Bu çalışma, İsviçre Ulusal Bilim Vakfı hibe (Pierre Fontana 310030_162579 / Brenda Renata Kwak 1 ve 320030_144150) yanı sıra ile İsviçre Kalp Vakfı bir hibe ile desteklenmiştir.

Beş ilgisiz sağlıklı gönüllüler trombosit izolasyon ve kümelenme testleri için kan örneği almak için alınmıştır. Yazılı onayları alınmıştır ve protokol Cenevre Üniversitesi Hastaneleri&#39;nin Merkez Etik Komitesi tarafından onaylandı. sertifikalı Tüm gönüllüler sağlıklı olmak için ve deneyler öncesinde en az 10 gün boyunca herhangi bir trombosit müdahale ilaçları almamış etmek. İnsan Kan Toplama 1. Tampon Hazırlama ve Yıkanmış Trombosit İzolasyonu <ol><li> (Cı-6H 8 O 7 • H2O, 66.6 mM), 2.5 gr trisodyum sitrat dihidrat (Na3 C6 H5 1.4 g sitrik asit monohidrat çözülmesiyle asit sitrat dektroz (CD) bir 100 ml sulu çözelti hazırlayın O 7 • 2 H2O, 85 mM) ve susuz D (+) 2 g - glikoz ihtiva eder. Çözeltinin pH değeri yaklaşık 4.5 olan. </li><li> Şöyle Tyrode tampon için stok çözelti hazırlayın<ol><li> , Nispi final konsantrasyon 2.73 M, 238 53.6 mM olan, 10 g NaHCC 3 ve 0.58 g NaH2 4 * H damıtılmış H2O 500 mL 2 O 80 g NaCl, 2 g KCI çözülmesiyle stok çözelti hazırlayın 1 mM ve 8.4 mm. 4 ° C&#39;de çözelti tutun. </li><li> O 4 ° C&#39;de çözüm tutun H2 damıtılmış 500 ml içinde 10.15 g MgCl2 x 6 H2O (100 mM) eritilmesi ile stok solüsyonu 2 hazırlayın. </li><li> 10.95 g O, 4 ° C &#39;de çözüm tutun 2 O 500 ml damıtılmış H2 (100 mM) CaCl2 * 6H eritilerek stok çözelti 3 hazırlanır. </li></ol></li><li> 136,5 mM NaCl, 2.68 mM KCI, nihai konsantrasyonlara karşılık gelir Bu damıtık H2O ile 50 mL&#39;lik bir son hacim içinde stok çözeltisi 1 2.5 mL seyreltilerek Tyrode tamponu hazırlayın 11.9 mM NaHCOj 3 ve 0.42 mM NaH2? 4 * H2O 7.35 pH ayarlamak ve 0.22 um f filtre edilerek sterilizeiltrelerini. </li><li> 5 ml stok çözeltisi 1 seyreltilmesi ile Tyrode albümin% 0.35 tamponu (TA tamponu 7) hazırlanması, stok çözeltisi 2, 1 mL stok solüsyonu 3, 0.5 mL 1 M HEPES, 200 g / L, insan serum albümini, 1.8 ml 2 ml ve susuz D (+) 0.1 g - 100 mL&#39;lik nihai bir hacim içinde glükoz damıtık H2O <ol><li> 1 N HCI ile 7,35 pH ayarlama ve damıtılmış H2O (toplam hacmin% 10) eklenmesi ile 295 mOsm / L ozmolarite ayarlayın. Bu çözelti içinde nihai konsantrasyonları şunlardır: 124 mM NaCI, 2.44 mM KCI, 10.82 mM NaHCOj 3, 0.38 mM NaH2? 4 * H2O, 0.91 mM MgCl2 x 6 H2O, 1.82 mM CaCl2 * 6 H2O . tüm deney boyunca 37 ° C &#39;de TA tamponu tutun. </li></ol></li></ol> 2. Kan Toplama <ol><li> Con 50 ml tüplere, bir 19 G iğne ve bir ya da düşük turnike kullanılarak antekubital damardan, venöz kan 45-50 mL toplamak(Kan 6 hacim 1 hacim ACD) ettirilmesi ACD antikoagülan. trombin ve doku faktörü yok etmek için kan ilk 1-2 mL atın. <ol><li> Toplandıktan sonra yavaşça tersini tüp ACD ile kan karıştırın. 37 ° C&#39;de 10 dakika boyunca örnek inkübe. </li></ol></li></ol> İnsan 3. Bileşik Trombositler Yıkanmış <ol><li> 37 ° C&#39;ye kadar santrifüj önceden ısıtın. Bütün santrifüjleme aşamaları aşağıda bu sıcaklıkta gerçekleştirilir. </li><li> 13 dakika PRP elde etmek için 250 x g&#39;de 15 ml tüpler (tüp başına 5 mL) ve santrifüj toplanmış kan gönderir. Not: Örnek üç tabakadan üretimindeki bu santrifüjleme aşaması sonucu: 1) üst tabaka, plazma, trombositler oluşur ve beyaz kan hücrelerinin çok küçük bir bölümü. 2) ara tabaka, beyaz kan hücreleri açısından zengin bir bölümü. 3) esas olarak kırmızı kan hücrelerinden oluşur alt tabaka. </li><li> Üst la pipetleme PRP toplayınYer dikkatli bir şekilde maksimum kırmızı ve beyaz kan hücreleri ile kirlenmesini önlemek ve 37 ° C&#39;de 10 dakika boyunca inkübasyona yeni bir 15 mL tüpe. </li><li> (5 ml PRP) 12 dakika boyunca 2200 x g&#39;de PRP santrifüjleyin. NOT: Bu santrifüj aşaması düşük frenle veya frensiz yapılmalıdır. </li><li> Süpernatant (trombosit bakımından fakir plazma) çıkarın ve dikkatli bir şekilde bir plastik pastör pipeti kullanılarak, heparin 2 uL / mL içeren ta tamponu, 10 mL (5000 U / ml) ve 25 uM PGI2 2.5 uL / mL pelletini. 37 ° C&#39;de 10 dakika süreyle inkübe edilir. </li><li> (Düşük fren veya fren olmadan) 1,900 x g&#39;de 8 dakika boyunca 25 uM PGI2 ve santrifüj 2.5 uL / mL ekleyin. </li><li> Süpernatantı ve bir plastik pastör pipeti kullanılarak 25 uM PGI2 2.5 uL / mL içeren 5 ml ta tamponu ile pelletini. 37 ° C&#39;de 10 dakika süreyle inkübe edilir. </li><li> İnkübasyon sırasında, trombosit süspansiyonu 150 uL pipetleyinve 1.5 ml tüp otomatize hücre sayacı (bu doğru akım direnci değişiklikleri ölçerek kan hücrelerinin boyutunu tespit eder) kullanılarak, trombositler sayısı. </li><li> 10 dakika inkübasyondan sonra, trombosit süspansiyonuna 25 uM PGI2 2.5 uL / mL eklemek ve hemen sonra 8 dakika boyunca 1.900 x g&#39;de santrifüj. </li><li> Süpernatantı ve ta tamponu yeterli bir hacmi ile 250.000 trombosit / uL bir konsantrasyona pelletini U 0.01 apiraz 32 uL / mL ihtiva eden (hücre sayısı uL 500.000, 10 ml ta tamponu içinde tekrar süspansiyon yani ise) / ml (son konsantrasyon, 0.32 U / ml). Not: apiraz yüksek konsantrasyonu agonistleri yokluğunda, ATP 10, 11 kendiliğinden salgılanmasıyla oluşan P2X1 reseptörlerinin desensitizasyon önlemek için kullanılır. Kollajen ile indüklenen tepkileri hızlı parakrin ile uyarılmaktadır Bu önemlidir, çünkü / ATP tarafından P2X1 otokrin aktivasyon fr yayımlananom trombosit aktive. trombosit sinyal yolu kritik P2X1 fonksiyonunun korunmasına gerektirmez ise, 0.02 U / ml apiraz kullanın. (Mahaut-Smith ve ark., 10 gözden) çeşitli çalışmalar 0.02 U / ml apiraz ihmal edilebilir P2X1 yanıtlarla ADP reseptör P2Y1 duyarsızlaştırma engellediğini göstermiştir. </li><li> aggregometric ölçümleri yapılmadan önce, 37 ° C&#39;de en az 30 dakika boyunca bir hücre süspansiyonu