Biz yararlı tartışmalar için teşekkür Patrick Hayden (Mattek) ve Robert Smith ve EM becerileri Gürcistan Sağlık Bilimleri Üniversitesi Libby Perry. Bu çalışmada DAD NIDCD hibe DC010187 tarafından finanse edildi

1. Biyogüvenlik kabini EpiAirway dokular için hazırlanması <ol><li> Geri ve eldiven bağlı saç, özel bir laboratuvar önlüğü giymek, laminer akış başlar. 5 dakika sonra, kabine (Pipet, ipuçları, santrifüj tüpleri, vb) herhangi bir alet taşımak bir yana, sprey,% 70 etanol ve temiz bir kağıt havlu ile silin ile biyogüvenlik kabini iç ve kanat. % 70 etanol ile tekrar temizlenir iç Sprey ve kurumaya bırakın. Temiz tarafında araçları hareket ettirin ve etanol prosedürü tekrarlayın. </li><li> Kabine aerosol bariyer pipet uçları ve adanmış Pipet kullanın. Ayrı ayrı sarılmış steril serolojik pipetler kullanmak için, ambalaj dışında atarak, laminer akış ile takılı sonuna geçmesi açık ara ve kabin içine pipet kaydırın. </li><li> EpiAirway ekler steril forseps ile ele alınması gerekir. Yeri 6-inç ince ucu kavisli kendinden sızdırmaz sterilizasyon keseleri ve otoklav içine forseps diseksiyon. En az altı günlük kullanım için hazır olması için yeterli hazırlayın. </li></ol> 2. EpiAirway dokuların Unpacking <ol><li> % 70 etanol ile biyogüvenlik kabini çalışma yüzeyine püskürtün ve temiz bir kağıt havlu ile silin. Tekrar Sprey ve yüzey kullanmadan önce kurumasını bekleyin. EpiAirway kutusunu açın ve strafor ve ambalaj malzemesi atmak. </li><li> EpiAirway antibiyotik ücretsiz bakım medya, HAVA-100-AA ABF (MM), Mattek sahipli ve ekler ile kit olarak gönderilir. Biyogüvenlik kabini, ortam türü ve tarihi ile etiket altı steril 50 ml santrifüj tüplerine ve kapakları gevşetin. % 70 etanol ile medya şişe Sprey ve kabin içinde açık. 4 ° C&#39;de kısım her tüp için yeni bir steril serolojik pipet kullanarak her bir tüp içine 25 ml MM, kapaklar, ve mağaza sıkın. MM her gün taze bir kısım kullanın. </li><li> 2.2 1 X Dulbecco&#39;nun taze bir şişe fosfat, kalsiyum ve magnezyum ile tamponlu salin (D-PBS) kullanarak yukarıdaki tekrarlayın. Kalsiyum ve magnezyum olmadan D-PBS kullanarak tekrar tekrarlayın. 4 alikotları Mağaza ° C. </li><li> EpiAirway ekler HAVA-100 ° C katı medya içeren agaroz 4, 24 plaka gelmesi ve 6-iyi kullanmak için tabak içine yerleştirilmesi gerekir. Etanol-dayanıklı bir kalem kullanarak tarih ve açıklama ile her plaka etiketleyin. Her kuyuya 4 ° C EpiAirway MM Yeri 1 mililitre. Ulaşım, ambalaj,% 70 etanol ile sprey, ve biyogüvenlik kabini yer plaka çıkarın. Bandını çıkarın ve plakasını açın. Otoklavlanmış forseps kullanarak, EpiAirway ekler Nemli gazlı bez üzerine çıkarın. </li><li> 6 plaka bir kuyuya bir agaroz serbest yardım etmek için bir kıvırma hareketi ile otoklava forseps ile insert, yer ve Pick up. Bazı agaroz ortam için taşıma plakası sıcaklığı artar, özellikle de eklemek uygun olabilir. Steril bir pamuklu çubukla dikkatlice yerleştirin agaroz kaldırmak için kullanın. Membran dokunmaktan kaçının ve ekler altında sıkışmış hava kabarcıkları olup olmadığını kontrol edin. Plaka% 5 CO 2 ile nemlendirilmiş bir 37 ° C inkübatör içine yerleştirin. </li><li> Ortak kültürler başlamadan önce inkübatör dengeye dokular için en az 24 saat bekleyin. </li></ol> 3. EpiAirway dokuların bakımı <ol><li> Otoklavlanmış forseps kullanarak, bir ekleme pick up ve doku üzerine hafifçe kalsiyum ve magnezyum ile, önceden ısıtılmış D-PBS 200 mikrolitre pipet ve ekleme rock. Tilt bir açıyla yerleştirin ve insert altındaki membran tutan plastik halka karşı steril P1000 pipet yerleştirmek. Doku dokunmayın. D-PBS durulama ve etiketli bir steril cryovial yerleştirmek aspire edin. Numuneler -20 ° C&#39;de dondurulmuş ve sonraki bir tarihte, müsin ve / veya sitokin ifade için test edilebilir. </li><li> Aspire ve taze MM 1 mililitre ile değiştirerek günlük