Yazarlar, kaliteli multipleks immünofloresan ve IHC işleme için teknik rehberliğe katkıda bulunan Klinik Patoloji Araştırma Enstitüsü Batı Çin Hastanesi üyelerine teşekkür etmek ister. Bu protokol Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (82200078) tarafından desteklenmiştir.

Protokol, Çin'deki Sichuan Üniversitesi, Batı Çin Hastanesi Etik Komitesi'nin yönergeleri tarafından onaylanmıştır. Akciğer kanseri doku örnekleri, Batı Çin Hastanesi Akciğer Kanseri Merkezi'ndeki ameliyat sırasında alındı ve her hastadan bilgilendirilmiş onam alındı.
1. Doku kesiti hazırlığı
<ol><li>FFPE hazırlama<ol><li>Klinik dokuları 72 saatten fazla nötr formalin çözeltisine daldırın.</li>
		<li>Ksilen ve dereceli alkollü çözeltiler kullanarak dokuları kurutmak işlemini tamamlayın20.</li>
		<li>4 μm kesit kalınlığında manuel parafin gömme ve doku kesiti gerçekleştirin. Doku dilimlerinin düşmemesini sağlamak için yapışma mikroskobu slaytları kullanın.</li>
		<li>Slaytları 65 °C'deki fırında 2 saat pişirerek kağıt mendil ve slaytların kurumasını sağlayın. Oda sıcaklığında bir slayt kutusunda saklayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Doku kesiti ön tedavisi<ol><li>Doku slaytlarını 65 ° C'de 5 dakika boyunca bir fırında ön işleme tabi tutun ve ardından sırayla 2 x 15 dakika ksilen çözeltilerine, 2 x 15 dakika susuz etanol çözeltilerine, 10 dakika boyunca% 90 etanol çözeltisine, 10 dakika boyunca% 85 etanol çözeltisine, 10 dakika boyunca% 80 etanol çözeltisine ve 10 dakika boyunca% 75 etanol çözeltisine daldırın, ardından slaytları 3 x 1 dakika sterilize su ile yıkayın. NOT: Bu deneysel teknik, donmuş veya taze doku için değil, yalnızca FFPE dokusu için kullanılabilir, çünkü çoklu yüksek sıcaklık antijen onarım işlemi dokunun slayttan düşmesine neden olur.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Primer antikorun optimizasyonu
NOT: Esas olarak antikor konsantrasyonu ve antijen onarım koşulları dahil olmak üzere, bireysel antikorlar için inkübasyon koşullarını belirlemek için geleneksel IHC deneyleri kullanılmıştır. Antikor kullanım kılavuzundaki koşullara bakın.
<ol><li>Önerilen konsantrasyon aralığından ve ara değerlerden biraz daha yüksek bir antikor konsantrasyonu kullanın.</li>
	<li>Protein ekspresyonunun konumuna göre PH6 ve PH9 antijen alma tampon rutinlerini optimize edin. Çekirdekte eksprese edilen proteinler için PH9 kullanın ve diğer proteinler için rutin (PH6 veya PH9) kullanın.</li>
</ol>3. mIHC boyama yöntemi
NOT: Opal mIHC boyama, mevcut mIHC yöntemlerinden biridir. Bu deneysel 5 renkli protokolde, her doku örneğinin dört antikor ile boyanması gerektiğinden, dört primer antikor inkübasyonu, sekonder antikor inkübasyonu ve TSA sinyal amplifikasyonu kromojenik inkübasyonlarının yanı sıra beş antijen restorasyonuna ihtiyaç vardır. Son olarak, 4'6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) boyama ve anti-floresan patlama maddesi sızdırmazlığı gerçekleştirilir.
<ol><li>Ana reaktif hazırlama NOT: Doku slaytlarının boyutuna göre eklenecek reaktif miktarını belirleyin. Doku bölümünü tamamen kaplayacak kadar hacim kullanın (genellikle slayt başına 50-150 μL). Deney için gerekli çalışma çözümleri şu şekilde hazırlanır:<ol><li>Yıkama tamponu çalışma solüsyonu: 20x Yıkama tamponunu 1:20'de çift damıtılmış suyla seyreltin ve oda sıcaklığında saklayın.</li>
		<li>PH6 tampon çalışma çözeltisi: 100x PH6 tamponunu 1:100'de çift damıtılmış su ile seyreltin. Kullanmadan önce hazırlayın ve oda sıcaklığında saklayın.</li>
		<li>PH9 tampon çalışma çözeltisi: 50x PH9 tamponunu 1:50'de çift damıtılmış su ile seyreltin. Kullanmadan önce hazırlayın ve oda sıcaklığında saklayın.</li>
		<li>Polimer HRP: Bu kullanıma hazır çözeltiyi yalnızca tavşan ve fare kökenli primer antikorlar için hazırlayın.</li>