inkübe edin. Hazırlama 5 ile 8 saat boyunca stabildir. </li></ol> 4. agregometri <ol><li> Tyrode tampon içinde fibrinojen (56 mg / ml) hazırlayın. </li><li> Cam küvet içine trombosit süspansiyonu pipetleyin 260 uL (Şekil 1A, sol küvet) - bekletme oyuklarında, bu 37 ° C &#39;de 3 dakika 10 fibrinojen uL (56 mg / ml) ve bir manyetik karıştırma çubuğu içeren, daha sonra 2 süspansiyonu inkübe agregometre (Şekil 1B ve 1C) içinde. </li><li> Panx1 ile önceden kuluçkayaönleyicisi Parlak Mavi ÜİT 37 ° C &#39;de, 7 dakika için 2.8 mM veya 28 mM stok çözeltisi (nihai konsantrasyon 100 uM ve 1 sırasıyla mM), 10 uL eklenmesiyle gerçekleştirilebilir. </li><li> 10 uL fibrinojen (56 mg / ml), trombositler olmadan 10 uL Parlak Mavi FCF (2.8 mM veya 28 mM) ve TA tamponu ihtiva eden bir küvete OD&#39;si ölçülerek, bir varsayımsal% 100 agregasyon değerine agregometre kalibre edin. <ol><li> Bir toplama de altında otomatik olarak karıştırıldı küvet yerleştirilir ve (agregasyon da 1 kullanılırsa, örneğin, pres F1) agregometrede bağlantılı bilgisayarın klavyesi karşılık gelen düğmesine basın. NOT: Aşağıda açıklanan Bu deney Parlak Mavi ÜİT içerir. Kalibrasyon için kullanılan bileşik deney koşulu için ayarlanmalıdır. </li></ol></li><li> Otomatik karıştırma altında deney için kullanılacak olan aynı trombosit örnek kullanarak, bir varsayımsal% 0 agregasyon değerine agregometre kalibreg. <ol><li> İyi bir araya getirilmesinde küvet koyun ve agregometre bağlantılı bilgisayarın klavyesinde karşılık gelen düğmeye basın. Devam etmeden önce yaklaşık 20-30 sn bekleyin. Bu gecikme hiçbir toplama agonistleri eklemeden önce olur sağlamak için hizmet vermektedir. Not: trombosit sayısında herhangi bir fark ölçülen OD üzerinde bir etkiye sahip gibi,% 0 kalibrasyon adımı, her bir ölçüm için tekrar edilmesi gerekmektedir. </li></ol></li><li> küvet içine, (75 uM son), araşidonik asidin arzu edilen agonist 20 uL, örneğin 15 ug / ml kolajen (1 ug / mL nihai) ya da 1.125 mM ekleyin. Hemen agregometrede bağlantılı bilgisayarın klavyesi karşılık gelen düğmeye basarak sürekli otomatik karıştırma altında kayıt başlar. Not: agonist ilave trombosit aktivasyonuna yol açar. Trombosit agregalar açık deneyde (Şekil 1A sonunda cam küvet içinde ayırt edilebilir; Right küvet). </li><li> kayıt otomatik 6 dakika sonra durur. Bu noktada, bilgisayarın tasarruf simgesine tıklayarak verileri kaydetmek. Not: agregasyon hızının hesaplanması yüzdesi olarak kümelenme işlemi uç sonuçlar ifade bilgisayar tarafından gerçekleştirilir. </li><li> Verileri analiz edin. <ol><li> Yıkanmış trombositler süspansiyonlar ve trombosit agregasyonunun türbidimetrik ölçüm hazırlanması için protokoller ek detaylı bilgi için bu alanda 12, 13, uzmanlar tarafından kaleme diğer kağıtlar bakın. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Patel, S. R., Hartwig, J. H., Italiano, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biogenesis+of+platelets+from+megakaryocyte+proplatelets.">The biogenesis of platelets from megakaryocyte proplatelets.</a> J Clin Invest. 115 (12), 3348-3354 (2005).</li><li>Andrews, R. K., Berndt, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+physiology+and+thrombosis.">Platelet physiology and thrombosis.</a> Thromb Res. 114 (5-6), 447-453 (2004).</li><li>Go, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+disease+and+stroke+statistics--2014+update:+a+report+from+the+American+Heart+Association.">Heart disease and stroke statistics--2014 update: a report from the American Heart Association.</a> Circulation. 129 (3), e28-e292 (2014).</li><li>Creager, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Results+of+the+CAPRIE+trial:+efficacy+and+safety+of+clopidogrel.+Clopidogrel+versus+aspirin+in+patients+at+risk+of+ischaemic+events.">Results of the CAPRIE trial: efficacy and safety of clopidogrel. Clopidogrel versus aspirin in patients at risk of ischaemic events.</a> Vasc Med. 3 (3), 257-260 (1998).</li><li>Born, G. V., Cross, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Aggregation+of+Blood+Platelets.">The Aggregation of Blood Platelets.</a> J Physiol. 168, 178-195 (1963).</li><li>Cazenave, J. P., Hemmendinger, S., Beretz, A., Sutter-Bay, A., Launay, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=[Platelet+aggregation:+a+tool+for+clinical+investigation+and+pharmacological+study+Methodology].">[Platelet aggregation: a tool for clinical investigation and pharmacological study Methodology].</a> Ann Biol Clin (Paris). 41 (3), 167-179 (1983).</li><li>Molica, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+role+of+a+polymorphism+in+the+Pannexin1+gene+in+collagen-induced+platelet+aggregation.">Functional role of a polymorphism in the Pannexin1 gene in collagen-induced platelet aggregation.</a> Thromb Haemost. 114 (2), 325-336 (2015).</li><li>Taylor, K. A., Wright, J. R., Vial, C., Evans, R. J., Mahaut-Smith, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amplification+of+human+platelet+activation+by+surface+pannexin-1+channels.">Amplification of human platelet activation by surface pannexin-1 channels.</a> J Thromb Haemost. 12 (6), 987-998 (2014).</li><li>Wang, J., Jackson, D. G., Dahl, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+food+dye+FD&amp;C+Blue+No.+1+is+a+selective+inhibitor+of+the+ATP+release+channel+Panx1.">The food dye FD&amp;C Blue No. 1 is a selective inhibitor of the ATP release channel Panx1.</a> J Gen Physiol. 141 (5), 649-656 (2013).</li><li>Mahaut-Smith, M. P., Jones, S., Evans, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+P2X1+receptor+and+platelet+function.">The P2X1 receptor and platelet function.</a> Purinergic Signal. 7 (3), 341-356 (2011).