bazal MM değiştirin. Her bir kuyu için yeni bir bariyer pipet kullanın. Bir gecede% 10 çamaşır suyu ile kullanılan medya davranın ve atın. </li></ol> 4. Aşılama, EpiAirway dokuların <ol><li> Çikolata agara, dondurulmuş gliserol stok tiplendirilemeyen Haemophilus influenzae (NTHi) taze bir kültür dışarı Streak . Nemlendirilmiş bir% 5 CO2 inkübatör geceleme büyütün. </li><li> Ertesi gün, kalsiyum ve magnezyum ile yaklaşık 0,7 OD (600 nm) önceden ısıtılmış D-PBS NTHi tek koloniler tekrar süspansiyon haline getirin. Optik yoğunluk ölçüm şiddetle önce Vortex. Optik yoğunluk ilişkisi koloni oluşturan NTHi ml (CFU / ml) başına birimleri 0.2 &#39;lik bir OD (600 nm) yaklaşık 1.0 x 10 8 CFU / ml eşittir. Bu nedenle, bir OD 0.7 (600 nm) yaklaşık 3.5 x 10 8 CFU / ml. Bu algoritma, aşılama için önce her NTHi suşu için valide edilmelidir. </li><li> EpiAirway dokuların HAVA-100, 0.6 cm 2 ve 0,4 mikron membran yüzey alanına sahip ekler yetiştirilmektedir . ~ 8.0 x 10 5 ~ 1.0 x 10 6 dokularda oluşan &lt;/&gt; Hücreleri destek. 12 - Bu nedenle, 1.0 x 10 7 CFU bir aşılama yaklaşık 10 enfeksiyon çokluğu karşılık gelir. Aşılamak için, 3.1 &#39;deki gibi her EpiAirway eklemek yıkayın, daha sonra bakteriyel süspansiyon biyogüvenlik kabini içinde her EpiAirway eklemek apikal yüzeye 4.2 hazırlanan 28 mikrolitre ekleyin. Bazal MM aşılamak etmeyin. Inkübatör her plaka dönün. </li></ol> 5. NTHi inokulum Kantitasyonu <ol><li> Sterilize etmek için% 0,1 jelatin (PBS-G), otoklav ile fosfat tamponlu salin (PBS) çözeltisi hazırlayın. Her tüpe steril PBS-G ve inokulum kısım 900 mikrolitre OD (600 nm) dayalı istenilen 01:10 dilüsyonları Etiket steril 1,5 ml Eppendorf tüpleri. </li><li> Çikolata agar plaklarına inoküle NTHi numaralandırmak için gerekli sayısını belirler. , Bir saat boyunca üst yarısında dinlenme plakanın alt baş aşağı bir hava inkübatör bu levhaların yerleştirin. Bu plaka 37 sıcak ° C ve NTHi açılan kaplama kolaylaştırılması, kuru yüzey. Sağlayacaktır </li><li> 4.2 &#39;den ilk tüp bakteriyel süspansiyon 100 mikrolitre ekleyerek inokulum seri 01:10 dilüsyonları başlayın. Vorteks her seyreltme 5 saniye boyunca güçlü bir şekilde bir sonraki önce yapmak için. Her bir seyreltme için yarım tabak kullanarak, önceden ısıtılmış ve yüzey kurutulmuş çikolata agar plakları üzerine 10 mikrolitrelik alikotları bırakın. Beş altı 10 mikrolitrelik alikotları birlikte çalışan her 100 mm plaka bir yarım sığabilir. , Baş aşağı 37 nemlendirilmiş bir kuru yer ° C CO 2 inkübatör geceleme . </li><li> Ertesi gün, her açılan 15-30 farklı koloniler dilüsyonları sayma ve NTHi gerçek canlı inokulum geri hesaplanırken CFU / ml belirlemek. </li></ol> 6. NTHi ile uzun vadeli işbirliği-kültür <ol><li> -20 Bakteri ve dondurma aynı gerginlik ° C gelecek analizi için etiketli cryovial inoküle her doku yıkamalar havuzu, sonra 3.1 &#39;deki gibi, her 24 saatte bir, ekler yıkayın. Bu örnekler nokta leke müsin varlığı veya ELISA ile sitokinlerin ifadesi için çalışılmalıdır. Alternatif olarak, dokularda mRNA için hasat edilebilir ve qPCR ilgi genlerin yapılabilir. 3.2 &#39;deki gibi günlük bazal MM değiştirin. Co-kültür boyunca devam edin. </li></ol> 7. EpiAirway dokuların hasadı <ol><li> Kalsiyum ve magnezyum olmadan D-PBS saponin taze% 1 solüsyon hazırlayın, filtre sterilize ve 37 ° C sıcak </li><li> 37 ° C, kalsiyum ve magnezyum olmadan, MM ve D-PBS başka bir 50 ml tüp Sıcak </li><li> 5.1 &#39;sulandırma tüpleri hazırlayın yanı sıra eklemek sayısı ve NTHi gerilme ile etiketlenmiş eklemek başına bir boş steril 1,5 ml Eppendorf tüp,. </li><li> EpiAirways yapışık ve içselleştirilmiş organizmalar, ya da sadece içselleştirilmiş bakteriler için iki içeren, toplam hücre ilişkili bakteri ya da hasat edilebilir. </li><li> , Damla plakalı hücre ilişkili veya 5.2 gibi bir hava inkübatör etiket ve bir saat süreyle kuru NTHi işgal gerekli çikolata agar plaklarına sayısını belirler. </li><li> Toplam hücre ilişkili bakteriler hasat için, kalsiyum veya magnezyum olmadan 200 mikrolitre D-PBS ile üç kez EpiAirways apikal yüzey durulama, daha sonra ekleme eğilme ve bazal membran kalan MM durulayın. Ilk yıkamada daha sonra analiz için dondurulmuş olabilir; aşağıdaki yıkar iptal. </li><li> 7.1 &#39;den% 1 steril saponin çözüm yıkanmış MM olmadan yeni bir 6-plaka, insert, ve pipetle 250 mikrolitre her doku apikal yüzeye yerleştirin. 