MRC-LMB kristalizasyon tesis tür tıbbi araştırma Konseyi (İngiltere) tarafından desteklenmektedir. Üyeleri LMB desteklerinden dolayı teşekkür ediyoruz: Olga Perisic (PNAC), Tony Warne, Fusinita Van den KBB ve Pat Edwards (yapısal çalışmalar), Steve Scotcher ve diğer üyeleri mekanik atölye, Neil Grant ve Jo Westmoreland (görsel), Paul Hart ve Tom Pratt (BT). Biz de Steve Elliot (Tecan, Birleşik Krallık), Mitchell Stuart ve Heather Ringrose (Hamilton Robotik, İngiltere), Paul Thaw, Robert Lewis ve Joby Jenkins (TTP Labtech, UK), Paul Reardon (Swissci AG, İsviçre), George Stephens ve Donald Ogg (Alphabiotech, teşekkür etmek istiyorum Birleşik Krallık), Neil Williams (kurulmus Imaje, İngiltere) ve Graham Harris (Cleveland Ajansı) teknik yardım için.

1. iki tam otomatik sistemleri (başlangıç tarama)
<ol><li>
Sistem 1: 72 96-şey kristalizasyon plakaların hazırlık setleri (LMB plakaları) eleme ile dolu
	<ol>
<li>Yordamı gerçekleştirmeden önce sistemin robotlar başlatılır ve kendi kontrol eden yazılım açık olduğundan emin olun. Tüp soğutma taşıyıcı soğutucu üzerinde yaklaşık 30 dakika ana program başlamadan açın.</li>
		<li>Bir testi plaka plaka mühürleyen motorlu SBS taşıyıcı yerleştirin. Plaka mühürleyen çalıştırın ve film düzgün uygulandığını onaylayın. Plaka mühürleyen hazır olduğunu doğrulamak için bu testi iki kez daha tekrarlayın.</li>
		<li>Daha sonra 20 litre deiyonize su sıvı işleyicisi ana konteyner için ekleyin. Kaplin ekler küçük kapsayıcıdan (% 20 etanol durulama çözüm) kesmek ve ekler için ana kapsayıcı bağlanın.</li>
		<li>Uygun ekran adını (Tablo 1) mürekkep püskürtmeli yazıcı dokunmatik ekranda girin. O zaman, açın ve carousel döndürmeyi tetiklemek için carousel kapıyı kapat. Kapıyı açık ne zaman ilk yığın kendini göstermektedir.</li>
		<li>Tam 22 kristalizasyon levha, her biri 1 sütun bakan ilk yığınıyla yük dışarı. Tam olarak aynı şekilde sonraki iki yığınları yükleyin.</li>
		<li>Kalan 6 plakaları dördüncü yığın en yüksek konumlarda yükleyin. O zaman, atlıkarınca kapıyı kapat.</li>
		<li>Chiller görüntü 14 ° C. bulunduğunu doğrulayın Yavaşça ve sürekli olarak seçilen tarama kitleri için 1 dakika tersine çevirin. Sonra ön panelindeki sıvı işleyicisi açın.</li>
		<li>Tüpler açın ve standart 96-şey düzen (A1, A2, vb) göre soğutma taşıyıcıya yerleştirin. Her tüpün içinde taşıyıcı üzerine yerleştirerek, kapağı aynı 96-şey düzen bir tepsiye yerleştirin.</li>
		<li>Çapraz kontrol tüp konumlandırır ve tüm tüpler düzeyi ve taşıyıcı olarak yerleşmiş emin olun. Sonra ön paneli kapatın.</li>
		<li>'Başlangıç' penceresinde sıvı işleyicisi yazılım 'Çalıştır bakım' seçin ve reçeteye göre sarf programı açın. % 20 etanol sistemden temizlemek için ve sıvı dağıtımı ipuçları outsides yıkamak için çalıştırın.</li>
		<li>Kızarma tamamlandığında, '' Başlangıç' dönmek için İptal' i tıklatın. 'Varolan bir işlemi çalıştırmak' seçip 'seçiminizi Başlat' düğmesini tıklatın. 'MRC seti dağıtımı' programını açın. 'Örnekleri' yapılandırma ekran ve programı çalıştırmak için '18' doldurun.</li>