</li><li>Hechler, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+platelet+functions+and+thrombosis+through+selective+or+nonselective+inhibition+of+the+platelet+P2+receptors+with+increasing+doses+of+NF449+[4,4',4'',4'''-(carbonylbis(imino-5,1,3-benzenetriylbis-(carbonylimino)))tetrakis+-benzene-1,3-disulfonic+acid+octasodium+salt].">Inhibition of platelet functions and thrombosis through selective or nonselective inhibition of the platelet P2 receptors with increasing doses of NF449 [4,4',4'',4'''-(carbonylbis(imino-5,1,3-benzenetriylbis-(carbonylimino)))tetrakis -benzene-1,3-disulfonic acid octasodium salt].</a> J Pharmacol Exp Ther. 314 (1), 232-243 (2005).</li><li>Cazenave, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+washed+platelet+suspensions+from+human+and+rodent+blood.">Preparation of washed platelet suspensions from human and rodent blood.</a> Methods Mol Biol. 272, 13-28 (2004).</li><li>Jarvis, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+aggregation:+turbidimetric+measurements.">Platelet aggregation: turbidimetric measurements.</a> Methods Mol Biol. 272, 65-76 (2004).</li><li>Thompson, N. T., Scrutton, M. C., Wallis, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+volume+changes+associated+with+light+transmittance+changes+in+the+platelet+aggregometer:+dependence+upon+aggregating+agent+and+effectiveness+of+stimulus.">Particle volume changes associated with light transmittance changes in the platelet aggregometer: dependence upon aggregating agent and effectiveness of stimulus.</a> Thromb Res. 41 (5), 615-626 (1986).</li><li>Malinski, J. A., Nelsestuen, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+of+turbidity+to+the+stages+of+platelet+aggregation.">Relationship of turbidity to the stages of platelet aggregation.</a> Biochim Biophys Acta. 882 (2), 177-182 (1986).</li><li>Riess, H., Braun, G., Brehm, G., Hiller, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+evaluation+of+platelet+aggregation+in+whole+human+blood.">Critical evaluation of platelet aggregation in whole human blood.</a> Am J Clin Pathol. 85 (1), 50-56 (1986).</li><li>Hayward, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evaluation+of+methods+for+determining+reference+intervals+for+light+transmission+platelet+aggregation+tests+on+samples+with+normal+or+reduced+platelet+counts.">An evaluation of methods for determining reference intervals for light transmission platelet aggregation tests on samples with normal or reduced platelet counts.</a> Thromb Haemost. 100 (1), 134-145 (2008).</li><li>Frelinger, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+function+tests,+independent+of+platelet+count,+are+associated+with+bleeding+severity+in.">Platelet function tests, independent of platelet count, are associated with bleeding severity in.</a> ITP. Blood. 126 (7), 873-879 (2015).</li><li>Fusegawa, Y., Goto, S., Handa, S., Kawada, T., Ando, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+spontaneous+aggregation+in+platelet-rich+plasma+is+increased+in+habitual+smokers.">Platelet spontaneous aggregation in platelet-rich plasma is increased in habitual smokers.</a> Thromb Res. 93 (6), 271-278 (1999).</li><li>Davis, R. B., Boyd, D. G., McKinney, M. E., Jones, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+exercise+and+exercise+conditioning+on+blood+platelet+function.">Effects of exercise and exercise conditioning on blood platelet function.</a> Med Sci Sports Exerc. 22 (1), 49-53 (1990).</li><li>Yee, D. L., Sun, C. W., Bergeron, A. L., Dong, J. F., Bray, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aggregometry+detects+platelet+hyperreactivity+in+healthy+individuals.">Aggregometry detects platelet hyperreactivity in healthy individuals.</a> Blood. 106 (8), 2723-2729 (2005).</li><li>Cattaneo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recommendations+for+the+Standardization+of+Light+Transmission+Aggregometry:+A+Consensus+of+the+Working+Party+from+the+Platelet+Physiology+Subcommittee+of+SSC/ISTH.">Recommendations for the Standardization of Light Transmission Aggregometry: A Consensus of the Working Party from the Platelet Physiology Subcommittee of SSC/ISTH.</a> J Thromb Haemost. , (2013).</li><li>Patel, D., Zhang, X., Veenstra, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin+hemichannel+and+pannexin+channel+electrophysiology:+how+do+they+differ?.">Connexin hemichannel and pannexin channel electrophysiology: how do they differ?.</a> FEBS Lett. 588 (8), 1372-1378 (2014).</li><li>European Food Safety Authority. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scientific+Opinion+on+the+re-evaluation+of+Brilliant+Blue+FCF+(E+133)+as+a+food+additive.">Scientific Opinion on the re-evaluation of Brilliant Blue FCF (E 133) as a food additive.</a> EFSA Journal. 8 (11), 1853-1889 (2010).</li><li>Lages, B., Scrutton, M. C., Holmsen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+gel-filtered+human+platelets:+isolation+and+characterization+in+a+medium+containing+no+added+Ca2+,+Mg2+,+or+K+.">Studies on gel-filtered human platelets: isolation and characterization in a medium containing no added Ca2+, Mg2+, or K+.</a> J Lab Clin Med. 85 (5), 811-825 (1975).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Kanama riskini artıran olmadan tromboz önlemek amacıyla trombosit fonksiyonunu modüle edebilen yeni ilaç bulmakta büyük bir ilgi vardır. Bu amaç için, güvenilir ve tekrarlanabilir bir insan plateletlerinde agregasyon karşılıklarının izlenmesi için, in vitro laboratuar testleri kesinlikle gereklidir. Bulanıklık agregometri gerçekleştirmek için kolay bir tekniktir. Ancak, bazı önlemler unutulmaması gerekir. toplama işlemi karıştırıldıktan büyük ölçüde bağımlı olduğu gibi ö...

