Biz Drosophila suşları sağlamak için Viyana Drosophila Kaynak Merkezi ve Bloomington Drosophila stok merkezi (NIH P40OD018537) kabul eder. Biz görüntülemede uzman desteği almak için Mikroskobik Görüntüleme Merkezi&#39;nden Jack Fransen teşekkür ederim. Bu çalışma Alman Mental Retardasyon Network tarafından, iki DCN / Radboud Üniversitesi Tıp Merkezi Doktora burs tarafından, Vidi ve Hollanda Bilimsel Araştırma Örgütü (NWO) TOP hibe (917-96-346, 912-12-109) tarafından desteklenmiştir Eğitim ve Araştırma (Bmbf) Alman Federal Bakanlığı NGFN + programı tarafından ve AS Avrupa Birliği&#39;nin FP7 büyük ölçekli entegre ağ Gencodys (SAĞLIK-241995) tarafından finanse. Maliyeciler, çalışma tasarımı, veri toplama ve analiz, yayımlama kararı, ya da yazının hazırlanmasında hiçbir rolü yoktu.

Önceki Görüntü İşlemeye 1. Gereksinimleri <ol><li> Daha önce tarif edildiği gibi 19, üçüncü instar dolaşan larvası (L3), Drosophila açık bir kitap preparatları gerçekleştirin. </li><li> Eş immunolabel İki markalama maddesi bir arada kullanarak Drosophila NMJ terminalleri: &quot;Drosophila NMJ Bouton Morfometri&quot; 20 analiz için BRP ile birlikte &quot;Drosophila NMJ Morfometri&quot; ile analiz için BRP ve SYT veya CSP ile birlikte Dlg-1 ya da HRP. Not: aynı türden antikorlar, Zenon Alexa etiketleme kitleri 17 gibi bir antikor-konjugasyon kiti ile ön etiketleme, bir ile birleştirilebilir. </li><li> Ile (ya da Apotome olmadan), örneğin bir seçim, floresan veya konfokal mikroskopi bir mikroskop kullanarak görüntü NMJ terminaller. <ol><li> NMJ terminalin bir 2 kanallı görüntü yığını elde edin. <ol><li> bir şekilde, mikroskop ayarlarını düzenleme söz konusu kanal 1BRP ile immunolabeled NMJ terminali 2 Dlg-1 (ya da HRP, SYT, CSP) ve kanal ile immunolabeled NMJ terminali elde eder. </li><li> İsteğe bağlı olarak, makro ile (tek bir antikor ile immunolabeled sinaps) tek kanallı görüntüleri analiz. Görüntü NMJs &quot;Drosophila NMJ morfometri&quot; veya &quot;Drosophila NMJ Bouton Morfometri&quot; için SYT veya CSP ile analiz için Dlg-1 veya HRP ile benzersiz immunolabeled. NOT: Sadece anti-BRP immünoboyandı sinaps analiz etmek mümkün değildir. </li></ol></li><li> Bireysel&#39; .tiff dosyaları olarak elde görüntüleri aktarın. belirtildiği gibi kazanılmış değilse makro çalıştırmadan önce kanal sırasını ters çevirin. </li></ol></li></ol> 2. Yazılım Gereksinimleri ve Kurulum <ol><li> Makro indir: &quot;Drosophila NMJ Morfometri&quot; ve &quot;Drosophila NMJ Bouton Morfometri&quot; Aşağıdaki web sitesinden: https://figshare.com/s/ec634918c027f62f7f2a <supclass = &quot;xref&quot;&gt; 21. </li><li> klasörün &quot;Makro güncelleme 1&quot; için imleci hareket ettirin ve görünen seçeneği &quot;görüntüsü&quot; e tıklayın. Bu klasörün içeriği ile bir liste görünür. Klasör makro &quot;Drosophila NMJ Morfometri&quot; ve &quot;Drosophila NMJ Bouton Morfometri&quot; içerir. NOT: Her iki makro da aynı klasörde sağlanır Fiji sürümleri 1.4 ile uyumludur. makrolar son sürümlerinde çalışmayabilir. sağlanan sürüm 1.4 kullanan edin. Mevcut daha yeni Fiji sürümüyle bile bilgisayarlarda, bu sürümü başlatmak için sorunsuzdur. </li><li> &quot;Tümünü indir&quot; butonuna tıklayın. Klasör içeriği .zip dosyası olarak bilgisayara indirilecek. İndirilen dosyayı açın. </li><li> Fiji.app/plugins/ dizinine Drosophila _NMJ_Morphometrics.ijm ve Drosophila _NMJ_Bouton Morphometrics.ijm dosyaları kopyalayın. programı yeniden başlatmanız zaman makrolar Eklentiler alt kısmında görünecektirAşağıya doğru açılan menü. </li></ol> 3. Çalışma Alt makro NMJ Görüntüler Z-projeksiyonlar ve Hyperstacks oluşturma &quot;Stack dönüştürme&quot; <ol><li> Açılır menüden &quot;Drosophila NMJ Morfometri&quot; araç çubuğundaki Plugins seçerek grafik arayüzü başlatın ve seçin. </li><li> makronun grafiksel arayüzde &quot;Eşsiz Dosya Dize&quot; ayarını tanımlayın. NOT: mikroskop yazılımı bireysel&#39; .tiff dosyaları olarak yığınlarını saklarken uçakları ve kanalları düzenlemek için bir kimlik imzasını kullanır. Girilen benzersiz dosya dize ayarı birinci kanalın birinci düzleme yazılım tarafından atanan imza belirtmesi gerekir (önemli: düzlem ve kanal numarası ihtiyacı düşük belirtilecektir). </li><li> sadece alt makro ve &quot;Tamam&quot; ı tıklayın ve resimlerin bulunduğu klasörü seçin &quot;yığın dönüştür&quot; seçeneğini seçin. Birkaç alt klasörler ile bir ana dizin seçilirse, &#39;bütün bireysel .tiff içinde dosyalarıbenzersiz dosya dize kriterleri ana dizin ve alt klasör işlenecektir. <ol><li> z yığın tek bir kanal içeriyorsa, kutu &quot;Kanal 1 sadece&quot; seçin. </li></ol></li><li> Varsayılan olarak NMJ resim başına iki yeni dosyalar, stack_image_name olarak adlandırılan ve flatstack_image_name görünecektir dikkat edin. Daha fazla analiz için sadece bu yığını ve flatstack saklayın. .tiff dosya serisi gerekli depolama kapasiteleri minimize ve potansiyel hata kaynaklarının kaçınarak, bu noktada silinebilir. </li></ol> 4. Çalışma Alt makro İlgi NMJ Terminali Delineate için &quot;YG&#39;yi tanımla&quot; <ol><li> &quot;Drosophila NMJ Morfometri&quot; nin grafik arayüzü başlatın. </li><li> &quot;YG&#39;yi tanımla&quot; ve &quot;OK&quot; ve flatstack_name başlıklı görüntüler saklanabilir ve basın &quot;Seç&quot; ana dizin seçin sadece onay kutusunu işaretleyin. alt makro &quot;yatırım getirisi tanımla&quot; otomatik olarak tüm alt klasörler ararSeçilen ana dizin içinde. </li><li> İlk projeksiyon açar gibi, araç çubuğundaki &quot;Freehand seçimleri&quot; aracını seçin. Fare münhasıran ilgi komple NMJ terminalini içeren bir seçim çizin ve pencere &quot;Terminal tanımla&quot; in &quot;Tamam&quot; ı kullanma. Makro sonraki projeksiyon ile devam edecek. </li><li> Bir sonraki yatırım getirisi Delineate ve tüm ROI tanımlanır kadar tekrarlayın. &quot;Roi_image_name&quot; adlı YG görüntü dosyası, işlenmiş görüntülerin her biri için önceden oluşturulan yığını ve projeksiyon görüntüleri aynı dizine saklanacaktır. Bu alt makro çıktı siyah arka plan üzerinde beyaz ROI bir ikili resimdir. </li></ol> &quot;Analiz&quot; 5. Run Alt makro NMJ Terminali Özellikleri belirlememize <ol><li> &quot;Eklentileri&quot; ve kullanımını seçmek, araç çubuğuna gidin: &quot;Drosophila _NMJ_Morphometrics&quot; Anti-Dlg-1 ya da anti-HRP (kanal 1) ile imüno-sinaps analizinde birlikteAnti-BRP (kanal 2), ya da &quot;Drosophila _NMJ_Bouton_Morphometrics&quot; BRP ile (kanal 1) ile birlikte anti-SYT ya da anti-CSP ile immunolabeled sinaps analiz ile (kanal 2). <ol><li> Bir kanal görüntü yığınları analiz edilecek olduğunda ( &quot;Drosophila_ NMJ_Morphometrics&quot; veya SYT veya &quot;Drosophila _NMJ__Bouton_Morphometrics&quot; CSP için yapısal kanal Dlg-1 ya da HRP), kutu &quot;Kanal 1 sadece&quot; seçin. </li></ol></li><li> görüntülere karşılık gelen ölçeğini ayarlayın analiz edilecek. görüntüde bir piksel 2.5 um karşılık geliyorsa, um = 2,5 ölçek Piksel = 1, Ölçek mesafe göstermektedir. durumda her iki ayar NMJ alan, çevre, uzunluk ve en uzun dal uzunluğu piksel sayısı olarak ifade edilecektir, 0&#39;dan bırakılır. </li></ol><ol start="3"><li> Gerekirse, makro varsayılan analizi ayarlarını yapın. alt makro &quot;Analiz&quot;, sadece ayarlamaları (yetersiz sonuçlarla bu bölümü ve DETE gerçekleştir6. bölümde rmined daha iyi ayarları) işletilmektedir. </li><li> onay kutularını işaretleyin &quot;Analiz&quot; ve &quot;Bekle&quot; ve &quot;Tamam&quot; tuşuna basın. <ol><li> 2 kanallı resimlerde alt makro &quot;Analiz&quot; çalıştırırken &quot;Bekle&quot; onay kutusunu seçin. Aksi takdirde, aktif bölge sayımı hatalar nedeniyle sınırlı bilgisayar kapasitelerinin oluşabilir. </li></ol></li><li> Yeni bir pencere olarak açılır &quot;Bir Rehber Seç&quot; görüntüleri &quot;select&quot; bulunur ve basın dizini seçin. Uygulanabilir, daha sonraki klasörler (: stack_image_name, flatstack_image_name ve roi_image_name önceki alt makro yürütülmesini üç dosya kullanarak) eğer makro, ana dizinde saklanan tüm görüntüleri analiz etmek ve edecektir. Makro süreçler tek tek ve ardışık her görüntü. Bu (bilgisayar kapasitesine bağlı olarak) görüntü yığını başına birkaç dakika sürebilir. </li><li> Makro çalıştırdıktan sonra, her biri için yeni bir resim dosyası adında res_image_name analiz dikkat sinaps Crea olacak saklananebeveyn klasörde ted. kantitatif ölçümleri &quot;results.txt&quot; dosya olarak saklanır. </li><li> algılamak ve segmentasyon hataları ile resim dışlamak için tüm sonuç görüntüleri inceleyin. Olası segmentasyon hataları bu atlatmak için ayarlarını nasıl tavsiye ile birlikte, Tablo 3&#39;te açıklanmıştır. Böyle segmentasyon hataları ile Sonucu görüntüleri Şekil 4&#39;te örnek olarak verilmiştir. NOT: kullanıcı arayüzü gözlenen varsayılan ayarlarla makro çalıştırırken, makro değerlendirme manuel değerlendirme 17 oranla edildiğinde yaklaşık% 95&#39;lik bir doğruluk yoktu. </li></ol> 6. Görseller&#39;e Makro ayarlarını ayarla <ol start="1"><li> Görüntülerin% 5&#39;den fazla segmentasyon hataları gösterdiğinizde, / tanımlamak görüntüler için en uygun makro ayarları seçmek için farklı algoritmalar keşfetmek. </li><li> Yuvarlanan bir top yarıçap değeri ayarlama NOT: haddeleme topu yarıçapıfonksiyon resmin arka planını çıkarır. floresan mikroskoplar edinilen görüntülerle çalışırken Bu fonksiyon hayati öneme sahiptir ve / veya görüntüler yüksek arkaplan gürültüsünü varken. arka plan çıkarma NMJ terminallerinin yeterli segmentasyon üretmek için makronun otomatik eşikleme adımlarını yardımcı olacaktır. <ol><li> Üç NMJ Z projeksiyonlar görüntü veri kümesi temsil eden (alt makro &quot;yığın dönüştürme&quot; tarafından üretilen flatstack_image_name görüntüleri) seçin. </li><li> araç kutusunda, Görüntü | Renk | Bölünmüş kanalları. İki görüntü bir kanal 1 ve diğer kanal 2 temsilen oluşturulacaktır. </li><li> Dlg-1, HRP, SYT veya CSP immunolabeling tekabül eden, 1 açık kanal ve görüntü kapatarak BRP kanal görüntü atmak ait tek görüntü tutun. </li><li> açılır menüden ardından araç çubuğundaki &quot;Süreç&quot; &quot;Çıkar Arka Plan ...