		<li>İlk dört tabak etiketli, dolu mühürlü ve sistem izlemeniz.</li>
		<li>Bir kez tüm 72 plakaları hazırlanan ve carousel geri yerleştirilir, kaplin ekler ana kapsayıcıdan küçük kapsayıcıya geçin. 'Kadar floş Başlat' programını çalıştırın (bkz. Adım 1.1.10).</li>
		<li>Chiller açmak ve boş atmak kiti tüpler eleme. Dikkatli bir şekilde 72 hazırlanan tabak atlıkarınca çıkarın. Yanlış dolu veya kötü mühürlü plakalar atmak. Kullanıma hazır plakaları 10 ° C'de depolayın</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sistem 2: 20 LMB tabak içinde tek bir örnekten kristalizasyon damlacıkları kadar (100 nL protein + 100 nL condition) ayarlama
	<ol>
<li>İlk olarak, sistemin robotlardır yazılımının açık nanoliter dağıtıcısı başlatılır ve sıvı işleyicinin yöntemi Yöneticisi açık olduğundan emin olun. Microtube soğutma taşıyıcı ana program başlamadan 15 dakika kadar çevirin.</li>
		<li>Bir testi plaka plaka mühürleyen motorlu SBS taşıyıcı yerleştirin. Plaka mühürleyen çalıştırın ve plaka düzgün mühürlü doğrulayın. Plaka mühürleyen test üç kere.</li>
		<li>Daha sonra test çözüm damlacıkları 100-nL bir testi plaka ayarlamak için nanoliter dağıtıcı çalıştırın. Mikroskop altında damlacıkları doğru şekilde ayarlandığını denetleyin. Nanoliter dağıtıcı yazılım kapatın ve şerit-sahibi blok güverteden kaldır.</li>
		<li>Ardından, özel tasarlanmış plaka tutucu Ekle ( Temsilcisi sonuçlarıgörmek: kristalizasyon geliştirdiler LMB adlı) kendi koşulları (Tablo 1) geçici reaktifler en yüksek göreli miktarı LMB plakalı. Yapıştırıcı film plaka kaldırın.</li>
		<li>Sıvı işleyicisi ön panel açmak ve ilk sürgülü taşıyıcı arka güvertede mühürsüz tabak yerleştirin (taşıyıcıları kayma çıkardı kolay erişim için).</li>
		<li>Plaka bir SBS alüminyum kapaklı kapağı. Taşıyıcı arka sol köşesine doğru kapak kapak karşı köşeye hafif basınç uygulayarak yerleşmek.</li>
		<li>PIN'i, sürgülü taşıyıcıları yük ve kalan 19 çalışma üzerinden en az uçucu koşulları için aynı şekilde kuruyucu. Microtube soğutma taşıyıcı bir yeşil ışık tarafından belirtildiği şekilde 4 ° C'de olduğunda, onun kapağını çıkarın.</li>
		<li>Protein örneği (Tablo 2) (en az) 440 µL içeren bir microtube kapağı kesti. Bu sıvı algılama sistemi ile müdahale edecek gibi örnek köpüksüz Menisküs, yukarıda olduğundan emin olun. Tüp pozisyon 1. microtube-soğutma taşıyıcı yerleştirin.</li>
		<li>Plaka Taşıma bağdaştırıcısı taşıyıcı önünde sıvı işleyicisi güvertede bir PCR tabak koyun. Sonra ön paneli kapatın.</li>
		<li>Güverte yükledikten sonra nanoliter dağıtıcı güverte şerit-tutucu bloğunu açıktır ve 50 µL ipucu yığınlarının arkasında taşıyıcıları alüminyum SBS kapakları açık olun.</li>