Trombositler, kan ve pıhtılaşma ile ana işlevi-birlikte önemli bileşenleridir, kan damar hasarı sonrası kanamayı durdurmak için faktörlerin-olduğunu. Trombositler, kemik iliği 1 megakaryosit türetilmiş küçük (2-3 um) nukleussuz fragmanlarıdır. Trombositler ve bu süreçte mercek şeklinde yapılar olarak görünür, aktif olmayan halde dolaşır. endotelyumdaki kesinti üzerine, trombosit delik, birincil hemostaz adı verilen bir işlem takmak için kan damarı hasar bölgesinde toplanır. Başlangıçta, trombositler yaralanma yapışma aşama 2&#39;de bir sonucu olarak maruz kollajen ve von Willebrand faktörü gibi bir alt endotelial moleküller, ekleyin. Sonra, şekil değiştirebilir ve kimyasal haberciler-aktivasyon aşamasını salgılar. Son olarak, reseptörleri toplanma aşaması köprü ile birbirine bağlanır. Primer hemostaz stabilize fibrin birikimi, pıhtılaşma aktivasyonu kapsayan bir ikincil işlem takip ederBaşlangıç trombus 2 s. Miyokardiyal enfarktüs 3 olarak akut iskemik olaylar nedeniyle sıklıkla bir aterosklerotik plak fiziksel parçalama (kopma) arasında meydana trombusları. Güncel antiplatelet ilaçlar bu yaygın hastalığın tedavisinde temel taşlarıdır ancak klinik yarar kanama riskinde artış ile sınırlıdır. Kardiyovasküler hastalarda, aspirin ve anti-P2Y12 bileşikleri en çok önerilen ilaçlar, tromboksan A2 ve trombosit aktivasyonu giden ana yollar sırasıyla ADP yollar 4, hedef. Ancak, optimum antitrombotik etkileri ve hemorajik riski dengelemek olurdu yeni hedeflere doğru yenilikçi araştırmalar hala gereklidir. Bugüne 1960&#39;lardan 5 itibaren, türbidimetrik agregometri trombosit reaktivitesi ve i bilgimizi arttırmak, araştırma önemli bir rol oynamıştırİnsanlarda anti-trombotik reaktiflerin potansiyelinin kontrolü n. Türbidimetrik ilk kan örneklerinden ekstrakte PRP uygulanmıştır. Gerçekten de, kan toplama sitrat trombosit bütünlüğü ve işlevi üzerinde herhangi bir etkiye sahip olmaksızın PRP hızlı ve büyük üretimine izin verir içeren tüpler içerisinde gerçekleştirildi. Bununla birlikte, PRP kısa süreli kararlılık (yaklaşık 3 saat) ve trombin gibi kalan plazmatik enzim, ve potansiyel olarak artefakt agregasyon profilleri ile bağlantılı düşük kalsiyum konsantrasyonlu PRP kullanımı için önemli bir rahatsızlık vardır. Önemli bir ilerleme ek bir santrifüjleme ve yıkama 6 numaralı adımları ile trombosit izolasyonu için bir yöntemin geliştirilmesi olmuştur. bir izo-ozmotik bir fosfat tamponu (Tyrode tamponu) içeren glikoz, insan serum albumini ve iki değerli c tekrar askıya alınmadan önce Kısacası, PRP asit sitrat dektroz (CD) üzerinde alınan tam kandan izole edilir ve trombosit seri santrifüj aşamasından sonra izole ediliralar (Ca2 + ve Mg2 +). trombosit reaktivite değişiklikleri önlemek için, Tyrode tamponu pH dikkatli bir şekilde 7.35-7.4 tutulur. Ayrıca, trombositlerin arzu edilmeyen aktivasyonunun, bir santrifüj aşamasından önce (PGI2) prostasiklin ilave edilerek baskılanmaktadır. Son olarak, apiraz eklenmesi ATP / ADP etkisine karşı dirençli hale gelen yıkanmış trombositler engeller. Elde edilen trombosit süspansiyonu pıhtılaştırıcı faktörler sahip değildir ve PRP çözümlere kıyasla gibi platelet stabilitesi, en azından iki kat artar. Buna ek olarak, trombositler aktif olmayan fakat sağlam garanti eder türbidimetrik ölçümlerin tekrarlanabilirlik ve aslında optimal bir şekilde agonistleri veya trombosit agregasyon antagonistlerinin işlem çalışma olanağı sağlar. Bu yöntemi kullanarak, son çalışmada göstermiştir ki, bir genetik yaklaşım Panx1 kanallarının oluşumunu inhibe etmek (knock-out fareler) ya da farmakolojik ile Panx1 kanal aktivitesini azaltarakindirgenmiş kolajen ile uyarılan platelet birikmesini 7 yaklaşır. Panx1 her yerde bulunan bir insan trombositleri 7, 8 de dahil olmak üzere bir çok hücre tipinde ifade edilir, ATP-salım kanalları oluşturur. İnsan inhibe çeşitli agonistlerin ilavesinden önce daha çok ya da daha az spesifik kimyasal blokerleri (probenesid, meflokin, 10 Panx1 peptitler) bir panelin bir 7 dakika ön inkübasyon, kolajen ile uyarılan bu yıkanmış plateletler üzerinde Aslında, bulanıklık derecesi gösterdi platelet agregasyon AA ve ADP trombosit tepkileri etkilenmemektedir. Biz Panx1 kanallardan ATP salma, kolajen ile uyarılan agregasyonuna yol açan GPVI sinyalleme yolağında müdahale olduğunu göstermiştir. İlginç bir şekilde, başka hastalıkların (probenesid, meflokin) uygulamaları ile birden çok FDA onaylı bileşikler trombositlerde Panx1 kanallarının aktivitesini etkiler. Bir yandan, bu seçmek için yeni terapötik perspektifler açıyoryanıtını verdiler trombosit reaktivitesi değiştirin. Öte yandan, bir bu bileşiklerin potansiyel ikincil etkilerini dikkate almalıdır. Bu bağlamda, güvenli gıda boyası Parlak Mavi FCF Panx1 9 seçici bir inhibitörü olarak tarif edilmiştir birden fazla şeker ve enerji içecekleri kullanılır. Burada bir trombosit agregasyon antagonisti olarak Parlak Mavi FCF boya etkisini araştırmak üzere uyarlanmış insan yıkanmış trombositler ve trombosit agregasyon türbidimetrik ölçümleri izolasyonu için bir protokol açıklar.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>citric acid monohydrate (C6H8O7*H2O)</td>
			<td>Roth</td>
			<td>5949-29-1</td>
			<td>danger of eye damage/irritation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trisodium citrate dihydrate (Na3C6H5O7*2H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S1804</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate (NaHCO3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6014</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dihydrogenophosphate monohydrate (NaH2PO4*H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9638</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2*6H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9272</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride hexahydrate (CaCl2*6H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>442909</td>
			<td>danger of eye damage/irritation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (Hepes)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific&#160;</td>
			<td>15630</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human serum albumin</td>
			<td>CSL Behring</td>
			<td>00257/374</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hydrochloric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>320331</td>
			<td>Corrosive and irritative for the respiratory system. Can cause severe skin and eye damages.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf 5810 R</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>heparin</td>
			<td>Drosspharm AG/SA</td>
			<td>20810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>prostacyclin I2 (PGI2)</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>18220</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>apyrase from potatoes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6535</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fibrinogen (Haemocomplettan)</td>
			<td>CSL Behring</td>
			<td>HS 73466011</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>thrombo-aggragometer SD-Medical</td>
			<td>SD-Innovation</td>
			<td>TA8V</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant blue FCF (Erioglaucine disodium salt)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>80717</td>
			<td>Harmful to aquatic life with long lasting effects (Avoid release to the environnement)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagen</td>
			<td>Horm, Nycomed</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>arachidonic acid</td>
			<td>Bio/Data corporation</td>
			<td>C/N 101297</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell counter Sysmex KX-21N</td>
			<td>Sysmex Digitana&#160;</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-056</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass cuvettes</td>
			<td>SD-Innovation</td>
			<td>THCV1000</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnetic stirrers</td>
			<td>SD-Innovation</td>
			<td>THA100</td>
			<td>-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