10 dakika boyunca inkübatör dön. </li><li> Inkübatör çıkar ve P1000 steril bir pipet kullanarak, geri ve ileri hareket, insert kenarlarından doku kaldırmak için dairesel bir hareket takip membran dokuların fırçalayın. Büyük bir delik steril P1000 pipet kullanarak, 7.3 &#39;de hazırlanan boş etiketli tüpe süspansiyon yerleştirin. Eklemek apikal yüzeye kalsiyum veya magnezyum olmadan D-PBS 250 mikrolitre ekleyin. </li><li> Kalan herhangi bir doku hasat edilebilir olup olmadığını belirlemek için ters bir faz-kontrast mikroskop kullanarak eklemek inceleyin. Gerekirse, başka bir steril P1000 pipet ile tekrar fırçalayın, sonra büyük bir delik steril P1000 pipet kullanarak tüp 7.8 süspansiyon ekleyin. 1 mililitre kalsiyum veya magnezyum olmadan D-PBS kullanarak tüp toplam hacmi getirin. </li><li> En yüksek hızda bir dakika boyunca şiddetle vorteks hücre süspansiyonu. 26 gauge iğne ile donatılmış, 1 ml steril bir şırınga, iğne süspansiyon ile enjektöre aspire. Yavaş yavaş süspansiyon özen baloncuklar oluşturmak için değil, iğne 3 kez geçmektedir. Bir dakika boyunca kuvvetlice tekrar karıştırın. </li><li> 7 hazırlanan ilk sulandırma tüpü içine geniş çaplı bir pipet, yer süspansiyon 100 mikrolitre kullanma.3. Vortex şiddetle beş saniye sonra seri 01:10 dilüsyonları. Drop-plaka yüzey kuru çikolata agar plakları üzerine istenilen dilüsyonları. </li><li> Içselleştirilmiş bakteri sadece hasat için, kalsiyum veya magnezyum olmadan D-PBS 200 mikrolitre her ekleme 3 kere yıkayın. Ilk yıkamada saklayın ve dondurma. Önceden ısıtılmış MM nihai konsantrasyonu 100 mikrogram / ml gentamisin sülfat ekleyin. 1.5 ml eklemek için hasat edilebilir başına medya hazırlayın. Gentamisin içeren MM ile bazal MM değiştirin ve apikal yüzeye gentamisin içeren MM 300 mikrolitre ekleyin. Bir saat geri plaka CO 2 kuvöz içine yerleştirin. </li><li> Apikal yüzey gentamisin içeren MM çıkarın ve apikal yüzey ve yaygın olarak kalsiyum ve magnezyum olmadan önceden ısıtılmış D-PBS ile ekleme bazal membran yıkayın. 7,7-7,11 içinde gibi devam edin. </li></ol> 8. Temsilcisi sonuçları: NTHi ile 5 günlük bir ko-kültür (A) bulaşmamış EpiAirway doku ve (B) doku elektron mikrograflar sonra Tarama Şekil 1&#39;de gösterildiği NTHi ile uzun vadeli işbirliği-kültür apikal önemli bir hasara yol açmaz . dokular, EpiAirway modeli yardımcı programı vurgulayan. Dokular içinde zamanla sayısal içselleştirilmiş bakteri sayısını gösteren bir grafik Şekil 2&#39;de gösterildiği gibi, her ikisi de oldukça tekrarlanabilir sonuçlar, EpiAirway dokular ve tutarlı bir insan üst solunum yolu in vitro model biyolojik ilgili çalışma NTHi konak- patojen etkileşimleri. <img src="/files/ftp_upload/3261/3261fig1.jpg" alt="Şekil 1"/> Şekil 1 EpiAirway dokuların elektron mikroskobu Tarama. A. bulaşmamış kontrolü doku. NTHi eş-kültür beş gün sonra B. Doku. Apikal yüzey enfekte dokularda önemli bir hasar yok görülmektedir. <img src="/files/ftp_upload/3261/3261fig2.jpg" alt="Şekil 2"/> Şekil 2 NTHi sayısı EpiAirway ko-kültür sırasında zamanla içselleştirilmiş. Gerilme R2866 sonra her Belirtilen bir zaman noktasında içselleştirilmiş bakteriler hasat yaklaşık 1.0 x 10 7 CFU / ekleme (Gün 0) ekildi. Barlar = 3, en az iki nüsha halinde çoğaltır n temsil eder. Hata çubukları, SD.