		<li>Florofor çalışma çözeltisi: Her bir florofor tozunu (florofor 780 hariç) 75 μL DMSO içinde sulandırın. Her prosedürden önce, floroforu 1x amplifikasyon seyrelticisinde 1:100'de seyreltin. Florofor çalışma solüsyonunun kullanılmayan kısımlarını atın.</li>
		<li>Florofor 780 Çalışma Çözeltisi: TSA-DIG'yi 75 μL DMSO'da ve florofor tozu 780'i 300 μL çift damıtılmış suda sulandırın. İşlemden önce, TSA-DIG'yi 1x amplifikasyon seyrelticisinde 1:100'de seyreltin ve florofor 780'i 1:25'te Ab seyreltici ile seyreltin.</li>
		<li>DAPI çalışma solüsyonu: DAPI solüsyonunu 1:50'de çift damıtılmış su veya PBS ile seyreltin. Kullanmadan önce hazırlayın ve 4 °C'de 48 saatten fazla saklamayın. NOT. Bu çok etiketli floresan boyama deneyi boyunca slaytları yalnızca çift damıtılmış su ve yeni hazırlanmış yıkama tamponu çalışma solüsyonu ile yıkayın. Doku kesitleri musluk suyu ile temas etmemelidir; Musluk suyundaki kirleticiler doku bölümlerine yapışabilir ve otofloresansa neden olabilir. Deney boyunca numuneleri ışıktan uzak tutun.</li>
	</ol></li>
	<li>Antijen alımı<ol><li>Slaytları bir boyama ve tamir kutusuna yerleştirin ve PH6 veya PH9 tampon çalışma solüsyonu ile doldurun, kapağı kapatın ve mikrodalga fırında %100 güçte 2 x 8 dakika ısıtın. NOT: Dilimlerin kurumasına neden olabilecek aşırı buharlaşmayı önlemek için ısıtma işlemi sırasında tamir kutusuna çift damıtılmış su ekleyin.</li>
		<li>Devam etmeden önce slaytların oda sıcaklığında soğumasını bekleyin (30-60 dakika).</li>
		<li>Slaytları 3 x 2 dakika çift damıtılmış suyla yıkayın. Slayttaki doku bölümünü çevrelemek için hidrofobik bir bariyer kalemi kullanın.</li>
	</ol></li>
	<li>Engelleme<ol><li>Doku bölümlerini yıkama tamponuna daldırın, bloke edici solüsyonla örtün ve slaytları oda sıcaklığında nemlendirilmiş bir odada 10 dakika inkübe edin.</li>
	</ol></li>
	<li>Primer antikor inkübasyonu<ol><li>Blokaj solüsyonunu slaytlardan çıkarın ve doku bölümlerini birincil antikor çalışma solüsyonu ile örtün. Slaytları nemlendirilmiş bir odada inkübatörde 37 °C'de 1 saat veya buzdolabında 4 °C'de gece boyunca inkübe edin. NOT: Slaytların kurumasına izin vermeyin.</li>
	</ol></li>
	<li>Polimer HRP'nin Tanıtımı<ol><li>Slaytları yıkama tamponu çalışma solüsyonunda 3 x 2 dakika yıkayın. Polimer HRP'yi doğrudan doku bölümlerine damla damla ekleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. NOT: Buzdolabında saklanan slaytlar için, birincil antikoru çıkarmak için yıkamadan önce yaklaşık 30 dakika oda sıcaklığında tutun.</li>
	</ol></li>
	<li>Tiramin sinyal amplifikasyonu (TSA) üretimi<ol><li>Slaytı yıkama tamponu çalışma solüsyonu ile 3 x 2 dakika yıkayın, florofor çalışma solüsyonunu doğrudan doku bölümlerine damla damla ekleyin ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Slaytı yıkama tamponu çalışma solüsyonu ile 3 x 2 dakika yıkayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Florofor 780 için özel prosedür NOT: Fluorophore 780 zayıftır ve tüm deneyin renk eşleştirme şemasında rutin olarak en son sıraya yerleştirilir. Fluorophore 780 normalde bu deneysel protokolde kullanılmaz, ancak özgüllüğü nedeniyle deneysel adımları listelenmiştir.<ol><li>TSA-DIG'nin Tanıtımı<ol><li>Slaytı yıkama tamponu çalışma solüsyonu ile 3 x 2 dakika yıkayın, doku bölümlerine damla damla TSA-Drg çalışma solüsyonu ekleyin ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.</li>
		</ol></li>
		<li>Mikrodalga tedavisi<ol><li>Slaytları yıkama tamponu çalışma solüsyonu ile 3 x 2 dakika yıkayın.</li>
			<li>Slaytları bir boyama ve tamir kutusuna yerleştirin, tamir solüsyonu ile doldurun, kapağı kapatın ve mikrodalga fırında %100 güçte 2 x 8 dakika ısıtın. Devam etmeden önce slaytların oda sıcaklığında soğumasını bekleyin (30-60 dakika).</li>
			<li>Slaytları 3 x 2 dakika boyunca çift damıtılmış suyla yıkayın.</li>
		</ol></li>
		<li>Fluorophore 780 sinyal üretimi<ol><li>Bölümleri yıkama tamponuna daldırın, florofor 780 çalışma solüsyonu ile kaplayın ve slaytları oda sıcaklığında 1 saat nemlendirilmiş bir odada inkübe edin.</li>
