li>
<li>Fernandez, S. A., et al. Emulsion-based islet encapsulation: predicting and overcoming islet hypoxia. Bioencapsulation Innovations. (220), 14-15 (2014).</li>
<li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellProfiler%3A+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biol. 7 (10), R100(2006).</li>
<li>Hinze, J. O. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/aic.690010303/abstract">Fundamentals of the hydrodynamic mechanism of splitting in dispersion processes.</a> AIChE Journal. 1 (3), 289-295 (1955).</li>
<li>Kolmogorov, A. N. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/chapter/10.1007%2F978-94-011-3030-1_50">On the breakage of drops in a turbulent flow (translated from Russian).</a> Doklady Akademii Nauk. 66, 825-828 (1949).</li>
<li>Davies, J. T. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/244114023_Drop_Sizes_of_Emulsions_Related_to_Turbulent_Energy_Dissipation_Rates">Drop Sizes of Emulsions Related to Turbulent Energy-Dissipation Rates.</a> Chemical Engineering Science. 40 (5), 839-842 (1985).</li>
<li>Pacek, A. W., Chamsart, S., Nienow, A. W., Bakker, A. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0009250999001566">The influence of impeller type on mean drop size and drop size distribution in an agitated vessel.</a> Chemical Engineering Science. 54 (19), 4211-4222 (1999).</li>
<li>Steiner, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0009250906002673">Numerical simulation and experimental study of emulsification in a narrow-gap homogenizer.</a> Chemical Engineering Science. 61 (17), 5841-5855 (2006).</li>
<li>Tcholakova, S., Denkov, N. D., Lips, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+solid+particles%2C+globular+proteins+and+surfactants+as+emulsifiers%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Chem+Chem+Phys%22%5BJournal%5D)">Comparison of solid particles, globular proteins and surfactants as emulsifiers.</a> Phys Chem Chem Phys. 10 (12), 1608-1627 (2008).</li>
<li>Lagisetty, J. S., Das, P. K., Kumar, R., Gandhi, K. S. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0009250986851983">Breakage of viscous and non-Newtonian drops in stirred dispersions.</a> Chemical Engineering Science. 41 (1), 65-72 (1986).</li>
<li>Draget, K. I., Ostgaard, K., Smidsrod, O. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/014486179090028Q">Homogeneous Alginate Gels - a Technical Approach.</a> Carbohydrate Polymers. 14 (2), 159-178 (1990).</li>
<li>Poncelet, D., Dulieu, C., Jacquot, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPoncelet%2C+D+%22Immobilized+Cells%22">Immobilized Cells</a>. Wijffels, R. H. , Springer. Berlin Heidelberg. 15-30 (2001).</li>
<li>Islam, A. W., Zavvadi, A., Kabadi, V. N. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/271038379_Analysis_of_Partition_Coefficients_of_Ternary_Liquid-Liquid_Equilibrium_Systems_and_Finding_Consistency_Using_Uniquac_Model">Analysis of Partition Coefficients of Ternary Liquid-Liquid Equilibrium Systems and Finding Consistency Using Uniquac Model.</a> Chemical and Process Engineering-Inzynieria Chemiczna I Procesowa. 33 (2), 243-253 (2012).</li>
<li>Quong, D., Neufeld, R. J., Skjak-Braek, G., Poncelet, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((External+versus+internal+source+of+calcium+during+the+gelation+of+alginate+beads+for+DNA+encapsulation%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">External versus internal source of calcium during the gelation of alginate beads for DNA encapsulation.</a> Biotechnol Bioeng. 57 (4), 438-446 (1998).</li>
<li>De Vos, P., De Haan, B. J., Van Schilfgaarde, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Upscaling+the+production+of+microencapsulated+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Upscaling the production of microencapsulated pancreatic islets.</a> Biomaterials. 18 (16), 1085-1090 (1997).</li>
<li>Gross, J. D., Constantinidis, I., Sambanis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+of+encapsulated+cell+systems%5BTitle%5D)+AND+%22J+Theor+Biol%22%5BJournal%5D)">Modeling of encapsulated cell systems.</a> J Theor Biol. 244 (3), 500-510 (2007).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

İç jelleşme reaksiyonu sırasında çeşitli adımlar ( Şekil 2&#39;de gösterilmektedir) genel kinetiği sınırlayabilir. ~ 2.5 μm&#39;den büyük kalsiyum karbonat taneleri için karbonat çözünme hızı sınırlayıcı 26 , 44 olduğu gösterilmiştir. Dahili kalsiyum salınımına yol açan asitlendirme basamağının, hücre sağkalımını etkileyen kritik süreç değişkeni olduğu gösterilmiştir 32 . Do...