<ol>
	<li>Murphy, T. F., Apicella, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nontypeable+Haemophilus+influenzae:+a+review+of+clinical+aspects,+surface+antigens,+and+the+human+immune+response+to+infection.">Nontypeable Haemophilus influenzae: a review of clinical aspects, surface antigens, and the human immune response to infection.</a> Rev. Infect. Dis. 9, 1-15 (1987).</li><li>Murphy, T. F., Faden, H., Bakaletz, L. O., Kyd, J. M., Forsgren, A., Campos, J., Virji, M., Pelton, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nontypeable+Haemophilus+influenzae+as+a+pathogen+in+children.">Nontypeable Haemophilus influenzae as a pathogen in children.</a> Ped. Infect. Dis. J. 28, 43-48 (2009).</li><li>Hotomi, M., Arai, J., Billal, D. S., Takei, S., KIkeda, Y., Ogami, M., Kono, M., Beder, L. B., Toya, K., Kimura, M., Yamanaka, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nontypeable+Haemophilus+influenzae+isolated+from+intractable+acute+otitis+media+internalized+into+cultured+human+epithelial+cells.">Nontypeable Haemophilus influenzae isolated from intractable acute otitis media internalized into cultured human epithelial cells.</a> Auris Nasus Larynx. 37, 137-144 (2010).</li><li>Chemuturi, N. V., Hayden, P., Kalausner, M., Donovan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+human+tracheal/bronchial+epithelial+cell+culture+and+bovine+nasal+respiratory+explants+for+nasal+drug+transport+studies.">Comparison of human tracheal/bronchial epithelial cell culture and bovine nasal respiratory explants for nasal drug transport studies.</a> J. Pharm. Sci. 94, 1976-1985 (2005).</li><li>Sharma, M., Schoop, R., Hudson, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+efficacy+of+Echinacea+in+a+3-D+tissue+model+of+human+airway+epithelium.">The efficacy of Echinacea in a 3-D tissue model of human airway epithelium.</a> Phytother. Res. 24, 900-904 (2010).</li><li>Sexton, K., Balharry, D., BeruBe, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+biomarkers+of+pulmonary+exposure+to+tobacco+smoke+components.">Genomic biomarkers of pulmonary exposure to tobacco smoke components.</a> Pharmacogenet Genomics. 10, 853-860 (2008).</li><li>Babu, R. J., Dayal, P., Singh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+cyclodextrins+on+the+complexation+and+nasal+permeation+of+melatonin.">Effect of cyclodextrins on the complexation and nasal permeation of melatonin.</a> Drug Deliv. 6, 381-388 (2008).</li><li>Balharry, D., Sexton, K., BeruBe, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+approach+to+assess+the+toxicity+of+inhaled+tobacco+smoke+components:+nicotine,+cadmium,+formaldehyde+and+urethane.">An in vitro approach to assess the toxicity of inhaled tobacco smoke components: nicotine, cadmium, formaldehyde and urethane.</a> Toxicology. 244, 66-76 (2008).</li><li>Fahy, J. V., Dickey, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+mucus+function+and+dysfunction.">Airway mucus function and dysfunction.</a> N. Engl. J. Med. 363, 2233-2247 (2010).</li><li>Huang, Y., Mikami, F., Jono, H., Zhang, W., Weng, X., Koga, T., Xu, H., Yan, C., Kai, H., Li, J. -. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opposing+roles+of+PAK2+and+PAK4+in+synergistic+induction+of+MUC5AC+mucin+by+bacterium+NTHi.">Opposing roles of PAK2 and PAK4 in synergistic induction of MUC5AC mucin by bacterium NTHi.</a> 359, 691-696 (2007).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Bu yöntem, hava-sıvı arayüzü birincil insan solunum dokuların biyolojik ilgili bir arka planda uzun vadeli konak-patojen etkileşimleri soruşturma sağlar. Burada bulaşmasını organizma olarak NTHi kullanılan, ancak herhangi bir bakterinin zamanla kabul edilemez sitotoksisite tanıtmak gelmez bu yöntem ile etkileşimi sayılabilir olabilir. EpiAirway model aynı zamanda, virüsler, ilaçlar, ya da kimyasalların bu etkiyi insan üst solunum yolu 5 çalışma için kullanılan, 6, 7, 8 . ...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktif Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog # </th><th> Yorumlar </th></tr><tr><td> Saponin </td><td> Calbiochem </td><td> 558.255-25GM </td><td> Kalsiyum veya magnezyum olmadan D-PBS içinde% 1, sterilize filtre </td></tr><tr><td> 1 X Dulbecco&#39;nun kalsiyum ve magnezyum ile tuzlu fosfat tamponlu </td><td> Lonza </td><td> 17-513Q </td><td></td></tr><tr><td> 1 X Dulbecco&#39;nun kalsiyum veya magnezyum olmadan tuzlu fosfat tamponlu </td><td> Lonza </td><td> 17-515Q </td><td></td></tr><tr><td> EpiAirway antibiyotik ücretsiz dokular </td><td> Mattek </td><td> AIR-100-ABF </td><td></td></tr><tr><td> EpiAirway antibiyotik ücretsiz bakım medya </td><td> Mattek </td><td> HAVA-100-AA-ABF </td><td> Kit ile birlikte </td></tr><tr><td> 10X fosfat tamponlu salin solüsyonu </td><td> EMD </td><td> 6506 </td><td> 1X seyreltik kullanmadan önce </td></tr><tr><td> Jelâtin </td><td> JT Baker </td><td> 2124-01 </td><td> 1 X PBS ve otoklav bir final konsantrasyon% 0.1 ekle </td></tr><tr><td> Difco GC Orta Bankası (çikolata agar) </td><td> VWR </td><td> 90002-016 </td><td> Otoklav 500 ml GKD 2 O 36 - 60 g ve serin ° C </td></tr><tr><td> BBL Hemoglobin (çikolata agar) </td><td> VWR </td><td> 90000-662 </td><td> 60 500 ml GKD 2 O serin Otoklav 10 g ° C ve üzerinde GC orta tabanı ile karıştırın </td></tr><tr><td> BD BBL IsoVitaleX zenginleştirme (çikolata agar) </td><td> VWR </td><td> 90000-414 </td><td> - 55 ° C ve 10 ml rehidrate IsoVitaleX eklemek, çikolata agar plaklarına dökün GC orta taban ve hemoglobin karışımı soğutun </td></tr><tr><td> Diseksiyon forseps, ince uçlu, kavisli </td><td> VWR </td><td> 82027-406 </td><td></td></tr><tr><td> Sızdırmazlık sterilizasyon keseleri </td><td> VWR </td><td> 89140-802 </td><td></td></tr><tr><td> Gentamisin sülfat, 10 mg / ml </td><td> Lonza </td><td> 17-519Z </td><td> 10 mikrolitre / ml gentamisin öldürmek için EpiAirway MM </td></tr></tbody></table>