&quot; seçerek filtreyi &quot;Çıkar arka plan&quot; çalıştırın. </li><li> Pop-up pencere önizleme kutusunu tıklayın ve panel (Şekil 5A&#39;)&#39; deki gibi sinaps ve arka plan arasındaki kontrastı arttırmak değere haddeleme top çapındaki ayarlayın. NOT: Bir örnek için Şekil 5&#39;e bakınız. Şekil 5A&#39;da&#39; 500 olarak ayarlanmış &#39;Rolling top yarıçapı&#39; sinaps ve zemin arasında güçlü bir kontrast oluşturmaktadır buna karşın Figure5A olarak, sinaps parçaları, arka plan aynı gri seviyelerinin gösteriyoruz. </li><li> yuvarlanan bir top yarıçapı için uygun bir değer tanımlanır, aynı haddeleme top yarıçap değeri ile seçilen Z projeksiyonları &quot;Çıkart arka plan&quot; algoritmasını çalıştırabilir ve (herhangi bir dizin içinde) kaydedin. NOT: 8-bit veya RGB görüntüleri için haddeleme topu yarıçap değeri arka planın parçası değil görüntüde büyük nesnenin yarıçapı en az kadar büyük olmalıdır. 16-bit ve 32 bit görüntüler için yarıçap inv edilmelidirpiksel değer aralığı 22 ersely orantılıdır. </li></ol></li><li> Kullanılacak farklı bir otomatik eşik belirleme <ol><li> Önceki adımda (6.2.6) &#39;de kaydedilen Z-projeksiyonları açın ve Görüntü seçin | ayarlayın | AutoThreshold | Tüm deneyin. </li><li> bir ikili eşiklenir sonuç görüntü tüm farklı otomatik eşik algoritmaları ile görünecektir gibi, görüntüler için en uygun algoritmayı belirler. <ol><li> daha sonra makro çalıştırırken, buna göre makro ayarlarında eşiği değiştirin. </li><li> aktif bölgeleri belirlemek üzere &quot;RenyiEntrophy&quot; veya NMJ iskelet belirlemek için NMJ anahat eşiği ve &quot;Li&quot; olarak daha izin eşikler gibi &quot;an&quot; ve &quot;Huang,&quot; gibi daha kısıtlayıcı eşik kullanın. görüntüler hiçbir arka plan çok az çabayla çok keskin olduğunda, Aksi sinaps parçaları görüntü segmentasyonu sonra eksik olabilir. NMJ anahat eşiği &quot;olarak &quot;Huang&quot; kullanırlar. </li><li> Örnek için, Şekil 5B bakınız. sinapsların Uygun segmentasyon yeşil kutularla vurgulanan otomatik eşikleri ile elde edilir. Uygun olmayan eşikler bazı örnekleri, kırmızı kutular (yüksek büyütmede sinaps kontrol edin) ile vurgulanır. İkinci olarak, sinaps her iki parça eksik veya arka kısımları dahildir. Daha fazla bilgi için 23 başvuru bakın. </li></ol></li></ol></li></ol><ol start="4"><li> Küçük parçacıkların en büyük boyutu belirleme NOT: Bu fonksiyon analizinden &quot;küçük parçacıklar ayarında&quot; tanımlanan değerden daha küçük olan NMJ anahat eşiği ve İskelet eşiği tarafından algılanan tüm partikülleri hariç tutar. Bu değer, piksel olarak tanımlanır. Bu fonksiyon, bir gürültü filtre olarak işlev görür ve (örneğin, kristaller / toz gibi) tek biçimli bir arka yüksek oranda elde edilen görüntülerin mevcut olduğunda çok yararlıdır. <ol><li> adımda 6.2.6 kaydedilen Z-projeksiyonlar açın. ve setölçek analiz yoluyla piksel sayısını tespit etmek için | Set Ölçeği. aşağıdaki ayarları uygulanır: mesafe piksel = 1, bilinen bir mesafe = 1, piksel boy oranı = 1, uzunluğu = piksel ve &quot;OK&quot; birimi. araç çubuğundaki &quot;Oval seçim&quot; aracını tıklayın. </li><li> Fare kullanma yakından immünoboyamaya mevcuttur ancak NMJ ait olmayan tek parçacıkları çevreleyen bir seçim çizin. Mac kullanıcıları için bir Windows kullanıcı veya cmd + m için Ctrl + m. Bir sonuç pencere piksel sayısı cinsinden seçilen parçacıkların alanı gösteren açılır. </li><li> En büyük bulaşıcı partikül / yapay alanı belirlemek için görüntülerin mevcut çok sayıda eşya ile önceki adımı birkaç kez tekrarlayın. Bu daha sonra makro çalışırken ortamda ayarlamak için değer olacaktır. En küçük parçacık boyutu gözlenen irin olarak &quot;küçük tanecikler boyutu&quot; % 25 marj set makro çalıştırırken. </li><li> Bir örnek için Şekil 5D bakınız. En büyük kristal algılamaked 112 piksel bir alana sahiptir. 150 - makro ile bu görüntüyü işlerken &quot;Küçük parçacıklar boyut&quot; ayarı, to125 ayarlanmalıdır. </li></ol></li></ol><ol start="5"><li> Asgari bouton boyutunu belirleme NOT: Bu fonksiyon analizinden tanımlanan değerden daha küçük olan NMJ anahat eşiği tarafından tespit edilen tüm boutons hariç tutar. Bu değer, piksel olarak tanımlanır. <ol><li> Bölüm 6.4 de tarif edildiği gibi, aynı adımları, ancak bu durumda NMJ terminali içinde mevcut küçük BOUTONS çevreleyen bir seçim çizin. Ölçülen olanlardan en küçük bouton tekabül en küçük alanı seçin. Bu daha sonra makro çalışırken asgari bouton boyutu ayarında ayarlamak için değerdir. </li></ol></li></ol><ol start="6"><li> Define değeri &quot;maxima gürültü toleransı bul&quot; <ol><li> Bölüm 6.2.1 seçilen Z hyperstacks kullanın. </li><li> araç kutusunda, Görüntü | Renk | El kremi ile Bölünmüş kanallarte 2 yığınlarının (kanal 1 ve kanal 2) ve açık BRP kanala karşılık gelen görüntü tutun. kapatarak diğer kanal görüntü atılır. </li><li> Süreci seçin açılan menüden eklentileri sekmesine gidin | Maksimum (3D) ve maximum_image_name (birkaç dakika kadar sürebilir) göründüğünde, orijinal görüntü yığınını kapatın. </li><li> | Maksimum ... image_name (elde görüntü yığını) seçin ve Eklentileri seçin Süreç | Asgari (3D), Maksimum ... image_name yığını kapatın. </li><li> Araç çubuğunda işlem seçin | maxima bul .... Yeni bir pencere &quot;Bul maxima ...&quot; açılacaktır. &quot;... Önizleme noktası seçimi&quot; onay kutusu tıklayın ve küçük haç olarak görüntüde belirtilecektir 50 maxima noktalarını ayarlama varsayılan makro ile &quot;Gürültü tolerans&quot; kutusunu doldurun. <ol><li> Içinde aktif bölgelerin üstüne değildir açıklamalı aktif bölgeleri, yani haç aşırısını gözlemliyormuş &quot;gürültü toleransı&quot; değerini artırmakarka tespit edilir seçilmiş yığın düzlem ya da yanlış olarak aktif bölgeleri üzerine odaklanır. <ol><li> Tam olarak aktif bölgeleri açıklamalı gözlemi Diğer taraftan, &quot;Gürültü toleransı&quot; değerini azaltmak, etiketli kabul edilmesi odakta aktif bölgeleri yani. haçlar uygun odakta aktif bölgeleri etiketleme dek bu prosedürü takip farklı değerler çalışırken tutun. Bu değer ile &quot;Bul maxima gürültü toleransı&quot; doldurun. </li><li> Bir örnek için Şekil 5C bakınız. Çok fazla aktif bölgeleri tespit edilmiştir. Şekil 5C&#39;de&#39; Yalnızca merkezde aktif bölgeleri tespit edilmiştir. </li></ol></li></ol></li><li> alt makro tüm önceki adımlarda tanımlanan ayarlarla, adım 5.1 seçilen temsilci görüntüler için &quot;Analiz&quot; çalıştırın. </li></ol></li><li> Alt ve üst eşik BRP-puncta ayarlama <ol><li> Yeni bir dosya m çalıştırdıktan sonra görünen olacak dikkat edinakro göre 6.6 olarak adlandırılan 2_active_zone_stack_image_name adım. Bu resimde, her düzlemde beyaz noktalar ile belirtilmiştir &quot;maxima Bul&quot; fonksiyonu ile tespit aktif bölgeleri yığını. </li><li> sürükleyip araç çubuğu basıp Görüntü içine bırakın bu dosyayı açın | Stack | Zproject | Projeksiyon type = Sum dilimleri. 2_active_zone_stack_image_name bir projeksiyonu elde edilecektir. </li><li> Resim Seç | ayarlayın | Eşik. Yeni bir pencere &quot;Eşik&quot; açılacaktır. İstenen tüm odaklar / BRP pozitif noktalar kırmızı görselleştirildiği, bir eşik değerini seçmek için üst çubuk kaydırın. Not: eşiği çok düşük olması halinde, aktif bölgelerin aşırı sayılır. çok yüksek ayarlarsanız, aktif bölgelerinin bir kısmını özleyeceğiz. <ol><li> Bir örnek için Şekil 5E bakınız. Eşik 400 ayarlandığında kırmızı (Şekil 5 &#39;de vurgulanan değildir, çünkü (1 piksel odakları olarak sembolize edilen) aktif bölgelerin en segmentasyon dahil değildirE). Eşik değeri 50 ayarlandığında tüm aktif bölgeler kırmızı (Şekil 5E&#39;) vurgulanır. </li></ol></li><li> minimum eşik olarak bu değeri tanımlar. Maksimum değeri &quot;Üst puncta eşiği&quot; bırakın. </li><li> alt makro Bu bölümün tüm önceki adımlarda tanımlanan ayarlarla temsili görüntüler için &quot;Analiz&quot; yeniden çalıştırın. Kritik çıkan görüntü dosyaları değerlendirmek ve segmentasyon düzgün yapıldığından emin olun. Bu durum söz konusu değilse segmentasyon hataları doğasına (Şekil 4, Tablo 3) &#39;e göre yeniden ayarlayabilirsiniz. