M.Z. ve K.S.F. ve bu çalışma, Pittsburgh Üniversitesi Klinik ve Çeviri Bilimi Enstitüsü aracılığıyla Pitt Innovation Challenge (PInCh) kapsamında verilen bir hibe ve M.Z'ye verilen NHLBI R01 hibesi HL153407 ile desteklendi.

Pittsburgh Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi, bu hayvan deneylerinden herhangi birini üstlenmeden önce bu yayında belirtilen tüm hayvan protokollerini onayladı.
NOT: Bu protokol, çift modlu SPECT/CT tarayıcı ile radyonüklid görüntüleme kullanılarak in vivo mukozit temizleme çalışmalarının nasıl gerçekleştirildiğini detaylandırmamaktadır. Gösterilen teknikler sistem kalibrasyonları, uyuşturma fareleri, farelerin trakeal entübasyonu, izotopun akciğerlere aşılanması, çift modalite görüntüleme, bu görüntülerin birlikte kaydedilmesi ve analizdir.
1. SPECT/CT sistem kurulumu
<ol><li>Uygun bir iş akışı tasarlayın ve canlı hayvanları kullanarak deneyler yapmadan önce ayarlayın.<ol>
<li>40 cm dönüş yarıçapına sahip projeksiyonlar arasında adım boyutu 6o olan 60 projeksiyondan oluşan bir SPECT alımı kullanın. CT alımı, projeksiyonlar arasında 1,6o açıya sahip 220 projeksiyondan oluşur.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sistemin fareler ve SPECT görüntüleme için doğru MWB kolimatörlerine sahip olduğundan emin olun. Uygun olmayan kolimatörler yüklüyse, doğru olanları yüklemek için kolimatör sihirbazını kullanın.</li>
	<li>Sistemi kullanıma hazırlamak için gerekli sistem kalibrasyonlarını çalıştırın. NOT: Tarayıcının SPECT ve CT bileşenlerinin kalibrasyona ihtiyacı vardır. CT bileşenlerini günde bir kez kaynak koşullandırma ve Koyu/Açık (D/L) kalibrasyon, 2 haftada bir Merkez Ofset (COS) kalibrasyonu kullanarak kalibre edin ve x-ray donanımını her ay değerlendirin. SPECT bileşenlerinin yılda bir kez kalibre edilmesi gerekir.<ol>
<li>X-ray donanımını değerlendirmek için CT kalibrasyonları sırasında X-ışını donanımını değerlendir kutusunu işaretleyin(Ek CT Kalibrasyon Menüsü).</li>
		<li>Kaynak koşullandırmasını gerçekleştirmek için CT kalibrasyonları sırasında kaynak koşullandırmayı gerçekleştir kutusunu işaretleyin(Ek CT Kalibrasyon Menüsü).</li>
		<li>D/L kalibrasyonu gerçekleştirmek için, CT kalibrasyonları sırasında denemeler sırasında kullanılan CT alım protokolünün yanındaki D/M kutusunu işaretleyin. Diğer tüm protokollerin işaretini kaldırın (Ek CT Kalibrasyon Menüsü).</li>
		<li>COS kalibrasyonu gerçekleştirmek için yatağı kalibrasyon halkası aracıyla değiştirin, yatak tipi ayarlarını hareket kontrol ayarlarında eşleşecek şekilde ayarlayın ve CT kalibrasyonları sırasında denemeler sırasında kullanılan CT alım protokolünün yanındaki COS kutusunu işaretleyin. Diğer tüm protokollerin işaretini kaldırın(Ek CT Kalibrasyon Menüsü, Ek Kalibrasyon Halkası).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Fare Entübasyonu ve Aşılama
<ol><li>Taranacak fareleri tartın. Birden fazla fareyi tarıyorsanız, kulak delme veya kuyruğun işaretlenmesi gibi yöntemleri kullanarak fareleri tanımlama amacıyla işaretlemeye özen edin.</li>
	<li>Nefes almak dakikada ~55-65 nefese kadar yavaşlayınçaya kadar yeterli derinlikte anestezi üretmek için bir gaz odasında~5 dakika boyunca 2 L / dk O 2 gaz akışı ile% 1.5 izofluran kullanarak bir fareyi uyuşturun 16 (Şekil 1A).</li>
	<li>Fareyi odadan çıkarın ve 45 o eğimdeki entübasyon standında ön kesici dişlerdenaskıya alın. Entübasyon sırasında farenin uyuşturulmasını sağlamak için entübasyon standını bir burun konisi ile donatın (Şekil 1B).</li>
	<li>50 μm fiber optik telin bir ucunu bir ışık kaynağına bağlayın ve kılavuz görevi görmek için teli kullanarak üzerine 20 kalibrelik bir ampul geçirin (Şekil 1C).</li>
	<li>Farenin ağzını açın ve künt forseps kullanarak dili öne doğru çekin. Kılavuz teli aydınlatın ve ses tellerini görselleştirmek için kullanın (Şekil 1D).</li>
	<li>Kılavuz teli ses tellerinden geçirin, böylece tel ses tellerinin hemen ötesinde ve üst nefes borusunda dinlenir. Fareyi entübe etmek için 1 inçlik kanı tel boyunca ileri doğru kaydırın, kanı yeterince derine geçirin, böylece göbeği hayvanın kesici dişlerine karşıdır (Şekil 1E). Canülleri yerinde bırakarak teli çıkarın.</li>
	<li>Kanülü bir parmakla kısa bir süre takarak ve nefes almadaki değişiklikleri kontrol ederek entübasyonu test edin. Tıkanırken solunumun durması veya nefes almanın zorlanması ve serbest bırakıldığında hızlandırılmış solunum, uygun trakeal entübasyon belirtileridir. Canül takıldıktan sonra solunum modellerinde bir değişiklik yoksa, ikincisi yemek borusunda muhtemeldir.</li>
	<li>10 μL hacimde 0,2 mCi 99mtechnetium-kükürt kolloid (99m Tc-Sc) hazırlayın ve pipeti canüle alın. Farenin 1-2 dakika boyunca akciğerlere kendiliğinden solumasına izin verin(Şekil 1F). Fareyi tarayıcının paletine aktarmadan önce tarayısı çıkarın. NOT: Radyonüklid Kardinal Sağlık tarafından hazırlandı ve filtrelendi.</li>
</ol>3. SPECT/CT Görüntüleme
<ol><li>Fareyi burun konisi ile 25 mm'lik bir palete aktarın ve bantla sabitleyin, solunumu bozmamak için göğsü ve karnı çok sıkı bantlamamaya dikkat edin. Fareye bağlı metal kulak etiketlerini çıkarmaya özen göster.</li>
	<li>200 μL'de 0,05 mCi'den oluşan bir radyoaktif fantom hazırlayın ve bu miktarı 0,2 mL PCR tüpüne yerleştirin. Tüpü, farenin alt karnının altındaki palete bantlayarak, akciğerlerle çakışmayı önleyerek yerleştirin. NOT: Hayalet, CT ve SPECT görüntülerinin birlikte kaydedilmesinin yanı sıra boşluk için negatif bir kontrol amacıyla kullanılır.</li>
	<li>Fareyi SPECT/CT sistemine yerleştirin, görüntüleme iş akışını seçin ve Kur 'u çalıştırın.</li>
	<li>Dedektörlerin fare üzerindeki konumunu ayarlayın ve görüntüleme iş akışını çalıştırın.</li>
	<li>İşlem sonrası radyoaktivite alan fareler için yiyecek ve suya sınırsız erişime sahip bir kafes hazırlayın ve radyasyon güvenliği etiketi kullanarak etiketlemeyi temizleyin.</li>