use of the epiairway model for characterizing long-term host-pathogen interactions

2; Tiplendirilemeyen Haemophilus influenzae (NTHi), tekrarlayan ve kronik solunum mukoza 1 enfeksiyonlara yol açabilir insan adapte Gram-negatif bakteriler . Bu organizmalar solunum dokularda ve iç hayatta hangi mekanizmaları, bakteri ve insan hücreleri başarılı bir şekilde uzun vadeli işbirliği kültürü yapılabilir hangi modelin incelenmesi. Biz hava-sıvı arayüzü yükseltilmiş birincil insan solunum yolu epitel dokuların kullanımı, EpiAirway modeli (Mattek, Ashland, MA). Bu sıkı kavşaklar, siliyalı ve nonciliated hücreleri, müsin üreten ve enfeksiyona karşı sitokin üretme yeteneğini muhafaza goblet hücreleri içeren olmayan ölümsüzleştirdi, iyi diferansiye, 3-boyutlu dokular. Bu biyolojik olarak insan üst solunum yolu in vitro model ilgili bir dizi şekillerde kullanılabilir; zamanla bu yöntem genel hedefi, NTHi ve Asitli EpiAirway dokuların uzun vadeli işbirliği kültürü hücre ilişkili ve içselleştirilmiş bakteriler gerçekleştirmek için . Yanı sıra, enfekte ko-kültür müsin üretimi ve sitokin profili tespit edilebilir. Bu yaklaşım, pek çok mevcut protokoller mevcut yöntemleri geliştirir uzun süre 3 üzerinde bakteriyel enfeksiyonlar destekleme yeteneğine sahip değildir, insan hücrelerinin batık tek tabaka veya transwell kültürleri, kullanın . Örneğin, eğer bir organizmanın üstteki medya çoğaltmak, bu deney tutuklamak, sitotoksisite ve ev sahibi hücrelerin kaybı kabul edilemez düzeyde neden olabilir. EpiAirway modeli uzun vadeli konak-patojen etkileşimi karakterizasyonu sağlar. EpiAirway için kaynak ölümsüzleştirilen çizgisinden daha çok bir normal insan trakea-bronş hücreleri beri Ayrıca, her gerçek insan üst solunum yolu doku yapısı ve fonksiyonu 4 hem de mükemmel bir temsil,. Bu yöntem için, EpiAirway dokular teslimattan 2 gün önce anti-mikrobiyal ve anti-mantar bileşiklerin sütten ve tüm işlemler antibiyotik koşullar altında yapılmaktadır. Bu her iki bakteri ve birincil insan dokuları aynı Biyogüvenlik kabini olduğundan, özel durumlar gerektirmektedir ve uzun süre ko-kültür vardır.

Watch this Scientific Journal Video about Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions at JoVE.com

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

Bu yöntem EpiAirways, hava-sıvı arayüzü yetişen birincil insan solunum yolu epitel doku, biyolojik ilgili ko-kültür uzun bakteriyel karakterizasyonu<em&gt; In vitro</em&gt; Modeli. Bu yaklaşım uzun vadeli ko-kültür için uygun herhangi bir mikrop ile kullanılabilir.

Uzun vadeli Host-patojen Etkileşimleri karakterize EpiAirway Model kullanın.

