Simone Punt, Hollanda Kanser Derneği&#39;nden hibe UL2010-4801 tarafından desteklendi. Bu JoVE protokolünün dayandığı orijinal makalenin tüm yazarlarına, Emilie A. Dronkers, Marij JP Welters, Renske Goedemans, Senada Koljenović, Elisabeth Bloemena, Peter JF Snijders, Arko Gorter ve Sjoerd van&#39;a teşekkür ederiz. Der Burg.

Hasta örnekleri, Hollanda Biyomedikal Bilim Toplulukları Federasyonu İnsan Doku&#39;nun Doğru İkincil Kullanımı Davranış Kurallarında (www.federa.org) açıklanan tıbbi etik yönergelere göre ele alınmıştır. 1. Slayt Hazırlayın <ol><li> Rezeke edilen materyali kullanma tıbbi etik komite iznini aldıktan sonra bir patoloji bölümünden rezeke edilen doku materyalini (her türlü doku) elde edin. NOT: Mevcut deney için, 1970 ve 2011 yılları arasında Leiden, Leiden&#39;de Leiden Üniversitesi Tıp Merkezi&#39;nde teşhis edilen primer orofaringeal tümörlerden ön tedavi tümörü örnekleri daha önce tarif edildiği gibi seçilmiştir (n = 162) 13 . Doku büyüklüğü, tümörün içinde 4 mikroskopik görüntü elde etmek için yeterli miktarda tümör dokusu gereksinimi ile sınırlıydı. </li><li> Dokuyu% 4 tamponlu formalinde en az 12 saat sabitleyin. Dokuyu ag içinde kurutunTasarlanmış etanol serisi. Ksilen içinde yıkayın ve otomatik bir doku işlemcisi kullanarak parafin mumu içine katıştırın. </li><li> Cam kapaklar üzerinde 4 μm kalınlığındaki formaline sabitlenmiş, parafine gömülü (FFPE) doku kesitlerini bir mikrotome kullanarak kesin. Standart prosedürler kullanarak doku bloğunu mikro tonlu doku tutucusuna yerleştirin. <ol><li> Kurdele şeritleri kesin ve 45 ° C&#39;de deiyonize su içeren bir su banyosu yüzeyine koyun. İmmunohistokimyasal boyama için uygun bir slayt kullanarak, slaydı doğrudan bölümün altındaki suya yerleştirerek bir bölüme balık tutun. Parçayı suyun dışına çıkararak ve slayt üzerine yapıştırarak, slaydı dikkatli bir açıyla yukarıya doğru hareket ettirin. </li></ol></li><li> Slaytlar gece boyunca 37 ° C&#39;de kurumaya bırakılsın. </li><li> FFPE slaytlarını, her biri 5 dakika süreyle üç kez tamamen taze% 100 ksilende daldırmak suretiyle deparafinize hale getirin. Slaytları, her biri 5 dakika boyunca taze% 100 etanol,% 70 etanol ve% 50 etanol içine iki kez batırarak yeniden su haline getirin. </li></ol> 2. Antigen Alımı gerçekleştir <ol><li> Slaytları deiyonize suda 5 dakika boyunca yıkayın. </li><li> Bir mikrodalga kullanarak kaynar sıcaklığa kadar Tris-etilendiamintetraasetik asit (EDTA) tamponunu (10 mM Tris artı 1 mM EDTA, pH 9.0) önceden ısıtın. Sürgüleri önceden ısıtılmış EDTA tamponuna batırarak ve tamponu mikrodalgada 10 dakika boyunca bu sıcaklıkta tutarak antijen alımını gerçekleştirin. NOT: 900 W gücünde herhangi bir mikrodalga kullanılabilir. </li><li> Slaytları tamponda 2 saat boyunca soğutun. </li></ol> 3. Leke Doku Sunumları <ol><li> Slaytları her biri 5 dakika süreyle fosfat tamponlu salin (PBS) ile iki kez yıkayın. </li><li> Seyreltilmiş antikorların slayttan dökülmesini önlemek için hidrofobik bir kalemle doku etrafında bir daire çizin. PBS ile bir kez daha yıkayın; Bu isteğe bağlıdır. </li><li> % 1 a / a sığır serumu a içinde seyreltilmiş birincil antikorlar (anti-CD3 1:50, anti-FoxP3 1: 200 ve anti-IL-17 1:50) ile dokuyu inkübe edin.Lbümin (BSA) ile gece boyunca oda sıcaklığında PBS içerisinde karıştırılır. NOT: Slayt başına hacim dokunun boyutuna bağlıdır, ancak genellikle 50 - 150 μL&#39;dir. CD3, CD8 ve FoxP3 antikorları ( yani, tavşan Ig izotip kontrol antikoru, fare IgG1 izotip kontrol antikoru ve keçi ile aynı seyreltmede negatif kontrol slaytları için bilinmeyen bir özgüllük ile birincil antikorları aynı izotip sınıfının antikorları ile değiştirin IgG izotip kontrol antikoru). </li><li> Slaytları her biri için 5 dakika boyunca PBS ile üç kez yıkayın. </li><li> Doku, seyreltilmiş birincil antikor türünü ve / veya izotiplerini ( yani, 1: 200 eşek anti-keçi IgG Alexa 488, eşek anti-tavşan IgG A546 ve eşek anti-fare A647) hedef alan floresan etiketli sekonder antikorların bir kombinasyonu ile inkübe edin 1% BSA, PBS içinde oda sıcaklığında 1 saat süreyle. NOT: Slayt başına hacim, dokunun boyutuna bağlıdır, ancak genellikle 50 - 150 μL&#39;dir. <ol><li> SonraIkincil antikoru ekleyerek, slaytları karanlık bir kutuya koyarak veya kutuyu alüminyum folyo ile sararak mümkün olduğunca ışıktan koruyun. </li></ol></li></ol> 4. Doku Saydamlarını Yerleştirme ve Karşıtın Bakım <ol><li> Slaytları her biri için 5 dakika boyunca PBS içinde üç kez yıkayın. </li><li> Slaytları, nükleer kontrast içeren sulu bir anti-solmaya dayanıklı montaj malzemesi ( ör . DAPI) kullanarak monte edin. Slaytları mümkün olan en kısa sürede (iki hafta içinde) bir flüoresan mikroskop kullanarak analiz edin. Analiz edilinceye kadar slaytları 4 ° C&#39;de karanlıkta