	<li>İş akışı tamamlandıktan sonra, fareyi görüntüleme paletinden çıkarın ve hazırlanan kafeste taramalar arasında 6 saat boyunca (tarama 1 ila tarama 2'nin başlangıcı) yiyecek ve suya reklam libitum erişimi ile iyileşmesine izin verin. 6 saat, cilia fonksiyonuna bağlı olarak doğrusal boşluğun çok az alveolar boşlukla gerçekleştiği zaman dilimine karşılık geldiği için seçildi.</li>
	<li>6 saat sonra, fareyi yeniden uyuşturun ve hayaletle birlikte, hava yollarından temizlenen izotop miktarını ölçmek için aynı iş akışını kullanarak tarayın. NOT: Farenin 6 saat boyunca izofluran ile kesintisiz anestezi olarak iyileşmesine izin vermek, neredeyse sıfır mukozal boşlukla sonuçlanan önemli bir cilia-depresan etkisine yol açacaktır.</li>
</ol>4. Analiz
<ol><li>Görüntülemeden sonra, tam 3D yığın görüntülerini yeniden oluşturmak için işlem sonrası gerçekleştirin.<ol>
<li>Spect görüntülerini 99mTc için fabrika standart ayarlarını kullanarak histogramlayın ve ardından bir MAP3D algoritması ve nokta yayma işlevi (PSF) rekonstrüksiyonu kullanarak yeniden oluşturun. NOT: Yeniden yapılandırma 8 yineleme ve 6 alt küme kullanılarak gerçekleştirildi. Etkili bir yeniden yapılandırma, alt kümelerin 1:10'daki projeksiyonlara oranına veya projeksiyon sayısına eşit olarak bölünmesine ihtiyaç duyar, bu nedenle 60 projeksiyon kullanılarak elde edilmesi nedeniyle 6 alt küme kullanılmıştır.</li>
		<li>CT görüntülerini Feldkamp algoritması ve Shepp-Logan filtresi kullanarak yeniden yapılandırın. NOT: Yeniden yapılandırma 4 yineleme kullanılarak gerçekleştirildi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Varsayılan eksenel görüntülerden koronal görünüm görüntüleri oluşturmak için reslice aracını kullanarak FIJI ImageJ21'deki CT ve SPECT görüntülerini işleyin. Ardından, her dilimden sayım verilerini eklemek ve analiz kolaylığı için tek bir görüntü oluşturmak için SPECT görüntüsünde bir z yığını toplam projeksiyonu gerçekleştirin.</li>
	<li>Referans olarak hayalet Eppendorf tüpünü kullanarak CT ve SPECT görüntülerini yeniden boyutlandırın ve birlikte kaydedin (Şekil 2A,B). Tüm numunelerde tutarlı yeniden boyutlandırma ölçümlerini izleyin ve kullanın.</li>
	<li>Ct görüntüsünü otomatik eşik kullanarak binarize edin, ardından yığını ters çevirin ve analiz için akciğerlerin anahattını oluşturmak için z yığını toplam projeksiyonu gerçekleştirin (Şekil 2C).</li>
	<li>CT ve SPECT görüntülerini döndürün ve kanal araçlarını kullanarak görüntüyü birleştirin. Sağ akciğerin etrafına bir yatırım getirisi çizerek ve ölçerek MCC'yi hesaplayın (Şekil 2D). NOT: Bu ölçüm, 0 ve 6 saatlik zaman noktaları için sağ akciğerdeki toplam sayımlardan olacak ve 6 saatlik görüntüler radyoaktif bozunma için aşağıdaki formül kullanılarak düzeltilecektir: N(t) = N0e−t. 99m Tc-Sc, ~6 saatlik yarı ömrü ile saniyede 3,21e−5 çürüme sabitine sahiptir. Bu değerler daha sonra bir yüzde boşluğu hesaplamak için kullanılabilir. NOT: Mukoza boşluğu radyoizotopu akciğerlerden farenkse yutulacağı yerden taşıyacak ve mideye düşeceğinden, yatırım getirisi çizimi ve ölçüm sayıları için sağ akciğer seçilir. Midede oldukça sık sol akciğerle örtüşebilecek ve bu nedenle hatalı sayımlar üretebilecek sayımlar görülebilir. Bu kafa karıştırıcı sadece sağ akciğerdeki sayımlar ölçülerek önlenebilir.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Afzelius, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cilia-related+diseases.">Cilia-related diseases.</a> Journal of Pathology. 204 (4), 470-477 (2004).</li><li>Mitchell, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolution+of+eukaryotic+cilia+and+flagella+as+motile+and+sensory+organelles.">The evolution of eukaryotic cilia and flagella as motile and sensory organelles.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 607, 130-140 (2007).</li><li>Carvalho-Santos, Z., Azimzadeh, J., Pereira-Leal, J. B., Bettencourt-Dias, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution:+Tracing+the+origins+of+centrioles,+cilia,+and+flagella.">Evolution: Tracing the origins of centrioles, cilia, and flagella.</a> Journal of Cell Biology. 194 (2), 165-175 (2011).</li><li>Randell, S. H., Boucher, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=University+of+North+Carolina+Virtual+Lung,+G.+Effective+mucus+clearance+is+essential+for+respiratory+health.">University of North Carolina Virtual Lung, G. Effective mucus clearance is essential for respiratory health.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 35 (1), 20-28 (2006).</li><li>Wanner, A., Salathe, M., O'Riordan, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucociliary+clearance+in+the+airways.">Mucociliary clearance in the airways.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 154, 1868-1902 (1996).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+genetic+analysis+in+mice+unveils+central+role+for+cilia+in+congenital+heart+disease.">Global genetic analysis in mice unveils central role for cilia in congenital heart disease.</a> Nature. 521 (7553), 520-524 (2015).</li><li>Zahid, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+ciliary+dysfunction+and+respiratory+symptoms+in+patients+with+transposition+of+the+great+arteries.">Airway ciliary dysfunction and respiratory symptoms in patients with transposition of the great arteries.</a> PLoS One. 13 (2), 0191605 (2018).</li><li>Stewart, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+ciliary+dysfunction:+Association+with+adverse+postoperative+outcomes+in+nonheterotaxy+congenital+heart+disease+patients.">Airway ciliary dysfunction: Association with adverse postoperative outcomes in nonheterotaxy congenital heart disease patients.</a> Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 155 (2), 755-763 (2018).</li><li>Garrod, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+ciliary+dysfunction+and+sinopulmonary+symptoms+in+patients+with+congenital+heart+disease.">Airway ciliary dysfunction and sinopulmonary symptoms in patients with congenital heart disease.</a> Annals of the American Thoracic Society. 