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Lin, Y. C., Koleske, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+synapse+and+dendrite+maintenance+and+their+disruption+in+psychiatric+and+neurodegenerative+disorders.">Mechanisms of synapse and dendrite maintenance and their disruption in psychiatric and neurodegenerative disorders.</a> Annu Rev Neurosci. 33, 349-378 (2010).</li><li>van Bokhoven, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+epigenetic+networks+in+intellectual+disabilities.">Genetic and epigenetic networks in intellectual disabilities.</a> Annu Rev Genet. 45, 81-104 (2011).</li><li>Penzes, P., Buonanno, A., Passafaro, M., Sala, C., Sweet, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+vulnerability+of+synapses+and+circuits+associated+with+neuropsychiatric+disorders.">Developmental vulnerability of synapses and circuits associated with neuropsychiatric disorders.</a> J Neurochem. 126, 165-182 (2013).</li><li>Mainen, Z. F., Sejnowski, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+dendritic+structure+on+firing+pattern+in+model+neocortical+neurons.">Influence of dendritic structure on firing pattern in model neocortical neurons.</a> Nature. 382, 363-366 (1996).</li><li>Yuste, R., Majewska, A., Holthoff, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+form+to+function:+calcium+compartmentalization+in+dendritic+spines.">From form to function: calcium compartmentalization in dendritic spines.</a> Nat Neurosci. 3, 653-659 (2000).</li><li>Vetter, P., Roth, A., Hausser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation+of+action+potentials+in+dendrites+depends+on+dendritic+morphology.">Propagation of action potentials in dendrites depends on dendritic morphology.</a> J Neurophysiol. 85, 926-937 (2001).</li><li>Bosch, M., Hayashi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+plasticity+of+dendritic+spines.">Structural plasticity of dendritic spines.</a> Curr Opin Neurobiol. 22, 383-388 (2012).</li><li>Mehnert, K. I., Cantera, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+rhythms+in+the+morphology+of+neurons+in+Drosophila.">Circadian rhythms in the morphology of neurons in Drosophila.</a> Cell Tissue Res. 344, 381-389 (2011).</li><li>Sigrist, S. J., Reiff, D. F., Thiel, P. R., Steinert, J. R., Schuster, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experience-dependent+strengthening+of+Drosophila+neuromuscular+junctions.">Experience-dependent strengthening of Drosophila neuromuscular junctions.</a> J Neurosci. 23, 6546-6556 (2003).</li><li>Ruiz-Canada, C., Budnik, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+on+the+use+of+the+Drosophila+embryonic/larval+neuromuscular+junction+as+a+model+system+to+study+synapse+development+and+function,+and+a+brief+summary+of+pathfinding+and+target+recognition.">Introduction on the use of the Drosophila embryonic/larval neuromuscular junction as a model system to study synapse development and function, and a brief summary of pathfinding and target recognition.</a> Int Rev Neurobiol. 75, 1-31 (2006).</li><li>Menon, K. P., Carrillo, R. A., Zinn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+plasticity+of+the+Drosophila+larval+neuromuscular+junction.">Development and plasticity of the Drosophila larval neuromuscular junction.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2, 647-670 (2013).</li><li>Kraut, R., Menon, K., Zinn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gain-of-function+screen+for+genes+controlling+motor+axon+guidance+and+synaptogenesis+in+Drosophila.">A gain-of-function screen for genes controlling motor axon guidance and synaptogenesis in Drosophila.</a> Curr Biol. 11, 417-430 (2001).</li><li>Parnas, D., Haghighi, A. P., Fetter, R. D., Kim, S. W., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+postsynaptic+structure+and+protein+localization+by+the+Rho-type+guanine+nucleotide+exchange+factor+dPix.">Regulation of postsynaptic structure and protein localization by the Rho-type guanine nucleotide exchange factor dPix.</a> Neuron. 32, 415-424 (2001).</li><li>Eaton, B. A., Fetter, R. D., Davis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynactin+is+necessary+for+synapse+stabilization.">Dynactin is necessary for synapse stabilization.</a> Neuron. 34, 729-741 (2002).</li><li>Laviolette, M. J., Nunes, P., Peyre, J. B., Aigaki, T., Stewart, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+screen+for+suppressors+of+Drosophila+NSF2+neuromuscular+junction+overgrowth.">A genetic screen for suppressors of Drosophila NSF2 neuromuscular junction overgrowth.</a> Genetics. 170, 779-792 (2005).</li><li>Collins, C. A., Wairkar, Y. P., Johnson, S. L., DiAntonio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highwire+restrains+synaptic+growth+by+attenuating+a+MAP+kinase+signal.">Highwire restrains synaptic growth by attenuating a MAP kinase signal.</a> Neuron. 51, 57-69 (2006).</li><li>Nijhof, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+New+Fiji-Based+Algorithm+That+Systematically+Quantifies+Nine+Synaptic+Parameters+Provides+Insights+into+Drosophila+NMJ+Morphometry.">A New Fiji-Based Algorithm That Systematically Quantifies Nine Synaptic Parameters Provides Insights into Drosophila NMJ Morphometry.</a> PLoS Comput Biol. 12, e1004823 (2016).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9, 676-682 (2012).</li><li>Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+larval+NMJ+dissection.">Drosophila larval NMJ dissection.</a> J Vis Exp. , (2009).</li><li>Dubos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+depletion+of+intellectual+disability+and+Parkinsonism+candidate+gene+ATP6AP2+in+fly+and+mouse+induces+cognitive+impairment+and+neurodegeneration.">Conditional depletion of intellectual disability and Parkinsonism candidate gene ATP6AP2 in fly and mouse induces cognitive impairment and neurodegeneration.</a> Hum Mol Genet. 24, 6736-6755 (2015).</li><li>Nijhof, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila NMJ Morphometrics. , (2017).</li><li>Ferreira, T., Rasband, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> ImageJ User Guide IJ 1.46. , (2014).</li><li>Ferreira, T., Rasband, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> ImageJ User Guide IJ 1.46. , (2014).</li><li>Pielage, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+presynaptic+giant+ankyrin+stabilizes+the+NMJ+through+regulation+of+presynaptic+microtubules+and+transsynaptic+cell+adhesion.">A presynaptic giant ankyrin stabilizes the NMJ through regulation of presynaptic microtubules and transsynaptic cell adhesion.</a> Neuron. 58, 195-209 (2008).</li><li>Koch, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+ankyrin+2+is+required+for+synaptic+stability.">Drosophila ankyrin 2 is required for synaptic stability.</a> Neuron. 58, 210-222 (2008).</li><li>Iqbal, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homozygous+and+heterozygous+disruptions+of+ANK3:+at+the+crossroads+of+neurodevelopmental+and+psychiatric+disorders.">Homozygous and heterozygous disruptions of ANK3: at the crossroads of neurodevelopmental and psychiatric disorders.</a> Hum Mol Genet. 22, 1960-1970 (2013).</li><li>Prokop, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+the+efferent+system+and+structure+of+neuromuscular+junctions+in+Drosophila.">Organization of the efferent system and structure of neuromuscular junctions in Drosophila.</a> Int Rev Neurobiol. 75, 71-90 (2006).</li><li>Wan, H. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highwire+regulates+synaptic+growth+in+Drosophila.">Highwire regulates synaptic growth in Drosophila.</a> Neuron. 26, 313-329 (2000).</li><li>Shi, L., Fu, A. K., Ip, N. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+underlying+maturation+and+maintenance+of+the+vertebrate+neuromuscular+junction.">Molecular mechanisms underlying maturation and maintenance of the vertebrate neuromuscular junction.</a> Trends Neurosci. 35, 441-453 (2012).</li><li>Sutcliffe, B., Forero, M. G., Zhu, B., Robinson, I. M., Hidalgo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuron-type+specific+functions+of+DNT1,+DNT2+and+Spz+at+the+Drosophila+neuromuscular+junction.">Neuron-type specific functions of DNT1, DNT2 and Spz at the Drosophila neuromuscular junction.</a> PLoS One. 8, e75902 (2013).</li><li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biol. 7, R100 (2006).</li></ol>