Memeli hücre kapsüllemesi, transplante edilen hücreleri immün rejeksiyon 1&#39;den korumak veya immobilize edilmiş hücre kültürü 2 , 3 , 4 için üç boyutlu bir destek sağlamak için bir araç olarak geniş olarak incelenmiştir. Aljinat boncuklardaki pankreatik adacık kapsüllemesi allogeneik 5 , 6 veya ksenogeneik 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 kemirgenlerde diyabetin tersine çevrilmesi için kullanılmıştır. Tip 1 diyabet tedavisinde kapsüllenmiş pankreatik adacık transplantasyonunun klinik öncesi ve klinik çalışmaları devam ediyor 13 , 14 , 15 . Transplantasyon uygulamaları veya daha büyük ölçekliİn vitro immobilize hücre üretimi, meme esaslı boncuk jeneratörleri genellikle kullanılır. Tipik olarak, alginat ve hücrelerin bir karışımı, bir damlacıkları oluşturmak üzere bir memeden pompalanır ve damlacıkların dış jelasyonuyla sonuçlanan, iki değerlikli katyonlar içeren karıştırılmış bir solüsyona düşer. Eş eksenli gaz akışı 16 , 17 , nozul titreşimi 18 , elektrostatik itme 19 veya dönen teller 20 , meme ucunda damlacık oluşumunu kolaylaştırır. Geleneksel boncuk jeneratörlerinin temel dezavantajları, sınırlı üretim ve yeterli boncuk oluşumuna neden olacak sınırlı çözelti viskozitesi aralığıdır 21 . Yüksek akış hızlarında, memeden çıkan sıvı, meme çapından daha küçük damlalar halinde parçalanır ve boyut kontrolü azalır. Verimi artırmak için çoklu nozullu boncuk jeneratörleri kullanılabilir, ancakMemelerin arasındaki akışın tekdüze dağılımı ve&gt; 0.2 Pas çözeltilerin kullanımı problemlidir 22 . Son olarak, nozul esaslı cihazların hepsinin adacıklara bir miktar zarar vermesi beklenir, çünkü kullanılan memelerin çapı 100 um ila 500 um arasında iken insan adacıklarının ~% 15&#39;i 200 um 23&#39;den büyük olabilir. Bu videoda, damla damla yerine tek bir emülsifikasyon adımında damlacıkları oluşturarak memeli hücrelerini kapsüllemek için alternatif bir yöntem tarif ediyoruz. Boncuk üretimi basit bir karıştırma teknesinde yapıldığından, yöntem, düşük ekipman maliyetleri ile küçük (~ 1 mL) ila büyük ölçekli (10 3 L aralıklı) boncuk üretimi için uygundur 24 . Bu yöntem, boncuk oluşum süreleri kısa ( örneğin 20 dakika) olan geniş bir aljinat viskoziteleri aralığında yüksek küreselliklü boncuk üretimine olanak tanır. Bu yöntem başlangıçta Poncelet ve ark. Tarafından geliştirildi.l. 25 , 26&#39;ya bağlanır ve DNA 27&#39;yi , insülin 29&#39;u içeren proteinleri 28 ve bakterileri 30 hareketsiz hale getirir. Son zamanlarda bu yöntemleri pankreas beta hücre hatları 31 , 32 ve primer pankreatik doku 32 kullanarak memeli hücrelerinin kapsüllenmesine uyarladık. Yöntemin prensibi, mineral yağı içerisindeki alginat damlalarından oluşan bir yağ içinde su emülsiyonu üretmek ve bunu takiben aljinat damlacıklarının iç jelleştirilmesini sağlamaktır ( Şekil 1 ). Önce, kapsülleyici ( örn., Hücreler), başlangıçtaki işlem pH&#39;sında düşük çözünürlük ile ince taneli bir kalsiyum tuzu içeren bir aljinat solüsyonuna dağıtılır. Ardından alginat karışımı, bir emülsiyon oluşturmak üzere, genellikle biryüzey aktif madde. Memeli hücre kapsüllemesi durumunda, serumda bulunan bileşenler yüzey aktif maddeler olarak görev yapabilir. Daha sonra, pH, sulu faza bölünen yağda çözünür bir asit ilave ederek kalsiyum tuzunu çözündürmek için indirgenir. Mineral yağ / su bölme katsayısı &lt;0.005 33 olan asetik asit yağda önceden çözülmüş, daha sonra yağ fazında karıştırıldığı emülsiyona ilave edilmeli ve sulu faza 34 hızla bölünmelidir. Şekil 2 , asitleştirme ve iç jelasyon adımında gerçekleşen kimyasal reaksiyonları ve difüzyonu göstermektedir. Son olarak, kapsüllenmiş hücreler, faz ters çevirme, faz ayrımı, santrifüjleme, tekrarlanan yıkama adımları ve filtrasyon ile hızlandırılarak toplanır. Bu aşamalardan sonra, kalite kontrol analizleri, in vitro hücre kültürü ve / veya kapsüllenmiş hücrelerin transplantasyonu için boncuk ve hücre örneklemesi yapılabilir. Şekil 1: Memeli hücreleri kapsüllemek için emülsifikasyona dayalı sürecin şematik. Boncuklar önce bir aljinat, hücre ve CaCO3 karışımının mineral yağı içerisinde emülsiyon haline getirilmesi (şemada adım 1 ve 2) ile üretilir ve asetik asit (adım 3) ilave edilerek iç jelleşmeye başlar. Daha sonra jel haline getirilmiş boncuklar, faz ters çevirme tetikleyicisine sulu bir tampon eklenerek (basamak 4), ardından santrifüj ve yağ aspirasyonu (basamak 5) ve daha sonra süzme (adım 6) vasıtasıyla yağdan ayrılır. Son olarak, filtre üzerinde toplanan boncuklar , in vitro kültür veya transplantasyon için hücre kültür ortamına aktarılır. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55280/55280fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <imgAlt = &quot;Şekil 2&quot; class = &quot;xfigimg&quot; src = &quot;/ dosyalar / ftp_upload / 55280 / 55280fig2.jpg&quot; /&gt; Şekil 2: İç jelleşme sırasında oluşan reaksiyonlar ve difüzyon basamakları. (1) Asetik asit organik faza eklenir ve konveksiyon ile aljinat damlacıklarına taşınır. (2) Asetik asit sulu faza bölünür. (3) Suyun bulunduğu yerde asit, dağılmakta ve koyu mavi renkte tasvir edilen CaCO 3 tanelerine ulaşmak için dağılmaktadır. (4) H + iyonları, Ca 2+ iyonlarını salan CaCO 3 içinde Ca 2+ iyonlarıyla değiştirilir. (5) Kalsiyum iyonları, reaksiyona girmemiş aljinatla karşılaşıncaya kadar dağılır ve alginat zincirlerinin iyonotropik çapraz bağlanmasına yol açar. