Yazarlar fon hibe 1 U01 AI124316-01, çoklu ilaca dirençli patojenlerin tedavisinde bir sistem biyolojisi yaklaşımı için R. Quinn ve NIH / NIAID finansmanı için Vertex Pharmaceuticals ve Kistik Fibrozis Araştırma Yenilik Ödülü kabul etmek istiyorum. Biz de bu işin mühendislik yönleri ile işbirliğinin kolaylaştırılması için UCSD&#39;nin lisans makine mühendisliği üst düzey tasarım sahasında Makine ve Uzay Mühendisliği Bölümü teşekkür etmek istiyorum.

1. Yapay Balgam Ortamında Stok Hazırlama <ol><li> % 5 müsin solüsyonu oluşturun. 1.0 g dehidrate domuz mide musini, 20 mL deiyonize suya ilave edin. Elde edilen çözeltiyi otoklavlayın. NOT: Müsin sterilizasyonu doğal yapısını bozacaktır; Müsini kuru halde sterilize etmek için diğer yöntemler arasında UV sterilizasyonu ve ışınlama bulunur. Bununla birlikte, bu yöntemler WinCF sistemi için yaygın olarak kullanılmamıştır. </li><li> 2.2 g KCI&#39;yi 50 mL deiyonize suya ilave edin ve çözünmesine izin verin. 50 mL deiyonize suya 5.0 g NaCl ilave edin ve çözünmesine izin verin. Bu iki çözümü otoklavla yapın. </li><li> 10 mL steril deiyonize suya 100 mg somon sperm DNA&#39;sı ekleyin. Çözünmeyi sağlamak için bu çözeltiyi bir su banyosunda birkaç saat boyunca yaklaşık 85 ° C&#39;ye ısıtın. </li><li> 5.0 mL steril deiyonize suya 5.0 mg ferritin ekleyin. </li></ol> 2. Yapay Balgam Ortamının Hazırlanması <ol><li> birleştirmekAşağıdaki bileşenler: 2.0 ml NaCI stok çözeltisi, 2.0 ml KCI stok çözeltisi musin stok çözeltisi 16 ml, yumurta sarısı, emülsiyon 200 uL DNA stok çözeltisi 5.6 mL, ferritin stok çözeltisi 120 uL, uçucu 5.78 mL amino asit çözeltisi, esansiyel olmayan amino asit çözeltisi 5.78 ml ve steril su 2.44 ml. <ol><li> tortu az miktarda görünüyorsa, karıştırmak için hafifçe sallayın. </li><li> Sekiz steril 15 ml santrifüj tüplerine ortam pipetleyin 5.0 mL. Not: İstenilen her borunun kimyasal koşullar manipüle edilebilir. Örneğin, tampon çözeltiler ve pH göstergeleri farklı pH seviyelerinde mikrobiyal davranışlarını karşılaştırmak amacıyla her bir tüpe ilave edilebilir. Bu bir gösteri 5.0 ila 8.5, 0.5, pH &#39;lik artışlarla, 8 farklı pH değerleri ile elde edilen temsilci sonuçlar kesit olarak gösterilmiştir. </li></ol></li><li> medyanın kimyasal koşullar başarıyla manipüle sonra, daha sonra kullanılmak üzere dondurmak. Medya fro stabil olacaktır-20 ° C&#39;de birkaç ay boyunca zen. Çözündükten sonra girdap. </li></ol> 3. Kılcal Tüplerin Kontrol Dengelemesinin Hazırlanması <ol><li> Steril bir biyolojide, sekiz steril mikrosantrifüj tüpünü 250 mcL ortamla doldurun. </li><li> Adım 3.1&#39;de bahsedilen bir mikrosantrifüj tüpüne karşılık gelen sekiz steril 15 mL santrifüj tüpü elde edin. <ol><li> Kağıt havluyu% 70 etanol çözeltisi ile sterilize edin ve kurumaya bırakın. Kuruduktan sonra havluyu her biri yaklaşık dört santimetre parçaya bölün ve her bir parçayı 15 mL&#39;lik bir santrifüj tüpünün tabanında parçalayın. İlave tüpler için, gerektiğinde ilave kağıt havluları püskürterek ve kurutun. </li><li> Her bir santrifüj borusunun altındaki bir kağıt kümesiyle, nemli bir ortam oluşturmak için yaklaşık 1.0 mL steril su ile her kağıt kümesini hafifçe nemlendirin. </li></ol></li><li> Adım 3.1&#39;de hazırlanan her mikrosantrifüj tüpü için üç cam kılcal tüp ve bir kılcal boru macunu seal bloğu alınnt. </li><li> Her bir mikrosantrifüj tüpü için, üç kılcal tübü, tüpün üstündeki mavi işaretleyiciden yaklaşık 5 mm uzaktaki bir ortama doldurun. <ol><li> Borunun bir ucunu mikro santrifüj tüpünde tutarak ve kılcal hareketin ortamı tüpe yönlendirmesi için yatay yönlendirmeye doğru bastırın (Bkz. Şekil 1 ). </li><li> Tüpün açık ucuna hafifçe eldivenli bir parmak yerleştirerek doldurmayı durdurun ve sonra tüpün diğer ucunu conta bloğuna bastırarak kapatın. </li></ol></li><li></li></ol><img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/55532/55532fig1.jpg" /> Şekil 1: Örnek pH Gradyanı, Yapay Balgam Ortamıyla Kapiler Tüp Dolum. Ortam, tüpün bir ucunu sıvının içine sokarak ve kılcal eylemi kolaylaştıracak şekilde eğilerek eklenir. Bu örnekte orta renklenme, iblide yardım etmek için eklenen pH göstergesinden kaynaklanmaktadırKuluçka sonrasında asitlikteki potansiyel değişiklikleri belirler. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55532/55532fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <ol start="5"><li> Üç kılcal tüpün her bir setini, steril suyla, macunla mühürlenmiş yüzü tamamen nemlendirilmiş kağıt havlu ile doldurulmuş 15 mL santrifüj tüplerine yerleştirin. Tüpü ve etiketi kapatın. Bu üç kılcal boru, her kontrol durumunun replikasyonu içindir. </li><li> 15 mL&#39;lik tüm santrifüj tüpleri, belirlenmiş kılcal boruları ile doldurulduğunda, tüpleri bir tutma rafa yerleştirin. Rafı yatay olarak inkübe edecek şekilde yerleştirin (gaz kabarcıkları yakalamak için) (Bkz. Şekil 2 ). 48 saat boyunca 37 ° C&#39;de (nemli kağıt kümeleri içeren) santrifüj tüpleri içindeki kılcal tüpleri inkübe edin. </li></ol><img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/55532/55532fig2.jpg" /> Şekil 2: Örnek pH Gradyan, Kuluçka kılcal borular hazır. üç kılcal tüpler, doldurulmuş ve kapatılmış sonra, bunlar altta nemli bir kağıt havlu ile bir santrifüj tüpüne yerleştirilir. Bu tüp daha sonra kapatılmış ve bir rafın içine konur. Resimdeki olarak kuluçka tamamlandıktan sonra bu gaz üretimi gözlenebilir böylece raf, inkübasyon sırasında yanlara doğru yönlendirilmiş olması gerekir. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55532/55532fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.</a> Inkübasyon sonrasında kontrol kılcal tüpler 4. Görüntüleme <ol><li> Yatay tüpleri tutmak emin olarak inkübatör santrifüj tüpleri raf çıkarın. Dikkatlice diğer setleri ayrı olarak her üç set tutarak, santrifüj tüpleri üzerinden kılcal tüpler kaydırın. </li><li> bir ışık kutusu üzerinde birbirine, her dizilmiş bir sonraki kılcal tüpler düzenlemek böylece, tüplerin muhtevaları olduğu visible ve ışıklı. farklı kimyasal koşullar ayrılması için bir aralık ile, her üç tüpleri bırakın. </li><li> borular hizalanır ve ışık kutusu, doğrudan yukarıdan, fotoğrafı açıkken. (Şekil 3&#39;e bakınız) </li></ol><img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/55532/55532fig3.jpg" /> Şekil 3: Örnek pH Gradyan, Kontrol Partisi, Ön-enkübasyon, balgam Eklendi. sonra yapay balgam orta soldan sağa doğru pH artan, üçlü setler halinde kılcal tüplere ilave edilir. Sarı belirlenen daha fazla asidik tüpler orta sonucuna ilave göstergeler kombinasyonu, daha az asidik borular mor haline gelmektedir. borular yatay olarak düzenlenmiş ve yukarıda fotoğraflandı alttan aydınlatılır. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55532/55532fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.