			<li>Slaytları yıkama tamponu çalışma solüsyonu ile 3 x 2 dakika yıkayın. NOT: Bu adımdan sonra mikrodalga tedavisi YAPMAYIN.</li>
		</ol></li>
		<li>Tüm iş akışının son adımı olarak florofor 780'i kullanın ve ardından çekirdekleri doğrudan DAPI çalışma çözümü ile boyayın. NOT: Florofor 780 kullanmıyorsanız adım 3.7'yi atlayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Mikrodalga tedavisi NOT: Bu mikrodalga adımı, birincil-ikincil HRP kompleksini sıyırır ve antijenleri yeniden açığa çıkararak bir sonraki birincil antikorun eklenmesine izin verir.<ol><li>Slaytları bir boyama ve tamir kutusuna koyun, PH6 veya PH9 tampon çalışma solüsyonu ile doldurun, kapağı kapatın ve mikrodalga fırında %100 güçte 2 x 8 dakika ısıtın.</li>
		<li>Devam etmeden önce slaytların oda sıcaklığında soğumasını bekleyin (30-60 dakika). Slaytları 3 x 1 dakika çift damıtılmış suyla yıkayın.</li>
		<li>Slaytları 2 dakika boyunca yıkama tamponu çalışma solüsyonuna batırın. Bir sonraki antikor inkübasyonunu gerçekleştirin.</li>
	</ol></li>
	<li>Sonraki antikor inkübasyonu<ol><li>3.2-3.8 adımlarını tekrarlayın (adım 3.7 hariç).</li>
	</ol></li>
	<li>Hücre nükleer boyama ve doku sızdırmazlığı<ol><li>Doku bölümlerini DAPI çalışma solüsyonu ile örtün ve slaytları nemlendirilmiş bir odada oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. Slaytları 3 x 2 dakika boyunca çift damıtılmış suyla yıkayın.</li>
		<li>Slaytlardan su damlacıklarını çıkarın, her slayta 10-20 μL anti-floresan söndürücü ekleyin ve slaytları bir mikroskop kapak camı ile kapatın.</li>
		<li>Bitmiş slaytları 4 °C'de, ışıktan koruyarak 1 aydan fazla saklayın. NOT: Hava kabarcıklarından kaçınmaya dikkat edin.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Negatif kontrolü ayarlayın
<ol><li>Negatif kontrol slaytlarını, doku içeren slaytlar gibi, ancak filmi tararken doku otofloresansını gidermek için kullanılan birincil antikorlar, ikincil antikorlar, TSA reaktifleri ve DAPI gibi reaktifler eklenmeden işleyin.</li>
</ol>5. Doku slaytlarının tam otomatik taranması
NOT: Spektral görüntüleme için kullanılan ekipman, tam otomatik bir multispektral doku miktar tayin analizörüdür ve 5 renkli slaytların görüntüleme ve analiz görselleştirmesi, referans verilen sistem kullanılarak gerçekleştirilebilir (bkz. Sistem, çoklu floroforların ve doku otofloresansının kantitatif olarak karıştırılması için multispektral görüntüleme kullanır.
<ol><li>Her floresan kanalı için pozlama süresini ve tarama programını manuel olarak ayarlayın ve cihazın doku slaytlarının tam otomatik pozlamasını ve taramasını tamamladığını onaylayın. NOT: Slayt yüzeyi temiz ve su filmi içermemelidir. Kapatıcı miktarına dikkat edin: çok fazla lamel kaymasına ve cihazın bir hata bildirmesine neden olur.</li>
</ol>6. Floresan analizi
<ol><li>Yazılıma çift tıklayın (Malzeme Tablosuna bakın), orijinal taramadan elde edilen çok renkli floresan görüntü dosyasını yazılıma sürükleyin ve görüntü türünü floresan olarak ayarlayın.</li>
	<li>Parlaklık ve kontrast düğmesini tıklatın ve paneldeki kanalları kontrol edin. İlgilendiğiniz floresan kanalını seçmek için dışını ve ardından kanalı tıklatın. Her kanalın parlaklığını ve kontrastını ayarlamak için Minimum ekran ve Maks ekranı sürükleyin.</li>
	<li>Analizden sonra, kaydedilecek görünümü belirleyin, bu iki içeriği kaldırmak için Slayta genel bakışı göster ve İmleç konumunu göster'e tıklayın, ölçek çubuğunu tutun ve Dosya | Anlık görüntüyü dışa aktar | Bir png dosyasını dışa aktarmak için geçerli görüntüleyici içeriği. NOT: Her floresan kanalı ve birleştirilmiş bir şekil, gelecekteki analizler için dışa aktarılmalıdır.</li>
	<li>Hedef hücre pozitifliğinin daha fazla analizi için, hücre tanımlama ve segmentasyon yazılımı21'i kullanın (bkz.</li>
</ol>