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

use-epiairway-model-for-characterizing-long-term-host-pathogen

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.6K Görüntüleme.  Mercer University School of Medicine. Bu yöntem EpiAirways, hava-sıvı arayüzü yetişen birincil insan solunum yolu epitel doku, biyolojik ilgili ko-kültür uzun bakteriyel karakterizasyonu In vitro Modeli. Bu yaklaşım uzun vadeli ko-kültür için uygun herhangi bir mikrop ile kullanılabilir.

Video: Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and temporal control between the phagocytic cell and microbe has rendered focused observations into the initial interactions of host response to pathogens difficult. Historically, intercellular contact events such as phagocytosis3 have been imaged by mixing two cell types, and then continuously scanning the field-of-view to find serendipitous intercellular contacts at the appropriate stage of interaction. The stochastic nature of these events renders this process tedious, and it is difficult to observe early or fleeting events in cell-cell contact by this approach. This method requires finding cell pairs that are on the verge of contact, and observing them until they consummate their contact, or do not. To address these limitations, we use optical trapping as a non-invasive, non-destructive, but fast and effective method to position cells in culture.
Optical traps, or optical tweezers, are increasingly utilized in biological research to capture and physically manipulate cells and other micron-sized particles in three dimensions4. Radiation pressure was first observed and applied to optical tweezer systems in 19705, 6, and was first used to control biological specimens in 19877. Since then, optical tweezers have matured into a technology to probe a variety of biological phenomena8-13.
We describe a method14 that advances live cell imaging by integrating an optical trap with spinning disk confocal microscopy with temperature and humidity control to provide exquisite spatial and temporal control of pathogenic organisms in a physiological environment to facilitate interactions with host cells, as determined by the operator. Live, pathogenic organisms like Candida albicans and Aspergillus fumigatus, which can cause potentially lethal, invasive infections in immunocompromised individuals15, 16 (e.g. AIDS, chemotherapy, and organ transplantation patients), were optically trapped using non-destructive laser intensities and moved adjacent to macrophages, which can phagocytose the pathogen. High resolution, transmitted light and fluorescence-based movies established the ability to observe early events of phagocytosis in living cells. To demonstrate the broad applicability in immunology, primary T-cells were also trapped and manipulated to form synapses with anti-CD3 coated microspheres in vivo, and time-lapse imaging of synapse formation was also obtained. By providing a method to exert fine spatial control of live pathogens with respect to immune cells, cellular interactions can be captured by fluorescence microscopy with minimal perturbation to cells and can yield powerful insight into early responses of innate and adaptive immunity.

A method is described to individually select, manipulate, and image live pathogens using an optical trap coupled to a spinning disk microscope. The optical trap provides spatial and temporal control of organisms and places them adjacent to host cells. Fluorescence microscopy captures dynamic intercellular interactions with minimal perturbation to cells.

Dinamik Canlı Hücre Görüntüleme Konukçu-Patojen Etkileşimleri Çalışma Optik Tuzak

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

Significant efforts were gathered to generate large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is instrumental to understand the pathogen-host relationships and was essentially performed by genetic screenings in yeast two-hybrid systems. The recent improvement of protein-protein interaction detection by a Gaussia luciferase-based fragment complementation assay now offers the opportunity to develop integrative comparative interactomic approaches necessary to rigorously compare interaction profiles of proteins from different pathogen strain variants against a common set of cellular factors.
This paper specifically focuses on the utility of combining two orthogonal methods to generate protein-protein interaction datasets: yeast two-hybrid (Y2H) and a new assay, high-throughput Gaussia princeps protein complementation assay (HT-GPCA) performed in mammalian cells.
A large-scale identification of cellular partners of a pathogen protein is performed by mating-based yeast two-hybrid screenings of cDNA libraries using multiple pathogen strain variants. A subset of interacting partners selected on a high-confidence statistical scoring is further validated in mammalian cells for pair-wise interactions with the whole set of pathogen variants proteins using HT-GPCA. This combination of two complementary methods improves the robustness of the interaction dataset, and allows the performance of a stringent comparative interaction analysis. Such comparative interactomics constitute a reliable and powerful strategy to decipher any pathogen-host interplays.

This article focuses on the identification of high-confident interaction datasets between host and pathogen proteins using a combination of two orthogonal methods: yeast two-hybrid followed by a high-throughput interaction assay in mammalian cells called HT-GPCA.

Ana-Patojen protein-protein etkileşimleri ve Peyzaj karakterize etmek Karşılaştırmalı Bir Yaklaşım

Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model itself. Early phases of inflammation and infection have been widely studied by using the Pseudomonas aeruginosa agar-beads mouse model, while only few reports have focused on the long-term chronic infection in vivo. The main challenge for long term chronic infection remains the low bacterial burden by P. aeruginosa and the low percentage of infected mice weeks after challenge, indicating that bacterial cells are progressively cleared by the host.
This paper presents a method for obtaining efficient long-term chronic infection in mice. This method is based on the embedding of the P. aeruginosa clinical strains in the agar-beads in vitro, followed by intratracheal instillation in C57Bl/6NCrl mice. Bilateral lung infection is associated with several measurable read-outs including weight loss, mortality, chronic infection, and inflammatory response. The P. aeruginosa RP73 clinical strain was preferred over the PAO1 reference laboratory strain since it resulted in a comparatively lower mortality, more severe lesions, and higher chronic infection. P. aeruginosa colonization may persist in the lung for over three months. Murine lung pathology resembles that of CF patients with advanced chronic pulmonary disease.
This murine model most closely mimics the course of the human disease and can be used both for studies on the pathogenesis and for the evaluation of novel therapies.