</a> <ol start="4"><li> elden çıkarmakBiyolojik tehlikeli atıklarda kontrol malzemeleri. </li></ol> 5. Balgam Örneği ile WinCF Kapiler Tüpleri İnoküle Edilmesi <ol><li> Steril bir biyolojide, sekiz adet steril mikrosantrifüj tüpünü 225 μL medya ile doldurun. </li><li> Balgam numunesini, 3 mL&#39;lik şırınga (iğne olmadan plastik bir şırınga) ile tekrar tekrar çekerek çıkartarak homojenize edin. Balgam pürüzsüz bir kıvama gelene kadar bunu yapın. </li><li> Adım 5.1&#39;de hazırlanan her mikrosantrifüj tüpüne (ASM ortamında 1/10 seyreltme) 25 μL homojenize balgam ekleyin. Daha sonra, tüpleri 30 saniye boyunca vorteksleyerek iyice karıştırın. </li><li> 3. 3.2 ile 3.5 arasındaki adımları izleyerek medyumu kılcal borulara ekleyin. </li></ol> 6. İnkübasyondan Sonra Örnek Kılcal Tüplerin Görüntülenmesi <ol><li> 48 saatlik inkübasyon süresinden sonra, 4.1 ila 4.3 arasındaki adımlarla aynı prosedür izlenerek kılcal tüpleri alın ve görüntüleyin. </li><li> Kabarcıklar tüplerde varsa,Çekilen fotoğrafların tüplerdeki kabarcıklar ve ortamlar arasındaki çizimi açıkça gösterdiğinden emin olun. Biyofilm varsa, fotoğrafların varlığını da açıkça gösterebildiğinden emin olun. </li></ol> 7. Aşağı Akış Uygulamalarında Ortamın Kaldırılması <ol><li> Akış aşağı analizini kolaylaştırmak için, görüntülemeden sonra ortamı kılcal tüplerden çıkarın. Olası uygulamalar, kültürleme ve DNA / RNA dizilemesi ve metabolomik profillemeyi içerir. Dikkat: Patojenlerle dolu cam kılcal borular önemli bir biyolojik tehlikeye sahiptir, bu nedenle bu adımlar belirli ekipmanlarla çok dikkatli yapılmalıdır. Kılcal tüpler kırılırsa, uygun biyolojik tehlike aralıkları kabına koyun. </li><li> Ortamı çıkarmak için 25 gauge ve 0,5 inç uzunluğunda künt uçlu iğneler kullanın. Contasını kırmak için kör uçlu iğneyi tüpün tıkalı ucuna yerleştirin. </li><li> Contayı kırdıktan sonra, kılcal boruyu ters çevirin ve ortam üst bölümden damlayacaktır. benf media, kolayca damla 200 uL ucu olan bir pipet kullanın ve kılcal borunun ucuna takıldığında pipet piston üzerine bastırarak tüp üzerinden ortam dışarı atmaz. uygun bir kap (1.5 ml santrifüj tüpü) atılır boru ortamı toplayın. Not: transkriptomik veya başka RNA analizi için, ortam RNA, stabilize edici tampon doğrudan deşarj edilebilir. </li></ol> 8. WinCF Flud Sistemi Not: WinCF Sıvı yükleme Yardımcı Cihaz (Flud) Sistem WinCF Sisteminin verimini optimize etmek için tasarlanmış tamamlayıcı cihazlar isteğe bağlı bir takımdır. WinCF Flud Sistemi öncelikle 3D yazdırılabilir malzemelerin oluşur. Malzemelerin hızlı ve kolay değiştirme araştırmacılar için asgari kesinti yanı sıra asgari üretim gereksinimlerini sağlamak için 3D baskılı imalat sağlar. Tasarımlar, stl dosyaları, 3D baskı talimatları ve WinCF Flud manuel çevrimiçi suppleme mevcutturnt. <ol><li> Kılcal boru yüklemesi için ortam hazırlama <ol><li> Steril bir biyolojide, her biri 900 μL orta ile sekiz steril 2 mL mikro santrifüj tüpünü doldurun. </li><li> Herhangi bir balgam numunesini, 3 mL&#39;lik bir şırınga (iğne olmadan plastik bir şırınga) ile tekrar tekrar çekerek ve atarak atın. Balgam pürüzsüz bir kıvama gelene kadar bunu yapın. </li><li> Adım 8.1.1&#39;de hazırlanan her mikrosantrifüj tüpüne (ortamda 1/10 dilüsyon) 100 μL homojenize balgam ekleyin. Daha sonra, tüpleri 30 saniye boyunca vorteksleyerek iyice karıştırın. </li><li> Doldurulmuş ve açık mikro santrifüj tüplerini, borular dikey olacak şekilde yönlendirilmiş rotator tüp tutucusuna yerleştirin. </li></ol></li><li> Kılcal boruların yerleştirilmesi <ol><li> Adım 8.1&#39;de her mikrosantrifüj tüpü için üç kılcal boruyu alın. </li><li> Aygıtın diğer ucundaki mikrosantrifüj tüpleriyle hizalanacak şekilde üç boruyu lastik beşik içine sokun.Tüplerin işaretli uçlarının mikrosantrifüj borularından uzakta durduğundan emin olun. Beşikten altındaki ç deliği, beşlik yerindeki üç pedi uygun şekilde takın. </li><li> Yerleştirilen kılcal borular, cihaz üzerindeki kılavuz kanallarına oturtulduğunda, kaydırmayı önlemek için lastik tamponlarını orta kısımlarının üzerine sıkıca yerleştirin. (Bakınız Şekil 4 ) </li></ol></li></ol><img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/55532/55532fig4.jpg" /> Şekil 4: Kauçuk Tampa Tarafından Menteşeler Üzerinde Tutulan Kılcal Tüplerle Tamamen Yüklenen FLUD Sistemi. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55532/55532fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <ol start="3"><li> Kılcal tüplere malzeme yüklenmesi <ol><li> Kılcal tüplerin bulunduğu cihazın ucunu bir elle tutmak için dikkatli bir şekilde kullanınaktarıldı ve mikrosantrifüj tüpleri yüklü olan rotator dişli çubuğu diğer elle. </li><li> mikrosantrifüj tüpleri neredeyse yatay ve yavaş yavaş kılcal tüpler karşı rafı itmek devam böylece ince mikrosantrifüj raf döndürün. (Bakınız Şekil 5) </li><li> Kılcal tüplerin uçları, mikrosantrifüj tüpleri içinde ortam ile temas ettiğinde, bu kılcal etki hemen kılcal tüplerin doldurmak başlar emin olun. seviyesi doldurma hızını ayarlamak ve doldurmak için, yumuşak bir bütün olarak cihaz döndürün. Bunu yaparken mikro santrifüj tüpünün dışarı medyayı dökmemeye dikkat edin. (Bakınız Şekil 6) </li><li> kılcal tüpler, istenen seviyelere dolu olduğunda, bir yüzey üzerinde cihazı seviyesi yerleştirin ve dikkatli bir şekilde yine hızlı ve dolgu durdurma kılcal tüpler uçlarındaki mikro santrifüj tüpünün raf çekin. mikrosantrifüj tüpleri artık dikey konumuna geri tüm yol geri ve kapatılabilir. </li><li> Kılcal boruların çıkıntı yapan uçlarını, her üçlü setin üzerine bir conta bloğu basarak kapatın ve tüm setler kapatılıncaya kadar bir sefer bir set sızdırmaz hale getirin. Kirlenme riskini azaltmak için, her üçlü sete de sızdırmazlık engelinin farklı bir bölümüne basın (Bkz. Şekil 7 ). </li></ol></li></ol><img alt="Şekil 5" src="/files/ftp_upload/55532/55532fig5.jpg" /> Şekil 5: Yatay Oryantasyona Dağıtılmış Orta Tüpler ile FLUD Sistemi, Kılcal Tüplerle Temas Yapmaya Hazır. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55532/55532fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 6" src="/files/ftp_upload/55532/55532fig6.jpg" /> Şekil 6: Kılcal İşlemle Ortam Yükleyen Kılcal Tüplerle FLUD Sistemi. </strong&gt; <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55532/55532fig6large.jpg" target="_blank">bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayın.</a> <img alt="Şekil 7," src="/files/ftp_upload/55532/55532fig7.jpg" /> Şekil 7: Bir su geçirmezlik maddesi Block Kullanımı Sırasında Set Flud Sistemi Bir üç nüsha üzerinde Kılcal Tüpleri Dolgulu mühürleme. Bu dolgu bloğu sızdırmazlık sırasında komşu üçlü gruplar ile temasını önlemek için kesildi kenarlar boyunca plastik vardı. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55532/55532fig7large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.