saklayın. </li></ol> 5. Lekeli Doku Saydamlarını Analiz Edin <ol><li> Her slaytta dört resim elde etmek için, 20 - 25X&#39;lik bir objektifle donatılmış bir floresans mikroskopu kullanın. Tümörün temsil eden bir bölümünü yakalamak için slaytta bulunan toplam tümör alanı boyunca rastgele yerlerde görüntü alın. NOT: 250X standart bir büyütme kullanılmalıdır. Herhangi bir floresan oKullanılan florokromları görselleştirmek için gerekli olan filtreler ve lazerler varsa r tarayıcı mikroskop kullanılabilir. <ol><li> Alexa 488&#39;in görselleştirilmesi için, maksimum 490 uyarma ve 525 emisyon maksimum kullanın; Alexa 546&#39;yı görselleştirmek için maksimum uyarı mıknatısı 556 ve maksimum emisyon 573 kullanın; Alexa 647&#39;yi görselleştirmek için, maksimum 650 uyarı ve maksimum emisyon 665 kullanın; Ve DAPI&#39;nın görselleştirilmesi için, maksimum uyarı mıknatısı 358 ve maksimum emisyon 461 kullanın. </li><li> Görüntüleri, kullanıcıya sunulan yazılımda görüntü dosyaları ( örn., Jpeg ve tiff) olarak kaydedin. </li></ol></li><li> Bir patoloğa danıştıktan sonra tümör epitelyumuna karşı stromal hücrelerin nükleer ve hücresel şekillerine dayalı olarak tümör epiteli ve tümör stroması alanlarını ayırt edin. <ol><li> Toplam stromal yüzey alanını belirlemek için, stromal hücreler (tümör hücreleri yerine) tarafından işgal edilen tüm alanların etrafında bir çizgi çizin ve yeniden çizinMikroskop imalatçısı tarafından sağlanan görüntü analiz yazılımını kullanarak yüzey alanı. <ol><li> Resmin altındaki &quot;Döşeme&quot; sekmesini tıklayın; &quot;Kapalı Poli-çizgi&quot; şeklini seçin ve üzerine tıklayın. Alanın çevresine tıklayarak tümör epitelial ve stromal alanlar arasındaki sınırı yeniden ilk noktaya ulaşana kadar sınırlayın .; Bu alan için bir önlem sağlar. NOT: şekil kapandıktan sonra, seçilen görüntünün yüzey alanını çevreleyen şeklin yanında bir sayı görünür (A = x μm 2 ). </li></ol></li><li> Epitel yüzey alanını hesaplamak için bu yüzey alanını (görüntü özelliklerinde sağlanan) toplam görüntü yüzey alanından çıkarın. Vasküler, nekrotik ve otofloresan alanları, etrafında bir çizgi çizerek, verilen alanın büyüklüğünü kaydedin ve bunu epitel yüzey alanından çıkararak hariç tutun. </li><li> Ortalama yüzey alanlarını hesaplamak için tüm yüzey alanı numaralarını bir elektronik tablo dosyasına kaydedin veSlayt başına hücre sayıları. </li><li> Görüntü analiz yazılımını kullanarak, dört kanalın floresansını kontrol ederek hücrelerin tek, çift veya üçlü pozitif olup olmadığını belirleyin. <ol><li> ImageJ kullanarak her bir resimdeki tek, çift ve üçlü pozitif hücreleri sayın. <ol><li> İndir ImageJ. &quot;Dosya&quot; ve &quot;Aç&quot; ı tıklayıp analiz edilecek resmi seçerek bir resim açın. &quot;Nokta Aracı&quot; (dört çizginin ortasındaki kırmızı bir kar) sağ tıklayın ve &quot;Çok Nokta Aracı&quot; nı seçin. &quot;Çok Nokta Araç&quot; ı çift tıklayın ve her hücre türüne göre farklı bir sayaç numarası seçerek, resimdeki farklı hücre türlerinin sayısını hesaplayın. NOT: Bir, iki veya üç floresan renginin varlığıyla tanımlandığı gibi, farklı her hücre türünün tüm hücrelerini sayın. Bu nükleer karşıtın her hücrede mevcut olduğu ve tümör hücrelerini bağışıklık hücrelerinden ayırt etmek için kullanıldığı için DAPI&#39;yı hariç tutun. Her hücre türü sayılırFarklı bir sayaç numarası kullanarak. Her seferinde farklı bir sayaç seçerek tümör epitelyal ve stromal bölgelerinde her hücre türünün hücre sayılarını ayrı olarak sayın. Kan damarları içinde hücreleri saymayın ve büyük oranda otofloresan alanlar. </li><li> Analiz edilen hücrelerin sayısını, her bir resim için her kutu bölmesinde bir elektronik tablo dosyasına kaydedin. </li><li> Analiz edilen tümör epiteli ve tümör stromasının toplam yüzey alanı boyunca her bir hücre tipi için toplam hücre sayısını bölün. </li></ol></li></ol></li></ol></li></ol> 6. İstatistiksel Analiz NOT: Verilerin kalitesini sağlamak için tüm istatistiksel analizler bir istatistikçi ile tartışılmalıdır. Genel istatistikler için herhangi bir tıbbi istatistik rehberi 14 kullanın . <ol><li> Bir Spearman sıra korelasyonu rho testi kullanarak hücre frekansları arasındaki korelasyonları test edin. </li><li> Olumlu cel sayısındaki istatistiksel farklılıkları test edinWilcoxon Mann-Whitney testini kullanarak hasta grupları arasındaki mesafe. </li><li> Kaplan-Meier eğrisi üretimi ve günlüğü kullanarak, kesilen hücre sayısına dayalı gruplardaki hastaları bölerek, hücre sayıları ile hastalıksız sağkalım arasındaki ( yani tanıdan , yerel veya uzak tekrar nüksetme veya hastalığa kadar geçen süre arasındaki korelasyonları test edin) test edin Sıralama analizi 15 . </li><li> Cox orantısal tehlike regresyon analizini kullanarak çok değişkenli analizler yapın. </li></ol>