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

We describe the agar-beads method to establish persistent long-term chronic Pseudomonas aeruginosa airway infection in the mouse model.

Uzun Vadeli Kronik<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</emFarelerde&gt; Havayolu Enfeksiyon

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote its motility and dissemination. New work has shown that proteins involved in actin-based motility are also linked to autophagy, an intracellular degradation process crucial for cell autonomous immunity. Strikingly, host cells may prevent actin-based motility of S. flexneri by compartmentalizing bacteria inside &#8216;septin cages&#8217; and targeting them to autophagy. These observations indicate that a more complete understanding of septins, a family of filamentous GTP-binding proteins, will provide new insights into the process of autophagy. This report describes protocols to monitor autophagy-cytoskeleton interactions caused by S. flexneri in vitro using tissue culture cells and in vivo using zebrafish larvae. These protocols enable investigation of intracellular mechanisms that control bacterial dissemination at the molecular, cellular, and whole organism level.

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

To counteract pathogen dissemination, host cells reorganize their cytoskeleton to compartmentalize bacteria and induce autophagy. Using Shigella infection of tissue culture cells, host and pathogen determinants underlying this process are identified and characterized. Using zebrafish models of Shigella infection, the role of discovered molecules and mechanisms are investigated in vivo.

Kullanımı<em&gt; Shigella flexneri</em&gt; Otofaji-Sitoiskelet Etkileşimleri Okumak

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

Long Term Intravital Multiphoton Microscopy Imaging of Immune Cells in Healthy and Diseased Liver Using CXCR6.Gfp Reporter Mice

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, neutrophils, T cell subsets, B cells, natural killer (NK) and NKT cells. Intravital microscopy of the liver for monitoring immune cell migration is particularly challenging due to the high requirements regarding sample preparation and fixation, optical resolution and long-term animal survival. Yet, the dynamics of inflammatory processes as well as cellular interaction studies could provide critical information to better understand the initiation, progression and regression of inflammatory liver disease. Therefore, a highly sensitive and reliable method was established to study migration and cell-cell-interactions of different immune cells in mouse liver over long periods (about 6 hr) by intravital two-photon laser scanning microscopy (TPLSM) in combination with intensive care monitoring.
The method provided includes a gentle preparation and stable fixation of the liver with minimal perturbation of the organ; long term intravital imaging using multicolor multiphoton microscopy with virtually no photobleaching or phototoxic effects over a time period of up to 6 hr, allowing tracking of specific leukocyte subsets; and stable imaging conditions due to extensive monitoring of mouse vital parameters and stabilization of circulation, temperature and gas exchange.
To investigate lymphocyte migration upon liver inflammation CXCR6.gfp knock-in mice were subjected to intravital liver imaging under baseline conditions and after acute and chronic liver damage induced by intraperitoneal injection(s) of carbon tetrachloride (CCl4).
CXCR6 is a chemokine receptor expressed on lymphocytes, mainly on Natural Killer T (NKT)-, Natural Killer (NK)- and subsets of T lymphocytes such as CD4 T cells but also mucosal associated invariant (MAIT) T cells1. Following the migratory pattern and positioning of CXCR6.gfp+ immune cells allowed a detailed insight into their altered behavior upon liver injury and therefore their potential involvement in disease progression.

Stable intravital high-resolution imaging of immune cells in the liver is challenging. Here we provide a highly sensitive and reliable method to study migration and cell-cell-interactions of immune cells in mouse liver over long periods (about 6 hours) by intravital multiphoton laser scanning microscopy in combination with intensive care monitoring.

CXCR6.Gfp Muhabir Fare kullanma Sağlıklı ve hastalıklı Karaciğer Bağışıklık Hücreleri Uzun Vadeli intravital multiphoton Mikroskopi Görüntüleme

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.

Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.

Bir gen ya da ilaç terapisinde kullanım için, HIV-1 üretim yapan RNA&#39;lar etkinlik ve toksisite Değerlendirilmesi

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

Airway inflammation is often associated with bacterial infections and represents a major determinant of lung disease. The in vivo determination of the pro-inflammatory capabilities of various factors is challenging and requires terminal procedures, such as bronchoalveolar lavage and the removal of lungs for in situ analysis, precluding longitudinal visualization in the same mouse. Here, lung inflammation is induced through the intratracheal instillation of Pseudomonas aeruginosa culture supernatant (SN) in transiently transgenized mice expressing the luciferase reporter gene under the control of a heterologous IL-8 bovine promoter. Luciferase expression in the lung is monitored by in vivo bioluminescent image (BLI) analysis over a 2.5- to 48-h timeframe following the instillation. The procedure can be repeated multiple times within 2 - 3 months, thus permitting the evaluation of the inflammatory response in the same mice without the need to terminate the animals. This approach permits the monitoring of pro- and anti-inflammatory factors acting in the lung in real time and appears suitable for functional and pharmacological studies.