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55280/55280fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> Geleneksel nozul tabanlı hücre kapsülleştiricilerinin aksine, geniş bir boncuk boyut dağılımıKarıştırılmış emülsifikasyonda damlacık oluşum mekanizması nedeniyle bu prosesten kaçınılmalıdır. Uygulamaların bir alt kümesi için bu boncuk boyut dağılımı sorunlu olabilir. Örneğin, küçük boncuklarda boncuk yüzeyinde daha büyük bir hücre fraksiyonu açığa çıkabilir. Besin maddesi ( örneğin oksijen) sınırlamaları endişe veriyorsa, bu kısıtlamalar daha büyük boncuklarda daha da artabilir. Karıştırılan emülsiyonlaşma yönteminin bir avantajı, ortalama boncuk boyutunun, emülsiyonlaşma aşamasında ajitasyon oranını değiştirerek kolayca ayarlanabilmesidir. Geniş boncuk boyutu dağılımı boncuk boyutunun kapsüllenmiş hücre performansı üzerindeki etkisini incelemek için de kullanılabilir. Emülsifikasyon ve iç jelleştirme ile memeli hücresi kapsüllemesi, bir boncuk jeneratörü ile donatılmamış laboratuarlar için ilginç bir alternatiftir. Ayrıca, bu yöntem kullanıcılara işleme süresini azaltma veya çok düşük veya çok yüksek aljinat konsantrelerinde boncuk oluşturma seçeneği sunarations. Aşağıda özetlenen protokol, hücrelerin, 10 mM 4- (2-hidroksietil) -1-piperazinetansülfonik asit (HEPES) tamponu içerisinde hazırlanan 10.5 mL% 5 alginat çözeltisi içerisinde nasıl kapsüle edileceğini açıklamaktadır. Aljinat, transplantasyon dereceli LVM (düşük viskoziteli yüksek mannuronik asit içeriği) ve MVG (orta viskozite yüksek guluronik asit içeriği) aljinatın bir 50:50 karışımından oluşur. 24 mM nihai konsantrasyonda kalsiyum karbonat, fiziksel çapraz bağlayıcı madde olarak kullanılır. Emülsiyonu asitleştirmek ve iç jelleştirmeyi tetiklemek için asetik asit kullanılırken hafif mineral yağ organik fazı oluşturur. Bununla birlikte, aljinat türü ve bileşimi ve seçilen işlem tamponu istenilen uygulamaya 32 bağlıdır. Bu protokolle boncuklar üretmek için çeşitli alginat türleri (bkz. Tablolar) kullanılmıştır.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents and consumables&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LVM alginate (transplantation-grade)</td><td>Novamatrix</td><td>Non-applicable</td><td>Referred to as &quot;alginate #1&quot; in the results.</td></tr><tr><td>MVG alginate (transplantation-grade)</td><td>Novamatrix</td><td>Non-applicable</td><td>Referred to as &quot;alginate #2&quot; in the results.</td></tr><tr><td>Alginate (cell culture-grade)</td><td>Sigma</td><td>A0682 (low viscosity) or A2033 (medium viscosity)</td><td>A2033 is referred to as &quot;alginate #3&quot; in the results.</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum, characterized, Canadian origin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SH3039603</td><td></td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Life Technologies</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin and streptomycin</td><td>Sigma</td><td>P4333-100ML</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, cell culture tested</td><td>Sigma</td><td>H4034-100G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S271-1</td><td></td></tr><tr><td>Fine-grain CaCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Avantor Materials</td><td>1301-01</td><td>After preparing the CaCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; suspension, sonicate and use within one month.</td></tr><tr><td>Light mineral oil</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>O121-4</td><td>Sterile filter through a 0.22 &amp;mu;m pore size membrane prior to use.</td></tr><tr><td>Glacial acetic acid</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A38-500</td><td>Handle with caution: refer to MSDS.</td></tr><tr><td>Sterile spatulas</td><td>Sigma</td><td>CLS3004-100EA</td><td></td></tr><tr><td>Sterile nylon cell strainers, 40 &amp;micro;m</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>08-771-1</td><td></td></tr><tr><td>Serological pipettes (2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL)</td><td>Sarstedt</td><td>86.1252.001, 86.1253.001, 86.1254.001 and 86.1685.001</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur pipettes</td><td>VWR</td><td>14673-043</td><td></td></tr><tr><td>Toluidine Blue-O</td><td>Sigma</td><td>T3260</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 mL microcarrier spinner flasks</td><td>Bellco</td><td>1965-00100</td><td>The impeller configuration with recent models may not be suitable for adequate emulsification. A blade able to sweep the oil down to 0.5 cm from the bottom of the flask can be custom-made from a Teflon sheet.</td></tr><tr><td>Magnetic stir plate with adjustable speed</td><td>Bellco</td><td>7760-06005</td><td>The rotation speed should be calibrated (e.g. using a tachometer) prior to use.</td></tr><tr><td>Cell counter</td><td>Innovatis</td><td>Cedex AS20</td><td>This system is now sold by Roche. This automated cell counter can also be replaced by manual cell enumeration after Trypan blue staining using a hemocytometer.</td></tr><tr><td>LED light box</td><td>Artograph</td><td>LightPad&amp;reg; PRO</td><td>This item can be replaced by other types of illuminators.</td></tr><tr><td>Handheld camera</td><td>Canon</td><td>PowerShot A590 IS</td><td>A variety of handheld cameras can be used to capture toluidine blue-o stained bead images. A ruler should be placed next to the Petri dish containing the beads prior to acquiring images.</td></tr><tr><td>Fluorescence microscope with phase contrast and adequate fluorescence filters</td><td>Olympus</td><td>IX81</td><td>Several microscopy systems were used to image the beads. The results shown here were obtained with an IX81 microscope equipped with GFP and TRITC fluorescence filters. To capture entire beads, 4X to 20X objectives were used depending on the agitation rate. Live/dead staining images were typically captured with 20X to 40X objectives.</td></tr><tr><td>Image aquisition software</td><td>Molecular Devices</td><td>Metamorph</td><td>A variety of image acquisition software can be used to acquire phase contrast and fluorescence images.</td></tr><tr><td>Image analysis freeware</td><td>CellProfiler</td><td>Non-applicable</td><td>A variety of image analysis software can be used to identify beads as objects and analyze bead size (e.g. ImageJ).</td></tr></tbody></table>