Yazarlar ifşa etmek Çıkar çatışması var.

&quot;Drosophila NMJ Morfometri&quot; ve &quot;Drosophila NMJ bouton Morfometri&quot; sinaps morfolojiyi değerlendiren ilgilenen araştırmacılar için güçlü araçlardır. NMJ parametrelerin Manuel değerlendirme zahmetli olduğu; o makroları 15 dakika için deneyimli bir araştırmacı biriktirmek olacağı tahmin edilmektedir / NMJ manuel görüntü segmentasyonu üzerine geçirdi. koşul veya genotip başına değerlendirilen sinapsların bir ila iki onlarca ile bu hızla bile küçük ölçekli çalışmalarda, kaydedilen zaman ciddi miktarda özetliyor. büyük ekranlar gerçekleştirirken, el değerlendirmesi ve ölçümü ile karşılaştırıldığında, yüksek hacimli bir analiz kullanılarak kazancı, büyük olabilir. artan bir çıktı ile ek olarak, makro kolaylıkla objektif bir analiz sağlanır; aksi takdirde kör deneyleri yanı sıra birden fazla araştırmacı analiz dahil ortaya kişilerarası farklılıkları gerektiren kişisel önyargıları dahil değildir. Son olarak, makro hassas ve doğru bir sağlamaktırDramatik NMJ kusurları ziyade ince yol ve bugüne kadar araştırmacının gözle hesaba katılmayan kalmıştır sinaptik düzenleyiciler tanımlanmasına izin NMJ özelliklerinden alysis. Doğrulama prosedürleri ve makrolar kullanılan algoritmalar ile ilgili ayrıntılı bilgiler yayın Nijhof ve diğerleri bulunur. 17. Makrolar işlevselliği uygun Daha sonra kas 4. Drosophila melanogaster NMJs morfolojik özellikleri ölçmek için doğrulanmıştır, bu makrolar da bu organizma diğer kaslarda sinaps analiz etmek için uygun olduğu gösterilmiştir. Makro, diğer Drosophila türleri ve ayrıca böcekler dahil olmak üzere, diğer türler, içindeki yapı ile NMJ morfolojik parametrelerin ölçülmesi için kullanılabilir olması muhtemeldir. Evriminde çok uzak olsa NMJs, örneğin farelerin NMJs, oldukça benzer bir yapısal şekle göstermek 29. makrolar diğer türlerden NMJ hazırlıklar üzerinde test edilmemiştir ancak potansiyel kullanıcılar bu tür amaçlar için makro sınamak için teşvik edilir. Kullanıcı / tanımlamak görüntüler için en uygun makro ayarları seçmek için farklı bir otomatik eşikleri ve algoritmalar araştırıyor çok önemlidir. Makro değerlendirme kılavuzu değerlendirmeye kıyaslandığında Bu ayarlarla, yaklaşık% 95&#39;lik bir doğruluk elde edilir. Makro ayarlarını yapma düzgün segmenti görüntülerin% 100 çok zahmetli ve hatta imkansız bir prosedür olabilir için. sayıları% 5&#39;in altındadır nedenle, düzgün segmentli olmayan görüntülerin dışlama önerilir. Görüntülerin kalitesi düşükse Açıkça, makrolar yetersiz görüntü segmentasyon daha yüksek bir oranda üretecektir. Düşük kaliteli görüntüler benzer manuel değerlendirmeyi etkileyecektir ve bu nedenle makro performansı ile bağlantılı olamaz. bunların resim için tasarlanmış gibi Yine makro oldukça sağlamdıryüksek içerik mikroskop 17 (örneklerin çok sayıda görüntüleme sağlayan otomatik bir floresan mikroskop) oluşturulan s. Bir kritik nokta kullanıcı görsel makrolar tarafından oluşturulan tüm sonuç görüntüleri inceler olmasıdır. Bu algılamak ve yetersiz segmentasyon ile resim dışlamak için izin verecektir. Bu protokol bölüm 6, kullanıcı &quot;Analiz&quot; alt makro çalıştırırken doğru görüntü segmentasyon için ayarlarını nasıl yönlendirilir. hızla makrolar gereklerine ve nasıl makro ayarları &quot;makro ayarlarını Examples_adjusting&quot; adlı bir klasör ayarlamak için birlikte alıştırmak için makro depo https://figshare.com/s/ec634918c027f62f7f2a dahildir. örnekler (içeriği yüksek / eş odaklı / floresans mikroskobu) farklı mikroskop platformlarda elde edilen görüntüler ve farklı immunostainings sahip on üç alt klasörler her biri verilmiştir. PDF başlıklı “Örnekler rehber” Aynı dahildirHer örnek için gerekli ayarları beklenen sonuçları ve sonuçları görüntüler sağlayan bir metin belgesi ile birlikte temin edilmektedir klasörü. makrolar .tiff dosyaları ayrılmış olarak kaydedilen görüntüleri işlemek için tasarlanmış, yine de bazı kullanıcılar farklı bir biçimde kendi görüntüleri kurtarmış olabilir. Ve ayrıntılı talimatlar belge &quot;Örnekler Kılavuzu&quot; nasıl makro içine görüntüleri aktarmak için - Aşağıdaki web sitesi https://figshare.com/s/ec634918c027f62f7f2a 21 üç örnek dosyaları (3 Örnek 1) &quot;Drosophila NMJ&quot; adlı bir klasör içeriyor .tiff ayrı dosyalar olarak saklanır değilse de aynı klasörde bulunabilir. NMJ alanı, NMJ çevre, BOUTONS sayısı NMJ bouton alanı, NMJ uzunluk, NMJ en uzun dal uzunluğu, Isla sayısı: Birlikte, &quot;Drosophila NMJ Morfometri&quot; ve &quot;Drosophila NMJ bouton Morfometri&quot; makro on farklı NMJ özelliklerini ölçmekNDS, dal sayısı, dallanma noktalarının sayısı ve aktif bölgelerin sayısıdır. Bu yalnızca bir veya birkaç sinaptik özellikleri 30, 31 değerlendirebilir şimdiye kadar mevcut araçlar üzerinde büyük bir avantaj sağlamaktadır. Multiparametrik nicel analiz sinaps biyoloji sayısız yönleri kadar birini kontrol roman düzenleyicileri tanımlamak için yeni keşifler, örneğin için büyük bir potansiyele taşımaktadır. Ayrıca, tam olarak aynı veya üst üste NMJ özellikleri coregulate ve böylece, ortak moleküler yollarla çalışma olasılığı olan genleri belirlemek için gerekli çözünürlüğü sağlar. Son olarak, sinaptik parametreler genler, koordine morfometrik korelasyon temin istifin bozulmadığı koşullar 17 ve birbirleriyle ilişkili ne kadar farklı araştırmak için ihtimalini açmaktadır. Birlikte ele alındığında, bu protokol &quot;Drosophila NMJ Morfometri&quot; iki makro nasıl kullanılacağı gösterilmektedir veYüksek verimli bir şekilde on morfolojik NMJ özelliklerinin objektif ve duyarlı kantifikasyonunu gerçekleştirmek &quot;Drosophila NMJ Bouton Morfometri&quot;.