11 (9), 1426-1432 (2014).</li><li>Harden, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+postoperative+respiratory+complications+in+heterotaxy+congenital+heart+disease+patients+with+respiratory+ciliary+dysfunction.">Increased postoperative respiratory complications in heterotaxy congenital heart disease patients with respiratory ciliary dysfunction.</a> Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 147 (4), 1291-1298 (2014).</li><li>Leigh, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+and+genetic+aspects+of+primary+ciliary+dyskinesia/Kartagener+syndrome.">Clinical and genetic aspects of primary ciliary dyskinesia/Kartagener syndrome.</a> Genetics in Medicine. 11 (7), 473-487 (2009).</li><li>Donaldson, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+ivacaftor+on+mucociliary+clearance+and+clinical+outcomes+in+cystic+fibrosis+patients+with+G551D-CFTR.">Effect of ivacaftor on mucociliary clearance and clinical outcomes in cystic fibrosis patients with G551D-CFTR.</a> JCI Insight. 3 (24), (2018).</li><li>Donaldson, S. H., Corcoran, T. E., Laube, B. L., Bennett, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucociliary+clearance+as+an+outcome+measure+for+cystic+fibrosis+clinical+research.">Mucociliary clearance as an outcome measure for cystic fibrosis clinical research.</a> Proceedings of the American Thoracic Society. 4 (4), 399-405 (2007).</li><li>Ledowski, T., Hilmi, S., Paech, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bronchial+mucus+transport+velocity+in+patients+receiving+anaesthesia+with+propofol+and+morphine+or+propofol+and+remifentanil.">Bronchial mucus transport velocity in patients receiving anaesthesia with propofol and morphine or propofol and remifentanil.</a> Anaesthesia. 61 (8), 747-751 (2006).</li><li>Donnelley, M., Morgan, K. S., Siu, K. K., Parsons, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dry+deposition+of+pollutant+and+marker+particles+onto+live+mouse+airway+surfaces+enhances+monitoring+of+individual+particle+mucociliary+transit+behaviour.">Dry deposition of pollutant and marker particles onto live mouse airway surfaces enhances monitoring of individual particle mucociliary transit behaviour.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 19, 551-558 (2012).</li><li>Christopher, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+temperature+and+anesthetic+agents+on+ciliary+function+in+murine+respiratory+epithelia.">The effects of temperature and anesthetic agents on ciliary function in murine respiratory epithelia.</a> Frontiers in Pediatrics. 2, 111 (2014).</li><li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+quantitative+study+of+airway+functional+microanatomy+using+micro-optical+coherence+tomography.">Method for quantitative study of airway functional microanatomy using micro-optical coherence tomography.</a> PLoS One. 8 (1), 54473 (2013).</li><li>Lam, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+deacetylase+6-mediated+selective+autophagy+regulates+COPD-associated+cilia+dysfunction.">Histone deacetylase 6-mediated selective autophagy regulates COPD-associated cilia dysfunction.</a> Journal of Clinical Investigation. 123 (12), 5212-5230 (2013).</li><li>Bhashyam, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pilot+study+to+examine+the+effect+of+chronic+treatment+with+immunosuppressive+drugs+on+mucociliary+clearance+in+a+vagotomized+murine+model.">A pilot study to examine the effect of chronic treatment with immunosuppressive drugs on mucociliary clearance in a vagotomized murine model.</a> PLoS One. 7 (9), 45312 (2012).</li><li>Ortiz, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+Mucociliary+Clearance+by+Three+Dimension+Micro-CT-SPECT+in+Guinea+Pig:+Role+of+Bitter+Taste+Agonists.">Evaluation of Mucociliary Clearance by Three Dimension Micro-CT-SPECT in Guinea Pig: Role of Bitter Taste Agonists.</a> PLoS One. 11 (10), 0164399 (2016).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Solomon, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+ciliary+phenotype+in+primary+ciliary+dyskinesia+by+micro-optical+coherence+tomography.">Assessment of ciliary phenotype in primary ciliary dyskinesia by micro-optical coherence tomography.</a> JCI Insight. 2 (5), 91702 (2017).</li><li>Nakhleh, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+prevalence+of+respiratory+ciliary+dysfunction+in+congenital+heart+disease+patients+with+heterotaxy.">High prevalence of respiratory ciliary dysfunction in congenital heart disease patients with heterotaxy.</a> Circulation. 125 (18), 2232-2242 (2012).</li><li>Whaley, S. L., Renken, S., Muggenburg, B. A., Wolff, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technique+for+aerosol+deposition+restricted+to+the+nose+in+beagle+dogs.">Technique for aerosol deposition restricted to the nose in beagle dogs.</a> Journal of Toxicology and Environmental Health. 23 (4), 519-525 (1988).</li><li>Foster, W. M., Walters, D. M., Longphre, M., Macri, K., Miller, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodology+for+the+measurement+of+mucociliary+function+in+the+mouse+by+scintigraphy.">Methodology for the measurement of mucociliary function in the mouse by scintigraphy.</a> Journal of Applied Physiology. 90 (3), 1111-1117 (2001).</li><li>Bhashyam, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vagal+control+of+mucociliary+clearance+in+murine+lungs:+a+study+in+a+chronic+preparation.">Vagal control of mucociliary clearance in murine lungs: a study in a chronic preparation.</a> Autonomic Neuroscience. 154 (1-2), 74-78 (2010).</li><li>Van Audenhaege, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+SPECT+collimator+selection,+optimization,+and+fabrication+for+clinical+and+preclinical+imaging.">Review of SPECT collimator selection, optimization, and fabrication for clinical and preclinical imaging.</a> Medical Physics. 42 (8), 4796-4813 (2015).</li></ol>