mammalian cell encapsulation in alginate beads using a simple stirred vessel

Aljinat boncuklardaki hücre kapsüllemesi, in vitro immobilize edilmiş hücre kültürü için ve in vivo immüno izolasyon için kullanılmıştır. Pankreatik adacık kapsüllemesi allojenik veya ksenogeneik transplantlarda adacık sağkalımını artırmak için kapsamlı bir yöntem olarak incelenmiştir. Alginat kapsülleme sıklıkla meme ekstrüzyonu ve dış jelleştirme ile sağlanır. Bu yöntemi kullanarak, memelerin ucunda oluşturulan hücre içeren alginat damlacıkları, damlacıklara difüzyon yaparken iyonotropik alginat jelleşmesine neden olan iki değerlikli katyonları içeren bir çözeltiye düşer. Nozul ucunda damlacık oluşumu gereksinimi, elde edilebilen hacimsel üretim ve alginat konsantrasyonunu sınırlar. Bu video,% 0,5 ila% 10 alginat içindeki memeli hücrelerini% 70 ila% 90 hücre hayatta kalışını kapsüllemek için ölçeklenebilir bir emülsiyonlaşma yöntemi anlatmaktadır. Bu alternatif yöntemle, hücreleri içeren aljinat damlacıkları ve kalsiyum karbonat, mineral yağ, folPH&#39;daki düşüş ile azaltılır ve iç kalsiyum salınımı ve iyonotropik aljinat jelleşmesine yol açar. Mevcut yöntem, alginat boncuklarının emülsifikasyon işleminden 20 dakika sonra üretilmesine olanak tanır. Kapsülleme aşaması için gerekli olan ekipman, çoğu laboratuarda bulunan basit karıştırmalı kaplardan oluşur.

<html> Emülsifikasyon ve iç jelasyon işleminin sonunda, başlangıç ​​aljinat ve hücre karışım hacmine benzer bir boncuk hacmi elde edilmelidir. Boncuklar çok kusurlu çok küresel olmalıdır ( Şekil 3 ). Boncuklar, büyük çaplı pipetler yardımıyla pipetlemeye dayanacak kadar güçlü olmalıdır. Yüksek alginat konsantrasyonlarında boncuklarda kapsüllenmiş yağ veya hava damlacıkları gözlemlenebilir. Bu, muhtemelen emülsifikasyon ...