Gibi zihinsel engelli, otizm spektrum bozukluğu ve şizofreni gibi bilişsel hastalıklar çoğu zaman anormal sinaptik fonksiyon, 1, 2, 3 ile karakterize edilir. Sinaps morfolojisi ve fonksiyon sıkı iç içe geçmiştir; morfolojik kusurlar sinaptik arızaya neden olabilir ve, tersine, anormal sinaptik transmisyon sinaptik olgunlaşmasını ve şekil 4, 5, 6 etkileyecektir. Model organizmaların bir dizi daha sinaps biyolojisini anlamak ve sinaptik değişiklikler sağlık ve hastalık 7, 8, 9 beyin fonksiyonlarını nasıl etkilediğini ışık tutmak amacıyla kullanılmıştır. Drosophila NMJ bir geniş olarak araştırılmış ve glutamaterjik sistem için in vivo model köklünapse biyoloji 10, 11. Geçmiş yıllarda, bu model NMJs arasındaki morfolojik farklılıkları tespit etmek amacıyla, hem de büyük ölçekli genetik ekranlar için, fizyolojik ve gen odaklı çalışmalar için kullanılmıştır. Özellikle, ileri genetik ekranlar sinaps gelişimi altında yatan pek çok önemli regülatörleri ve mekanizmalar tanımlanmış ve 12, 13, 14, 15, 16 fonksiyon var. Bununla birlikte, bu ekranların en NMJ terminali morfolojisinin görsel değerlendirme ile ve nitel sinaptik anormalliklerin tespit edilmesi veya birkaç morfolojik özelliklerin yarı-kantitatif puanlama dayanıyordu. Sonuç olarak, insan gözünün olmayan ortada oldukça ince sinaptik morfolojik anormallikler kolayca cevapsız edilir. amacıyla kapsamlı kantitatif farklılıklar tespit edebilmek içinNMJ doğru çıkar morfolojik parametrelerin sistematik olarak ölçmek suretiyle değerlendirilmelidir. elle NMJ özellikleri Ölçme birkaç NMJ ilgi özellikleri ve / veya büyük ölçekli genetik gösterimleri gerçekleştirilirken özellikle olduğunda, zahmetlidir. Multiparametrik, yüksek hacimli morfolojik analizini desteklemek ve objektif ölçümünü elde etmek için, iki makro &quot;Drosophila NMJ Morfometri&quot; ve &quot;Drosophila NMJ Bouton Morfometri&quot; 17 geliştirilmiştir. Her iki makro açık kaynak görüntü analiz yazılımı Fiji 18 çalıştırmak ve her ikisi de aynı odaklı ve nonconfocal görüntüleri ölçmek. &quot;Drosophila NMJ Morfometri&quot; önlemler büyük 1 postsinaptik işaretleyici disk (DLG-1) ya da presinaptik yaban turpu peroksidaz (HRP) ile immüno-NMJ terminalleri, aktif bölge işaretleyici bruchpilot (BRP) ile birlikte etiketli. Dokuz morfolojik parametrelerle quantifiesters (aşağıda daha ayrıntılı olarak tarif edilmiştir): NMJ alanı, NMJ çevre, BOUTONS sayısı NMJ uzunluğu, NMJ uzun dal uzunluğu, adacıkların sayısı, dal sayısı, dallanma noktaları ve sinaptik terminalden aktif bölgelerin sayısı gibi (Şekil 1) . BOUTONS sayısının belirlenmesi için bir algoritma bu makro mevcut olsa da, doğruluk 17 kriterlerini karşılamayan. Düzgün BOUTONS sayısını değerlendirmek için, özellikle anti-sinaptotagmin (SYT) ya da anti-Sistein dize protein (CSP) ile boyama NMJ hazırlıklarını kullanarak boutons ölçmek için tasarlanmıştır &quot;Drosophila NMJ Bouton Morfometri&quot; makro kullanmak için gerekli olan, ve BRP ile birlikte imüno-. &quot;Drosophila NMJ Bouton Morfometri&quot; makro aşağıdaki parametreleri quantifies: Aktif zo ait BOUTONS sayısını, NMJ bouton alanı, NMJ uzunluğu, NMJ en uzun dal uzunluğu, adaların sayısı, şube sayısını, dallanma noktalarının sayısını ve numarayıaksam (Şekil 2). Makroları 3 alt makrolar oluşur: (I) &quot;yığın dönüştür&quot; mevcut tüm görüntü dosyalarını tanımlar ve Z-hyperstacks ve her iki kanalın maksimum yoğunluk projeksiyonları oluşturur. çıktısı gibi, bu makro &quot;stack_image_name&quot; ve &quot;flatstack_image_name&quot; denilen sinaps başına iki yeni dosyalar oluşturur. II) &quot;ROI tanımlama&quot; art arda her maksimum projeksiyon görüntüleri &quot;flatstack_image_name&quot; açık ve manüel olarak ilgi çekici bir spesifik sinaptik terminali mevcut olduğu (ROI), bölgeyi tanımlamak için isteğe ile sunacaktır. Bu görüntülerin 11 mevcut olabilir bitişik kas ve / veya (1 olan), sinaptik terminallerinden diğer tip bağlantı sinaps hariç tutulmasına izin uygulanmıştır. (III) &quot;Analiz&quot; tam ROI sınırları içinde görüntülerin tüm bölgelerine analizini otomatik uygular. Gibitüm sayısal ölçüm açıklamalı olacak &quot;results.txt&quot; ve makro tarafından üretilen temel görüntü segmentasyonları izah edilecektir bir &quot;res_image_name.tif&quot;: Bu adımın sonucu, kullanıcı iki yeni dosyalar elde edecektir. NMJ anahat, NMJ iskelet ve BRP pozitif aktif bölgelerin sayısı: Görüntü analizi sırasında üç yapılar, her bir sinaptik terminalden elde edilir. NMJ anahat NMJ alan ve çevre belirlemek için kullanılır ve daha sonraki bir havza ayırma BOUTONS sayısını belirtir. İskeletin itibaren beş NMJ özellikler çıkarılabilir gibidir: toplam NMJ uzunluğu, herhangi iki uç noktalarını bağlayan en uzun kesintisiz yolun uzunluğunun toplamı (en uzun dal uzunluğu), NMJ başına bağlantısız bölmeleri sayısını ( &quot;adalar&quot; olarak anılacaktır ), dal sayısı ve dallanma noktaları (bir dallanma noktası üç veya daha fazla dal bağlanır) sayısı. aktif bölgelerinin sayısı, saymak suretiyle BRP-kanal belirlenirBRP pozitif noktalar. (Açıklamalı NMJ hatları (sarı çizgi), NMJ iskelet (mavi çizgi) ve (beyaz odaklar ile gösterilir) BRP pozitif aktif bölgeleri sayısı sonuçları resim görüntülenir ve parametrelerin ölçümleri için işlenir. txt) çıktı dosyası (Şekil 3). Drosophila NMJ Morfometri&quot; ve &#39;Drosophila NMJ Bouton Morfometri Drosophila NMJ Morfometri &#39;ve &#39;Drosophila NMJ Bouton Morfometri&#39;&#39; önce tarif edilen ve yaygın olarak Nijhof ve ark. 17 ile doğrulanmıştır. Bu makale makrolar kullanılarak NMJ morfolojisi analiz etmek için yöntem odaklanır&#39;. Bununla birlikte, makro-destekli analizi öncesinde, NMJ tahlil ve immunostainings Bu önemli adımlardır. gerçekleştirilmesi gereken ve immünohistokimya için kullanılan işaretlerin kombinasyonu makro analizler için uygun olması gerekmektedir. Bu adımlar kısaca açıklanan seBu protokolün ction 1 ve bu prosedürleri gerçekleştirmek için ayrıntılı protokolleri tarif referanslara yönlendirmek.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Immunostainings</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-discs large 1</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>AFFN-DLG1-4D6</td>
			<td>1/25 (conjungated using the Zenon Alexa Fluor 528 Labeling Kit)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-horseradish peroxidase</td>
			<td>Jackson IR</td>
			<td>323-005-021</td>
			<td>1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Synaptotagmin</td>
			<td>Gift from Hugo Bellen</td>
			<td></td>
			<td>Jan-00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-Cysteine string protein</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>DCSP-1(ab49)</td>
			<td>1/10 (conjungated using the Zenon Alexa Fluor 528 Labeling Kit)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-Bruchpilot</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>nc82</td>
			<td>Jan-50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse Alexa Fluor 488</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>A11029</td>
			<td>1/200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit Alexa Fluor 568</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>A11011</td>
			<td>1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zenon Alexa Fluor 568 Mouse IgG1 Labeling Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Z25006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>P36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Confocal microscope or fluorescence microscope</td>
			<td>Leica SP5</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axio imager</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer</td>
			<td>Mac or Pc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