</a> <ol start="4"><li> Kuluçka <ol><li> Tüp orta kesimlerinde üzerinde tamp lastiği çıkarın ve ana aparatı kapalı kauçuk beşiği kaldırın. Bu da beraberinde bütün kılcal tüpler almalıdır. Şimdi beşiği ayarlamak ve tüpler görüntüleme raf üzerine tutuluyor. Bu raCk, beşiği ayarlamak için beşiğin yanı sıra küçük rehber kanallarına uyan üç saplamaya sahiptir. </li><li> Görüntü rafını bir bütün olarak açık plastik kuluçka kutusuna yerleştirin. İnkübasyon esnasında nemi sağlamak için küçük miktarda steril kağıt havluları steril suya batırın ve kutunun iki kısa yanına yerleştirin. (Bakınız Şekil 8 ) </li><li> Kutuyu tamamen kapatın ve tüpleri yatay tutmaya özen gösterin, 37 ° C inkübatör içine yerleştirin. 48 saat inkübe edin. </li></ol></li></ol><img alt="Şekil 8" src="/files/ftp_upload/55532/55532fig8.jpg" /> Şekil 8: Nem Sağlamak İçin Nemli Kağıt Havlularının yanında Şeffaf İnkübasyon Kutusuna Yerleştirilen FLUD Sisteminden Görüntüleme Raketine Aktarılan Kauçuk Beşikten Tüplü Kılcal Borular. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55532/55532fig8large.jpg" target="_blank">Th daha büyük bir sürümünü görmek için lütfen tıklayınız</a>Şekildir. <ol start="5"><li> Görüntüleme ve çıkarma <ol><li> Tüpleri kuluçka kutusundan tutarak görüntüleme rafını çıkarın ve alttan aydınlatılmış bir ışık kutusu üzerine yerleştirin. Zaten görüntüleme rafındaki tüplerle, üçlü takımlar düzgün bir şekilde aralıklarla yerleştirilecek ve hemen görüntü hazır hale gelecektir. </li><li> Kamerayı tüplere odaklayın, böylece hepsi görünen alanda görünür ve ışık kutusundaki ışık, tüp boyalarındaki rengin yeterli kontrast ve görselleştirilmesini sağlar. Doğrudan yukarıdan fotoğraf. </li><li> Tüplerin içeriğini çıkarmak için, kılcal tüpleri kauçuk beşikten birer birer üçlüden çıkarın. Tüpleri hafifçe kaldırın ve yuvasından çıkarın veya dışarıya doğru kaydırın. </li><li> Her üçlü grubun her biri için, adım 7.1 ila 7.3&#39;te ayrıntılı olarak açıklanan çıkarma prosedürünü uygulayın. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Quinn, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Winogradsky-based+culture+system+shows+an+association+between+microbial+fermentation+and+cystic+fibrosis+exacerbation.">A Winogradsky-based culture system shows an association between microbial fermentation and cystic fibrosis exacerbation.</a> ISME J . 9, 1024-1038 (2015).</li><li>Quinton, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystic+fibrosis:+impaired+bicarbonate+secretion+and+mucoviscidosis.">Cystic fibrosis: impaired bicarbonate secretion and mucoviscidosis.</a> Lancet. 372 (9636), 415-417 (2008).</li><li>Harrison, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+ecology+of+the+cystic+fibrosis+lung.">Microbial ecology of the cystic fibrosis lung.</a> Microbiology. 153 (Pt 4), 917-923 (2007).</li><li>Caverly, L. J., Zhao, J., LiPuma, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystic+fibrosis+lung+microbiome:+Opportunities+to+reconsider+management+of+airway+infection.">Cystic fibrosis lung microbiome: Opportunities to reconsider management of airway infection.</a> Pediatr pulmonol. 50, S31-S38 (2015).</li><li>Blainey, P. C., Milla, C. E., Cornfield, D. N., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+the+human+airway+microbial+ecology+reveals+a+pervasive+signature+for+cystic+fibrosis.">Quantitative analysis of the human airway microbial ecology reveals a pervasive signature for cystic fibrosis.</a> Sci Transl Med. 4 (153), 153ra130 (2012).</li><li>Willner, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+distribution+of+microbial+communities+in+the+cystic+fibrosis+lung.">Spatial distribution of microbial communities in the cystic fibrosis lung.</a> ISME J. 6 (2), 471-474 (2012).</li><li>Delhaes, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+airway+microbiota+in+cystic+fibrosis:+a+complex+fungal+and+bacterial+community--implications+for+therapeutic+management.">The airway microbiota in cystic fibrosis: a complex fungal and bacterial community--implications for therapeutic management.</a> PloS one. 7 (4), e36313 (2012).</li><li>Rogers, G. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=D.+Bacterial+diversity+in+cases+of+lung+infection+in+cystic+fibrosis+patients:+16S+ribosomal+DNA+(rDNA)+length+heterogeneity+PCR+and+16S+rDNA+terminal+restriction+fragment+length+polymorphism+profiling.">D. Bacterial diversity in cases of lung infection in cystic fibrosis patients: 16S ribosomal DNA (rDNA) length heterogeneity PCR and 16S rDNA terminal restriction fragment length polymorphism profiling.</a> J clin microbiol. 41 (8), 3548-3558 (2003).</li><li>Stenbit, A. E., Flume, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+exacerbations+in+cystic+fibrosis.">Pulmonary exacerbations in cystic fibrosis.</a> Curr Opin Pulm Med. 17 (6), 442-447 (2011).</li><li>Twomey, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbiota+and+metabolite+profiling+reveal+specific+alterations+in+bacterial+community+structure+and+environment+in+the+cystic+fibrosis+airway+during+exacerbation.">Microbiota and metabolite profiling reveal specific alterations in bacterial community structure and environment in the cystic fibrosis airway during exacerbation.</a> PloS one. 8 (12), e82432 (2013).</li><li>Carmody, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+cystic+fibrosis+airway+microbiota+at+pulmonary+exacerbation.">Changes in cystic fibrosis airway microbiota at pulmonary exacerbation.</a> Ann. Am. Thorac. Soc. 10 (3), 179-187 (2013).</li><li>Worlitzsch, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+reduced+mucus+oxygen+concentration+in+airway+Pseudomonas+infections+of+cystic+fibrosis+patients.">Effects of reduced mucus oxygen concentration in airway Pseudomonas infections of cystic fibrosis patients.</a> J. Clin. Invest. 109 (3), 317-325 (2002).</li><li>Cowley, E. S., Kopf, S. H., LaRiviere, A., Ziebis, W., Newman, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pediatric+Cystic+Fibrosis+Sputum+Can+Be+Chemically+Dynamic,+Anoxic,+and+Extremely+Reduced+Due+to+Hydrogen+Sulfide+Formation.">Pediatric Cystic Fibrosis Sputum Can Be Chemically Dynamic, Anoxic, and Extremely Reduced Due to Hydrogen Sulfide Formation.</a> mBio. 6 (4), e00767-e00715 (2015).</li><li>Sriramulu, D. D., L&#252;nsdorf, H., Lam, J. S., R&#246;mling, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcolony+formation:+a+novel+biofilm+model+of+Pseudomonas+aeruginosa+for+the+cystic+fibrosis+lung.">Microcolony formation: a novel biofilm model of Pseudomonas aeruginosa for the cystic fibrosis lung.</a> J. Med. Microbiol. 54 (Pt 7), 667-676 (2005).</li><li>Quinn, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogeochemical+forces+shape+the+composition+and+physiology+of+polymicrobial+communities+in+the+cystic+fibrosis+lung.">Biogeochemical forces shape the composition and physiology of polymicrobial communities in the cystic fibrosis lung.</a> mBio. 5 (2), (2014).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