<ol>
	<li>Westra, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+changing+face+of+head+and+neck+cancer+in+the+21st+century:+the+impact+of+HPV+on+the+epidemiology+and+pathology+of+oral+cancer.">The changing face of head and neck cancer in the 21st century: the impact of HPV on the epidemiology and pathology of oral cancer.</a> Head Neck Pathol. 3 (1), 78-81 (2009).</li><li>Rietbergen, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+papillomavirus+detection+and+comorbidity:+critical+issues+in+selection+of+patients+with+oropharyngeal+cancer+for+treatment+De-escalation+trials.">Human papillomavirus detection and comorbidity: critical issues in selection of patients with oropharyngeal cancer for treatment De-escalation trials.</a> Ann Oncol. 24 (11), 2740-2745 (2013).</li><li>Wallis, S. P., Stafford, N. D., Greenman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+relevance+of+immune+parameters+in+the+tumor+microenvironment+of+head+and+neck+cancers.">Clinical relevance of immune parameters in the tumor microenvironment of head and neck cancers.</a> Head Neck. 37 (3), 449-459 (2015).</li><li>Ye, J., Livergood, R. S., Peng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+and+regulation+of+human+Th17+cells+in+tumor+immunity.">The role and regulation of human Th17 cells in tumor immunity.</a> Am J Pathol. 182 (1), 10-20 (2013).</li><li>Amedei, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+analysis+of+pancreatic+cancer-infiltrating+T+lymphocytes+reveals+that+ENO-specific+Tregs+accumulate+in+tumor+tissue+and+inhibit+Th1/Th17+effector+cell+functions.">Ex vivo analysis of pancreatic cancer-infiltrating T lymphocytes reveals that ENO-specific Tregs accumulate in tumor tissue and inhibit Th1/Th17 effector cell functions.</a> Cancer Immunol Immunother. 62 (7), 1249-1260 (2013).</li><li>Whiteside, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+are+regulatory+T+cells+(Treg)+regulating+in+cancer+and+why?.">What are regulatory T cells (Treg) regulating in cancer and why?.</a> Semin Cancer Biol. 22 (4), 327-334 (2012).</li><li>Punt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angels+and+demons:+Th17+cells+represent+a+beneficial+response,+while+neutrophil+IL-17+is+associated+with+poor+prognosis+in+squamous+cervical+cancer.">Angels and demons: Th17 cells represent a beneficial response, while neutrophil IL-17 is associated with poor prognosis in squamous cervical cancer.</a> Oncoimmunology. 4 (1), e984539 (2015).</li><li>Bamias, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Significant+differences+of+lymphocytes+isolated+from+ascites+of+patients+with+ovarian+cancer+compared+to+blood+and+tumor+lymphocytes.+Association+of+CD3+CD56++cells+with+platinum+resistance.">Significant differences of lymphocytes isolated from ascites of patients with ovarian cancer compared to blood and tumor lymphocytes. Association of CD3+CD56+ cells with platinum resistance.</a> Gynecol Oncol. 106 (1), 75-81 (2007).</li><li>Gasparoto, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patients+with+oral+squamous+cell+carcinoma+are+characterized+by+increased+frequency+of+suppressive+regulatory+T+cells+in+the+blood+and+tumor+microenvironment.">Patients with oral squamous cell carcinoma are characterized by increased frequency of suppressive regulatory T cells in the blood and tumor microenvironment.</a> Cancer Immunol Immunother. 59 (6), 819-828 (2010).</li><li>Jordanova, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+leukocyte+antigen+class+I,+MHC+class+I+chain-related+molecule+A,+and+CD8+/regulatory+T-cell+ratio:+which+variable+determines+survival+of+cervical+cancer+patients?.">Human leukocyte antigen class I, MHC class I chain-related molecule A, and CD8+/regulatory T-cell ratio: which variable determines survival of cervical cancer patients?.</a> Clin Cancer Res. 14 (7), 2028-2035 (2008).</li><li>van Esch, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+classical+and+nonclassical+HLA+expression+in+recurrent+and+progressive+HPV-induced+usual+vulvar+intraepithelial+neoplasia+and+implications+for+immunotherapy.">Alterations in classical and nonclassical HLA expression in recurrent and progressive HPV-induced usual vulvar intraepithelial neoplasia and implications for immunotherapy.</a> Int J Cancer. 135 (4), 830-842 (2014).</li><li>Heeren, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+effect+of+different+PD-L1+expression+patterns+in+squamous+cell+carcinoma+and+adenocarcinoma+of+the+cervix.">Prognostic effect of different PD-L1 expression patterns in squamous cell carcinoma and adenocarcinoma of the cervix.</a> Mod Pathol. 29 (7), 753-763 (2016).</li><li>Punt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+beneficial+tumor+microenvironment+in+oropharyngeal+squamous+cell+carcinoma+is+characterized+by+a+high+T+cell+and+low+IL-17(+)+cell+frequency.">A beneficial tumor microenvironment in oropharyngeal squamous cell carcinoma is characterized by a high T cell and low IL-17(+) cell frequency.</a> Cancer Immunol Immunother. 65 (4), 393-403 (2016).</li><li>Kirkwood, B. R., Sterne, J. A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Essential Medical Statistics. , (2003).</li><li>Kleinbaum, D. G., Klein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Survival Analysis: A Self-Learning Text. , (2005).</li><li>Fabre, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+Tumor+Microenvironment:+The+Protumor+Effects+of+IL-17+Related+to+Cancer+Type.">Targeting the Tumor Microenvironment: The Protumor Effects of IL-17 Related to Cancer Type.</a> Int J Mol Sci. 17 (9), (2016).</li><li>Feng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multispectral+imaging+of+formalin-fixed+tissue+predicts+ability+to+generate+tumor-infiltrating+lymphocytes+from+melanoma.">Multispectral imaging of formalin-fixed tissue predicts ability to generate tumor-infiltrating lymphocytes from melanoma.</a> J Immunother Cancer. 3 (47), (2015).</li></ol>