two algorithms for high-throughput and multi-parametric quantification of drosophila neuromuscular junction morphology

Sinaptik morfolojisi sinaptik etkinlik için sıkı ilişkili olduğu ve birçok durumda morfolojik sinaps kusurları sonuçta sinaptik arızalanmasına yol açar. Drosophila larva nöromuskular (NMJ), glütamaterjik sinapslarda büyük bir köklü model yaygın olarak yıllardır çalışılmıştır. NMJ morfolojik kusurlara neden mutasyonların belirlenmesi sinaps gelişimi ve işlevi düzenleyen genlerin bir repertuarı ortaya çıkardı. Bunların çoğu Drosophila NMJ morfolojik anormallikleri tespit etmek için nitel yaklaşımlar üzerinde duruldu büyük ölçekli çalışmalarda tespit edilmiştir. nitel analizler bir dezavantajı NMJ morfolojisi katkıda birçok ince oyuncu muhtemelen fark edilmeden kalması. nicel analizler ustaca morfolojik farklılıkları tespit etmek için gerekli olan Halbuki onlar zahmetli olduğu için, bu tür analizler henüz yaygın gerçekleştirilen değildir. Bu protokol detay iki görüntü analiz algoritmaları açıklar &quot;Drosophila </emDrosophila NMJ, kantitatif doğru ve objektif morfometrik analiz Fiji uyumlu makrolar gibi mevcut&gt; NMJ Morfometri&quot; ve &#39;Drosophila NMJ Bouton Morfometri&#39;. Bu metodoloji, yaygın olarak kullanılan belirteçler ile immunolabeled NMJ terminalleri analiz etmek için geliştirilmiştir Dlg-1 ve . BRP Ayrıca, bu tür Hrp, CSP ve SYT gibi diğer belirteçler onun daha geniş uygulama bu protokolde sunulan makro dokuz morfolojik NMJ özelliklerini değerlendirmek için edebiliyoruz. NMJ alanı, NMJ çevre, bOUTONS sayısı NMJ uzunluk, NMJ en uzun şube uzunluk, adacıkların sayısı, dal sayısı, dallanma noktaları ve NMJ terminali aktif bölgelerin sayısı.

Watch this Scientific Journal Video about Two Algorithms for High-throughput and Multi-parametric Quantification of Drosophila Neuromuscular Junction Morphology at JoVE.com

Two Algorithms for High-throughput and Multi-parametric Quantification of Drosophila Neuromuscular Junction Morphology

İki görüntü analiz algoritmaları, &quot;Drosophila NMJ Morfometri&quot; ve &quot;Drosophila NMJ Bouton Morfometri&quot; otomatik Drosophila nöromüsküler kavşakta (NMJ) dokuz morfolojik özelliklerini ölçmek için, yaratıldı.

Yüksek throughput ve Çok parametrik Nicelik için iki Algoritmalar<em&gt; Drosophila</em&gt; Nöromusküler Junction Morfoloji

Synaptic morphology is tightly related to synaptic efficacy, and in many cases morphological synapse defects ultimately lead to synaptic malfunction. The ...

two-algorithms-for-high-throughput-multi-parametric-quantification

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Two Algorithms for High-throughput and Multi-parametric Quantification of Drosophila Neuromuscular Junction Morphology

9.6K Görüntüleme.  Radboud University Medical Center.  İki görüntü analiz algoritmaları, "Drosophila NMJ Morfometri" ve "Drosophila NMJ Bouton Morfometri" otomatik Drosophila nöromüsküler kavşakta (NMJ) dokuz morfolojik özelliklerini ölçmek için, yaratıldı. 