Akciğer Skuamöz Karsinomunda mIHC Kullanılarak Tümör Mikroçevresinin Deşifre Edilmesi

<ol>
	<li>Zaidi, A. U., Enomoto, H., Milbrandt, J., Roth, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+fluorescent+in+situ+hybridization+and+immunohistochemical+detection+with+tyramide+signal+amplification.">Dual fluorescent in situ hybridization and immunohistochemical detection with tyramide signal amplification.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 48 (10), 1369-1375 (2000).</li><li>Lovisa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial-to-mesenchymal+transition+induces+cell+cycle+arrest+and+parenchymal+damage+in+renal+fibrosis.">Epithelial-to-mesenchymal transition induces cell cycle arrest and parenchymal damage in renal fibrosis.</a> Nature Medicine. 21 (9), 998-1009 (2015).</li><li>Nghiem, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1+blockade+with+pembrolizumab+in+advanced+Merkel-cell+carcinoma.">PD-1 blockade with pembrolizumab in advanced Merkel-cell carcinoma.</a> The New England Journal of Medicine. 374 (26), 2542-2552 (2016).</li><li>Zaretsky, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+associated+with+acquired+resistance+to+PD-1+blockade+in+melanoma.">Mutations associated with acquired resistance to PD-1 blockade in melanoma.</a> The New England Journal of Medicine. 375 (9), 819-829 (2016).</li><li>Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+heterogeneous+immune+landscape+between+lung+adenocarcinoma+and+squamous+carcinoma+revealed+by+single-cell+RNA+sequencing.">The heterogeneous immune landscape between lung adenocarcinoma and squamous carcinoma revealed by single-cell RNA sequencing.</a> Signal Transduction and Targeted Therapy. 7 (1), 289 (2022).</li><li>Becheva, Z. R., Gabrovska, K. I., Godjevargova, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+between+direct+and+indirect+immunofluorescence+method+for+determination+of+somatic+cell+count.">Comparison between direct and indirect immunofluorescence method for determination of somatic cell count.</a> Chemical Papers. 72, 1861-1867 (2018).</li><li>Niedenberger, B. A., Geyer, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+immunostaining+approaches+to+study+early+male+germ+cell+development.">Advanced immunostaining approaches to study early male germ cell development.</a> Stem Cell Research. 27, 162-168 (2018).</li><li>Granier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tim-3+expression+on+tumor-infiltrating+PD-1+CD8++T+cells+correlates+with+poor+clinical+outcome+in+renal+cell+carcinoma.">Tim-3 expression on tumor-infiltrating PD-1+CD8+ T cells correlates with poor clinical outcome in renal cell carcinoma.</a> Cancer Research. 77 (5), 1075-1082 (2017).</li><li>Badoual, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1-expressing+tumor-infiltrating+T+cells+are+a+favorable+prognostic+biomarker+in+HPV-associated+head+and+neck+cancer.">PD-1-expressing tumor-infiltrating T cells are a favorable prognostic biomarker in HPV-associated head and neck cancer.</a> Cancer Research. 73 (1), 128-138 (2013).</li><li>Meany, D. L., Hackler, L., Zhang, H., Chan, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyramide+signal+amplification+for+antibody-overlay+lectin+microarray:+a+strategy+to+improve+the+sensitivity+of+targeted+glycan+profiling.">Tyramide signal amplification for antibody-overlay lectin microarray: a strategy to improve the sensitivity of targeted glycan profiling.</a> Journal of Proteome Research. 10 (3), 1425-1431 (2011).</li><li>Surace, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+multiplex+immunofluorescence+panel+for+immuno-oncology+studies+on+formalin-fixed+carcinoma+tissue+specimens.">Automated multiplex immunofluorescence panel for immuno-oncology studies on formalin-fixed carcinoma tissue specimens.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (143), 58390 (2019).</li><li>Lazarus, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization,+design+and+avoiding+pitfalls+in+manual+multiplex+fluorescent+immunohistochemistry.">Optimization, design and avoiding pitfalls in manual multiplex fluorescent immunohistochemistry.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (149), 59915 (2019).</li><li>Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+immunohistochemistry,+imaging,+and+quantitation:+a+review,+with+an+assessment+of+Tyramide+signal+amplification,+multispectral+imaging+and+multiplex+analysis.">Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis.</a> Methods. 70 (1), 46-58 (2014).</li><li>Mansfield, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multispectral+imaging:+a+review+of+its+technical+aspects+and+applications+in+anatomic+pathology.">Multispectral imaging: a review of its technical aspects and applications in anatomic pathology.</a> Veterinary Pathology. 51 (1), 185-210 (2014).</li><li>Gustavson, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+unsupervised+pixel-based+clustering+algorithm+for+compartmentalization+of+immunohistochemical+expression+using+Automated+QUantitative+Analysis.">Development of an unsupervised pixel-based clustering algorithm for compartmentalization of immunohistochemical expression using Automated QUantitative Analysis.</a> Applied Immunohistochemistry &amp; Molecular Morphology. 17 (4), 329-337 (2009).</li><li>Lu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+biomarker+modalities+for+predicting+response+to+PD-1/PD-L1+checkpoint+blockade:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">Comparison of biomarker modalities for predicting response to PD-1/PD-L1 checkpoint blockade: a systematic review and meta-analysis.</a> JAMA Oncology. 5 (8), 1195-1204 (2019).</li><li>Humphries, M. P., Maxwell, P., Salto-Tellez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=QuPath:+The+global+impact+of+an+open+source+digital+pathology+system.">QuPath: The global impact of an open source digital pathology system.</a> Computational and Structural Biotechnology Journal. 19, 852-859 (2021).</li><li>Bankhead, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=QuPath:+Open+source+software+for+digital+pathology+image+analysis.">QuPath: Open source software for digital pathology image analysis.</a> Scientific Reports. 7 (1), 16878 (2017).</li><li>Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+immunohistochemistry,+imaging,+and+quantitation:+a+review,+with+an+assessment+of+Tyramide+signal+amplification,+multispectral+imaging+and+multiplex+analysis.">Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis.</a> Methods. 70 (1), 46-58 (2014).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+4,+Experimental+Pathology+Techniques+of+Respiratory+System.">Chapter 4, Experimental Pathology Techniques of Respiratory System.</a> Atlas of Experimental Pathology Techniques. , 125-126 (2012).</li><li>Wilson, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+and+opportunities+in+the+statistical+analysis+of+multiplex+immunofluorescence+data.">Challenges and opportunities in the statistical analysis of multiplex immunofluorescence data.</a> Cancers. 13 (12), 3031 (2021).</li><li>Mori, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+tumor+immune+microenvironment+with+Tyramide-based+multiplex+immunofluorescence.">Characterizing the tumor immune microenvironment with Tyramide-based multiplex immunofluorescence.</a> Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 25 (4), 417-432 (2020).</li><li>Mansfield, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+context+in+epigenetics:+quantitative+multicolor+imaging+and+automated+per-cell+analysis+of+miRNAs+and+their+putative+targets.">Cellular context in epigenetics: quantitative multicolor imaging and automated per-cell analysis of miRNAs and their putative targets.</a> Methods. 52 (4), 271-280 (2010).</li></ol>

Tüm yazarlar herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan eder.

mIHC, tek bir doku kesitinde tek hücre düzeyinde çoklu protein belirteçlerinin kantitatif ve mekansal analizi için bilimsel araştırma alanında vazgeçilmez bir deneysel tekniktir ve orijinal doku bağlamında ayrıntılı doku yapısına ve hücresel etkileşimlere odaklanarak hastalık patolojisinin incelenmesi için sezgisel ve doğru veriler sağlar. mIHC teknolojisinin yaygın olarak benimsenmesi, optimize edilmiş ve etkili deneysel protokoller gerektirecektir. Deneylerde ortaya çıkabilecek sorunları ele ...