Yazarlar ticari ya da finansal çıkar çatışması ilan etmez.

Açıklanan protokol için en kritik adımlardan biri, kullanılan primer antikorların doğru seyreltilmesini belirlemektir. Etiketli sekonder antikorların seyreltilmesi, bu spesifik Alexa etiketli antikorların imalatçısı tarafından tavsiye edildiği gibi 1: 200 idi. Birincil antikorların seyreltilmesi, daha sonra tercihen amaçlanan doku türünün iki farklı numunesi (bu durumda OPSCC) kullanılarak bir seri seyreltme ile belirlenmelidir. Optimal çalışma seyreltmesi, arka plan gürültüsü olmaksızın ve...

Orofaringeal skuamoz hücreli karsinomlar (OPSCC), orofarenks kaynaklı heterojen bir skuamöz hücreli kanser grubudur. OPSCC için risk faktörleri human papillomavirus (HPV) enfeksiyonu ve alkol ve tütün kullanımı 1 , 2&#39;yi içerir . Bağışıklık tepkisinin rolü ve bunun klinik ortamda nasıl kullanılacağı henüz keşfedilmeye başlandı. Tümör mikro-çevre, kanser bölgesine çekici olan immün hücreler tarafından sızdırılır. Yüksek CD8 + sitotoksik T hücre frekansı OPSCC hastalarında 3 sağkalımın iyileşmesiyle korele olmasına rağmen, Tregs ve Th17 hücreleri de dahil olmak üzere diğer T hücre alt gruplarının rolü hala net değildir 4 . Th1 ve Th17 hücrelerinin tümör hücrelerini hedefleyen bağışıklık tepkisine yardımcı olması beklenirken, Treg&#39;ler diğer T hücrelerinin aktivitesini bastırma kabiliyetleri açısından iyi bilinir 5 . Bununla birlikte, T varlığıRegların farklı tümör tiplerinde hem olumlu hem de olumsuz yanıtlarla korele olduğu bulunmuştur 6 . Kanda bulunan tüm immün hücreler aynı derecede tümöre nüfuz etmediğinden, lokal tümör mikro ortamının incelenmesi tümöre yöneltilen bağışıklık tepkisinin en güvenilir ölçümünü sağlar. Bu çalışmanın amacı immün hücrelerin sayı ve tipleri ile klinik sonuç arasındaki korelasyonun belirlenmesidir. İnsan OPSCC&#39;sindeki çeşitli T hücresi alt popülasyonlarının sayısını ve lokalizasyonunu analiz etmek için dört renk flüoresan IHC görüntüleme kullandık. Toplam T lenfositlerine (CD3 + ), Th17 hücrelerine ve immünsüpresif FoxP3 + Treg&#39;lere odaklandık ve farklılaşma yolu Th17 hücreleriyle yakından ilişkiliydi. Th17 hücreleri CD3 ve IL-17 kombinasyonu ile karakterize edilir. Sitokin IL-17, aynı zamanda T olmayan hücreler tarafından üretilebilir 7 . İntra epitop dağılımını saptadıkHelial ve stromal T hücreleri, Tregs, Th17 ve IL-17 + T olmayan hücrelerden oluşan gruptan seçildi ve hasta sağkalımı ile olan korelasyonlarını analiz etti. Bir DAPI karşıt lekesi ile kombinasyon halinde CD3, Foxp3 ve IL-17 ekspresyonunu tanımlamak için çok renkli floresans IHC kullanıldı. Bu tahlil, her iki tümör hücresinin (DAPI nükleer boyaması kullanılarak) kolaylıkla ve net bir şekilde tanımlanmasına ve sızma T hücresi popülasyonlarının (farklı markörlerin bir kombinasyonu kullanılarak) tespit edilmesine izin verdi. Örnek hazırlama ve boyamayı takiben, kullanılan flüoresan renkleri ayırmak ve hem tümör epitelyumunda hem de tümör ilişkili stromada bulunan hücre sayısını ve türünü belirlemek için bir floresan mikroskopu ve görüntüleme yazılımı kullanıldı. Bağışıklık hücre popülasyonlarının sayısallaştırılması ve fenotiplenmesi için alternatif bir analiz, tümörün veya periferik örneklerin ( örn., Kan veya asit) uçuş zamanına (CyTOF) göre akış sitometrisi analizi veya sitometridir. Bunu kullanarakTekniği ile lokalizasyon ve farklı hücre tiplerinin göreceli dağılımı ile ilgili tüm bilgiler kaybolur. Periferik örneklerin kullanımı ve analizi, hangi hücrelerin tümörün mikro ortamına sızabildiğiyle ilgili bilgi sağlamamaktadır. Kan ve asitle immün hücre analizleri tümör dokusunda 8, 9 bağışık hücre içi filtrasyonundan fenotip ve sıklığını yansıtacak şekilde gösterilmemiştir edilmiştir. Başka bir alternatif parlak alan mikroskobu kullanımıdır. Bu tekniğin flüoresan görüntüleme üzerindeki avantajı, doku otofloresansının bulunmamasıdır. Bazı örneklerde daha otofloresans, özellikle eritrositler, ancak nötrofilik granülositler de dahil olmak üzere diğer hücre türleri de bulunmakla birlikte, bu bölgeler hemen hemen tüm numunelerin analizinde kolayca alınabilir. İmmünofloresans, hedeflenen flüoresan panelini kullanarak bir örnekteki birden fazla işaretçiyi analiz etme avantajını sunarNt dalga boyları. Bu, belirli bir antijen için yeterli sayıda etiketin ve piyasada mevcut olan antikor izotiplerinin olmaması nedeniyle parlak alan mikroskopisi için aynı ölçüde mümkün değildir. Burada tarif edilen çok renkli floresan IHC tekniği, insan lökosit antijenler (HLA) ve PD-L1 10, 11 gibi farklı immün hücre popülasyonları, hem de tümör hücresi-tanımlı molekülleri, çalışma kanser türleri ve antikor kombinasyonları bir çok farklı kullanılmıştır 12 . Protokol, birçok farklı örnek ve antikor çeşidi kullanılarak kurulmuş ve onaylanmıştır.