Video: Two Algorithms for High-throughput and Multi-parametric Quantification of Drosophila Neuromuscular Junction Morphology

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

The Drosophila larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila is well known for the ease of powerful genetic manipulations and the larval nervous system has proven particularly useful in studying not only normal function but also perturbations that accompany some neurological disease (Lloyd and Taylor, 2010). Many key synaptic molecules found in Drosophila are also found in mammals and like most CNS excitatory synapses in mammals, the Drosophila NMJ is glutamatergic and demonstrates activity-dependent remodeling (Kohet al. , 2000). Additionally, Drosophila neurons can be individually identified because their innervation patterns are stereotyped and repetitive making it possible to study identified synaptic terminals, such as those between motor neurons and the body-wall muscle fibers that they innervate (Keshishian and Kim, 2004). The existence of evolutionarily conserved synapse components along with the ease of genetic and physical manipulation make the Drosophila model ideal for investigating the mechanisms underlying synaptic function (Budnik, 1996).
The active zones at synaptic terminals are of particular interest because these are the sites of neurotransmitter release. NC82 is a monoclonal antibody that recognizes the Drosophila protein Bruchpilot (Brp), a CAST1/ERC family member that is an important component of the active zone (Waghet al. , 2006). Brp was shown to directly shape the active zone T-bar and is responsible for effectively clustering Ca2+ channels beneath the T-bar density (Fouquetet al. , 2009). Mutants of Brp have reduced Ca2+ channel density, depressed evoked vesicle release, and altered short-term plasticity (Kittelet al. , 2006). Alterations to active zones have been observed in Drosophila disease models. For example, immunofluorescence using the NC82 antibody showed that the active zone density was decreased in models of amyotrophic lateral sclerosis and Pitt-Hopkins syndrome (Ratnaparkhiet al. , 2008; Zweieret al. , 2009). Thus, evaluation of active zones, or other synaptic proteins, in Drosophila larvae models of disease may provide a valuable initial clue to the presence of a synaptic defect.
Preparing whole-mount dissected Drosophila larvae for immunofluorescence analysis of the NMJ requires some skill, but can be accomplished by most scientists with a little practice. Presented is a method that provides for multiple larvae to be dissected and immunostained in the same dissection dish, limiting environmental differences between each genotype and providing sufficient animals for confidence in reproducibility and statistical analysis.

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

The neuromuscular junction (NMJ) of Drosophila melanogaster is an important model system for studying normal synaptic function as well as perturbations to synaptic function found in certain neurological diseases. We present a protocol for dissection of the Drosophila larval motor system and immunostaining for active zone proteins within the NMJ.

Aktif Bölgeleri Diseksiyon ve Görüntüleme Drosophila Nöromüsküler Junction

The Drosophila  larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila  is well known for ...

Nörobilim

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge. Gene targeting to generate constitutive or conditional loss of function knockouts remains cost and labor intensive, as well as time consuming. Adding to these challenges, retina expressed genes may have essential roles outside the retina leading to unintended confounds when using a knockout approach. Furthermore, the ability to ectopically express a gene in a gain of function experiment can be extremely valuable when attempting to identify a role in cell fate specification and/or terminal differentiation.
We present a method for the rapid and efficient incorporation of DNA plasmids into the neonatal mouse retina by electroporation. The application of short electrical impulses above a certain field strength results in a transient increase in plasma membrane permeability, facilitating the transfer of material across the membrane 1,2,3,4. Groundbreaking work demonstrated that electroporation could be utilized as a method of gene transfer into mammalian cells by inducing the formation of hydrophilic plasma membrane pores allowing the passage of highly charged DNA through the lipid bilayer 5. Continuous technical development has resulted in the viability of electroporation as a method for in vivo gene transfer in multiple mouse tissues including the retina, the method for which is described herein 6, 7, 8, 9, 10. 
DNA solution is injected into the subretinal space so that DNA is placed between the retinal pigmented epithelium and retina of the neonatal (P0) mouse and electrical pulses are applied using a tweezer electrode. The lateral placement of the eyes in the mouse allows for the easy orientation of the tweezer electrode to the necessary negative pole-DNA-retina-positive pole alignment. Extensive incorporation and expression of transferred genes can be identified by postnatal day 2 (P2). Due to the lack of significant lateral migration of cells in the retina, electroporated and non-electroporated regions are generated. Non-electroporated regions may serve as internal histological controls where appropriate. 
Retinal electroporation can be used to express a gene under a ubiquitous promoter, such as CAG, or to disrupt gene function using shRNA constructs or Cre-recombinase. More targeted expression can be achieved by designing constructs with cell specific gene promoters. Visualization of electroporated cells is achieved using bicistronic constructs expressing GFP or by co-electroporating a GFP expression construct. Furthermore, multiple constructs may be electroporated for the study of combinatorial gene effects or simultaneous gain and loss of function of different genes. Retinal electroporation may also be utilized for the analysis of genomic cis-regulatory elements by generating appropriate expression constructs and deletion mutants. Such experiments can be used to identify cis-regulatory regions sufficient or required for cell specific gene expression 11. Potential experiments are limited only by construct availability.

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

A method for the incorporation of plasmid DNA into murine retinal cells for the purpose of performing either gain- or loss of function studies in vivo is presented. This method capitalizes on the transient increase in permeability of cell plasma membranes induced by the application of an external electrical field.

Gelişmekte olan Fare Retina in vivo Elektroporasyon olarak

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system and has served as guiding model to study synaptic structure and function. In mouse NMJs motor axon terminals form pretzel-like contact sites with muscle fibers. The motor axon and its terminal are sheathed by SCs. Over the past decades, several transgenic mice have been generated to visualize motor neurons and SCs, for example Thy1-XFP1 and Plp-GFP mice2, respectively.
Along motor axons, myelinating axonal SCs are arranged in non-overlapping internodes, separated by nodes of Ranvier, to enable saltatory action potential propagation. In contrast, terminal SCs at the synapse are specialized glial cells, which monitor and promote neurotransmission, digest debris and guide regenerating axons. NMJs are tightly covered by up to half a dozen non-myelinating terminal SCs - these, however, cannot be individually resolved by light microscopy, as they are in direct membrane contact3.
Several approaches exist to individually visualize terminal SCs. None of these are flawless, though. For instance, dye filling, where single cells are impaled with a dye-filled microelectrode, requires destroying a labelled cell before filling a second one. This is not compatible with subsequent time-lapse recordings3. Multi-spectral "Brainbow" labeling of SCs has been achieved by using combinatorial expression of fluorescent proteins4. However, this technique requires combining several transgenes and is limited by the expression pattern of the promoters used. In the future, expression of "photo-switchable" proteins in SCs might be yet another alternative5. Here we present sequential photo-bleaching, where single cells are bleached, and their image obtained by subtraction. We believe that this approach - due to its ease and versatility - represents a lasting addition to the neuroscientist's technology palette, especially as it can be used in vivo and transferred to others cell types, anatomical sites or species6.
In the following protocol, we detail the application of sequential bleaching and subsequent confocal time-lapse microscopy to terminal SCs in triangularis sterni muscle explants. This thin, superficial and easily dissected nerve-muscle preparation7,8 has proven useful for studies of NMJ development, physiology and pathology9. Finally, we explain how the triangularis sterni muscle is prepared after fixation to perform correlated high-resolution confocal imaging, immunohistochemistry or ultrastructural examinations.

Visualizing individual cells in densely packed tissues, such as terminal Schwann cells (SCs) at neuromuscular junctions (NMJs), is challenging. "Sequential photo-bleaching" allows delineating single terminal SCs, for instance in the triangularis sterni muscle explant, a convenient nerve-muscle preparation, where sequential bleaching can be combined with time-lapse imaging and post-hoc immunostainings.

Sıralı Nöromusküler Kavşağı&#39;nda Tek Schwann Hücreleri belirginleştiren Photo-beyazlatma

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system ...

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat muscles can offer significant advantage over traditionally used thicker muscles, such as those from the hind limb (e.g. gastrocnemius). Thin muscles allow for comprehensive overview of the entire innervation pattern for a given muscle, which in turn permits identification of selectively vulnerable pools of motor neurons. These muscles also allow analysis of parameters such as motor unit size, axonal branching, and terminal/nodal sprouting. A common obstacle in using such muscles is gaining the technical expertise to dissect them. In this video, we detail the protocol for dissecting the transversus abdominis (TVA) muscle from young mice and performing immunofluorescence to visualize axons and neuromuscular junctions (NMJs). We demonstrate that this technique gives a complete overview of the innervation pattern of the TVA muscle&#160;and can be used to investigate NMJ pathology in a mouse model of the childhood motor neuron disease, spinal muscular atrophy.

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

In this video we demonstrate a protocol for dissection of the transversus abdominis muscle of the mouse and use immunofluorescence and microscopy to visualize neuromuscular junctions.

Tüm Montajlı Nöromüsküler Kavşak Analizi için Enine Abdominis Kasının Diseksiyonu

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat ...