Watch this Scientific Journal Video about Mammalian Cell Encapsulation in Alginate Beads Using a Simple Stirred Vessel at JoVE.com

Mammalian Cell Encapsulation in Alginate Beads Using a Simple Stirred Vessel

Bu video ve el yazması memeli hücrelerini basit bir karıştırma teknesi kullanarak büyük partiler halinde üretilebilen% 0.5 ila% 10 aljinat boncuklar halinde kapsüllemek için emülsiyon temelli bir yöntemi tarif eder. Kapsüllenmiş hücreler, hücresel terapi uygulamaları için in vitro kültürlenebilir veya nakledilebilir.

Alginat Boncuklarda Memeli Hücre Kapsüllenmesinin Basit Bir Karıştırılmış Geminin Kullanımı

Cell encapsulation in alginate beads has been used for immobilized cell culture in vitro as well as for immunoisolation in vivo. Pancreatic islet ...

mammalian-cell-encapsulation-alginate-beads-using-simple-stirred

Research

JoVE Journal

Bioengineering

19.5K Görüntüleme.  McGill University.  Bu video ve el yazması memeli hücrelerini basit bir karıştırma teknesi kullanarak büyük partiler halinde üretilebilen% 0.5 ila% 10 aljinat boncuklar halinde kapsüllemek için emülsiyon temelli bir yöntemi tarif eder. Kapsüllenmiş hücreler, hücresel terapi uygulamaları için in vitro kültürlenebilir veya nakledilebilir. 

Video: Mammalian Cell Encapsulation in Alginate Beads Using a Simple Stirred Vessel

Alginate Encapsulation of Pluripotent Stem Cells Using a Co-axial Nozzle

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening. However, the development of a mass culture system would be required for using PS cells in these applications. Suspension culture is one promising culture method for the mass production of PS cells, although some issues such as controlling aggregation and limiting shear stress from the culture medium are still unsolved. In order to solve these problems, we developed a method of calcium alginate (Alg-Ca) encapsulation using a co-axial nozzle. This method can control the size of the capsules easily by co-flowing N2 gas. The controllable capsule diameter must be larger than 500 &#181;m because too high a flow rate of N2 gas causes the breakdown of droplets and thus heterogeneous-sized capsules. Moreover, a low concentration of Alg-Na and CaCl2 causes non-spherical capsules. Although an Alg-Ca capsule without a coating of Alg-PLL easily dissolves enabling the collection of cells, they can also potentially leak out from capsules lacking an Alg-PLL coating. Indeed, an alginate-PLL coating can prevent cellular leakage but is also hard to break. This technology can be used to research the stem cell niche as well as the mass production of PS cells because encapsulation can modify the micro-environment surrounding cells including the extracellular matrix and the concentration of secreted factors.

We established a method of encapsulating pluripotent stem cells (PS cells) into alginate hydrogel capsules using a co-axial nozzle. This prevents cells from aggregating excessively and limits the shear stress experienced by cells in suspension culture. The technique is applicable to the mass production of PS cells as well as research on stem cell niche.

Bir Koaksiyel Memesini kullanma Pluripotent Kök Hücre Aljinat Encapsulation

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening.  However, the ...

Gelişim Biyolojisi

Generation of Alginate Microspheres for Biomedical Applications

Alginate-based materials have received considerable attention for biomedical applications because of their hydrophilic nature, biocompatibility, and physical architecture. Applications include cell encapsulation, drug delivery, stem cell culture, and tissue engineering scaffolds. In fact, clinical trials are currently being performed in which islets are encapsulated in PLO coated alginate microbeads as a treatment of type I diabetes. However, large numbers of islets are required for efficacy due to poor survival following transplantation. The ability to locally stimulate microvascular network formation around the encapsulated cells may increase their viability through improved transport of oxygen, glucose and other vital nutrients. Fibroblast growth factor-1 (FGF-1) is a naturally occurring growth factor that is able to stimulate blood vessel formation and improve oxygen levels in ischemic tissues. The efficacy of FGF-1 is enhanced when it is delivered in a sustained fashion rather than a single large-bolus administration. The local long-term release of growth factors from islet encapsulation systems could stimulate the growth of blood vessels directly towards the transplanted cells, potentially improving functional graft outcomes. In this article, we outline procedures for the preparation of alginate microspheres for use in biomedical applications. In addition, we describe a method we developed for generating multilayered alginate microbeads. Cells can be encapsulated in the inner alginate core, and angiogenic proteins in the outer alginate layer. The release of proteins from this outer layer would stimulate the formation of local microvascular networks directly towards the transplanted islets.

In the following sections, we outline procedures for the preparation of alginate microspheres for use in biomedical applications. We specifically illustrate a technique for creating multilayered alginate microspheres for the dual purpose of cell and protein encapsulation as a potential treatment for type 1 diabetes.

Biyomedikal Uygulamalar için Aljinatta Mikrokürelerin Üretimi

Alginate-based materials have received considerable attention for biomedical applications because of their hydrophilic nature, biocompatibility, and ...