Bu işle ilgili değil.

Hareketli solunum cilia'nın hem hastalık hem de gelişimdeki rolü gelişmeye ve daha iyi takdir olmaya devam ediyor. Trakeobronşiyal ağacı astarlayan hücrelerin apikal yüzeyinde birden fazla motile cilia'nın senkron, metakronal dövülmesi, mukozal boşluk veya MCC üreten sefalad akışı oluşturur. MCC, PCD22, KOAH18gibi edinilmiş hastalıklar gibi ciliopatilerde tehlikeye girer ve önemi geleneksel olarak ciliopati olarak kabul edilmeden CHD'lerde tanınmaktadır. Son veriler hem HETEROTAKSİ23 hem de heterotaksi7olmadan hem CHD'de solunum siliary disfonksiyonu göstermiştir. Bu tür hareketli cilia disfonksiyonu daha büyük solunum semptomları9 ve daha fazla ameliyat sonrası morbidite8'e çevrildiği gösterilmiştir. Hepsi olmasa da, bu hastalıkların çoğunda fare modelleri mevcuttur ve farelerde MCC'yi ölçme protokolümüz potansiyel terapötikleri test etmek için kullanılabilecek değerli bir araçtır.
Hayvan modelleri hastalıkları anlamak ve tedavilerin geliştirilmesi için fayda sağlar. In vivo hayvan görüntüleme, hayvanları feda etmeye gerek kalmadan aynı hayvanlardan birden fazla veri noktası elde etme yeteneği ile daha fazla yardımcı program sağlar ve araştırmacıların hastalığın boyuna seyrini ve tedavi etkilerinin çalışma süresini izlemelerine izin verir. MCC'nin fare modeli on yıllar boyunca birden fazla araştırmacı tarafından geliştirilmiştir, başlangıçta iki boyutlu bir nükleer görüntüleme tekniği olan düzlemsel sintigrafi kullanılarak beagle köpekleri üzerinde gerçekleştirilir24. Teknik on yıl sonra farelerde kullanılmak üzere uyarlandı, ardından spect görüntülemeye adaptasyon on yıl sonra25,26. Fare modellerinde bu tekniğin geliştirilmesi, silier fonksiyonun önemli ölçüde değiştiği PCD gibi insan hastalıklarının birden fazla fare modelinin bulunması nedeniyle bu tekniğin ilgisinde önemli bir gelişmeydi. MCC, akciğer denervasyonu ve immünosupresyon fare modellerinde değerlendirilmiştir ve diğer modellerle birlikte kullanılma potansiyeline sahiptir19,26. CHD ile ilişkili CF, astım, PCD ve ciliopatiler gibi hava yolu hastalıkları olan insan hastalarında MCC ölçüm çalışmaları yapılmıştır ve tekniğin hem akciğer fizyolojisi çalışmalarına hem de terapötik etkinlik çalışmalarına yardımcı olabileceğine dair sonuçlar13.
Bu protokolün önemli bir parçası, nicelik için doğru görüntüler elde etmek için doğru görüntüleme parametreleriyle alımlar ayarlamaktır. Hangi kolimatörlerin kullanıldığı, devir başına elde edilen projeksiyon sayısı ve döndürme adımı boyutu da dahil olmak üzere SPECT alım ayarlarını tasarlarken bir dizi faktör anahtardır. Kolimatör seçimi, alımın hassasiyetinde ve çözümünde önemli bir faktördür ve alım ayarlarının kullanılan kolimatöre uyarlanmış olması gerekebilir27. Alternatif olarak, sıçanlar gibi daha büyük hayvanlar kullanırken, kolimatörlerin ayarlanması gerekir. Örneğin birden fazla iğne deliği kolimatörleri daha hassastır, ancak üst üste binen projeksiyonları önlemek ve istenmeyen çoklamalara neden olmak için bir adım boyutu seçerken dikkatli olunmalıdır, bu da yeniden yapılandırma yapıtlarına neden olabilecek bazı görüntü belirsizliği pahasına kazanımın hassasiyetini daha da artırabilir25. Yeniden yapılandırma kurulumu, ölçülebilir görüntüler oluşturmak için de anahtardır. MAP3D yaygın olarak kullanılan bir yinelemeli rekonstrüksiyon algoritmasıdır ve PSF yaygın bir yeniden yapılandırma modelidir. Her ikisi de görüntüleri yeniden oluşturmak için güvenilirdir, ancak yinelemelerin ve alt kümelerin sayısını ayarlarken dikkatli olunmalıdır. Daha fazla sayıda yineleme, yeniden yapılandırma için gereken hesaplama süresini artıracak ve daha fazla arttıktan sonra azalan getirilerle yeniden yapılandırmanın kalitesini artıracaktır.
ImageJ'deki görüntüleri ölçmek için kullanılacak ideal ölçüm aracı, bir seçimdeki piksellerin toplam değerini çıkaran RawIntDen'dır. SPECT verilerini farklı boyutlardaki akciğer ROI'leri arasında ölçerken, RawIntDen kullanımı mutlak bir sayım ölçüsü sağlar ve ölçümün ortalama ölçümün21olacağı gibi yatırım getirisinin alanına ayarlanmasını önler.
Bu teknik, araştırmacının bu tekniği uygularken farkında olması gereken bir dizi ilişkili hata kaynağına sahiptir. Önemli bir kafa karıştırıcı anestezik ajanların kullanılmasıdır. Isoflurane, farelerin bir kazanımın tamamlanmasından sonra hızla kurtulduğu hızlı etkili, solunan bir anestezidir. Bununla birlikte, farelere kafeslerinde iyileşmeleri için bol zaman sağlamaya özen göstermeli ve gerektiğinden daha uzun süre uyuşturulmamalıdır. Kişisel deneyimimizde (yayınlanmamış veriler) 0 ila 6 saatlik zaman noktası arasında solunan izofluran kullanılarak sürekli uyuşturulmuş fareler ihmal edilebilir boşluk gösterdi. Aynı şekilde, hızlı iyileşmeyi sağlamak için kontrollü bir anestezi dozu da gereklidir. Hayvanı görüntüleme için palete sabitlerken, eserlerin akciğerlerle çakışmasını önlemek için ortak kayıt için kullanılan hayalet tüp midede düşük tutulmalıdır. Aynı şekilde, kaliteli bir CT görüntüsü sağlamak için, x-ışını saçılımından yapıtları önlemek için fareden herhangi bir metal etiketi çıkarmaya dikkat edin.
Mevcut MCC protokolü sayısız hayvan modeline uygulanabilir. Bu teknik taranan hayvanın sağlığı üzerinde ihmal edilebilir bir etkiye sahiptir, fareler tarafından iyi tolere edilir ve bu nedenle zaten hassas farelerin sağlığını riske atmadan hastalık modelleriyle kullanılabilir. Bu metodolojinin gücü, ex vivo modellerinin26. Bu tekniğin aynı hayvanların birden fazla taramasında tekrarlanabilir ölçümler üretmedeki tutarlılığı, aynı hayvanın farklı ajanlar veya potansiyel terapötiklerle tedavi edilmesine ve herhangi bir hayvan modelinde bulunan biyolojik değişkenliği azaltmak için aynı hayvan arasında yapılan istatistiksel karşılaştırmalara izin verir, böylece istatistiksel olarak anlamlı farklılıklar göstermek için gereken örnek boyutunu azaltır.
MCC tekniği kullanılarak hava yolu fonksiyonunun değerlendirilmesi çeşitli hayvan modellerine ayarlanabilir ve yeni tedavilerin test edilmesiyle birlikte birçok farklı hava yolu sağlığı modeline uygulanabilir. PCD'nin fare modellerinin hava yolları, koah modellerinin yanı sıra bu teknik kullanılarak değerlendirilebilir. Yöntemimiz, çeşitli anesteziklerin MCC üzerindeki yaygın klinik kullanımda olan diferansiyel etkilerini incelemek için de kullanılabilir. Son olarak, terapötik ajanların hava yolu üzerindeki etkileri de bu model kullanılarak değerlendirilebilir. Daha önce belirtildiği gibi, ancak tekrar taşır, in vivo bir ölçüm olduğu için, bir hastalığın seyri boyunca MCC değerlendirmelerinin tekrarlanmasına ve zaman içinde terapötik müdahalelerin test yararlarına izin verir. Ek olarak, fareler, insan hastalıklarını taklit etmek / incelemek için kullanılan en yaygın laboratuvar hayvanlarıdır ve bazı durumlarda, insan hastalığının birden fazla transgenik fare modeli arasından seçim yapabilir.