<table><tbody><tr><td>Pathos Delta Ultra Rapid Tissue Processor</td><td>Milestone and Histostar</td><td></td><td>Automated tissue processor</td></tr><tr><td>Histostar</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Tissue block embedding machine</td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Baker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xylol</td><td>Merck</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Merck</td><td></td><td></td></tr><tr><td>milliQ water</td><td>Elaga Purelab Chorus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraffin wax/Paraclean</td><td>Klinipath</td><td>5079A</td><td></td></tr><tr><td>Microtome tissue holder</td><td>Leica</td><td>RM225</td><td></td></tr><tr><td>Flex IHC side</td><td>Dako</td><td></td><td>Tissue slide</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Merk-Milipore</td><td>1,083,821,000</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Baker</td><td>1073</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Bio-Rad</td><td>BUF036A</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-CD3</td><td>Abcam</td><td>ab828</td><td>Titrate required antibody dilution</td></tr><tr><td>Mouse IgG1 anti-FoxP3</td><td>Abcam</td><td>ab20034</td><td>Titrate required antibody dilution</td></tr><tr><td>Goat IgG anti-IL-17</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>AF-317-NA</td><td>Titrate required antibody dilution</td></tr><tr><td>Rabbit Ig isotype control antibody</td><td>Abcam</td><td>ab27472</td><td>Use at same final concentration as anti-CD3</td></tr><tr><td>Mouse IgG1 isotype control antibody</td><td>Abcam</td><td>ab91353</td><td>Use at same final concentration as anti-FoxP3</td></tr><tr><td>Goat IgG isotype control antibody</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>02-6202</td><td>Use at same final concentration as anti-IL-17</td></tr><tr><td>Donkey anti-rabbit IgG A546</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A10040</td><td>Dilute 1:200 in 1% BSA/PBS</td></tr><tr><td>Donkey anti-mouse-A647</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A31571</td><td>Dilute 1:200 in 1% BSA/PBS</td></tr><tr><td>Donkey anti-goat IgG A488</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A11055</td><td>Dilute 1:200 in 1% BSA/PBS</td></tr><tr><td>VectaShield containing DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>LSM700 confocal laser scanning microscope&amp;nbsp;</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LCI Plan-Neofluar 25x/0.8 Imm Korr DIC M27 objective</td><td>Zeiss</td><td>420852-9972-720</td><td></td></tr><tr><td>LSM Zen Software</td><td>Zeiss</td><td>version 2009</td><td></td></tr><tr><td>LSM Image Browser</td><td>Zeiss</td><td>version 4.2.0.121</td><td>Available to download at www.zeiss.com/microscopy/int/website/downloads/lsm-image-browser.html.</td></tr><tr><td>SPSS</td><td>IBM Corp.</td><td>version 20.0</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td>version 1.50i</td><td>Available to download at http://rsb.info.nih.gov/ij.</td></tr></tbody></table>

four-color fluorescence immunohistochemistry of t-cell subpopulations in archival formalin-fixed, paraffin-embedded human oropharyngeal squamous cell carcinoma samples