Tıp

Immobilization of Multi-biocatalysts in Alginate Beads for Cofactor Regeneration and Improved Reusability

We have recently developed a simple, reusable and coupled whole-cell biocatalytic system with the capability of cofactor regeneration and biocatalyst immobilization for improved production yield and sustained synthesis. Described herewith is the experimental procedure for the development of such a system consisting of two E. coli strains that express functionally complementary enzymes. Together, these two enzymes can function co-operatively to mediate the regeneration of expensive cofactors for improving the product yield of the bioreaction. In addition, the method of synthesizing an immobilized form of the coupled biocatalytic system by encapsulation of whole cells in calcium alginate beads is reported. As an example, we present the improved biosynthesis of L-xylulose from L-arabinitol by coupling E. coli cells expressing the enzymes L-arabinitol dehydrogenase or NADH oxidase. Under optimal conditions and using an initial concentration of 150 mM L-arabinitol, the maximal L-xylulose yield reached 96%, which is higher than those reported in the literature. The immobilized form of the coupled whole-cell biocatalysts demonstrated good operational stability, maintaining 65% of the yield obtained in the first cycle after 7 cycles of successive re-use, while the free cell system almost completely lost the catalytic activity. Therefore, the methods reported here provides two strategies that could help improve the industrial production of L-xylulose, as well as other value-added compounds requiring the use of cofactors in general.

Presented is the protocol for co-immobilizing whole-cell biocatalysts for cofactor regeneration and improved reusability, using the production of L-xylulose as an example. The cofactor regeneration is achieved by coupling two Escherichia coli strains expressing functionally complementary enzymes; the whole-cell biocatalyst immobilization is achieved by cell encapsulation in calcium alginate beads.

Kofaktör Yenilenme ve Geliştirilmiş kullanırlılık için Aljinat Boncuk Multi-biyokatalizi immobilizasyonu

We have recently developed a simple, reusable and coupled whole-cell biocatalytic system with the capability of cofactor regeneration and biocatalyst ...

Kimya

Cellular Encapsulation in 3D Hydrogels for Tissue Engineering 

The 3D encapsulation of cells within hydrogels represents an increasingly important and popular technique for culturing cells and towards the development of constructs for tissue engineering. This environment better mimics what cells observe in vivo, compared to standard tissue culture, due to the tissue-like properties and 3D environment. Synthetic polymeric hydrogels are water-swollen networks that can be designed to be stable or to degrade through hydrolysis or proteolysis as new tissue is deposited by encapsulated cells. A wide variety of polymers have been explored for these applications, such as poly(ethylene glycol) and hyaluronic acid. Most commonly, the polymer is functionalized with reactive groups such as methacrylates or acrylates capable of undergoing crosslinking through various mechanisms. In the past decade, much progress has been made in engineering these microenvironments - e.g., via the physical or pendant covalent incorporation of biochemical cues - to improve viability and direct cellular phenotype, including the differentiation of encapsulated stem cells (Burdick et al.).
The following methods for the 3D encapsulation of cells have been optimized in our and other laboratories to maximize cytocompatibility and minimize the number of hydrogel processing steps. In the following protocols (see Figure 1 for an illustration of the procedure), it is assumed that functionalized polymers capable of undergoing crosslinking are already in hand; excellent reviews of polymer chemistry as applied to the field of tissue engineering may be found elsewhere (Burdick et al.) and these methods are compatible with a range of polymer types. Further, the Michael-type addition (see Lutolf et al.) and light-initiated free radical (see Elisseeff et al.) mechanisms focused on here constitute only a small portion of the reported crosslinking techniques. Mixed mode crosslinking, in which a portion of reactive groups is first consumed by addition crosslinking and followed by a radical mechanism, is another commonly used and powerful paradigm for directing the phenotype of encapsulated cells (Khetan et al., Salinas et al.).

Cellular Encapsulation in 3D Hydrogels for Tissue Engineering

We present protocols for the 3-dimensional (3D) encapsulation of cells within synthetic hydrogels. The encapsulation procedure is outlined for two commonly used methods of crosslinking (michael-type addition and light-initiated free radical mechanisms), as well as a number of techniques for assessing encapsulated cell behavior.

Doku Mühendisliği 3D Hidrojeller Hücresel Kapsülleme

The 3D encapsulation of cells within hydrogels represents an increasingly important and popular technique for culturing cells and towards the development ...

Biyoloji

Layered Alginate Constructs: A Platform for Co-culture of Heterogeneous Cell Populations

Many load bearing tissues possess structurally and functionally distinct regions, typically accompanied by different cell phenotypes with differential mechanosensing characteristics. Engineering and analysis of these tissue types remain a challenge. Layered hydrogel constructs provide an opportunity for investigating the interactions among multiple cell populations within single constructs. Alginate hydrogels are both biocompatible and allow for easy isolation of cells after experimentation. Here, we describe a method for the development of small sized dual layered alginate hydrogel discs. This process maintains high cell viability of human mesenchymal stem cells during the formation process and these layered discs can withstand unconfined cyclic compression, commonly used for stimulation of hMSCs undergoing chondrogenesis. These layered constructs can potentially be scaled up to include additional levels, and also be used to segregate cell populations initially after layering. This dual layer alginate hydrogel culture platform can be used for many different applications including engineering and analysis of cells of load bearing tissues and co-cultures of other cell types.