turbidimetry on human washed platelets: the effect of the pannexin1-inhibitor brilliant blue fcf on collagen-induced aggregation

Türbidimetrik birine ait kullanım ya da agonist bir kombinasyonu ile (yıkanmış trombositler), ya plazma (platelet bakımından zengin plazma, PRP) &#39;de ya da tampon maddesi içinde süspansiyon haline getirildi, trombosit agregasyonunu ölçülmesi için tatbik edilen bir laboratuar tekniğidir. plazma ortamından ve antikoagülan yokluğunda ayrılır, yıkanır platelet kullanımı içsel trombosit özelliklerini incelemek için izin verir. agonistleri, arakidonik asit (AA), adenozin, di-fosfat (ADP), büyük panelin arasında, trombin ve kollajen en sık kullanılanlardır. agregasyon yanıtı sürekli karıştırma altında trombosit süspansiyonu zamanla görece optik yoğunluk (OD) ölçerek belirlenir. Homojen süspansiyon içinde trombositler bir agonistin eklenmesinden sonra ışığın geçişini sınırlandırmak, trombosit şekil değişimi OD küçük geçici artış meydana oluşur. Bu ilk Aktivasyon aşamasından sonra, trombosit pıhtıları, res olarak süspansiyon içinden ışığın geçmesine izin veren, yavaş yavaş meydanave ön muamele OD azalmıştır. toplama işlemi sonunda, trombosit bakımından fakir plazma ya da tampon OD ile karşılaştırıldığında, bir yüzde olarak ifade edilir. Titiz kalibrasyon her denemenin başında dolayısıyla esastır. Genel bir kural olarak: Kalibrasyon% 0 hiçbir trombositlerden oluşan süspansiyon ortamının OD ölçümü% 100 arasında bir değere temsil ederken olmayan bir uyarılan platelet süspansiyonu OD ölçümü ile ayarlanır. Trombosit agregasyonu, genellikle gerçek zamanlı agregasyon eğrisinin olarak görülür. Türbidimetrik platelet fonksiyonunun incelenmesi için en yaygın olarak kullanılan laboratuar tekniklerinden biridir ve tarihi altın standart olarak kabul edilir ve platelet toplanmasını inhibe etmeyi hedefleyen yeni farmasötik maddelerin geliştirilmesi için kullanılır. Burada, insan hazırlanması yıkanmış plateletler ve insan kolajen kaynaklı agregasyonun 2) türbidimetrik analiz trombositler son kimliklerini olduğu gıda boyası Parlak Mavi FCF ile ön işleme tabi tutulmuş, yıkanmış) 1 için ayrıntılı protokoller tarifPannexin1 (Panx1) kanallarının bir inhibitörü olarak tified.

agregasyonu yazılım otomatik agregasyon eğri oluşturur ve yüzde olarak maksimum agregasyon değerlerini vermektedir. değerleri istatistiksel analiz ve çubuk grafikler halinde maksimum toplanma değerleri görselleştirmek için bir veri analiz yazılımı kopyalanabilir. İsteğe bağlı olarak, toplama eğrileri her bir nokta eğrileri görselleştirmek için bir tablo yazılımı içine ve daha sonra istatistiksel yazılım (örneğin, GraphPad) art arda verilebilir. Ba...

Watch this Scientific Journal Video about Turbidimetry on Human Washed Platelets: The Effect of the Pannexin1-inhibitor Brilliant Blue FCF on Collagen-induced Aggregation at JoVE.com

Turbidimetry on Human Washed Platelets: The Effect of the Pannexin1-inhibitor Brilliant Blue FCF on Collagen-induced Aggregation

Biz bulanıklık derecesi agonist kaynaklı trombosit agregasyon ölçümleri ile takip insan kanından yıkanıp trombosit izolasyonu için basit bir yöntem tarif eder. Bir örnek olarak, Pannexin1 kanalı inhibitörü Parlak Mavi FCF ile bir ön kuluçkalama sonrası kollajen insan trombosit agregasyon cevap üzerinde çalışma yapılması için bu yöntemi uygulanır.

Kollajen ile indüklenen on Aggregation Pannexin1-inhibitör Parlak Mavi FCF: Türbidimetrik İnsanlar üzerinde Trombositler Yıkanmış

Turbidimetry is a laboratory technique that is applied to measure the aggregation of platelets suspended in either plasma (platelet-rich plasma, PRP) or ...

turbidimetry-on-human-washed-platelets-effect-pannexin1-inhibitor

Research

JoVE Journal

Medicine

11.9K Görüntüleme.  University of Geneva.  Biz bulanıklık derecesi agonist kaynaklı trombosit agregasyon ölçümleri ile takip insan kanından yıkanıp trombosit izolasyonu için basit bir yöntem tarif eder. Bir örnek olarak, Pannexin1 kanalı inhibitörü Parlak Mavi FCF ile bir ön kuluçkalama sonrası kollajen insan trombosit agregasyon cevap üzerinde çalışma yapılması için bu yöntemi uygulanır. 