20 yılı aşkın bir geçmişe sahip olan tiramin sinyal amplifikasyonu (TSA), hedef antijenlerin yüksek yoğunluklu in situ etiketlemesi için yaban turpu peroksidaz (HRP) kullanan bir test teknikleri sınıfıdır ve enzime bağlı immünosorbent testlerinde (ELISA'lar), in situ hibridizasyon (ISH), immünohistokimya (IHC) ve biyolojik antijenlerin saptanması için diğer tekniklerde yaygın olarak uygulanır. algılanan sinyalin hassasiyetini önemli ölçüde artırmak1. TSA teknolojisine dayalı opal polikromatik boyama yakın zamanda geliştirilmiş ve çeşitli çalışmalarda yaygın olarak kullanılmıştır2,3,4,5. Geleneksel immünofloresan (IF) boyama, araştırmacılara çeşitli model organizmaların hücre ve dokularındaki protein dağılımının tespiti ve karşılaştırılması için kolay bir araç sağlar. Antikor/antijene özgü bağlanmaya dayanır ve doğrudan ve dolaylı yaklaşımları içerir6. Doğrudan immün boyama, bir floresan mikroskobu kullanılarak doğrudan floresan tespitini sağlayan, ilgilenilen antijene karşı florofor konjuge primer antikorun kullanılmasını içerir. Dolaylı immün boyama yaklaşımı, konjuge olmayan primer antikora karşı floroforla konjuge sekonder antikorunuygulanmasını içerir 6,7.
Geleneksel, tek etiketli, immünofloresan boyama yöntemleri, dokularda yalnızca bir, iki veya bazı durumlarda üç antijeni boyayabilir, bu da doku kesitlerinde bulunan zengin bilgilerin madenciliğinde önemli bir sınırlamadır. Kantitatif sonuçların yorumlanması genellikle görsel gözleme ve ImageJ gibi görüntüleme yazılımlarıyla doğru nicelemeye bağlıdır. Antikor tür kısıtlaması, zayıf floresan etiket sinyalleri ve floresan boya rengi örtüşmesi gibi teknik sınırlamalar vardır (Tablo 1). Opal multipleks IHC (mIHC) tekniği, primer antikorun orijini üzerinde herhangi bir kısıtlama olmaksızın, aynı doku kesitinde 7-9'dan fazla antijenin multipleks boyanmasına ve diferansiyel etiketlenmesine izin veren, ancak antijene karşı karşılık gelen antikorun yüksek özgüllüğünü gerektiren TSA türevine dayanır. Boyama prosedürü, iki fark dışında normal immünofloresan boyamaya benzer: her boyama turu sadece bir antikorun kullanımını içerir ve bir antikor elüsyon adımı eklenir. Antijene kovalent olmayan bağlarla bağlanan antikorlar, mikrodalga elüsyonu ile uzaklaştırılabilir, ancak antijenin yüzeyine kovalent bağlarla bağlanan TSA floresan sinyali korunur.
Boya ile etiketlenmiş aktif tiramin (T) molekülleri, hedef antijende yüksek oranda zenginleştirilir ve floresan sinyalinin verimli bir şekilde amplifikasyonuna izin verir. Bu, antikor müdahalesi olmadan antijenin doğrudan etiketlenmesine izin verir ve daha sonra çoklu boyama döngülerindensonra çok renkli etiketleme elde edilebilir 8,9,10 (Şekil 1). Bu teknoloji, hastalığın incelenmesi için güvenilir ve doğru görüntüler üretse de, yararlı bir multipleks floresan immünohistokimya (mfIHC) boyama stratejisinin oluşturulması, kapsamlı optimizasyon ve tasarım ihtiyacı nedeniyle zaman alıcı ve titiz olabilir. Bu nedenle, bu multipleks panel protokolü, manuel protokolden daha kısa boyama süresine sahip otomatik bir IHC boyayıcıda optimize edilmiştir. Bu yaklaşım, insan formalinle sabitlenmiş ve parafine gömülü (FFPE) doku örnekleri üzerinde immüno-onkoloji çalışmaları için herhangi bir araştırmacı tarafından doğrudan uygulanabilir ve uyarlanabilir11. Ayrıca, slayt hazırlama, antikor optimizasyonu ve multipleks tasarım yöntemleri, yerinde doğru hücresel etkileşimleri temsil eden sağlam görüntülerin elde edilmesinde ve manuel analiz için optimizasyon süresinin kısaltılmasında yardımcı olacaktır12.
mfIHC temel olarak görüntü toplama ve veri analizini içerir. Görüntü elde etme açısından, çeşitli karışık renk sinyallerini tanımlamak ve doku otofloresansından etkilenmeden yüksek sinyal-gürültü görüntüleri elde etmek için çok renkli etiketli karmaşık lekeli numunelerin profesyonel spektral görüntüleme ekipmanı ile tespit edilmesi gerekir. Spektral görüntüleme için mevcut ekipman esas olarak spektral konfokal mikroskopları ve multispektral doku görüntüleme sistemlerini içerir. Multispektral doku görüntüleme sistemi, doku kesitlerinin kantitatif analizi için tasarlanmış profesyonel bir görüntüleme sistemidir ve en önemli özelliği, biyolojik doku örneklerinin hem morfolojik yapısını hem de optik haritalama bilgilerini sağlayan görüntü spektral bilgilerinin elde edilmesidir13,14. Spektral görüntüdeki herhangi bir piksel, tam bir spektral eğri içerir ve her boya (otofloresan dahil), karışık ve üst üste binen çok etiketli sinyallerin tam olarak kaydedilmesini ve doğru bir şekilde tanımlanmasını sağlayan karşılık gelen karakteristik spektruma sahiptir.
Veri analizi açısından, çok renkli etiketli numuneler, doku numunelerinin morfolojik yapısı ve kurucu hücreleri nedeniyle son derece karmaşıktır. Sıradan yazılımlar farklı doku tiplerini otomatik olarak tanımlayamaz. Bu nedenle, belirli bölgelerdeki antijen ekspresyonunun kantitatif analizi için akıllı kantitatif doku analiz yazılımıkullanılır 15,16,17,18.
Her şeyden önce, multispektral görüntüleme ve kantitatif patoloji analiz teknolojisi ile kaynaştırılmış çok etiketli immünofloresan boyama, çok sayıda tespit hedefi, etkili boyama ve doğru analiz avantajlarına sahiptir ve bu nedenle histomorfolojik analizin doğruluğunu önemli ölçüde artırabilir, hücresel düzeyde çözünürlüğe sahip proteinler arasındaki uzamsal ilişkiyi ortaya çıkarabilir ve doku kesiti örneklerinden daha zengin ve daha güvenilir bilgilerin çıkarılmasına yardımcı olabilir19 (Tablo 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD8</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab237709</td>
			<td>Primary antibody, 1/100, PH9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD68</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab955</td>
			<td>Primary antibody, 1/300, PH9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CK5/6</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB1620</td>
			<td>Primary antibody, 1/150, PH9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-HMGCS1</td>
			<td>GeneTex</td>
			<td>GTX112346</td>
			<td>Primary antibody, 1/300, PH6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal nonimmune serum</td>
			<td>MXB Biotechnologies</td>
			<td>SP KIT-B3</td>
			<td>Antigen blocking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluormount-G</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td>Anti-fluorescent burst</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal PolarisTM 7-Color Manual IHC Kit</td>
			<td>Akoya</td>
			<td>NEL861001KT</td>
			<td>Opal mIHC Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash Buffer</td>
			<td>Dako</td>
			<td>K8000/K8002/K8007/K8023</td>
			<td>Washing the tissues slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HALO</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>intelligent quantitative tissue analysis software, paid software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inForm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>intelligent quantitative tissue analysis software, paid software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerkinElmer Vectra</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>multispectral tissue imaging systems, fully automatic scanning of tissue slides.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuPath 0.3.2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>intelligent quantitative tissue analysis software, open source software, used in this experiment.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multiplex immunohistochemistry staining for paraffin-embedded lung cancer tissue