Engineering and analysis of load bearing tissues with heterogeneous cell populations are still a challenge. Here, we describe a method for creating bi-layered alginate hydrogel discs as a platform for co-culture of diverse cell populations within one construct.

Katmanlı Aljinat Yapıları: Heterojen hücre popülasyonlarının Co-kültür için bir platform

Many load bearing tissues possess structurally and functionally distinct regions, typically accompanied by different cell phenotypes with differential ...

Biyomühendislik

Encapsulation Thermogenic Preadipocytes for Transplantation into Adipose Tissue Depots

Cell encapsulation was developed to entrap viable cells within semi-permeable membranes. The engrafted encapsulated cells can exchange low molecular weight metabolites in tissues of the treated host to achieve long-term survival. The semipermeable membrane allows engrafted encapsulated cells to avoid rejection by the immune system. The encapsulation procedure was designed to enable a controlled release of bioactive compounds, such as insulin, other hormones, and cytokines. Here we describe a method for encapsulation of catabolic cells, which consume lipids for heat production and energy dissipation (thermogenesis) in the intra-abdominal adipose tissue of obese mice. Encapsulation of thermogenic catabolic cells may be potentially applicable to the prevention and treatment of obesity and type 2 diabetes. Another potential application of catabolic cells may include detoxification from alcohols or other toxic metabolites and environmental pollutants.

Here, we present a protocol for encapsulation of catabolic cells, which consume lipids for heat production in intra-abdominal adipose tissue and increase energy dissipation in obese mice.

Yağ Dokusu Depolarında içine Nakli Enkapsülasyon termojenik Preadipositler

Cell encapsulation was developed to entrap viable cells within semi-permeable membranes. The engrafted encapsulated cells can exchange low molecular ...

Synthesis of Black Seed Oil-loaded-, Alginate-based, pH-sensitive Beads Using Electrospraying Technique

Black seed oil (BSO), derived from the seeds of the Nigella sativa plant, has garnered attention for its potential anti-cancer properties, particularly in the context of colon cancer. Its active compound, thymoquinone, may help inhibit cancer cell growth and induce apoptosis in colon cancer cells. Additionally, black seed oil's anti-inflammatory and antioxidant effects could contribute to a healthier gut environment, potentially reducing cancer risk. Therefore, this study synthesized pH-sensitive alginate beads to deliver BSO into the colon in a controlled-release manner without releasing the drug at pH 1.2 (stomach), thus providing a well-defined release pattern at pH 6.8. The use of electrospray technology improves process performance by making it easier to formulate small, homogeneous beads with a higher rate of swelling and diffusion in the gastrointestinal medium. 
The formulated beads were characterized by an ex-vivo mucoadhesive strength test, bead size, sphericity factor (SF), encapsulation efficiency (EE), scanning electron microscope (SEM), in vitro swelling behavior (SB), and in vitro drug release in acidic and buffer media. All these manufactured beads demonstrated modest sizes of 0.58 &plusmn; 0.01 mm and spherical shape of 0.03 &plusmn; 0.00 mm in this testing. The formulation showed promising floating and releasing properties in vitro. With a very low cumulative percentage of beads, the oil EE of 90.13% &plusmn; 0.93% was high, and the release study demonstrated more than 90% in pH 6.8 with good floating nature in the stomach. Additionally, the beads were evenly spaced throughout the intestine. The electrospraying approach used in this protocol can be reproducible, yielding consistent outcomes. Therefore, this protocol can be used for large-scale production for commercialization purposes.

A technique employing high electric voltage and a targeted, active ingredient-loaded emulsion to fabricate pH-responsive, uniform microbeads is presented.

Çörek Otu Yağı Yüklü, Aljinat Esaslı, pH Duyarlı Boncukların Elektropüskürtme Tekniği Kullanılarak Sentezi

Black seed oil (BSO), derived from the seeds of the Nigella sativa plant, has garnered attention for its potential anti-cancer properties, particularly in ...

Three-dimensional Alginate-bead Culture of Human Pituitary Adenoma Cells

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from brown sea algae. Briefly, the tumor tissue is cut into small pieces and submitted to an enzymatic digestion with collagenase and trypsin. Next, a cell suspension is obtained. The tumor cell suspension is mixed with 1.2% sodium alginate and dropped into a CaCl2 solution, and the alginate/cell suspension is gelled on contact with the CaCl2 to form spherical beads. The cells embedded in the alginate beads are supplied with nutrients provided by the culture media enriched with 20% FBS. Three-dimensional culture in alginate beads maintains the viability of adenoma cells for long periods of time, up to four months. Moreover, the cells can be liberated from the alginate by washing the beads with sodium citrate and seeded on glass coverslips for further immunocytochemical analyses. The use of a cell culture model allows for the fixation and visualization of the actin cytoskeleton with minimal disorganization. In summary, alginate beads provide a reliable culture system for the maintenance of pituitary adenoma cells.