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

The method described here allows for the visualization of IL-8 promoter-dependent inflammation activation in the lungs of mice through non-invasive bioluminescence imaging (BLI). The same animal can be subjected to BLI multiple times for up to two months from the time of delivery of the luciferase reporter construct.

Bir IL-8 Geçici Transgenize Edilmiş Fare Modeli<emIn vivo</em&gt; İnflamatuvar Yanıtların Uzun Vadeli İzlenmesi

Airway inflammation is often associated with bacterial infections and represents a major determinant of lung disease. The in vivo determination of the ...

Long-term In Vivo Tracking of Inflammatory Cell Dynamics Within Drosophila Pupae

During the rapid inflammatory response to tissue damage, cells of the innate immune system are quickly recruited to the injury site. Once at the wound, innate immune cells perform a number of essential functions, such as fighting infection, clearing necrotic debris, and stimulating matrix deposition. In order to fully understand the diverse signaling events that regulate this immune response, it is crucial to observe the complex behaviors of (and interactions that occur between) multiple cell lineages in vivo, and in real-time, with the high spatio-temporal resolution. The optical translucency and the genetic tractability of Drosophila embryos have established Drosophila as an invaluable model to live-image and dissect fundamental aspects of inflammatory cell behavior, including mechanisms of developmental dispersal, clearance of apoptotic corpses&#160;and/or microbial pathogens, and recruitment to wounds. However, more recent work has now demonstrated that employing a much later stage in the Drosophila lifecycle &#8211; the Drosophila pupa &#8211; offers a number of distinct advantages, including improved RNAi efficiency, longer imaging periods, and significantly greater immune cell numbers. Here we describe a protocol for imaging wound repair and the associated inflammatory response at the high spatio-temporal resolution in live Drosophila pupae. To follow the dynamics of both re-epithelialization and inflammation, we use a number of specific in vivo fluorescent markers for both the epithelium and innate immune cells. We also demonstrate the effectiveness of photo-convertible fluorophores, such as Kaede, for following the specific immune cell subsets, to track their behavior as they migrate to, and resolve from, the injury site.

Long-term In Vivo Tracking of Inflammatory Cell Dynamics Within Drosophila Pupae

Here we present a protocol for live-imaging wound repair and the associated inflammatory response at high spatio-temporal resolution in vivo. This method utilizes the pupal stage of Drosophila development to enable long-term imaging and tracking of specific cell populations over time and is compatible with efficient RNAi-mediated gene inactivation.

İnflamatuar hücre dinamiği Drosophila pupa içinde uzun vadeli Vivo içinde izleme

During the rapid inflammatory response to tissue damage, cells of the innate immune system are quickly recruited to the injury site. Once at the wound, ...

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

To simulate Cryptococcus infection, amoeba, which is the natural predator of cryptococcal cells in the environment, can be used as a model for macrophages. This predatory organism, similar to macrophages, employs phagocytosis to kill internalized cells. With the aid of a confocal laser-scanning microscope, images depicting interactive moments between cryptococcal cells and amoeba are captured. The resolution power of the electron microscope also helps to reveal the ultrastructural detail of cryptococcal cells when trapped inside the amoeba food vacuole. Since phagocytosis is a continuous process, quantitative data is then integrated in the analysis to explain what happens at the timepoint when an image is captured. To be specific, relative fluorescence units are read in order to quantify the efficiency of amoeba in internalizing cryptococcal cells. For this purpose, cryptococcal cells are stained with a dye that makes them fluoresce once trapped inside the acidic environment of the food vacuole. When used together, information gathered through such techniques can provide critical information to help draw conclusions on the behavior and fate of cells when internalized by amoeba and, possibly, by other phagocytic cells.

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

This paper details a protocol for preparing a co-culture of cryptococcal cells and amoebae that is studied using still, fluorescent images and high-resolution transmission electron microscope images. Illustrated here is how quantitative data can complement such qualitative information.

Kripokus-Amoeba etkileşimlerinde mikroskobik teknikler ve floresans okuma tamamlayıcı kullanımı

To simulate Cryptococcus infection, amoeba, which is the natural predator of cryptococcal cells in the environment, can be used as a model for ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a striking increase in life expectancy around the globe. Nonetheless, determining vaccine efficacy remains a challenge. Emerging evidence suggests that the current acellular vaccine (aPV) for Bordetella pertussis (B. pertussis) induces suboptimal immunity. Therefore, a major challenge is designing a next-generation vaccine that induces protective immunity without the adverse side effects of a whole-cell vaccine (wPV). Here we describe a protocol that we used to test the efficacy of a promising, novel adjuvant that skews immune responses to a protective Th1/Th17 phenotype and promotes a better clearance of a B. pertussis challenge from the murine respiratory tract. This article describes the protocol for mouse immunization, bacterial inoculation, tissue harvesting, and analysis of immune responses. Using this method, within our model, we have successfully elucidated crucial mechanisms elicited by a promising, next-generation acellular pertussis vaccine. This method can be applied to any infectious disease model in order to determine vaccine efficacy.

Here we present an elegant protocol for in vivo evaluation of vaccine effectiveness and host immune responses. This protocol can be adapted for vaccine models that study viral, bacterial, or parasitic pathogens.

Ana bilgisayar-patojen yanıt ve aşı etkinliği farelerde değerlendirilmesi

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...