CF ile akciğerin mikrobiyolojik yapısı, çok çeşitli organizmalar içerir, ancak akciğerdeki koşullar, muhtemelen hangi tür mikropların hayatta kalabileceği ve gelişebileceği üzerinde önemli bir etkiye sahip olabilir 13,15. Bu koşulların değiştiği belirli mekanizmalar ve akciğer mikrobiyomu üzerindeki tam etkileri şu andan itibaren genellikle belirsizdir. Bu deneysel yöntemde, simüle edilmiş bir akciğer bronşiolündeki manipüle edilen kimyasal koşullara dayalı mikrobiyolojik değişiklikler...

Bu yazıda tarif edilen yöntem WinCF sistemi 1 olarak adlandırılır. WinCF genel amacı, mukus doldurulmuş akciğer bronşiyollerde ortamı simüle edebilen bir deney düzeneği sağlamaktır. Bir uysal sistemi kistik fibroz (CF), kronik obstrüktif akciğer hastalığı (COPD), astım ve diğerleri dahil olmak üzere, bir mukus aşırı salgılanması fenotip ile akciğer hastalıklarının mikrobiyal patojenleri çalışma Bu sağlayacaktır. Prosedür akciğer salgıları sonunda mukus 2 bronşiyolleri ve diğer küçük geçiş yolu doldurma temizlemek için kalın ve sert hale gelmesine neden mutasyon ile karakterize edilir CF çalışma için özel olarak tasarlanmıştır. Solunan hava artık birçok Alveollere ulaşmak ve de bakteri kolonizasyonu 3, 4 bir yaşam alanı sağlamak mümkün olduğu için akciğerde Bu tür blokajlar gaz değişimi önler. yetersizlik mikrobiyal büyümeyi önlemek içinAşırı akciğer mukusu sonunda hava yolu kompleksinde kronik enfeksiyonlara neden olur. Bu topluluklar virüsleri, mantarları ve Pseudomonas aeruginosa gibi bakterileri de içeren çeşitli organizmaları içerir; bunların hepsi birbirleriyle etkileşime girer 5 , 6 , 7 , 8 . CF akciğer mikrobiyomunun etkinliğinin pulmoner alevlenmeler 1 , 9 , 10 , 11 denilen belirtilerin alevlenmesine karıştığı düşünülmektedir. WinCF, bu alevlenmelerin etrafındaki mikrobik toplum davranışının incelenmesini sağlar ve şimdi akciğer mikrobik ekolojisini incelemek için bir temel deney sistemi olarak işlev görmek üzere genişletilmektedir. Geleneksel olarak, alevlenmeler akciğerden alınan örneklerin doğrudan analizi ile incelenmiştir. Birçok karıştırıcı faktör mikrobik b&#39;nin doğrudan analizini yaparWinCF sistemi ile akciğerlerde davranış, bu faktörlerin birçoğu kaldırılır ve akciğer mikrobiyesinin davranışı, mukus takılı bronşiolde bakteri aktivitesinin daha ince analizine izin verilerek daha doğrudan incelenebilir. WinCF sistemi, bakterileri akciğer ortamını etkili şekilde taklit edecek şekilde büyütmek ve analiz etmek için bir yöntem sağlar. Akciğer bakterilerini büyütmek için geleneksel yöntemler genellikle geleneksel agar plakalarına kültür örnekleri vermeyi gerektirir. Bu yöntemler, örnekleri atmosferik oksijene açık bırakarak, mukus ile tıkanan akciğer bronşiollerinde bulunan hipoksik ve çoğunlukla anoksik koşulları hesaba katmayı ihmal eder 12,13. Agar üzerinde aerobik koşullar altında kültür yapılması, CF akciğerinin ortamı gibi bir şey değildir ve klinisyenleri ve araştırmacıları, tedavi etmeye çalıştıkları patojenlerle ilgili yanıltabilir. Ek olarak, bakteri plağı üzerindeki bakterilerin besin maddeleriYapay balgam ortamı (ASM) kullanılarak WinCF&#39;de hesaplanan gerçek balgamda bulunanlardan farklıdır. Sriramulu ve diğerlerinde Pseudomonas kültürleri tarafından gösterildiği gibi ; 14 , ASM, balgam mikropları için mevcut olan kaynakları taklit eden ve balgamın fiziksel tutarlılığını çoğaltan spesifik bir bileşen seti içerir. Hastalıklı bir akciğerin spesifik bir mikrobiyomu olduğu için, bu tür mikroorganizmaların çalışılması ideal olarak akciğerin spesifik koşullarında gerçekleşmelidir. WinCF sistemi, gerçek bir akciğer bronşiolünde görüleceği gibi mikrobiyal değişiklikleri izlemek için hızlı analiz ve deney koşullarının kolay manipüle edilmesini sağlar. Bu teknik, balgam, tükrük, diğer vücut salgıları ve saf veya karışık bakteri kültürleri gibi sayısız ilgili örnek türlerinin aşılanmasına izin verir. Deney düzeneğinin doğası, derhal görsel olarak yorumlanmasına izin verir.mikrobiyal topluluk davranışı ve mikrobiyolojik ve omik prosedürlerin çok sayıda kolay mansap uygulamasını sağlamak için tasarlanmıştır. Böyle çalışmalar çevreleriyle fizikokimyasal şartlara bağlı olarak bakteriyel topluluk bileşim değişikliği nedeniyle önemlidir. ortamın kimyasal koşullar bakteriyel aktivite üzerinde etkilerini analiz etmek için manipüle edilebilir WinCF ile. Örneğin, ortamın asitliği bir numune ile aşılama öncesinde değiştirilebilir. İnkübasyondan sonra, bu durumların her bakteriyel aktivitesi direkt karşılaştırılabilir ve sonuçlar bu balgam numunelerinde bakteri değişen pH karşılık olarak hareket hakkında çizilebilir. Burada, WinCF sistemi ve medya kimyası akciğer mikrobiyomu üzerindeki etkilerini incelemek için manipüle edilebilir nasıl örneklerini uygulamak için prosedürleri özetlemektedir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="595">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Color-Coded Capillary Tubes</td>
			<td style="width:93px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">22-260943</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cha-seal Tube Sealing Compound</td>
			<td style="width:93px;">Kimble-Chase</td>
			<td align="right" style="width:119px;">43510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Mucin from porcine stomach</td>
			<td style="width:93px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M1778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ferritin, cationized from horse spleen</td>
			<td style="width:93px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">F7879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Salmon sperm DNA Sodium salt (sonified)</td>
			<td style="width:93px;">AppliChem Panreac</td>
			<td>A2159</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">MEM Nonessential Amino Acids</td>
			<td style="width:93px;">Corning cellgro</td>
			<td style="width:119px;">25-025-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MEM Amino Acids</td>
			<td style="width:93px;">Cellgro</td>
			<td style="width:119px;">25-030-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Egg Yolk Emulsion, 50%</td>
			<td style="width:93px;">Dalynn Biologicals</td>
			<td style="width:119px;">VE30-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Potassium Chloride</td>
			<td style="width:93px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">P2157500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:93px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S271500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">15mL centriguge tubes with Printed Graduations and Flat Caps</td>
			<td style="width:93px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">89039-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">50mL centrifuge tubes with Printed Graduations and Flat Caps</td>
			<td style="width:93px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">89039-656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1.5mL microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:93px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">MCT-150-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2.0mL microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:93px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">MCT-200-C</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the wincf model - an inexpensive and tractable microcosm of a mucus plugged bronchiole to study the microbiology of lung infections