Cilia, alglerden insanlara evrimsel tarih boyunca korunan mikrotübül bazlı hücresel organellerdir. Hücre yüzeylerinden çıkarlar ve yerel çevreselduyusal sinyallerin tanınmasından hareketliliğine, insanlardan erken tek hücreli ökaryotik organizmalara kadar izlenebilen işlevler2,3. Cilia, çevresel sinyalleri işlemek için bir hücrenin özel anteni olarak hareketli olmayan ve tek hizmet verebilir; veya alveollere giden terminal bronşioller hariç fallop tüplerinin astarı ve üst ve alt hava yolları gibi sıvı akışı oluşturmak için senkronize, metakronal dalgalarda dövülen hareketli veçoklu.
Solunum yollarının geniş epitel yüzeyi, çeşitli potansiyel olarak tehlikeli solunan kirleticiler ve patojenler şeklinde sürekli bir kirlenme yaylım ateşine maruz kalır ve bir savunma gerektirir. Önemli bir savunma mekanizması, trakeo-bronşiyal epitel hücrelerinin apikal yüzeylerini kaplayan birden fazla hareketli cilia'nın dövülmesiyle sürekli salgılanan mukusun akışının mekanik olarak hava yolundan taşındığı trakeobronşiyal ağacın mukozal aparatıdır. Solunan kirleticileri tuzağa çekmek için bu işlevler ve sürekli, senkron dayak yoluyla, onları sefalad4,5taşır.
Cilia'nın, embriyonik düğümdeki hareketli cilia'nın simetriyi kırdığı embriyoların geliştirilmesinde sol-sağ desenlemenin geliştirilmesi gibi kilit rollere sahip olduğu gösterilmiştir6. Cilia ile ilişkili genlerdeki mutasyonlar, kalbin asimetrik yapısına bağlı olarak konjenital kalp hastalığı (CHD) gibi hastalıklarla bağlantılıdır6. Son çalışmalar, CHD'li hastaların solunum yollarında silier disfonksiyon insidansının yüksek olduğunu, ayrıca üst ve alt hava yollarında ameliyat sonrası solunum komplikasyonları ve kronik solunum yolu semptomlarının yaygınlığının arttığını bildirmiştir 7,8,9,10. Heteroaksili veya heteroaksisiz CHD ve silier disfonksiyonlu hastaların ameliyat sonrası solunum komplikasyonu ve negatif solunum yolu sonuçları riskinin arttığı gösterilmiştir5,8,10. Sinyalizasyon ve gelişimdeki rollerinin ötesinde, hava yolu ciliasının önemi, birincil siliary diskinezi (PCD) olan ciliopatiler tarafından gösterilmiştir. PCD, hareketli solunum ciliasını etkileyen, tekrarlayan akciğer enfeksiyonlarına, bronşektazise ve potansiyel olarak akciğer nakli ihtiyacına yol açan bir dizi mutasyondan kaynaklanan bir doğumsal bozukluktur11. Ek olarak, Kafkas popülasyonunda en sık görülen konjenital bozukluk olan kistik fibroziste (CF) cilia normal olsa da, MCC CFTR geninde mutasyonlardan kaynaklanan kalın, viskoz mukus nedeniyle bozulur12. PCD ve CF'nin birden fazla fare modelinin yanı sıra giderek artan sayıda CHD modeli vardır. Sonuçta cilia birçok kilit rollere sahip çok yönlü yapılardır ve hareketli solunum cilia in vivo işlevini değerlendirmek için bir yöntem klinik öncesi çalışma için değerli olabilir ve mutasyonların yanı sıra ilaçların mukozik boşluk (MCC) üzerindeki etkilerini değerlendirmek için değerli olabilir13. Yöntem, bu fare modellerinde yeni ilaçların, gen tedavisinin veya müdahalelerin MCC üzerindeki etkilerini değerlendirmede de değerli olacaktır.
MCC'yi değerlendirmek için kullanılan birçok farklı model vardır. Önemli bir yöntem, bronşlara aşılanmış metilen mavi boyanın kullanımını içerir, boya hareketinin fiberoptik ölçümü ile ölçülen boşluk14. Bu yöntem, insanlarda klinik öncesi fare modellerine göre daha rutin olan boyanın hareketini gözlemleme yeteneği ile sınırlıdır. Bir diğer önemli yöntem, bir hava yolundaki tek tek parçacıkları izlemek için kullanılabilen senkrotron faz kontrastlı X-ışını görüntülemesidir (PCXI). Bu yöntem nispeten yenidir ve yaygın olarak erişilemez15. Video-mikroskopi için bir trakeayı ekströte ederek hava yolunu değerlendirmenin çok sayıda ex vivo yöntemi vardır, ancak bu modeller insan hastalarda çok az fayda sağlar16. Optik tutarlılık tomografisi gibi cilia görüntüleme için yüksek çözünürlüklü teknikler aynı şekilde sınırlıdır17.
Bu yazıda, sayısız hayvan modelinde akciğer boşluklarını ölçmek için kullanılan MCC in vivo'nun yanı sıra kronik obstrüktif akciğer hastalığında MCC'yi incelemek ve immünsüpresif ilaçların etkilerini değerlendirmek için tekrarlanabilir bir yöntem sunuyoruz18,19. Bu yöntem, akciğerlere aşılandıktan sonra çözünmeyen bir partikül radyotracer olan radyofarmasötik 99m technetium-kükürt kolloidinin(99mTc-Sc) açıkluğunu izler. Radyonüklid daha sonra tek foton emisyonlu bilgisayarlı tomografi (SPECT)18,20kullanılarak izlenebilir. Çift modalite SPECT ve bilgisayarlı tomografi (BT) görüntüleme kullanarak, radyoizotop sayımlarının akciğerlere birlikte lokalizasyonu ve bu sayımlardaki azalmayı 6 saat boyunca ölçerek MCC'yi ölçmek için bu tekniği daha da iyileştirdik. BT ve SPECT görüntülerinin birlikte kaydedilmesiyle çift modalite görüntüleme, radyasyon sayılarının ilgi alanımız olan akciğerlere doğru lokalizasyonunu sağlar. Farelerde MCC ölçümü için yöntemi ayrıntılı olarak açıklamamıza rağmen, protokol sıçanlarda MCC'yi incelemek için ayarlanabilir. Kollatörlerin radyasyon dozunu da ayarlamaları gerekir. Bizim görüşümüze göre, fare MCC taramaları küçük hayvan boyutu nedeniyle teknik olarak daha zordur, ancak bir dizi insan bozukluğunun çok sayıda yerleşik fare modeli nedeniyle sıçanlardan daha yararlıdır. Ek olarak, hayvan kolonilerinde daha düşük maliyet ve bakım maliyeti nedeniyle, farelerde daha büyük bir örnek boyutu daha mümkündür.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>500 &#181;m Unjacketed Fiber Optic Wire</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>02-532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>99mTechnecium-Sulfur Colloid</td>
			<td>Cardinal Health</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia Vaporizer</td>
			<td>Vetland Medical</td>
			<td>A13480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durmont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>99150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI ImageJ 2.0.0-rc-65/1.52p Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Introcan Safety Catheters 20G 1inch</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1534477</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>118-2097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Intubation Stand</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>ETI-MSE-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Siemens Inveon dual-modality SPECT/CT</td>
			<td>Siemens</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel Anesthesia Stand</td>
			<td>Summit Anesthesia Solutions</td>
			<td>22860</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo evaluation of mucociliary clearance in mice

Hücrenin özel organelleri olan solunum motile cilia, solunum yollarını kaplayan epitel hücrelerinin apikal yüzeyini hizalar. Metakronal, senkron bir şekilde yenerek, bu çoklu, hareketli, aktüer bazlı organeller, solunan kirleticilerin ve patojenlerin solunum yollarını temizleyen bir sefalad sıvı akışı oluşturur. Artan çevre kirliliği, yeni viral patojenler ve ortaya çıkan çok ilaca dirençli bakteriler ile cilia, üretilen mukoziyel boşluk (MCC) akciğer sağlığını korumak için gereklidir. MCC ayrıca primer silier diskinezi, kistik fibrozis gibi birden fazla doğumsal bozuklukta ve kronik obstrüktif akciğer hastalığı gibi edinilmiş bozukluklarda depresyondadır. Tüm bu bozukluklar, bazı durumlarda birden fazla fare modeli oluşturmuştur. Bu yayında, in vivo farelerde MCC'yi doğru ve tekrarlanabilir bir şekilde ölçmek için az miktarda radyoaktivite ve çift modalite SPECT / CT görüntüleme kullanarak bir yöntemi detaylandırıyoruz. Yöntem, görüntülemeden sonra farelerin iyileşmesine, seri ölçümlerin mümkün hale getirilmesine ve potansiyel terapötiklerin zaman içinde uzunlamasına test etmesine izin verir. Vahşi tip farelerdeki veriler, detaylara yeterli dikkat gösterdiği ve protokole kesinlikle uyulduğı sürece MCC ölçümünün tekrarlanabilirliğini göstermektedir.