Dört renk floresan immünohistokimya (IHC) tekniği, bağıl dağılımı ve dokudaki lokalizasyonu göz önüne alırken, ilgili hücre popülasyonlarını nicelleştirmek için kullanılan bir yöntemdir. Bu teknik, çeşitli tümör tiplerinde bağışıklık sızıntısının araştırılması için yoğun bir şekilde uygulanmıştır. Tümör mikro-çevre, tümör bölgesine çekilen bağışıklık hücreleri tarafından sızdırılır. Farklı immün hücre popülasyonlarının tümör mikro ortamında farklı roller oynadığı ve hastalığın sonucunda farklı bir etkisi olduğu bulunmuştur. Bu el yazması örnek olarak orofaringeal skuamöz hücreli karsinomda (OPSCC) multiparametre floresans IHC&#39;nin kullanımını açıklamaktadır. Bu teknik diğer doku örneklerine ve ilgi konusu hücre tiplerine kadar uzatılabilir. Sunulan çalışmada, büyük bir OPSCC kohortunun (n = 162) intraepitelyal ve stromal bölmesini analiz ettik. Toplam T lenfositleri (CD3 + ), immünosupresif düzenleyiciTümör epitelini stroma&#39;dan ayırmak için bir nükleer kontrast lekesi kullanarak , ory T hücrelerinde (Tregler; yani FoxP3 + ) ve T yardımcı 17 (Th17) hücrelerinde ( yani, IL-17 + CD3 + ). Az sayıda intratümöral IL-17 + T olmayan hücreler bulunan hastalarda iyileştirilmiş hastalıksız sağkalım ile yüksek sayıda T hücresinin korelasyon gösterdiği bulundu. Bu, IL-17 + olmayan T hücrelerinin, kanser hastalarında IL-17 ve kötü sağkalım arasında tarif edilen korelasyonla uyuşan OPSCC&#39;deki zayıf bir immün yanıt ile korele olabileceğini düşündürmektedir. Günümüzde, yeni multiparametre floresan IHC teknikleri 7 farklı florokrom kullanılarak geliştirilmektedir ve tümör mikro ortamında bağışık hücrelerin daha kesin karakterizasyonu ve lokalizasyonu sağlanacaktır.

Protokolü kullanılarak boyanmıştır (n = 162), daha önce tarif edildiği 13 tarif edildiği gibi Leiden Üniversitesi Tıp Merkezi, Leiden, 1970 ve 2011 arasında, Hollanda&#39;da bulunan teşhis konmuş primer orofaringeal tümörlerden elde edilen FFPE ön tümör örneğinden oluşan bir seri, seçilen. Her slaydın bir ila dört rasgele görüntüsü analiz edildi ( Şekil 1 ). Bazı otofloresan hücreler gösterilir, bu da t...

Watch this Scientific Journal Video about Four-color Fluorescence Immunohistochemistry of T-cell Subpopulations in Archival Formalin-fixed, Paraffin-embedded Human Oropharyngeal Squamous Cell Carcinom

Four-color Fluorescence Immunohistochemistry of T-cell Subpopulations in Archival Formalin-fixed, Paraffin-embedded Human Oropharyngeal Squamous Cell Carcinoma Samples

Multiparametre floresan immünohistokimyası, tümör mikro ortamındaki bağışık hücre popülasyonlarının sayısını, göreceli dağılımını ve lokalizasyonunu değerlendirmek için kullanılabilir. Bu el yazması oropharyngeal kanserdeki T hücresi alt popülasyonlarını analiz etmek için bu tekniği tanımlamaktadır.

Arşiv Formalin Sabitlenmiş, Parafin Gömülü İnsan Orofaringeal Skuamöz Hücreli Karsinoma Örneklerinde T-hücresi Subpopülasyonlarının Dört Renkli Floresan İmmunohistokimyası

The four-color fluorescence immunohistochemistry (IHC) technique is a method to quantify cell populations of interest while taking into account their ...

four-color-fluorescence-immunohistochemistry-t-cell-subpopulations

Research

JoVE Journal

Cancer Research

9.6K Görüntüleme.  Leiden University Medical Center.  Multiparametre floresan immünohistokimyası, tümör mikro ortamındaki bağışık hücre popülasyonlarının sayısını, göreceli dağılımını ve lokalizasyonunu değerlendirmek için kullanılabilir. Bu el yazması oropharyngeal kanserdeki T hücresi alt popülasyonlarını analiz etmek için bu tekniği tanımlamaktadır. 

Video: Four-color Fluorescence Immunohistochemistry of T-cell Subpopulations in Archival Formalin-fixed, Paraffin-embedded Human Oropharyngeal Squamous Cell Carcinoma Samples

Multiplexed Immunofluorescence Analysis and Quantification of Intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8+ T Cells

Immune cells are important components of the tumor microenvironment and influence tumor growth and evolution at all stages of carcinogenesis. Notably, it is now well established that the immune infiltrate in human tumors can correlate with prognosis and response to therapy. The analysis of the immune infiltrate in the tumor microenvironment has become a major challenge for the classification of patients and the response to treatment.
The co-expression of inhibitory receptors such as Program Cell Death Protein 1 (PD1; also known as CD279), Cytotoxic T Lymphocyte Associated Protein 4 (CTLA-4), T-Cell Immunoglobulin and Mucin Containing Protein-3 (Tim-3; also known as CD366), and Lymphocyte Activation Gene 3 (Lag-3; also known as CD223), is a hallmark of T cell exhaustion. We developed a multiparametric in situ immunofluorescence staining to identify and quantify at the cellular level the co-expression of these inhibitory receptors. On a retrospective series of frozen tissue of renal cell carcinomas (RCC), using a fluorescence multispectral imaging technology coupled with an image analysis software, it was found that co-expression of PD-1 and Tim-3 on tumor infiltrating CD8+ T cells is correlated with a poor prognosis in RCC. To our knowledge, this represents the first study demonstrating that this automated multiplex in situ technology may have some clinical relevance.

Multiplexed Immunofluorescence Analysis and Quantification of Intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8+ T Cells

Studying tumor microenvironment may identify prognostic or predictive biomarkers of clinical response to immunotherapy. Presented here, is an innovative method based on in situ fluorescence multispectral imaging to analyze and count automatically various subpopulations of CD8+ T cells. This reproducible and reliable technique is suitable for large cohort analyses.