Birçok kronik hava yolu hastalığı, mukusun solunum yollarının tıkanmasına neden olur. Kistik fibrozlu bir bireyin akciğerleri mukus takılan bronşiollerin mikrobiyal kolonizasyon için uygun bir yaşam alanı oluşturduğu örnek bir durumdur. Çeşitli patojenler bu ortamda birbirleriyle etkileşime girerek ve KF hastalığına bağlı belirtilerin çoğunu çekerler. Herhangi bir mikrobik toplumda olduğu gibi, yaşam alanlarının kimyasal koşulları toplum yapısı ve dinamikleri üzerinde önemli bir etkiye sahiptir. Örneğin, farklı mikroorganizmalar farklı oksijen seviyeleri veya diğer çözünen konsantrasyonlarda gelişirler. Bu durum, oksijen konsantrasyonlarının topluluk fizyolojisi ve yapısını yönlendirdiği düşünülen CF akciğerinde de geçerlidir. Burada açıklanan yöntemler, akciğer çevresini taklit etmek ve patojenlere hastalığa neden olduklarına benzer şekilde büyürler. Bu mikropların kimyasal çevrelerinin manipülasyonu daha sonra kimyasalın nasıl çalıştığını incelemek için kullanılırAkciğer enfeksiyonları stry onun mikrobiyal ekoloji yönetir. yöntem WinCF sistemi olarak, suni balgam orta ve mukus takılı bronşiyollerde var olan benzer bir oksijen gradyanı sağlamak amaçlı dar kılcal tüpler dayanır. , balgam veya antibiyotik basınç ortam pH gibi kimyasal koşullar, Manipulating, bu örneklerde mikrobiyolojik farklılıklar, renkli göstergeler kullanılarak gaz veya biyofilm üretimi için takip içerir, veya çıkarılan ve her bir numunenin nükleik asit içeriği dizilenmesi olarak gösterebilir.