Bu protokolü kullanarak, fareleri bir izofluran odasında uyuşturduk (Şekil 1A). Yeterli anestezi seviyesine ulaştıktan sonra, fareler dikey desteklere yerleştirildi (Şekil 1B) ve ses telleri aydınlatılmış bir kılavuz tel kullanılarak görselleştirildi (Şekil 1C-1D). Fareler entübe edildi ve bir kanül aracılığıyla 10 μL hacimlerde 0.2 mCi 99mTc-Sc ile aşılandı ve akciğerlere kendiliğinden solunmasına izin verildi (Şekil 1E-1F). Görüntü alımı ve işlenmesinden sonra, CT ve SPECT görüntüleri, hayalet tüpü bir dönüm noktası olarak kullanarak (Şekil 2A) kolokalize edildi (Şekil 2B). Akciğerlerin maskeleri BT görüntüsünden (Şekil 2C) oluşturuldu ve 0 ( Şekil 2D ) ve 6 saatte(Şekil2E-2F)analiz için sağ akciğerin etrafına ROI çekmek için kullanıldı. Protokolün tekrarlanabilirliğini test etmek için, aynı deneysel koşullarla farklı günlerde toplam 8 fare iki kez tarandı ve tekrar taramaları arasında önemli bir fark olmadığını gösteren eşleştirilmiş bir t testi kullanılarak analiz edildi (p-value=0.9904) (Şekil 3A). Aynı deneysel koşullarla farklı günlerde üç kez ek 2 fare tarandı, tek yönlü ANOVA kullanılarak yapılan analizler tekrar taramaları arasında önemli eşleşmeler gösterdi (p değeri 0.0041) (Şekil 3B). Toplam 8 fare tarandı ve iki temsili görüntü görüntülendi (Şekil 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61929/61929fig01.jpg"> Şekil 1: Fare entübasyonu ve izotop aşılaması. İzotopun entübe olması ve hava yoluna aşılası için gereken adımların görüntüleri. A) Fare bir odada uyuşturulur. B)Uyuşturulmuş fare, ön kesici dişler tarafından askıya alınmış dikey bir desteğe yerleştirilir. C) Kılavuz tel olarak hizmet veren ışıklı 0,5 mm fiber optik tel, 20 G'lık bir canülden çalıştırılarak hazırlanır. D) Farenin ağzı forseps kullanılarak açılır ve ses tellerini görselleştirmek için ışıklı kılavuz tel kullanılarak aydınlatılır. E) Canül ses telleri boyunca itilir ve kılavuz tel çıkarılır. F) Çözünür izotop bir pipet kullanılarak kanüle aşılanır ve farenin izotopu akciğerlere kendiliğinden solumasına izin verilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61929/61929fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61929/61929fig02v2.jpg"> Şekil 2: MCC taramasının SPECT/CT görüntüleri. A) CT görüntüsüyle birlikte yerelleştirilmiş bir SPECT görüntüsü. B)Birlikte lokalizasyon için kullanılan görünür bir fantom tüplü CT görüntüsü. C) CT görüntüsünün binarizing ve bir z-yığın toplam projeksiyon gerçekleştirme tarafından türetilen hava yolu maskesi. D) CT maskesi SPECT görüntüsüyle birlikte yerelleştirildi. Sağ akciğerin etrafına analiz için bir yatırım getirisi çizilmiş. E) 6 saatte hava yolunun maskesi. F) Analiz için bir yatırım getirisi ile 6 saatte hava yolunun CT ve SPECT birlikte lokalize görüntüsü. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61929/61929fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61929/61929fig03.jpg"> Şekil 3: Aynı farelerin birden fazla taramada boşluk ölçümleri. A) Deneysel koşullarda değişiklik olmayan 8 fare için iki ayrı tekrar boşluk ölçtü. Eşleştirilmiş bir t testi, p değeri 0.9904 olan tekrar taramaları arasında önemli bir fark olmadığını gösterdi. B) Deneysel koşullarda değişiklik olmayan iki fare için üç ayrı tekrar boşluk ölçtü. Tek yönlü bir ANOVA, p değeri 0.0041 olan tekrar taramaları arasında önemli bir eşleşme olduğunu gösterdi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61929/61929fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61929/61929fig04.jpg"> Şekil 4: Sağ akciğeri özetleyen 0 ve 6 saatte çizilmiş ROI'ler ile 2 farede 0 ve 6 saatlik hava yolunun birlikte lokalize SPECT /CT görüntüleri. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61929/61929fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Şekil 1: Nefes almanın etkisiyle fiber optik tel ile aydınlatılan ses tellerinin videosu görselleştirildi. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61929/61929supfig01.jpg" target="_blank">Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Ek Dosyalar. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61929/Supplemental_Files.zip" target="_blank">Bu dosyaları indirmek için lütfen tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about In vivo Evaluation of Mucociliary Clearance in Mice at JoVE.com

In vivo Evaluation of Mucociliary Clearance in Mice

Bu yayında, çift modalite radyonüklid görüntüleme kullanarak in vivo farelerde hava yolu mukozirary boşluğunu (MCC) değerlendirme protokollerini açıklıyoruz. Bu protokol, çift SPECT/CT sisteminde fare tüm gövde (MWB) kolimatörleri kullanılarak tek bir foton emisyonlu bilgisayarlı tomografi (SPECT) ve bilgisayarlı tomografi (BT) alma protokolü için tasarlanmıştır.

Farelerde Mukozdiliyel Temizliğin In vivo Değerlendirilmesi

Respiratory motile cilia, specialized organelles of the cell, line the apical surface of epithelial cells lining the respiratory tract. By beating in a ...

in-vivo-evaluation-of-mucociliary-clearance-in-mice

Research

JoVE Journal

Biology

4.2K Görüntüleme.  University of Pittsburgh School of Medicine. Bu yayında, çift modalite radyonüklid görüntüleme kullanarak in vivo farelerde hava yolu mukozirary boşluğunu (MCC) değerlendirme protokollerini açıklıyoruz. Bu protokol, çift SPECT/CT sisteminde fare tüm gövde (MWB) kolimatörleri kullanılarak tek bir foton emisyonlu bilgisayarlı tomografi (SPECT) ve bilgisayarlı tomografi (BT) alma protokolü için tasarlanmıştır.