Video: Turbidimetry on Human Washed Platelets: The Effect of the Pannexin1-inhibitor Brilliant Blue FCF on Collagen-induced Aggregation

A Contusive Model of Unilateral Cervical Spinal Cord Injury Using the Infinite Horizon Impactor

While the majority of human spinal cord injuries occur in the cervical spinal cord, the vast majority of laboratory research employs animal models of spinal cord injury (SCI) in which the thoracic spinal cord is injured. Additionally, because most human cord injuries occur as the result of blunt, non-penetrating trauma (e.g. motor vehicle accident, sporting injury) where the spinal cord is violently struck by displaced bone or soft tissues, the majority of SCI researchers are of the opinion that the most clinically relevant injury models are those in which the spinal cord is rapidly contused.1 Therefore, an important step in the preclinical evaluation of novel treatments on their way to human translation is an assessment of their efficacy in a model of contusion SCI within the cervical spinal cord. Here, we describe the technical aspects and resultant anatomical and behavioral outcomes of an unilateral contusive model of cervical SCI that employs the Infinite Horizon spinal cord injury impactor.
Sprague Dawley rats underwent a left-sided unilateral laminectomy at C5. To optimize the reproducibility of the biomechanical, functional, and histological outcomes of the injury model, we contused the spinal cords using an impact force of 150 kdyn, an impact trajectory of 22.5&deg; (animals rotated at 22.5&deg;), and an impact location off of midline of 1.4 mm. Functional recovery was assessed using the cylinder rearing test, horizontal ladder test, grooming test and modified Montoya's staircase test for up to 6 weeks, after which the spinal cords were evaluated histologically for white and grey matter sparing.
The injury model presented here imparts consistent and reproducible biomechanical forces to the spinal cord, an important feature of any experimental SCI model. This results in discrete histological damage to the lateral half of the spinal cord which is largely contained to the ipsilateral side of injury. The injury is well tolerated by the animals, but does result in functional deficits of the forelimb that are significant and sustained in the weeks following injury. The cervical unilateral injury model presented here may be a resource to researchers who wish to evaluate potentially promising therapies prior to human translation.

A reliable and repeatable way to produce a cervical unilateral spinal cord injury using the Infinite Horizon impactor is described. The method takes advantage of a custom designed frame and clamp to stabilize the spine. The standardized procedure and biomechanical injury parameters result in sufficient and sustained injuries.

Sonsuz Horizon Darbeli kullanarak tek taraflı Servikal Spinal Kord Yaralanması bir Contusive Modeli

While the majority of human spinal cord injuries occur in the cervical spinal cord, the vast majority of laboratory research employs animal models of ...

Tıp

Immunohistochemical Staining of B7-H1 (PD-L1) on Paraffin-embedded Slides of Pancreatic Adenocarcinoma Tissue

B7-H1/PD-L1, a member of the B7 family of immune-regulatory cell-surface proteins, plays an important role in the negative regulation of cell-mediated immune responses through its interaction with its receptor, programmed death-1 (PD-1) 1,2. Overexpression of B7-H1 by tumor cells has been noted in a number of human cancers, including melanoma, glioblastoma, and carcinomas of the lung, breast, colon, ovary, and renal cells, and has been shown to impair anti-tumor T-cell immunity3-8.
Recently, B7-H1 expression by pancreatic adenocarcinoma tissues has been identified as a potential prognostic marker9,10. Additionally, blockade of B7-H1 in a mouse model of pancreatic cancer has been shown to produce an anti-tumor response11. These data suggest the importance of B7-H1 as a potential therapeutic target. Anti-B7-H1 blockade antibodies are therefore being tested in clinical trials for multiple human solid tumors including melanoma and cancers of lung, colon, kidney, stomach and pancreas12.
In order to eventually be able to identify the patients who will benefit from B7-H1 targeting therapies, it is critical to investigate the correlation between expression and localization of B7-H1 and patient response to treatment with B7-H1 blockade antibodies. Examining the expression of B7-H1 in human pancreatic adenocarcinoma tissues through immunohistochemistry will give a better understanding of how this co-inhibitory signaling molecule contributes to the suppression of antitumor immunity in the tumor's microenvironment. The anti-B7-H1 monoclonal antibody (clone 5H1) developed by Chen and coworkers has been shown to produce reliable staining results in cryosections of multiple types of human neoplastic tissues4,8, but staining on paraffin-embedded slides had been a challenge until recently13-18. We have developed the B7-H1 staining protocol for paraffin-embedded slides of pancreatic adenocarcinoma tissues. The B7-H1 staining protocol described here produces consistent membranous and cytoplasmic staining of B7-H1 with little background.

Immunohistochemical Staining of B7-H1 PD-L1 on Paraffin-embedded Slides of Pancreatic Adenocarcinoma Tissue

B7-H1 (PD-L1) and its binding to PD-1 provide a major tumor-induced immunosuppressive signal in the tumor&#x2019;s microenvironment. An immunohistochemical staining technique to characterize the expression and localization of B7-H1 in pancreatic adenocarcinoma is described here.

Pankreas Adenokarsinom Doku B7-H1 immünohistokimyasal boyanma (PD-L1) parafin Slaytlar

B7-H1/PD-L1, a member  of the B7 family of immune-regulatory cell-surface proteins, plays an important  role in the negative regulation of cell-mediated ...

Formation of Human Prostate Epithelium Using Tissue Recombination of Rodent Urogenital Sinus Mesenchyme and Human Stem Cells

Progress in prostate cancer research is severely limited by the availability of human-derived and hormone-na&iuml;ve model systems, which limit our ability to understand genetic and molecular events underlying prostate disease initiation. Toward developing better model systems for studying human prostate carcinogenesis, we and others have taken advantage of the unique pro-prostatic inductive potential of embryonic rodent prostate stroma, termed urogenital sinus mesenchyme (UGSM). When recombined with certain pluripotent cell populations such as embryonic stem cells, UGSM induces the formation of normal human prostate epithelia in a testosterone-dependent manner. Such a human model system can be used to investigate and experimentally test the ability of candidate prostate cancer susceptibility genes at an accelerated pace compared to typical rodent transgenic studies. Since Human embryonic stem cells (hESCs) can be genetically modified in culture using inducible gene expression or siRNA knock-down vectors prior to tissue recombination, such a model facilitates testing the functional consequences of genes, or combinations of genes, which are thought to promote or prevent carcinogenesis.
The technique of isolating pure populations of UGSM cells, however, is challenging and learning often requires someone with previous expertise to personally teach. Moreover, inoculation of cell mixtures under the renal capsule of an immunocompromised host can be technically challenging. Here we outline and illustrate proper isolation of UGSM from rodent embryos and renal capsule implantation of tissue mixtures to form human prostate epithelium. Such an approach, at its current stage, requires in vivo xenografting of embryonic stem cells; future applications could potentially include in vitro gland formation or the use of induced pluripotent stem cell populations (iPSCs).