örnekleri içinde indüklenen farklı kimyasal koşullar arasında Mikrobiyolojik büyümenin önemli ölçüde, bazı durumlarda daha da fazla ustaca diğerlerinde değişiyordu. aktivitesinde çok değişiklik kısa Kuluçka süresi sona gibi hali hazırda belirginlik kazanacaktır, doğada görsel edildi. kuluçkadan sonra ortaya çıktı bir çok faktör tarafından gösterildiği gibi, pH değeri manipülasyon örnekte, pH spektrumu boyunca örnekler büyük ölçüde değişmişti...

Watch this Scientific Journal Video about The WinCF Model - An Inexpensive and Tractable Microcosm of a Mucus Plugged Bronchiole to Study the Microbiology of Lung Infections at JoVE.com

The WinCF Model - An Inexpensive and Tractable Microcosm of a Mucus Plugged Bronchiole to Study the Microbiology of Lung Infections

mukus kistik fibrozis solunum yolları (CF) hastalarının mikrobiyal patojenler gelişmek için ideal bir ortam vardır takılı. el yazması onlar kimyasal koşulların hastalığı ve nasıl değişikliklere neden taklit mikrobiyal dinamikleri harekete geçirebilir bir ortamda CF akciğer mikrobiyomu eğitimi için yeni bir yöntem tarif eder.

WinCF Modeli - Bir Mukus bir Ucuz ve Çekilebilir Microcosm Akciğer İnfeksiyonları Mikrobiyoloji Eğitim için bronşiole Takıldı

Many chronic airway diseases result in mucus plugging of the airways. Lungs of an individual with cystic fibrosis are an exemplary case where their ...

the-wincf-model-an-inexpensive-tractable-microcosm-mucus-plugged

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Pharmacology

Immunology and Infection

Unit 1

Lower Respiratory Disorders

SCIENTISTS IN ACTION

9.0K Görüntüleme.  University of California, San Diego.  mukus kistik fibrozis solunum yolları (CF) hastalarının mikrobiyal patojenler gelişmek için ideal bir ortam vardır takılı. el yazması onlar kimyasal koşulların hastalığı ve nasıl değişikliklere neden taklit mikrobiyal dinamikleri harekete geçirebilir bir ortamda CF akciğer mikrobiyomu eğitimi için yeni bir yöntem tarif eder. 

Video: The WinCF Model - An Inexpensive and Tractable Microcosm of a Mucus Plugged Bronchiole to Study the Microbiology of Lung Infections

Tractable Mammalian Cell Infections with Protozoan-primed Bacteria

Many intracellular bacterial pathogens use freshwater protozoans as a natural reservoir for proliferation in the environment. Legionella pneumophila, the causative agent of Legionnaires' pneumonia, gains a pathogenic advantage over in vitro cultured bacteria when first harvested from protozoan cells prior to infection of mammalian macrophages. This suggests that important virulence factors may not be properly expressed in vitro. We have developed a tractable system for priming L. pneumophila through its natural protozoan host Acanthamoeba castellanii prior to mammalian cell infection. The contribution of any virulence factor can be examined by comparing intracellular growth of a mutant strain to wild-type bacteria after protozoan priming. GFP-expressing wild-type and mutant L. pneumophila strains are used to infect protozoan monolayers in a priming step and allowed to reach late stages of intracellular growth. Fluorescent bacteria are then harvested from these infected cells and normalized by spectrophotometry to generate comparable numbers of bacteria for a subsequent infection into mammalian macrophages. For quantification, live bacteria are monitored after infection using fluorescence microscopy, flow cytometry, and by colony plating. This technique highlights and relies on the contribution of host cell-dependent gene expression by mimicking the environment that would be encountered in a natural acquisition route. This approach can be modified to accommodate any bacterium that uses an intermediary host as a means for gaining a pathogenic advantage.

This technique provides a method to harvest, normalize and quantify intracellular growth of bacterial pathogens that are pre-cultivated in natural protozoan host cells prior to infections of mammalian cells. This method can be modified to accommodate a wide variety of host cells for the priming stage as well as target cell types.

Protozoa astarlanmış Bakteriler ile uysal Memeli Hücre Enfeksiyonlar

Many intracellular bacterial pathogens use freshwater protozoans as a natural reservoir for proliferation in the environment. Legionella pneumophila, the ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the phenotypic and functional differences between murine and human monocyte-derived macrophages. Therefore, we here describe an in vitro model to generate and study primary human macrophages. Briefly, after density gradient centrifugation of peripheral blood drawn from a forearm vein, monocytes are isolated from peripheral blood mononuclear cells using negative magnetic bead isolation. These monocytes are then cultured for six days under specific conditions to induce different types of macrophage differentiation or polarization. The model is easy to use and circumvents the problems caused by species-specific differences between mouse and man. Furthermore, it is closer to the in vivo conditions than the use of immortalized cell lines. In conclusion, the model described here is suitable to study macrophage biology, identify disease mechanisms and novel therapeutic targets. Even though not fully replacing experiments with animals or human tissues obtained post mortem, the model described here allows identification and validation of disease mechanisms and therapeutic targets that may be highly relevant to various human diseases.

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages are important cells of the innate immune system. Here, we describe an easy to use in vitro model to generate these cells. Using gradient centrifugation, negative bead isolation and specific cell culture conditions, monocyte-derived macrophages can be generated for phenotypic and functional studies.