Video: In vivo Evaluation of Mucociliary Clearance in Mice

In Vivo 2-Photon Calcium Imaging in Layer 2/3 of Mice

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons . In-vivo two-photon calcium imaging is the only method that allows one to record the activity of a dense neuronal population with single-cell resolution . The method consists in implanting a cranial imaging window, injecting a fluorescent calcium indicator dye that can be taken up by large numbers of neurons and finally recording the activity of neurons with time lapse calcium imaging using an in-vivo two photon microscope. Co-injection of astrocyte-specific dyes allows one to differentiate neurons from astrocytes. The technique can be performed in mice expressing fluorescent molecules in specific subpopulations of neurons to better understand the network interactions of different groups of cells.

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons . In-vivo two-photon calcium imaging is the only method that allows one to record the activity of a dense neuronal population with single-cell resolution .

Katman In Vivo 2-Foton Kalsiyum Görüntüleme Fare 2 / 3

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons .  ...

Biyoloji

Evaluation of the Spatial Distribution of &gamma;H2AX following Ionizing Radiation

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone H2AX1,2. This phosphorylation of H2AX is mediated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PI3K) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)3. The phosphorylated form of H2AX, referred to as &gamma;H2AX, spreads to adjacent regions of chromatin from the site of the DSB, forming discrete foci, which are easily visualized by immunofluorecence microscopy3. Analysis and quantitation of &gamma;H2AX foci has been widely used to evaluate DSB formation and repair, particularly in response to ionizing radiation and for evaluating the efficacy of various radiation modifying compounds and cytotoxic compounds4.
Given the exquisite specificity and sensitivity of this de novo marker of DSBs, it has provided new insights into the processes of DNA damage and repair in the context of chromatin. For example, in radiation biology the central paradigm is that the nuclear DNA is the critical target with respect to radiation sensitivity. Indeed, the general consensus in the field has largely been to view chromatin as a homogeneous template for DNA damage and repair. However, with the use of &gamma;H2AX as molecular marker of DSBs, a disparity in &gamma;-irradiation-induced &gamma;H2AX foci formation in euchromatin and heterochromatin has been observed5-7. Recently, we used a panel of antibodies to either mono-, di- or tri- methylated histone H3 at lysine 9 (H3K9me1, H3K9me2, H3K9me3) which are epigenetic imprints of constitutive heterochromatin and transcriptional silencing and lysine 4 (H3K4me1, H3K4me2, H3K4me3), which are tightly correlated actively transcribing euchromatic regions, to investigate the spatial distribution of &gamma;H2AX following ionizing radiation8. In accordance with the prevailing ideas regarding chromatin biology, our findings indicated a close correlation between &gamma;H2AX formation and active transcription9. Here we demonstrate our immunofluorescence method for detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in non-adherent cells, with a particular focus on co-localization with other epigenetic markers, image analysis and 3D-modeling.

Evaluation of the Spatial Distribution of &amp;#947;H2AX following Ionizing Radiation

Microscopic analysis of &gamma;H2AX foci, which form following the phosphorylation of H2AX at Ser-139 in response to DNA double-strand breaks, has become an invaluable tool in radiation biology. Here we used an antibody to mono-methylated histone H3 at lysine 4 as an epigenetic marker of actively transcribing euchromatin, to evaluate the spatial distribution of radiation-induced &gamma;H2AX formation within the nucleus.

Radyasyondan aşağıdaki γH2AX Mekansal Dağılımı Değerlendirilmesi

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

İyon Kanalları incelenmesi için yama Kelepçe ve Perfüzyon Teknikleri cinsinden ifade edilir Xenopus Oosit

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Performing Vaginal Lavage, Crystal Violet Staining, and Vaginal Cytological Evaluation for Mouse Estrous Cycle Staging Identification

A rapid means of assessing reproductive status in rodents is useful not only in the study of reproductive dysfunction but is also required for the production of new mouse models of disease and investigations into the hormonal regulation of tissue degeneration (or regeneration) following pathological challenge. The murine reproductive (or estrous) cycle is divided into 4 stages: proestrus, estrus, metestrus, and diestrus. Defined fluctuations in circulating levels of the ovarian steroids 17-&beta;-estradiol and progesterone, the gonadotropins luteinizing and follicle stimulating hormones, and the luteotropic hormone prolactin signal transition through these reproductive stages. Changes in cell typology within the murine vaginal canal reflect these underlying endocrine events. Daily assessment of the relative ratio of nucleated epithelial cells, cornified squamous epithelial cells, and leukocytes present in vaginal smears can be used to identify murine estrous stages. The degree of invasiveness, however, employed in collecting these samples can alter reproductive status and elicit an inflammatory response that can confound cytological assessment of smears. Here, we describe a simple, non-invasive protocol that can be used to determine the stage of the estrous cycle of a female mouse without altering her reproductive cycle. We detail how to differentiate between the four stages of the estrous cycle by collection and analysis of predominant cell typology in vaginal smears and we show how these changes can be interpreted with respect to endocrine status.

Here, we describe how to identify the stage of the murine reproductive (proestrus, estrus, metestrus, or diestrus) by simple, non-invasive collection and cytological assessment of vaginal smear samples. We further describe how vaginal cytology reflects circulating hormonal levels underlying transition through the murine reproductive cycle.

Fare Östrus Döngüsü Evreleme Tanımlaması Vajinal Lavaj, Kristal Violet Boyama ve Vajinal Sitolojik Değerlendirilmesi Sahne

A rapid means of assessing reproductive status in rodents is useful not only in the study of reproductive dysfunction but is also required for the ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

Apoptotik hücresi Temizliği görüntülenmesi sırasında Canlı<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriyo

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Evaluation of Respiratory System Mechanics in Mice using the Forced Oscillation Technique

The forced oscillation technique (FOT) is a powerful, integrative and translational tool permitting the experimental assessment of lung function in mice in a comprehensive, detailed, precise and reproducible manner. It provides measurements of respiratory system mechanics through the analysis of pressure and volume signals acquired in reaction to predefined, small amplitude, oscillatory airflow waveforms, which are typically applied at the subject's airway opening. The present protocol details the steps required to adequately execute forced oscillation measurements in mice using a computer-controlled piston ventilator (flexiVent; SCIREQ Inc, Montreal, Qc, Canada). The description is divided into four parts: preparatory steps, mechanical ventilation, lung function measurements, and data analysis. It also includes details of how to assess airway responsiveness to inhaled methacholine in anesthetized mice, a common application of this technique which also extends to other outcomes and various lung pathologies. Measurements obtained in na&iuml;ve mice as well as from an oxidative-stress driven model of airway damage are presented to illustrate how this tool can contribute to a better characterization and understanding of studied physiological changes or disease models as well as to applications in new research areas.

The present protocol provides a detailed step-by-step description of the procedures required to execute measurements of respiratory system mechanics as well as the assessment of airway responsiveness to inhaled methacholine in mice using the forced oscillation technique (flexiVent; SCIREQ Inc, Montreal, Qc, Canada).

Zorla Salınım Tekniği kullanarak Fare Solunum Sistemi Mekanik Değerlendirilmesi

The  forced oscillation technique (FOT) is a powerful, integrative and translational  tool permitting the experimental assessment of lung function in mice ...