Akciğer kanseri, tüm dünyada malign tümöre bağlı morbidite ve mortalitenin önde gelen nedenidir ve kompleks tümör mikroçevresi, akciğer kanseri hastalarında önde gelen ölüm nedeni olarak kabul edilmektedir. Tümör mikroçevresinin karmaşıklığı, tümör dokularındaki hücreden hücreye ilişkileri anlamak için etkili yöntemler gerektirir. Multipleks immünohistokimya (mIHC) tekniği, tümör dokularındaki sinyal yolaklarının yukarı ve aşağı akışındaki proteinlerin ekspresyonu arasındaki ilişkiyi anlamak ve klinik tanı ve tedavi planları geliştirmek için önemli bir araç haline gelmiştir. mIHC, farklı protein ortak ekspresyonu ve birlikte lokalizasyon analizi elde etmek için aynı doku kesiti numunesi üzerinde birden fazla hedef molekülü aynı anda tespit edebilen Tiramin Sinyal Amplifikasyonu (TSA) teknolojisine dayanan çok etiketli bir immünofloresan boyama yöntemidir. Bu deneysel protokolde, klinik kökenli akciğer skuamöz karsinomunun parafine gömülü doku kesitleri multipleks immünohistokimyasal boyamaya tabi tutuldu. Deneysel protokolü optimize ederek, etiketli hedef hücrelerin ve proteinlerin multipleks immünohistokimyasal boyanması sağlandı ve akciğer dokularında otofloresan ve kanal karışması sorunu çözüldü. Ek olarak, multipleks immünohistokimyasal boyama, tek hücreli dizileme, proteomik ve doku boşluğu dizilemesi dahil olmak üzere tümörle ilgili, yüksek verimli dizilemenin deneysel olarak doğrulanmasında yaygın olarak kullanılır ve sezgisel ve görsel patoloji doğrulama sonuçları sağlar.

