TEM'in dağınık dağılımı ve sınırlı görsel aralığı, altyapı analizi için zorluklar ortaya çıkarmaktadır. Bu protokol, geleneksel yaklaşımı aşan yenilikçi ve verimli bir numune hazırlama yöntemi sunar. Bu gelişmiş TEM numune hazırlama yöntemi, numunelerin sonraki dehidrasyon sırasında düz kalmasına izin vererek, geleneksel yönteme kıyasla numunelerin kıvrılmasını önlemede daha etkilidir.
Numune tipine bağlı olarak reaktiflerin seçimi ve dozajın ayarlanması gerekli olmalıdır. Numune hazırlama sürecinde kullanılan birçok toksik kimyasal reaktif vardır. Prosedürü göstermek, Dr.Gan Guangming'in laboratuvarından bir yüksek lisans öğrencisi olan Sheng Qingyuan olacak.
Başlamak için, Ocak çözeltisinde dolaşan üçüncü instar Drosophila larvalarını inceleyin ve standart prosedürlere göre tüm vücut duvarını elde edin. Larva vücut duvarını sabitleyici ile diseksiyon odasına gece boyunca dört santigrat derecede sabitleyin. Ertesi gün, larva vücut duvarını diseksiyon odasından 1.5 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın ve birkaç kez sodyum kakodilat tamponu ile durulayın.
Larva vücut duvarını iki saat boyunca% 1 osmiyum tetroksit içinde sabitleyin. Fiksasyondan sonra, numuneleri birkaç kez damıtılmış suyla yıkayın. PHI nöromüsküler kavşağı boyamak için tüpe% 2 doymuş pisuar asetat çözeltisi ekleyin.
Ve iki saat sonra, numuneleri deiyonize su ile durulayın. Daha sonra makas kullanarak, gözenek boyutu 270 mikron olan iki yuvarlak metal ağ parçası kesin. Metal ağı düz tabanlı bir şişenin tabanına yerleştirin.
Daha sonra sabit larvaları ağın üzerine yerleştirin ve ardından başka bir ağ yerleştirin. Numuneleri, her biri dört santigrat derecede 20 dakika boyunca artan bir etanol konsantrasyonunda kurutun. Daha sonra numuneleri oda sıcaklığında her biri beş dakika propilen oksit ile iki kez durulayın.
Daha sonra, numuneleri bir propilen oksit ve epoksi reçine çözeltisine, ardından oda sıcaklığında iki saat boyunca saf epoksi reçineye yerleştirin. Gömmek için, bir polietilen filmi büyük bir kareye ve küçük, içi boş bir dikdörtgen desteğe kesin. Küçük kareyi büyük kareyle yapıştırın.
Büyük karenin ortasına yeterli miktarda epoksi reçine ekleyin. Ardından stereoskopu açın ve numuneleri kas tarafı yukarı bakacak şekilde önceden konumlandırılmış epoksi reçineye yerleştirin. Numunelerin üzerine birkaç damla epoksi reçine ekleyin ve üzerlerini polietilen film ile kaplayın.
Numuneleri polimerizasyon için her biri 24 saat boyunca artan sıcaklıklarda yerleştirin. Polimerizasyondan sonra, keskin bir bıçak kullanarak, A2 ve A3 segmenti de dahil olmak üzere bir yamuk tutarken larva gövdesinin fazla kısımlarını çıkarın. Yamuğu kalan larva vücut duvarından çıkarın ve AB yapıştırıcısı ile reçine dolu kapsüle yapıştırın.
Işık mikroskobu altında, A2 ve A3 segmentlerinin altıncı ve yedinci kaslarının pozisyonunu onaylayın ve teğet düzlemini altıncı kasa paralel tutun. Ardından, A3 segmentinin iki tarafı boyunca numunenin beşte birini kesin. Bir mikrotom kullanarak, altıncı kastan başlayarak numunenin ultra ince bir bölümünü hazırlayın.
Bölümlere ayırdıktan sonra, her bir bakır ağa mümkün olduğunca çok dilim ekleyin. Numuneleri gözlemlemek için bir transmisyon elektron mikroskobu kullanın. Lowicryl K4M reçinesi ve epoksi reçinesi arasında Lowicryl K4M reçinesi, Drosophila vücut kaslarının daha keskin ve daha kolay gözlemlenebilir sonuçlarını sağladı.
Konfokal görüntüleme, altıncı ve yedinci kaslar arasındaki nöromüsküler kavşağın gelişmiş görselleştirmesini gösterdi. Transmisyon elektron mikroskobu, gelişmiş sinaptik yapı bilgisi sunan boncuk benzeri nöromüsküler kavşakları ortaya çıkardı. Numuneler, metal ağların kısıtlanması nedeniyle dehidrasyon işlemi boyunca düz kaldı.
Ayrıca, numuneler plastik ürünler arasında polimerize edilerek numunelerin katlanması önlendi. Gelecekte, TEM numune hazırlama yöntemi beyin ve ventral sinir kordonu nöropillerine uygulanabilir ve böylece ultrastrüktürel araştırmaların potansiyelini artırabilir.