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval neuromuscular junction (NMJ) in Drosophila. Previous studies have shown that the postsynaptic distribution of Dlg at the larval NMJ overlaps with that of Hu-li tai shao (Hts), a homologue to the mammalian adducins. In addition, Dlg and Hts are observed to form a complex with each other based on co-immunoprecipitation experiments involving whole adult fly lysates. Due to the nature of these experiments, however, it was unknown whether this complex exists specifically at the NMJ during larval development.
Proximity Ligation Assay (PLA) is a recently developed technique used mostly in cell and tissue culture that can detect protein-protein interactions in situ. In this assay, samples are incubated with primary antibodies against the two proteins of interest using standard immunohistochemical procedures. The primary antibodies are then detected with a specially designed pair of oligonucleotide-conjugated secondary antibodies, termed PLA probes, which can be used to generate a signal only when the two probes have bound in close proximity to each other. Thus, proteins that are in a complex can be visualized. Here, it is demonstrated how PLA can be used to detect in situ protein-protein interactions at the Drosophila larval NMJ. The technique is performed on larval body wall muscle preparations to show that a complex between Dlg and Hts does indeed exist at the postsynaptic region of NMJs.

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

This protocol demonstrates how Proximity Ligation Assay can be used to detect in situ protein-protein interactions at the Drosophila larval neuromuscular junction. With this technique, Discs large and Hu-li tai shao are shown to form a complex at the postsynaptic region, an association previously identified through co-immunoprecipitation.

Algılama<em&gt; In Situ</emEn&gt; Protein-protein kompleksleri<em&gt; Drosophila</emProximity ligasyon Testi Kullanımı&gt; Larva Nöromüsküler Junction

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval ...

FIM Imaging and FIMtrack: Two New Tools Allowing High-throughput and Cost Effective Locomotion Analysis

The analysis of neuronal network function requires a reliable measurement of behavioral traits. Since the behavior of freely moving animals is variable to a certain degree, many animals have to be analyzed, to obtain statistically significant data. This in turn requires a computer assisted automated quantification of locomotion patterns. To obtain high contrast images of almost translucent and small moving objects, a novel imaging technique based on frustrated total internal reflection called FIM was developed. In this setup, animals are only illuminated with infrared light at the very specific position of contact with the underlying crawling surface. This methodology results in very high contrast images. Subsequently, these high contrast images are processed using established contour tracking algorithms. Based on this, we developed the FIMTrack software, which serves to extract a number of features needed to quantitatively describe a large variety of locomotion characteristics. During the development of this software package, we focused our efforts on an open source architecture allowing the easy addition of further modules. The program operates platform independent and is accompanied by an intuitive GUI guiding the user through data analysis. All locomotion parameter values are given in form of csv files allowing further data analyses. In addition, a Results Viewer integrated into the tracking software provides the opportunity to interactively review and adjust the output, as might be needed during stimulus integration. The power of FIM and FIMTrack is demonstrated by studying the locomotion of Drosophila larvae.

FIM is a novel, cost effective imaging system designed to track small moving objects such as C. elegans, planaria or Drosophila larvae. The accompanying FIMTrack program is designed to deliver fast and efficient data analysis. Together, these tools allow high-throughput analysis of behavioral traits.

FIM Görüntüleme ve FIMtrack: Yüksek verim ve Maliyet Etkili Hareket Analizi izin İki Yeni Araçlar

The analysis of neuronal network function requires a reliable measurement of behavioral traits. Since the behavior of freely moving animals is variable to ...

High Throughput Assay to Examine Egg-Laying Preferences of Individual Drosophila melanogaster

Recently, egg-laying preference of Drosophila has emerged as a genetically tractable model to study the neural basis of simple decision-making processes. When selecting sites to deposit their eggs, female flies are capable of ranking the relative attractiveness of their options and choosing the &#34;greater of two goods.&#34; However, most egg-laying preference assays are not practical if one wants to take a systematic genetic screening approach to search for the circuit basis underlying this simple decision-making process, as they are population-based and laborious to set up. To increase the throughput of studying of egg-laying preferences of single females, we developed custom chambers that each can simultaneously assay egg-laying preferences of up to thirty individual flies as well as a protocol that ensures each female has a high egg-laying rate (so that their preference is readily discernable and more convincing). Our approach is simple to execute and produces very consistent results. Additionally, these chambers can be equipped with different attachments to allow video recording the egg-laying animals and to deliver light for optogenetics studies. This article provides the blueprints for fabricating these chambers and the procedure for preparing the flies to be assayed in these chambers.

High Throughput Assay to Examine Egg-Laying Preferences of Individual Drosophila melanogaster

This protocol describes a high throughput assay for testing egg-laying preferences of Drosophila melanogaster at single-animal resolution. This assay provides a simple, efficient, and scalable platform to identify genes and circuit components that control a simple decision-making process.

Yüksek Verimli Testi Bireyin Yumurta Yumurtlayan Tercihler incelemek için<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Recently, egg-laying preference of Drosophila has emerged as a genetically tractable model to study the neural basis of simple decision-making processes. ...

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic pathways. Quantitative descriptions are rarely performed, although genetic manipulations produce a range of phenotypic effects and variations are observed even among individuals within control groups.&#160;Emerging evidence shows that morphology, size and location of organelles play a previously underappreciated, yet fundamental role in cell function and survival. Here we provide step-by-step instructions for performing quantitative analyses of phenotypes at the Drosophila larval neuromuscular junction (NMJ). We use several reliable immuno-histochemical markers combined with bio-imaging techniques and morphometric analyses to examine the effects of genetic mutations on specific cellular processes. In particular, we focus on the quantitative analysis of phenotypes affecting morphology, size and position of nuclei within the striated muscles of Drosophila larvae. The Drosophila larval NMJ is a valuable experimental model to investigate the molecular mechanisms underlying the structure and the function of the neuromuscular system, both in health and disease. However, the methodologies we describe here can be extended to other systems as well.

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Morphology, size and location of intracellular organelles are evolutionarily conserved and appear to directly affect their function. Understanding the molecular mechanisms underlying these processes has become an important goal of modern biology. Here we show how these studies can be facilitated by the application of quantitative techniques.

En fenotip Karakterizasyonu: Niceleme Matters Neden<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva Nöromüsküler Junction

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

Measuring Neuromuscular Junction Functionality

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is impaired, such as aging and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Here we describe an experimental protocol that can be used to measure NMJ functionality by combining two types of electrical stimulation: direct muscle membrane stimulation and the stimulation through the nerve. The comparison of the muscle response to these two different stimulations can help to define, at the functional level, potential alterations in the NMJ that lead to functional decline in muscle.
Ex vivo preparations are suited to well-controlled studies. Here we describe an intensive protocol to measure several parameters of muscle and NMJ functionality for the soleus-sciatic nerve preparation and for the diaphragm-phrenic nerve preparation. The protocol lasts approximately 60 min and is conducted uninterruptedly by means of a custom-made software that measures the twitch kinetics properties, the force-frequency relationship for both muscle and nerve stimulations, and two parameters specific to NMJ functionality, i.e. neurotransmission failure and intratetanic fatigue. This methodology was used to detect damages in soleus and diaphragm muscle-nerve preparations by using SOD1G93A transgenic mouse, an experimental model of ALS that ubiquitously overexpresses the mutant antioxidant enzyme superoxide dismutase 1 (SOD1).

A functional assessment of the neuromuscular junction (NMJ) can provide essential information on the communication between muscle and nerve. Here we describe a protocol to comprehensively evaluate both the NMJ and muscle functionality using two different muscle-nerve preparations, i.e. soleus-sciatic and diaphragm-phrenic.

Nöromüsküler kavşak işlevleri ölçme

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is ...

Quantification of Drosophila Grooming Behavior

Drosophila grooming behavior is a complex multi-step locomotor program that requires coordinated movement of both forelegs and hindlegs. Here we present a grooming assay protocol and novel chamber design that is cost-efficient and scalable for either small or large-scale studies of Drosophila grooming. Flies are dusted all over their body with Brilliant Yellow dye and given time to remove the dye from their bodies within the chamber. Flies are then deposited in a set volume of ethanol to solubilize the dye. The relative spectral absorbance of dye-ethanol samples for groomed versus ungroomed animals are measured and recorded. The protocol yields quantitative data of dye accumulation for individual flies, which can be easily averaged and compared across samples. This allows experimental designs to easily evaluate grooming ability for mutant animal studies or circuit manipulations. This efficient procedure is both versatile and scalable. We show work-flow of the protocol and comparative data between WT animals and mutant animals for the Drosophila type I Dopamine Receptor (DopR).

This protocol describes a scalable individual grooming assay technique in Drosophila that yields robust, quantitative data to measure grooming behavior. The method is based on comparing the difference in dye accumulation on the bodies of un-groomed versus groomed animals over a set period of time.

Drosophila Bakım Davranışının Nicelleştirilmesi

Drosophila grooming behavior is a complex multi-step locomotor program that requires coordinated movement of both forelegs and hindlegs. Here we present a ...