To unravel the earliest molecular mechanisms underlying prostate cancer initiation, novel and innovative human model systems and approaches are desperately needed. The potential of pre-prostatic urogenital sinus mesenchyme (UGSM) to induce pluripotent stem cell populations to form human prostate epithelium is a powerful experimental tool in prostate research.

Kemirgen Ürogenital Sinüs mezenşimin ve İnsan Kök Hücre Doku Rekombinasyon kullanarak İnsan Prostat epiteli oluşumu

Progress in prostate cancer research is severely  limited by the availability of human-derived and hormone-na&iuml;ve model systems,  which limit our ...

Measuring Frailty in HIV-infected Individuals. Identification of Frail Patients is the First Step to Amelioration and Reversal of Frailty

A simple, validated protocol consisting of a battery of tests is available to identify elderly patients with frailty syndrome. This syndrome of decreased reserve and resistance to stressors increases in incidence with increasing age. In the elderly, frailty may pursue a step-wise loss of function from non-frail to pre-frail to frail. We studied frailty in HIV-infected patients and found that ~20% are frail using the Fried phenotype using stringent criteria developed for the elderly1,2. In HIV infection the syndrome occurs at a younger age.
HIV patients were checked for 1) unintentional weight loss; 2) slowness as determined by walking speed; 3) weakness as measured by a grip dynamometer; 4) exhaustion by responses to a depression scale; and 5) low physical activity was determined by assessing kilocalories expended in a week's time. Pre-frailty was present with any two of five criteria and frailty was present if any three of the five criteria were abnormal.
The tests take approximately 10-15 min to complete and they can be performed by medical assistants during routine clinic visits. Test results are scored by referring to standard tables. Understanding which of the five components contribute to frailty in an individual patient can allow the clinician to address relevant underlying problems, many of which are not evident in routine HIV clinic visits.

Frailty syndrome is commonly seen in the aged and reflects multi-system physiological change. However, with reduced functional reserve and resilience frailty is also known to be common in the HIV infected population. This study outlined an easily administered screening test to identify HIV patients with frailty. When significant components of frailty are identified, clinicians will be able to focus on amelioration of the problem and promote reversion to the pre-frail state.

HIV ile enfekte Bireylerde Frailty ölçüm. Narin Hastalar tanımlanması Islahı ve Frailty iptali için ilk adımdır

A simple, validated protocol consisting of a battery of tests is available to identify elderly patients with frailty syndrome. This syndrome of decreased ...

A Thrombotic Stroke Model Based On Transient Cerebral Hypoxia-ischemia

Stroke research has endured many setbacks in translating neuroprotective therapies into clinical practice. In contrast, the real-world therapy (tPA thrombolysis) rarely produces benefits in mechanical occlusion-based experimental models, which dominate preclinical stroke research. This split between the bench and bedside suggests the need to employ tPA-responsive models in preclinical stroke research. To this end, a simple and tPA-reactive thrombotic stroke model is invented and described here. This model consists of transient occlusion of the unilateral common carotid artery and delivery of 7.5% oxygen through a face mask in adult mice for 30 min, while maintaining the animal rectal temperature at 37.5 &#177; 0.5 &#176;C. Although reversible ligation of the unilateral carotid artery or hypoxia each suppressed cerebral blood flow only transiently, the combination of both insults caused lasting reperfusion deficits, fibrin and platelet deposition, and large infarct in the middle cerebral artery-supplied territory. Importantly, tail-vein injection of recombinant tPA at 0.5, 1, or 4 hr post-tHI (10 mg/kg) provided time-dependent reduction of the mortality rate and infarct size. This new stroke model is simple and can be standardized across laboratories to compare experimental results. Further, it induces thrombosis without craniectomy or introducing pre-formed emboli. Given these unique merits, the tHI model is a useful addition to the repertoire of preclinical stroke research.

Thromboembolic stroke models are vital tools for optimizing the recanalization therapy. Here we report a murine thrombotic stroke model based on transient cerebral hypoxic-ischemic (tHI) insult, which triggers thrombosis and infarction, and responds favorably to tissue plasminogen activator (tPA)-mediated fibrinolysis in a therapeutic window similar to those in stroke patients.

Geçici Serebral Hipoksi-iskemi Dayalı Bir Trombotik İnme Modeli

Stroke research has endured many setbacks in translating neuroprotective therapies into clinical practice. In contrast, the real-world therapy (tPA ...

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo and noninvasively in humans via phosphorus-31 magnetic resonance spectroscopy (31PMRS). However, the approach has not been widely adopted in translational and clinical research, with variations in methodology and limited guidance from the literature. Increased optimization, standardization, and dissemination of methods for in vivo 31PMRS would facilitate the development of targeted therapies to improve OXPHOS capacity and could ultimately favorably impact cardiovascular health. 31PMRS produces a noninvasive, in vivo measure of OXPHOS capacity in human skeletal muscle, as opposed to alternative measures obtained from explanted and potentially altered mitochondria via muscle biopsy. It relies upon only modest additional instrumentation beyond what is already in place on magnetic resonance scanners available for clinical and translational research at most institutions. In this work, we outline a method to measure in vivo skeletal muscle OXPHOS. The technique is demonstrated using a 1.5 Tesla whole-body MR scanner equipped with the suitable hardware and software for 31PMRS, and we explain a simple and robust protocol for in-magnet resistive exercise to rapidly fatigue the quadriceps muscle. Reproducibility and feasibility are demonstrated in volunteers as well as subjects over a wide range of functional capacities.

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

This work demonstrates the feasibility of an in vivo phosphorus-31 magnetic resonance spectroscopy (31PMRS) technique to quantify mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity in human skeletal muscle.

Fosfor-31 Manyetik Rezonans Spektroskopisi: Ölçme için Aracı<em&gt; İn Vivo</emİnsan İskelet Kası içinde&gt; Mitokondriyal Oksidatif Fosforilasyon Kapasitesi

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo ...