Multiplexed ayirt analizi ve Intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8 miktar+ T hücreleri

Immune cells are important components of the tumor microenvironment and influence tumor growth and evolution at all stages of carcinogenesis. Notably, it ...

Kanser Araştırmaları

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient management strategies. Orthotopic mouse models of oral cancer have been developed to facilitate the study of factors that impact invasion and serve as model system for evaluating anti-tumor therapeutics. In these systems, visualization of disseminated tumor cells within oral cavity tissues has typically been conducted by either conventional histology or with in vivo bioluminescent methods. A primary drawback of these techniques is the inherent inability to accurately visualize and quantify early tumor cell invasion arising from the primary site in three dimensions. Here we describe a protocol that combines an established model for squamous cell carcinoma of the tongue (SCOT) with two-photon imaging to allow multi-vectorial visualization of lingual tumor spread. The OSC-19 head and neck tumor cell line was stably engineered to express the F-actin binding peptide LifeAct fused to the mCherry fluorescent protein (LifeAct-mCherry). Fox1nu/nu mice injected with these cells reliably form tumors that allow the tongue to be visualized by ex-vivo application of two-photon microscopy. This technique allows for the orthotopic visualization of the tumor mass and locally invading cells in excised tongues without disruption of the regional tumor microenvironment. In addition, this system allows for the quantification of tumor cell invasion by calculating distances that invaded cells move from the primary tumor site. Overall this procedure provides an enhanced model system for analyzing factors that contribute to SCOT invasion and therapeutic treatments tailored to prevent local invasion and distant metastatic spread. This method also has the potential to be ultimately combined with other imaging modalities in an in vivo setting.

A comprehensive overview of the techniques involved in generating a mouse model of oral cancer and quantitative monitoring of tumor invasion within the tongue through multi-photon microscopy of labeled cells is presented. This system can serve as a useful platform for the molecular assessment and drug efficacy of anti-invasive compounds.

Oral Skuamöz Hücre Karsinomu Ortotopik Fare Modeli Tümör Hücre Invasion Multi-foton Görüntüleme

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

Tıp

Automated Multiplex Immunofluorescence Panel for Immuno-oncology Studies on Formalin-fixed Carcinoma Tissue Specimens

Continued developments in immuno-oncology require an increased understanding of the mechanisms of cancer immunology. The immunoprofiling analysis of tissue samples from formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) biopsies has become a key tool for understanding the complexity of tumor immunology and discovering novel predictive biomarkers for cancer immunotherapy. Immunoprofiling analysis of tissues requires the evaluation of combined markers, including inflammatory cell subpopulations and immune checkpoints, in the tumor microenvironment. The advent of novel multiplex immunohistochemical methods allows for a more efficient multiparametric analysis of single tissue sections than does standard monoplex immunohistochemistry (IHC). One commercially available multiplex immunofluorescence (IF) method is based on tyramide-signal amplification and, combined with multispectral microscopic analysis, allows for a better signal separation of diverse markers in tissue. This methodology is compatible with the use of unconjugated primary antibodies that have been optimized for standard IHC on FFPE tissue samples. Herein we describe in detail an automated protocol that allows multiplex IF labeling of carcinoma tissue samples with a six-marker multiplex antibody panel comprising PD-L1, PD-1, CD68, CD8, Ki-67, and AE1/AE3 cytokeratins with 4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole as a nuclear cell counterstain. The multiplex panel protocol is optimized in an automated IHC stainer for a staining time that is shorter than that of the manual protocol and can be directly applied and adapted by any laboratory investigator for immuno-oncology studies on human FFPE tissue samples. Also described are several controls and tools, including a drop-control method for fine quality control of a new multiplex IF panel, that are useful for the optimization and validation of the technique.

A detailed protocol for a six-marker multiplex immunofluorescence panel is optimized and performed, using an automated stainer for more consistent results and a shorter procedure time. This approach can be directly adapted by any laboratory for immuno-oncology studies.

IMMUNO-Onkoloji araştırmalar Formalin sabit Karsinomu doku örnekleri Multiplex ayirt Panel otomatik

Continued developments in immuno-oncology require an increased understanding of the mechanisms of cancer immunology. The immunoprofiling analysis of ...

Chromogenic In Situ Hybridization as a Tool for HPV-Related Head and Neck Cancer Diagnosis

Human papillomavirus (HPV) infection is a major risk factor for a subtype of oropharyngeal squamous cell carcinoma (OPSCC), which tends to be associated with a better outcome than alcohol- and tobacco-related OPSCC. Chromogenic in situ hybridization (CISH) of HPV viral RNA could allow the semiquantitative evaluation of viral transcripts of the oncogenic proteins E6 and E7 and an in situ visualization with a good spatial resolution. This technique allows the diagnosis of an active infection with the visualization of HPV transcription in the tumoral HPV-infected cells. An advantage of this technique is the avoidance of contamination from nonneoplastic HPV-infected cells adjacent to the tumor. Overall, its good diagnosis performances have it considered to be the gold standard for active HPV infection identification. Since E6 and E7 viral protein interaction with cell proteins pRb and p53 is mandatory for cell transformation, HPV RNA CISH is functionally relevant and acutely reflects active oncogenic HPV infection. This technique is clinically relevant as well since &#34;low&#34; or &#34;high&#34; HPV transcription levels helped the identification of two prognosis groups among HPV-related p16-positive head and neck cancer patients. Here we present the protocol for manual HPV RNA CISH performed on formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) slides with a kit obtained from the manufacturer. Instead of chromogenic revelation, RNA in situ hybridization may also be performed with fluorescent revelation (RNA FISH). It may also be combined with conventional immunostaining.