Three-dimensional culture in alginate beads, due to its simplicity and reproducibility, was chosen to maintain the pituitary adenoma cells. The procedures included an initial enzymatic digestion and mechanical dissociation of the tumor tissue, and the subsequent cell suspension was encapsulated in alginate beads.

İnsan Hipofiz Adenom Hücreleri üç boyutlu Aljinat-boncuk Kültür

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from ...

Fabrication of Amyloid-&#946;-Secreting Alginate Microbeads for Use in Modelling Alzheimer's Disease

According to the amyloid cascade hypothesis, the earliest trigger in the development of Alzheimer&#8217;s disease (AD) is the accumulation of toxic amyloid-&#946; (A&#946;) fragments, eventually leading to the classical features of the disease: amyloid plaques, neurofibrillary tangles and synaptic and neuronal loss. The lack of relevant non-transgenic preclinical models reflective of disease progression is one of the main factors hindering the discovery of effective drug treatments. To this end, we have developed a protocol for the fabrication of alginate microbeads containing amyloid-secreting cells useful for the study of the effects of chronic A&#946; production.
Chinese hamster ovary cells previously transfected with a human APP gene, secreting A&#946; (i.e., 7PA2 cells), were used in this study. A three-dimensional (3D) in vitro model for the sustained release of A&#946; was fabricated by encapsulation of 7PA2 cells in alginate. The process was optimized to target a bead diameter of 500-600 &#956;m for further in vivo studies. Optimization of 7PA2 cell encapsulation in alginate was performed altering fabrication parameters, e.g., alginate concentration, gel flow rate, electrostatic potential, head vibration frequency, gelling solution. Levels of secreted A&#946; were analyzed over time and compared between alginate beads and standard cell culture methods (up to 96 h).
A concentration of 1.5 x 106 7PA2 cells/mL and an alginate concentration of 2% (w/v) buffered with HEPES and subsequent gelation in 0.5 M calcium chloride for 5 min were found to fabricate the most stable microbeads. Fabricated microbeads were 1) of uniform size, 2) with an average diameter of 550 &#956;m, 3) containing about 100-150 cells per microbead and 4) able to secrete A&#946;.
In conclusion, our optimized method for the production of stable alginate microbeads containing amyloid-producing 7PA2 cells might enable the modeling of important aspects of AD both in vitro and in vivo.

This protocol illustrates a cell encapsulation method by rapid physical gelation of alginate to immobilize cells. Obtained microbeads allow controlled and sustained secretion of amyloid-&#946; over time and can be used to study the effects of secreted amyloid-&#946; in in vitro and in vivo models.

Alzheimer hastalığının modellenmesi için amiloid-β-salgıcı alginat Mikroboncuk imalatı

According to the amyloid cascade hypothesis, the earliest trigger in the development of Alzheimer&#8217;s disease (AD) is the accumulation of toxic ...

Proteolytically Degraded Alginate Hydrogels and Hydrophobic Microbioreactors for Porcine Oocyte Encapsulation

In reproductive biology, the biotechnology revolution that began with artificial insemination and embryo transfer technology led to the development of assisted reproduction techniques such as oocyte in vitro maturation (IVM), in vitro fertilization (IVF) and cloning of domestic animals by nuclear transfer from somatic cell. IVM is the method particularly of significance. It is the platform technology for the supply of mature, good quality oocytes for applications such as reduction of the generation interval in commercially important or endangered species, research concerning in vitro human reproduction, and production of transgenic animals for cell therapies. The term oocyte quality includes its competence to complete maturation, be fertilized, thereby resulting in healthy offspring. This means that oocytes of good quality are paramount for successful fertilization including IVF procedures. This poses many difficulties to develop a reliable culture method that would support growth not only of human oocytes but also of other large mammalian species. The first step in IVM is the in vitro culture of oocytes. This work describes two protocols for the 3D culture of porcine oocytes. In the first, 3D model cumulus-oocyte complexes (COCs) are encapsulated in a fibrin-alginate bead interpenetrating network, in which a mixture of fibrin and alginate are gelled simultaneously. In the second one, COCs are suspended in a drop of medium and encapsulated with fluorinated ethylene propylene (FEP; a copolymer of hexafluoropropylene and tetrafluoroethylene) powder particles to form microbioreactors defined as Liquid Marbles (LM). Both 3D systems maintain the gaseous in vitro culture environment. They also maintain COCs 3D organization by preventing their flattening and consequent disruption of gap junctions, thereby preserving the functional relationship between the oocyte, and surrounding follicular cells.

Presented here are two protocols for the encapsulation of porcine oocytes in 3D culture conditions. In the first, cumulus-oocyte complexes (COCs) are encapsulated in fibrin-alginate beads. In the second, they are enclosed with fluorinated ethylene propylene powder particles (microbioreactors). Both systems ensure optimal conditions to maintain their 3D organization.

Proteolytically Bozulmuş Aljinat Hidrojeller ve Porcine Oosit Kapsülleme için Hidrofobik Mikrobiyoreaktörler

In reproductive biology, the biotechnology revolution that began with artificial insemination and embryo transfer technology led to the development of ...