Bir<em&gt; In vitro</emİnsan Makrofaj Farklılaşma ve Polarizasyon heterojenliği Eğitim için&gt; Model

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the respective immune response to each single pathogen and may thereby affect pathogenesis and disease outcome. Coinfected patients may also respond differentially to anti-infective interventions. Coinfection between tuberculosis as caused by mycobacteria and the malaria parasite Plasmodium, both of which are coendemic in many parts of sub-Saharan Africa, has not been studied in detail. In order to approach the challenging but scientifically and clinically highly relevant question how malaria-tuberculosis coinfection modulate host immunity and the course of each disease, we established an experimental mouse model that allows us to dissect the elicited immune responses to both pathogens in the coinfected host. Of note, in order to most precisely mimic naturally acquired human infections, we perform experimental infections of mice with both pathogens by their natural routes of infection, i.e. aerosol and mosquito bite, respectively.

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

Tuberculosis and malaria are two of the most prevalent infections in humans and major causes of morbidity and mortality in impoverished populations in the tropics. We established an experimental model system to study outcome of malaria-tuberculosis coinfection in mice after challenge with both pathogens via their natural route of infection.

Doğal İletim üzerine Tüberküloz-Sıtma Koenfeksiyonu Çalışması için Deneysel Bir Model Mycobacterium tuberculosis Ve Plasmodium berghei</i

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the ...

Humanized Mouse Model to Study Bacterial Infections Targeting the Microvasculature

Neisseria meningitidis causes a severe, frequently fatal sepsis when it enters the human blood stream. Infection leads to extensive damage of the blood vessels resulting in vascular leak, the development of purpuric rashes and eventual tissue necrosis. Studying the pathogenesis of this infection was previously limited by the human specificity of the bacteria, which makes in vivo models difficult. In this protocol, we describe a humanized model for this infection in which human skin, containing dermal microvessels, is grafted onto immunocompromised mice. These vessels anastomose with the mouse circulation while maintaining their human characteristics. Once introduced into this model, N. meningitidis adhere exclusively to the human vessels, resulting in extensive vascular damage, inflammation and in some cases the development of purpuric rash. This protocol describes the grafting, infection and evaluation steps of this model in the context of N. meningitidis infection. The technique may be applied to numerous human specific pathogens that infect the blood stream.

Neisseria meningitidis is a human specific pathogen that infects blood vessels. In this protocol human microvessels are introduced into a mouse by grafting human skin onto immunocompromised mice. Bacteria adhere extensively to the human vessels, leading to vascular damage and development of the purpuric rash typically observed in human cases.

Insanlaşmış Fare Modeli mikrovaskülatürde Hedefleme Bakteriyel Enfeksiyonlar Eğitim için

Neisseria meningitidis causes a severe, frequently fatal sepsis when it enters the human blood stream. Infection leads to extensive damage of the blood ...

Human Placental and Decidual Organ Cultures to Study Infections at the Maternal-fetal Interface

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is imperative to design experiments using human cells and tissues. An advantage of organ culture is maintenance of three-dimensional (3D) structural organization and extracellular matrix. The goal of the method described here is successful establishment of ex vivo human gestational tissue organ cultures and their healthy culture maintenance for 72-96 hr. The protocol details the immediate processing of research-consented, placental and decidual specimens fresh from the operating suite. These are abundant specimens that would otherwise be discarded. Detailed instructions on the sterile collection of these samples, including morphologic details on how to select appropriate tissues to establish 3D organ cultures, is provided. Placental villous and decidual tissues are microdissected into 2-3 mm3 pieces and placed separately on matrix-lined transwell filters and cultured for several days. Villous and decidual organ cultures are well suited for the study of human host-pathogen interaction. As compared to other model organisms, these human cultures are particularly advantageous to examine mechanism of infection for pathogens that demonstrate variable patterns of host specificity. As an example, we demonstrate infection of placental and decidual organ cultures with the clinically relevant, facultative intracellular bacterial pathogen Listeria monocytogenes.

A simple method to establish primary human placental (villous) and decidual organ cultures is described. Villous and decidual organ cultures are invaluable tools for studying pathogenesis at the human maternal-fetal interface. Infection with the facultative intracellular bacterium Listeria monocytogenes is demonstrated.

İnsan Plasental ve Desidual Organ Kültürleri Maternal-Fetal Arayüz de Enfeksiyonlar Eğitim için

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is ...

Development of an Antigen-driven Colitis Model to Study Presentation of Antigens by Antigen Presenting Cells to T Cells

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological mechanisms involved during the disease is the T cell transfer model of colitis. In this model, immunodeficient mice (RAG-/- recipients) are reconstituted with naive CD4+ T cells from healthy wild type hosts.
This model allows examination of the earliest immunological events leading to disease and chronic inflammation, when the gut inflammation perpetuates but does not depend on a defined antigen. To study the potential role of antigen presenting cells (APCs) in the disease process, it is helpful to have an antigen-driven disease model, in which a defined commensal-derived antigen leads to colitis. An antigen driven-colitis model has hence been developed. In this model OT-II CD4+ T cells, that can recognize only specific epitopes in the OVA protein, are transferred into RAG-/- hosts challenged with CFP-OVA-expressing E. coli. This model allows the examination of interactions between APCs and T cells in the lamina propria.

In this antigen-driven colitis model, OT-II CD4+ T cells expressing a red fluorescent protein were adoptively transferred into RAG-/- mice that express a green fluorescent protein in mononuclear phagocytes (MPs). The hosts were challenged with Escherichia coli (E.coli) expressing the ovalbumin protein (OVA) fused to a cyan fluorescent protein (CFP).

Bir Antijen odaklı Kolit Modelinin Geliştirilmesi Antijen T hücreleri için Hücreler sunulması ile Antijen Sunumu Eğitim için

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological ...

Methodology for the Study of Horizontal Gene Transfer in Staphylococcus aureus

One important feature of the major opportunistic human pathogen Staphylococcus aureus is its extraordinary ability to rapidly acquire resistance to antibiotics. Genomic studies reveal that S. aureus carries many virulence and resistance genes located in mobile genetic elements, suggesting that horizontal gene transfer (HGT) plays a critical role in S. aureus evolution. However, a full and detailed description of the methodology used to study HGT in S. aureus is still lacking, especially regarding natural transformation, which has been recently reported in this bacterium. This work describes three protocols that are useful for the in vitro investigation of HGT in S. aureus: conjugation, phage transduction, and natural transformation. To this aim, the cfr gene (chloramphenicol/florfenicol resistance), which confers the Phenicols, Lincosamides, Oxazolidinones, Pleuromutilins, and Streptogramin A (PhLOPSA)-resistance phenotype, was used. Understanding the mechanisms through which S. aureus transfers genetic materials to other strains is essential to comprehending the rapid acquisition of resistance and helps to clarify the modes of dissemination reported in surveillance programs or to further predict the spreading mode in the future.