Human papillomavirus (HPV) RNA chromogenic in situ hybridization is considered to be one of the gold standards for active human papillomavirus infection detection within tumors. It allows the visualization of HPV E6-E7 mRNA expression with localization and semiquantitative evaluation of its signal.

Kromojenik In situ hybridization HPV Ile Ilgili baş ve boyun kanseri tanısı için bir araç ss

Human papillomavirus (HPV) infection is a major risk factor for a subtype of oropharyngeal squamous cell carcinoma (OPSCC), which tends to be associated ...

Genetik

Akciğer Skuamöz Karsinomunda mIHC Kullanılarak Tümör Mikroçevresinin Deşifre Edilmesi

Multiplex Immunohistochemistry Staining for Paraffin-embedded Lung Cancer Tissue

Lung cancer is the leading cause of malignant tumor-related morbidity and mortality all over the world, and the complex tumor microenvironment has been considered the leading cause of death in lung cancer patients. The complexity of the tumor microenvironment requires effective methods to understand cell-to-cell relationships in tumor tissues. The multiplex immunohistochemistry (mIHC) technique has become a key tool for inferring the relationship between the expression of proteins upstream and downstream of signaling pathways in tumor tissues and developing clinical diagnoses and treatment plans. mIHC is a multi-label immunofluorescence staining method based on Tyramine Signal Amplification (TSA) technology, which can simultaneously detect multiple target molecules on the same tissue section sample to achieve different protein co-expression and co-localization analysis. In this experimental protocol, paraffin-embedded tissue sections of lung squamous carcinoma of clinical origin were subjected to multiplex immunohistochemical staining. By optimizing the experimental protocol, multiplex immunohistochemical staining of labeled target cells and proteins was achieved, solving the problem of autofluorescence and channel crosstalk in lung tissues. In addition, multiplex immunohistochemical staining is widely used in the experimental validation of tumor-related, high-throughput sequencing, including single-cell sequencing, proteomics, and tissue space sequencing, providing intuitive and visual pathology validation results.

Yazar Spotlight: Akciğer Karsinomu Örneğinde Çok Renkli Floresan Lokalizasyonunun Geliştirilmesi

This experimental protocol describes and optimizes a multiplex immunohistochemistry (IHC) staining method, mainly by optimizing single-channel antibody incubation conditions and adjusting the settings of antibodies and channels to solve the problems of autofluorescence and channel crosstalk in lung cancer tissues of clinical origin.

Parafine Gömülü Akciğer Kanseri Dokusu için Multipleks İmmünohistokimya Boyama

Lung cancer is the leading cause of malignant tumor-related morbidity and mortality all over the world, and the complex tumor microenvironment has been ...

Kanser Dokularında İmmün Hücre Belirteçlerinin Yerinde İmmünohistokimyasal Tespiti

Multiplex Cyclic Fluorescent Immunohistochemistry

The tumor microenvironment involves interactions between host cells, tumor cells, immune cells, stromal cells, and vasculature. Characterizing and spatially organizing immune cell subsets and target proteins are crucial for prognostic and therapeutic purposes. This has led to the development of multiplexed immunohistochemistry staining methods. Multiplex fluorescence immunohistochemistry allows the simultaneous detection of multiple markers, facilitating a comprehensive understanding of cell function and intercellular interactions. In this paper, we describe a workflow for the multiplex cyclic fluorescent immunohistochemistry assay and its application in the quantification analysis of lymphocyte subsets. The multiplex cyclic fluorescent immunohistochemistry staining follows similar steps and reagents as standard immunohistochemistry, involving antigen retrieval, cyclic antibody incubation, and staining on a formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue slide. During the antigen-antibody reaction, a mixture of antibodies from different species is prepared. Conditions, such as antigen retrieval time and antibody concentration, are optimized and validated to increase the signal-to-noise ratio. This technique is reproducible and serves as a valuable tool for immunotherapy research and clinical applications.

Yazar Spotlight: Floresan İmmünohistokimya Kullanarak Kanser Dokularında İmmün Hücre İnfiltrasyonunun Etkili Tespiti

Multiplex cyclic immunohistochemistry allows in situ detection of multiple markers simultaneously using repeated antigen-antibody incubation, image scanning, and image alignment and integration. Here, we present the operating protocol for identifying immune cell substrates with this technology in lung cancer and paired brain metastasis samples.

Arşiv Formalin Sabitlenmiş, Parafin Gömülü İnsan Orofaringeal Skuamöz Hücreli Karsinoma Örneklerinde T-hücresi Subpopülasyonlarının Dört Renkli Floresan İmmunohistokimyası

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Multiplexed ayirt analizi ve Intratumoral PD-1⁺ Tim-3⁺ CD8 miktar⁺ T hücreleri

Oral Skuamöz Hücre Karsinomu Ortotopik Fare Modeli Tümör Hücre Invasion Multi-foton Görüntüleme

IMMUNO-Onkoloji araştırmalar Formalin sabit Karsinomu doku örnekleri Multiplex ayirt Panel otomatik

Kromojenik In situ hybridization HPV Ile Ilgili baş ve boyun kanseri tanısı için bir araç ss

Parafine Gömülü Akciğer Kanseri Dokusu için Multipleks İmmünohistokimya Boyama

Parafine Gömülü Akciğer Kanseri Dokusu için Multipleks İmmünohistokimya Boyama

Parafine Gömülü Akciğer Kanseri Dokusu için Multipleks İmmünohistokimya Boyama

Multipleks Siklik Floresan İmmünohistokimya

Multipleks Siklik Floresan İmmünohistokimya

Multipleks Siklik Floresan İmmünohistokimya