The 4-vessel Sampling Approach to Integrative Studies of Human Placental Physiology In Vivo

The human placenta is highly inaccessible for research while still in utero. The current understanding of human placental physiology in vivo is therefore largely based on animal studies, despite the high diversity among species in placental anatomy, hemodynamics and duration of the pregnancy. The vast majority of human placenta studies are ex vivo perfusion studies or in vitro trophoblast studies. Although in vitro studies and animal models are essential, extrapolation of the results from such studies to the human placenta in vivo is uncertain. We aimed to study human placenta physiology in vivo at term, and present a detailed protocol of the method. Exploiting the intraabdominal access to the uterine vein just before the uterine incision during planned cesarean section, we collect blood samples from the incoming and outgoing vessels on the maternal and fetal sides of the placenta. When combining concentration measurements from blood samples with volume blood flow measurements, we are able to quantify placental and fetal uptake and release of any compound. Furthermore, placental tissue samples from the same mother-fetus pairs can provide measurements of transporter density and activity and other aspects of placental functions in vivo. Through this integrative use of the 4-vessel sampling method we are able to test some of the current concepts of placental nutrient transfer and metabolism in vivo, both in normal and pathological pregnancies. Furthermore, this method enables the identification of substances secreted by the placenta to the maternal circulation, which could be an important contribution to the search for biomarkers of placenta dysfunction.

The 4-vessel Sampling Approach to Integrative Studies of Human Placental Physiology In Vivo

We present a detailed method to study human placental physiology in vivo at term. The method combines blood sampling from the incoming and outgoing vessels on the maternal and fetal sides of the placenta with ultrasound measurements of volume blood flow and placental tissue sampling.

İnsan vücudunun fizyolojisini bütünleştiren 4 damarlı Örnekleme Yaklaşımı<emIn vivo</em

The human placenta is highly inaccessible for research while still in utero. The current understanding of human placental physiology in vivo is therefore ...

Measuring the Effect of Chemicals on the Growth and Reproduction of Caenorhabditis elegans

Toxicological evaluation is crucial for understanding the effects of chemicals on living organisms in basic and applied biological science fields. A non-mammalian soil round worm, Caenorhabditis elegans, is a valuable model organism for toxicology studies due to its convenience and lack of animal ethics issues compared with mammalian animal systems. In this protocol, a detailed procedure of toxicological evaluation of chemicals in C. elegans is described. A clinical anticancer drug, etoposide, which targets human topoisomerase II and inhibits DNA replication of human cancer cells, was selected as a model testing chemical. Age-synchronized C. elegans eggs were exposed to either dimethyl sulfoxide (DMSO) or etoposide, and then the growth of C. elegans was monitored every day for 4 days by the stereo microscope observation. The total number of eggs laid from C. elegans treated with DMSO or etoposide was also counted by using the stereo microscope. Etoposide treatment significantly affected the growth and reproduction of C. elegans. By comparison of the total number of eggs laid from worms with different treatment periods of chemicals, it can be decided that the reproductive toxicity of chemicals on C. elegans reproduction is reversible or irreversible. These protocols may be helpful for both the development of various drugs and risk assessment of environmental toxicants.

Measuring the Effect of Chemicals on the Growth and Reproduction of Caenorhabditis elegans

A basic protocol to evaluate the toxicity of chemicals in a model animal, Caenorhabditis elegans, is described. The method is convenient and useful for the development of pharmaceuticals as well as for the risk assessment of various environmental pollutants.

Büyüme ve üreme Caenorhabditis elegans kimyasallar etkisi ölçme

Toxicological evaluation is crucial for understanding the effects of chemicals on living organisms in basic and applied biological science fields. A ...

A Primary Human Trophoblast Model to Study the Effect of Inflammation Associated with Maternal Obesity on Regulation of Autophagy in the Placenta

Maternal obesity is associated with an increased risk of adverse perinatal outcomes that are likely mediated by compromised placental function that can be attributed to, in part, the dysregulation of autophagy. Aberrant changes in the expression of autophagy regulators in the placentas from obese pregnancies may be regulated by inflammatory processes associated with both obesity and pregnancy. Described here is a protocol for sampling of villous tissue and isolation of villous cytotrophoblasts from the term human placenta for primary cell culture. This is followed by a method for simulating the inflammatory milieu in the obese intrauterine environment by treating primary trophoblasts from lean pregnancies with tumor necrosis factor alpha (TNF&#945;), a proinflammatory cytokine that is elevated in obesity and in pregnancy. Through the implementation of the protocol described here, it is found that exposure to exogenous TNF&#945; regulates the expression of Rubicon, a negative regulator of autophagy, in trophoblasts from lean pregnancies with female fetuses. While a variety of biological factors in the obese intrauterine environment maintain the potential to modulate critical pathways in trophoblasts, this ex vivo system is especially useful for determining if expression patterns observed in vivo in human placentas with maternal obesity are a direct result of TNF&#945; signaling. Ultimately, this approach affords the opportunity to parse out the regulatory and molecular implications of inflammation associated with maternal obesity on autophagy and other critical cellular pathways in trophoblasts that have the potential to impact placental function.

Presented here is a protocol for sampling of human placental villous tissue followed by isolation of cytotrophoblasts for primary cell culture. Treatment of trophoblasts with TNF&#945; recapitulates inflammation in the obese intrauterine environment and facilitates the discovery of molecular targets regulated by inflammation in placentas with maternal obesity.

Plasenta Autophagy düzenlenmesi üzerinde anne obezite ile ilişkili iltihap etkisini incelemek için bir birincil insan Trofoblast modeli

Maternal obesity is associated with an increased risk of adverse perinatal outcomes that are likely mediated by compromised placental function that can be ...

Effect of Artificial Tear Formulations on the Metabolic Activity of Human Corneal Epithelial Cells after Exposure to Desiccation

Artificial lipid-containing tear formulations are developed to reduce tear evaporation by the restoration of a deficient tear lipid layer. Artificial tear formulations that prevent cell desiccation will result in ocular surface protection and the maintenance of cell metabolic activity. During dehydration, cells undergo the process of loss of metabolic activity and subsequently cell death. This work describes a method for assessing the efficacy of artificial tear formulations. The metabolic dye (i.e., alamarBlue) changes from a low fluorescent molecule resazurin to a fluorescent molecule resorufin in viable cells. The biological performance of an artificial tear formulation is measured as the ability of the formulation to (a) maintain cell viability and (b) provide cell protection from desiccation. Growth media and saline are used as controls for the cell viability/desiccation tests. Cells are incubated with test solutions for 30 min and then desiccated for 0 or 5 min at 37 &#176;C and 45% relative humidity. Cell metabolic activity after initial exposure and after cell desiccation is then determined. The results show the comparative effects of eye drop formulations on cell metabolic activity and desiccation protection. This method can be used to test dry eye formulations that are designed to treat individuals with evaporative dry eye.

The purpose of this protocol is to evaluate if different artificial tear formulations can protect human corneal epithelial cells from desiccation using an in vitro model. After exposure to artificial tear formulations and desiccation, human corneal epithelial cells are assessed for metabolic activity.

Yapay Gözyaşı Formülasyonlarının Desiccation'a Maruz Kalma sonrası İnsan Kornea Epitel Hücrelerinin Metabolik Aktivitesi Üzerine Etkisi

Artificial lipid-containing tear formulations are developed to reduce tear evaporation by the restoration of a deficient tear lipid layer. Artificial tear ...