Methodology for the Study of Horizontal Gene Transfer in Staphylococcus aureus

We describe here three different protocols for the in vitro investigation of conjugation, transduction, and natural transformation in Staphylococcus aureus.

Yatay Gen Transferi Çalışmasında Metodolojisi<em&gt; Staphylococcus aureus</em

One important feature of the major opportunistic human pathogen Staphylococcus aureus is its extraordinary ability to rapidly acquire resistance to ...

Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

The presence of bacteria as structured biofilms in chronic wounds, especially in diabetic patients, is thought to prevent wound healing and resolution. Chronic mouse wounds models have been used to understand the underlying interactions between the microorganisms and the host. The models developed to date rely on the use of haired animals and terminal collection of wound tissue for determination of viable bacteria. While significant insight has been gained with these models, this experimental procedure requires a large number of animals and sampling is time consuming. We have developed a novel murine model that incorporates several optimal innovations to evaluate biofilm progression in chronic wounds: a) it utilizes hairless mice, eliminating the need for hair removal; b) applies pre-formed biofilms to the wounds allowing for the immediate evaluation of persistence and effect of these communities on host; c) monitors biofilm progression by quantifying light production by a genetically engineered bioluminescent strain of Pseudomonas aeruginosa, allowing real-time monitoring of the infection thus reducing the number of animals required per study. In this model, a single full-depth wound is produced on the back of STZ-induced diabetic hairless mice and inoculated with biofilms of the P. aeruginosa bioluminescent strain Xen 41. Light output from the wounds is recorded daily in an in vivo imaging system, allowing for in vivo and in situ rapid biofilm visualization and localization of biofilm bacteria within the wounds. This novel method is flexible as it can be used to study other microorganisms, including genetically engineered species and multi-species biofilms, and may be of special value in testing anti-biofilm strategies including antimicrobial occlusive dressings.

Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

Here we describe a novel diabetic murine model utilizing hairless mice for real-time, non-invasive, monitoring of biofilm wound infections of bioluminescent Pseudomonas aeruginosa. This method can be adapted to evaluate infection of other bacterial species and genetically modified microorganisms, including multi-species biofilms, and test the efficacy of antibiofilm strategies.

Işık tarafa: In Vivo izleme bir diyabetik tüysüz fare modelinde kronik yaralarda Pseudomonas aeruginosa biyofilm enfeksiyonların

The presence of bacteria as structured biofilms in chronic wounds, especially in diabetic patients, is thought to prevent wound healing and resolution. ...

Intraperitoneal Glucose Tolerance Test, Measurement of Lung Function, and Fixation of the Lung to Study the Impact of Obesity and Impaired Metabolism on Pulmonary Outcomes

Obesity and respiratory disorders are major health problems. Obesity is becoming an emerging epidemic with an expected number of over 1 billion obese individuals worldwide by 2030, thus representing a growing socioeconomic burden. Simultaneously, obesity-related comorbidities, including diabetes as well as heart and chronic lung diseases, are continuously on the rise. Although obesity has been associated with increased risk for asthma exacerbations, worsening of respiratory symptoms, and poor control, the functional role of obesity and perturbed metabolism in the pathogenesis of chronic lung disease is often underestimated, and underlying molecular mechanisms remain elusive. This article aims to present methods to assess the effect of obesity on metabolism, as well as lung structure and function. Here, we describe three techniques for mice studies: (1) assessment of intraperitoneal glucose tolerance (ipGTT) to analyze the effect of obesity on glucose metabolism; (2) measurement of airway resistance (Res) and respiratory system compliance (Cdyn) to analyze the effect of obesity on lung function; and (3) preparation and fixation of the lung for subsequent quantitative histological assessment. Obesity-related lung diseases are probably multifactorial, stemming from systemic inflammatory and metabolic dysregulation that potentially adversely influence lung function and the response to therapy. Therefore, a standardized methodology to study molecular mechanisms and the effect of novel treatments is essential.

The incidence of obesity is rising and increases the risk of chronic lung diseases. To establish the underlying mechanisms and preventive strategies, well-defined animal models are needed. Here, we provide three methods (glucose-tolerance-test, body plethysmography, and lung fixation) to study the effect of obesity on pulmonary outcomes in mice.

Mayi glikoz tolerans testi, akciğer işlev ölçümü ve akciğer fiksasyonu obezite ve pulmoner sonuçlar üzerine Engelli metabolizma etkisini incelemek için

Obesity and respiratory disorders are major health problems. Obesity is becoming an emerging epidemic with an expected number of over 1 billion obese ...

Arbovirus Infections As Screening Tools for the Identification of Viral Immunomodulators and Host Antiviral Factors

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. However, these screens are typically conducted in cells that are naturally permissive to the viral pathogen under study. Therefore, the robust replication of viruses in control conditions may limit the dynamic range of these screens. Furthermore, these screens may be unable to easily identify cellular defense pathways that restrict virus replication if the virus is well-adapted to the host and capable of countering antiviral defenses. In this article, we describe a new paradigm for exploring virus-host interactions through the use of screens that center on naturally abortive infections by arboviruses such as vesicular stomatitis virus (VSV). Despite the ability of VSV to replicate in a wide range of dipteran insect and mammalian hosts, VSV undergoes a post-entry, abortive infection in a variety of cell lines derived from lepidopteran insects, such as the gypsy moth (Lymantria dispar). However, these abortive VSV infections can be &#34;rescued&#34; when host cell antiviral defenses are compromised. We describe how VSV strains encoding convenient reporter genes and restrictive L. dispar cell lines can be paired to set-up screens to identify host factors involved in arbovirus restriction. Furthermore, we also show the utility of these screening tools in the identification of virally encoded factors that rescue VSV replication during coinfection or through ectopic expression, including those encoded by mammalian viruses. The natural restriction of VSV replication in L. dispar cells provides a high signal-to-noise ratio when screening for the conditions that promote VSV rescue, thus enabling the use of simplistic luminescence- and fluorescence-based assays to monitor the changes in VSV replication. These methodologies are valuable for understanding the interplay between host antiviral responses and viral immune evasion factors.

Here, we present the protocols to identify 1) virus-encoded immunomodulators that promote arbovirus replication and 2) eukaryotic host factors that restrict arbovirus replication. These fluorescence- and luminescence-based methods allow researchers to rapidly obtain quantitative readouts of arbovirus replication in simplistic assays with low signal-to-noise ratios.

Araçlar Viral Immunomodulators ve ana bilgisayar Antiviral faktörler tanımlanması için eleme olarak Abdovirüs enfeksiyonlar

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. ...