Tyramine signal amplification (TSA), which has a history of more than 20 years, is a class of assay techniques that use horseradish peroxidase (HRP) for high-density in situ labeling of target antigens and is widely applied in enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs), in situ hybridization (ISH), immunohistochemistry (IHC), and other techniques for the detection of biological antigens, substantially improving the sensitivity of the detected signal1. Opal polychromatic staining based on TSA technology has been recently developed and widely used in several studies2,3,4,5. Traditional immunofluorescence (IF) staining provides researchers with an easy tool for the detection and comparison of the distribution of proteins in the cells and tissues of various model organisms. It is based on antibody-/antigen-specific binding and includes direct and indirect approaches6. Direct immunostaining involves the use of a fluorophore-conjugated primary antibody against the antigen of interest, which enables direct fluorescent detection using a fluorescence microscope. The indirect immunostaining approach involves the application of a fluorophore-conjugated secondary antibody against the unconjugated primary antibody6,7.
Traditional, single-label, immunofluorescence staining methods can stain only one, two, or in some cases, three antigens in tissues, which is a major limitation in mining the rich information contained in tissue sections. The interpretation of quantitative results often depends on visual observation and accurate quantification by imaging software, such as ImageJ. There are technical limitations, such as antibody species restriction, weak fluorescent label signals, and fluorescent dye color overlap (Table 1). The Opal multiplex IHC (mIHC) technique is based on TSA derivation, which allows multiplex staining and differential labeling of more than 7-9 antigens on the same tissue section, with no restriction on the origin of the primary antibody, but requires high specificity of the corresponding antibody against the antigen. The staining procedure is similar to that of normal immunofluorescence staining, except for two differences: each round of staining involves the use of only one antibody and an antibody elution step is added. Antibodies bound to the antigen by noncovalent bonds can be removed by microwave elution, but the TSA fluorescent signal bound to the surface of the antigen by covalent bonds is retained.
Activated tyramine (T) molecules labeled with the dye are highly enriched at the target antigen, allowing efficient amplification of the fluorescent signal. This allows direct labeling of the antigen without antibody interference, and then multicolor labeling can be achieved after multiple staining cycles8,9,10 (Figure 1). Although this technology produces reliable and accurate images for the study of disease, the creation of a useful multiplex fluorescent immunohistochemistry (mfIHC) staining strategy can be time-consuming and exacting due to the need for extensive optimization and design. Therefore, this multiplex panel protocol has been optimized in an automated IHC stainer with a shorter staining time than that of the manual protocol. This approach can be directly applied and adapted by any researcher for immuno-oncology studies on human formalin-fixed and paraffin-embedded (FFPE) tissue samples11. Moreover, the methods for slide preparation, antibody optimization, and multiplex design will be helpful in obtaining robust images that represent accurate cellular interactions in situ and to shorten the optimization period for manual analysis12.
The mfIHC mainly includes image acquisition and data analysis. In terms of image acquisition, multicolor-labeled complex-stained samples need to be detected with professional spectral imaging equipment to identify the various mixed color signals and obtain high signal-to-noise images without interference from tissue autofluorescence. Current equipment for spectral imaging mainly includes spectral confocal microscopes and multispectral tissue imaging systems. The multispectral tissue imaging system is a professional imaging system designed for the quantitative analysis of tissue sections, and its most important feature is the acquisition of image spectral information, which provides both morphological structure and optical mapping information of biological tissue samples13,14. Any pixel in the spectral image contains a complete spectral curve, and each dye (including autofluorescence) has its corresponding characteristic spectrum, which enables the complete recording and accurate identification of mixed and overlapping multilabel signals.
In terms of data analysis, multicolor-labeled samples are extremely complex due to the morphological structure and constituent cells of the tissue samples. Ordinary software cannot automatically identify different tissue types. Hence, intelligent quantitative tissue analysis software is used for quantitative analysis of antigen expression in specific regions15,16,17,18.
Above all, multilabel immunofluorescence staining fused with multispectral imaging and quantitative pathology analysis technology has the advantages of a large number of detection targets, effective staining, and accurate analysis, and it can therefore significantly improve the accuracy of histomorphological analysis, reveal the spatial relationship between proteins with cellular-level resolution, and help to mine richer and more reliable information from tissue section samples19 (Table 1).

Yazar Spotlight: Akciğer Karsinomu Örneğinde Çok Renkli Floresan Lokalizasyonunun Geliştirilmesi

Parafine Gömülü Akciğer Kanseri Dokusu için Multipleks İmmünohistokimya Boyama

Our research focused on optimizing the mIHC protocol on paraffin section obtained from clinic sources. We aimed to effectively address autofluorescence and autofluorescence channel crosstalk issues in lung tissue. The current experimental challenges we are facing involve addressing the issues of autofluorescence and channel crosstalk in lung tissue, whereby achieving successful multicolor fluorescence localization they need for labeled target cells and proteins.Our highly efficient multiple antigen in situ labeling method, which requires less than three hours per antibody, seamlessly integrates a multispectral imaging system and a specialized pathology software. This optimized mIHC protocol is easily adaptable for use in other research laboratories.

CD8 primer antikoru ve floroforların eşleşme şemasını optimize ettik. Her iki floresan sonucu seti, antikor uyumlu florofordaki değişiklik dışında, deney grubundaki tam olarak aynı antikor inkübasyon koşullarına karşılık geldi. Şekil 2'de gösterildiği gibi, CD8+ T hücrelerinin florofor 480 ve florofor 690 ile kanal eşleşmesinde önemli bir fark vardı. Florofor 690 içeren kanal son derece güçlü bir floresan arka plan gösterir - sarı daire içindeki geniş kırm?...

Watch this Scientific Journal Video about Multiplex Immunohistochemistry Staining for Paraffin-embedded Lung Cancer Tissue at JoVE.com

Bu deneysel protokol, esas olarak tek kanallı antikor inkübasyon koşullarını optimize ederek ve klinik kökenli akciğer kanseri dokularında otofloresan ve kanal karışma problemlerini çözmek için antikorların ve kanalların ayarlarını ayarlayarak bir multipleks immünohistokimya (IHC) boyama yöntemini tanımlar ve optimize eder.

Lung cancer is the leading cause of malignant tumor-related morbidity and mortality all over the world, and the complex tumor microenvironment has been ...