Evaluation of Muscle Function of the Extensor Digitorum Longus Muscle Ex vivo and Tibialis Anterior Muscle In situ in Mice

Body movements are mainly provided by mechanical function of skeletal muscle. Skeletal muscle is composed of numerous bundles of myofibers that are sheathed by intramuscular connective tissues. Each myofiber contains many myofibrils that run longitudinally along the length of the myofiber. Myofibrils are the contractile apparatus of muscle and they are composed of repeated contractile units known as sarcomeres. A sarcomere unit contains actin and myosin filaments that are spaced by the Z discs and titin protein. Mechanical function of skeletal muscle is defined by the contractile and passive properties of muscle. The contractile properties are used to characterize the amount of force generated during muscle contraction, time of force generation and time of muscle relaxation. Any factor that affects muscle contraction (such as interaction between actin and myosin filaments, homeostasis of calcium, ATP/ADP ratio, etc.) influences the contractile properties. The passive properties refer to the elastic and viscous properties (stiffness and viscosity) of the muscle in the absence of contraction. These properties are determined by the extracellular and the intracellular structural components (such as titin) and connective tissues (mainly collagen) 1-2. The contractile and passive properties are two inseparable aspects of muscle function. For example, elbow flexion is accomplished by contraction of muscles in the anterior compartment of the upper arm and passive stretch of muscles in the posterior compartment of the upper arm. To truly understand muscle function, both contractile and passive properties should be studied.
The contractile and/or passive mechanical properties of muscle are often compromised in muscle diseases. A good example is Duchenne muscular dystrophy (DMD), a severe muscle wasting disease caused by dystrophin deficiency 3. Dystrophin is a cytoskeletal protein that stabilizes the muscle cell membrane (sarcolemma) during muscle contraction 4. In the absence of dystrophin, the sarcolemma is damaged by the shearing force generated during force transmission. This membrane tearing initiates a chain reaction which leads to muscle cell death and loss of contractile machinery. As a consequence, muscle force is reduced and dead myofibers are replaced by fibrotic tissues 5. This later change increases muscle stiffness 6. Accurate measurement of these changes provides important guide to evaluate disease progression and to determine therapeutic efficacy of novel gene/cell/pharmacological interventions. Here, we present two methods to evaluate both contractile and passive mechanical properties of the extensor digitorum longus (EDL) muscle and the contractile properties of the tibialis anterior (TA) muscle.

Evaluation of Muscle Function of the Extensor Digitorum Longus Muscle Ex vivo and Tibialis Anterior Muscle In situ in Mice

Changes in limb muscle contractile and passive mechanical properties are important biomarkers for muscle diseases. This manuscript describes physiological assays to measure these properties in the murine extensor digitorum longus and tibialis anterior muscles.

Ekstansör digitorum longus kas ve kas Fonksiyonunun Değerlendirilmesi<em&gt; Ex vivo</em&gt; Ve tibialis anterior kas<em&gt; Yerinde</em&gt; Farelerde

Body  movements are mainly provided by mechanical function of skeletal muscle. Skeletal  muscle is composed of numerous bundles of myofibers that are ...

In Vivo SiRNA Transfection and Gene Knockdown in Spinal Cord via Rapid Noninvasive Lumbar Intrathecal Injections in Mice

This report describes a step-by-step guide to the technique of acute intrathecal needle injections in a noninvasive manner, i.e. independent of catheter implantation. The technical limitation of this surgical technique lies in the finesse of the hands. The injection is rapid, especially for a trained experimenter, and since tissue disruption with this technique is minimal, repeated injections are possible; moreover immune reaction to foreign tools (e.g. catheter) does not occur, thereby giving a better and more specific read out of spinal cord modulation. Since the application of the substance is largely limited to the target region of the spinal cord, drugs do not need to be applied in large dosages, and more importantly unwanted effects on other tissue, as observed with a systemic delivery, could be circumvented1,2. Moreover, we combine this technique with in vivo transfection of nucleic acid with the help of polyethylenimine (PEI) reagent3, which provides tremendous versatility for studying spinal functions via delivery of pharmacological agents as well as gene, RNA, and protein modulators.

In Vivo SiRNA Transfection and Gene Knockdown in Spinal Cord via Rapid Noninvasive Lumbar Intrathecal Injections in Mice

This report describes a simple and rapid technique of intrathecal needle puncture for a localized transfection of siRNA in the lumbar spinal cord in mouse under short lasting light anesthesia.

Farelerde Hızlı noninvaziv Lomber İntratekal enjeksiyon yoluyla Vivo siRNA&#39;nın Transfaksiyon ve Omurilik Gen demonte olarak

This report describes a step-by-step guide to the technique of acute intrathecal needle injections in a noninvasive manner, i.e. independent of catheter ...

Evaluation of Zebrafish Kidney Function Using a Fluorescent Clearance Assay

The zebrafish embryo offers a tractable model to study organogenesis and model human genetic disease. Despite its relative simplicity, the zebrafish kidney develops and functions in almost the same way as humans. A major difference in the construction of the human kidney is the presence of millions of nephrons compared to the zebrafish that has only two. However, simplifying such a complex system into basic functional units has aided our understanding of how the kidney develops and operates. In zebrafish, the midline located glomerulus is responsible for the initial blood filtration into two pronephric tubules that diverge to run bilaterally down the embryonic axis before fusing to each other at the cloaca. The pronephric tubules are heavily populated by motile cilia that facilitate the movement of filtrate along the segmented tubule, allowing the exchange of various solutes before finally exiting via the cloaca2-4. Many genes responsible for CKD, including those related to ciliogenesis, have been studied in zebrafish5. However, a major draw back has been the difficulty in evaluating zebrafish kidney function after genetic manipulation. Traditional assays to measure kidney dysfunction in humans have proved non translational to zebrafish, mainly due to their aquatic environment and small size. For example, it is not physically possible to extract blood from embryonic staged fish for analysis of urea and creatinine content, as they are too small. In addition, zebrafish do not produce enough urine for testing on a simple proteinuria &#8216;dipstick&#8217;, which is often performed during initial patient examinations. We describe a fluorescent assay that utilizes the optical transparency of the zebrafish to quantitatively monitor the clearance of a fluorescent dye, over time, from the vasculature and out through the kidney, to give a read out of renal function1,6-9.

The zebrafish is a popular tool to model chronic kidney disease (CKD). However, their small size makes it impossible to evaluate renal function using traditional methods. We describe a fluorescent dye kidney clearance assay1 that allows quantitative analysis of zebrafish kidney function in CKD.

Bir Floresan Gümrükleme Testi kullanarak Zebra balığı Böbrek Fonksiyon Değerlendirilmesi

The zebrafish embryo offers a tractable model to study organogenesis and model human genetic disease. Despite its relative simplicity, the zebrafish ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a versatile analytical tool for characterizing viscoelastic mechanical properties for a variety of materials ranging from hard (plastic, glass, metal, etc.) surfaces to cells on any substrate. It has been widely used to measure the stiffness of cells, but less frequently used to measure the stiffness of aortas. In this paper, we will describe the procedures for using AFM in contact mode to measure the ex vivo elastic modulus of unloaded mouse arteries. We describe our procedure for isolation of mouse aortas, and then provide detailed information for the AFM analysis. This includes step-by-step instructions for alignment of the laser beam, calibration of the spring constant and deflection sensitivity of the AFM probe, and acquisition of force curves. We also provide a detailed protocol for data analysis of the force curves.

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

We present detailed protocols for isolation of aortas from mouse and measurement of their elastic modulus using atomic force microscopy.

sertliği ölçme<em&gt; Ex Vivo</emAtomik Kuvvet Mikroskobu Kullanma&gt; Fare aorta

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...