Araştırmamız, klinik kaynaklardan elde edilen parafin kesitinde mIHC protokolünü optimize etmeye odaklandı. Akciğer dokusunda otofloresan ve otofloresan kanal karışma sorunlarını etkili bir şekilde ele almayı amaçladık. Karşılaştığımız mevcut deneysel zorluklar, akciğer dokusunda otofloresan ve kanal karışması konularını ele almayı içerir, böylece etiketli hedef hücreler ve proteinler için ihtiyaç duydukları başarılı çok renkli floresan lokalizasyonu elde edilir.Antikor başına üç saatten az zaman gerektiren yüksek verimli çoklu antijen yerinde etiketleme yöntemimiz, bir multispektral görüntüleme sistemini ve özel bir patoloji yazılımını sorunsuz bir şekilde entegre eder. Bu optimize edilmiş mIHC protokolü, diğer araştırma laboratuvarlarında kullanım için kolayca uyarlanabilir.

multiplex-immunohistochemistry-staining-for-paraffin-embedded-lung

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Multiplex Immunohistochemistry Staining for Paraffin-embedded Lung Cancer Tissue

1.2K Görüntüleme.  Sichuan University. Araştırmamız, klinik kaynaklardan elde edilen parafin kesitinde mIHC protokolünü optimize etmeye odaklandı. Akciğer dokusunda otofloresan ve otofloresan kanal karışma sorunlarını etkili bir şekilde ele almayı amaçladık. Karşılaştığımız mevcut deneysel zorluklar, akciğer dokusunda otofloresan ve kanal karışması konularını ele almayı içerir, böylece etiketli hedef hücreler ve proteinler için ihtiyaç duydukları başarılı çok renkli floresan lokalizasyonu eld...

Video: Yazar Spotlight: Akciğer Karsinomu Örneğinde Çok Renkli Floresan Lokalizasyonunun Geliştirilmesi

Lung cancer is the leading cause of malignant tumor-related morbidity and mortality all over the world, and the complex tumor microenvironment has been considered the leading cause of death in lung cancer patients. The complexity of the tumor microenvironment requires effective methods to understand cell-to-cell relationships in tumor tissues. The multiplex immunohistochemistry (mIHC) technique has become a key tool for inferring the relationship between the expression of proteins upstream and downstream of signaling pathways in tumor tissues and developing clinical diagnoses and treatment plans. mIHC is a multi-label immunofluorescence staining method based on Tyramine Signal Amplification (TSA) technology, which can simultaneously detect multiple target molecules on the same tissue section sample to achieve different protein co-expression and co-localization analysis. In this experimental protocol, paraffin-embedded tissue sections of lung squamous carcinoma of clinical origin were subjected to multiplex immunohistochemical staining. By optimizing the experimental protocol, multiplex immunohistochemical staining of labeled target cells and proteins was achieved, solving the problem of autofluorescence and channel crosstalk in lung tissues. In addition, multiplex immunohistochemical staining is widely used in the experimental validation of tumor-related, high-throughput sequencing, including single-cell sequencing, proteomics, and tissue space sequencing, providing intuitive and visual pathology validation results.

This experimental protocol describes and optimizes a multiplex immunohistochemistry (IHC) staining method, mainly by optimizing single-channel antibody incubation conditions and adjusting the settings of antibodies and channels to solve the problems of autofluorescence and channel crosstalk in lung cancer tissues of clinical origin.

Kanser Araştırmaları

Optimizing Multiplex Immunohistochemistry (mIHC) Staining for Lung Cancer Tissue Samples to Address Autofluorescence Issues

To begin, obtain previously prepared formula and fixed and paraffin embedded lung cancer tissue sample slide. Incubate it at 65 degrees Celsius for five minutes. Perform dehydration by immersing the slide in xylene, followed by ethanol solutions of decreasing concentrations.Then immerse the slides in sterilized water three times for one minute each. For antigen retrieval, place the slide in a staining and repair box. Fill it with immunohistochemical antigen repair buffer working solution of pH six or nine.Cover the box with a lid, and heat it in a microwave oven for eight minutes at 100%power. Then cool the slide to room temperature. Cover the tissue with a blocking solution, and then incubate in a humidified chamber at room temperature for 10 minutes.After removing the blocking solution, cover the slide with the primary antibody working solution, and place it in a humidified chamber. Then incubate this chamber for one hour at 37 degrees Celsius. Next, wash the slide with wash buffer working solution for two minutes.Add polymer horseradish peroxidase directly dropwise onto the slide, and incubate it for 15 minutes at room temperature. After washing the slide, add fluorophore working solution directly dropwise onto the slide, and incubate it for 10 minutes at room temperature. Once the slide is washed, give microwave treatment as demonstrated previously.When the slide is cooled to room temperature, wash it three times with double distilled water for one minute each. Next, dip the slide in the wash buffer working solution for two minutes, and perform antibody incubation, horseradish peroxidase, and fluorophore addition as demonstrated. For cell nuclear staining, cover the slide with DAPI working solution and incubate it in a humidified chamber for five minutes at room temperature.Then wash the slides with double distilled water three times, one minute each. Remove water droplets from the slide. Add 10 to 20 microliters of anti-fluorescence quencher to the slide, and seal it with a microscope cover glass.

Otofloresan Sorunlarını Ele Almak için Akciğer Kanseri Doku Örnekleri için Multipleks İmmünohistokimya (mIHC) Boyamanın Optimize Edilmesi

Analyzing Fluorescence in Lung Cancer Tissue Samples Stained with Optimized Multiplex Immunohistochemistry (mIHC) Technique

To begin, obtain previously prepared stained lung cancer tissue sample slides. For automatic scanning of the stained slides, manually set the exposure time and scanning program for each fluorescence channel. Drag the multicolor fluorescence image file obtained from the original scan into the software and set the image type to fluorescence.Click the brightness and contrast button and check the channels on the panel. Click outside and then on the channel to select the fluorescence channel of interest. Drag the minimum display and maximum display to adjust the brightness and contrast of each channel.Once the view to be saved is determined, click on show slide overview and show cursor location to remove these two contents and keep the scale bar. Click file followed by export snapshot and current viewer content To export a PNG file. The non-small cell lung squamous carcinoma tissues showed that macrophages and CD eight positive T-cells significantly infiltrated around and within carcinoma foci.HMGCS1 protein exhibited widespread expression in squamous carcinoma cell plasma.