		<li>Sıvı işleyicisi 'Yöntemi Yönetimi' arabirimi 'tabak kurulum' seçin. Her iki sistemin başlatma izlemek ve çalışma parametreleri doldurmak. Yöntemi yönetim arabirimi (istemleri, rakamlar ve hazırlık ile yardımcı bir ipucu-yönetim sistemi) yönergeleri izleyin.</li>
		<li>Tüm bileşenlerin hazır ve o zaman başlamak belgili tanımlık oluşum gerekli bir kez daha denetleyin.</li>
		<li>Nanoliter dağıtıcı damla ilk plaka ve plaka mühürleyen daha sonra ayarlar gibi Sistem İzleyicisi plaka mühürler.</li>
		<li>Bir kez tüm 20 plakaları kristalizasyon damlacıkları ile hazırlanan ve otomatik olarak kayar taşıyıcılara iade, ön panel açmak ve yavaşça plakayı çıkarın. Kristalizasyon için depolamadan önce tabakları düzgün mühürlü kontrol edin.</li>
		<li>% 20 etanol çözüm SBS kapaklı depolama sıvı işleyicisinin sol taraftaki istifleme önce temiz. PCR plaka ve microtube atın.</li>
		<li>Microtube soğutma taşıyıcı açmak ve uzakta yoğunlaşma silin. Bir kağıt havlu daha fazla yoğunlaşma emmek için soğutucu yüzeyin üstüne bırakın. O zaman, taşıyıcı kapağını ve ön paneli kapatın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. optimizasyon koşulları
<ol><li>
Şırınga bağlı sıvı işleyici: konsantrasyonları kristalizasyon plaka (4-köşe yöntemi) rezervuar içine iki doğrusal gradyanlar üreten.
	<ol>
<li>Öncelikle, sıvı işleyicisi açık ve onun bilgisayar yazılımı açık başlatıldı emin olun.</li>
		<li>'GRADYAN' sekmesi: gerekli program açıkken, kristalizasyon plaka türü ve son hacim rezervuar (Tablo 3) seçin. Gelişmiş ayar 'maksimum çekim vol' için 3000 için 6.000 düşürülmelidir [isopropanol] > %10 v/v ve [MPD] > %20 v içeren çözümler kullanırken / v.
</li>
		<li>Şırınga hazır olun. Bir piston her şırınga (sivri uçlu aşağı) yerleştirin ve şırıngaları arkası robot baş altında belirlenmiş oluklar takabilirsiniz. Bir şırınga (program düzgün bağlı sadece tüm gerekli şırıngaları ile başlar) konumda kilitlemek için saat yönünde çevir.</li>
		<li>Tekneler hazırlayın. Paslanmaz çelik çerçeve çıkarıp tekneler yerleştirin. Soldaki 4 pozisyonlar 4 köşe A, B, C, D. gerekli çözümleri hacimleri her şırınga (üzerinde Tablo 3, 0,5 mL ölü birim görüntülenen birimler eklendi) görüntüleyen 'SET UP' sekmesine geçin karşılık gelir. Köşe çözümler onların anılan sıraya göre tekneler dökün ve çerçeve (çerçeve bulunduğu 2 küçük mıknatıslar güverte ön tarafta bulunan tutar) destenin geri yerleştirin. Zaten güvertede yerleştirildiğinde çözümleri kaplar dökmek için bu adım ile devam etmek için alternatif bir yol değil.
</li>
		<li>Kristalizasyon plaka üzerinde motorlu SBS taşıyıcı yerleştirin.</li>
		<li>'Aspire edin' tıklayın ve bu adımı (pistonlar kadar onların yolda durdu) tamamlanması bekleyin.</li>
		<li>"Çalıştır" sekmesine geçin ve programı çalıştırın.</li>
		<li>Üzerinde ikmal-in program, geri ayarla'yı sekmesine gidin ve 'Kaldır' ı tıklatın: sistem şırıngaları artık çözümlerinden temizler ve sonra pistons kaldırıncaya kadar. 'Tasfiye' istenen 'Yerine Kaldır'; Bu alt konumda aynı şırınga ile daha fazla çözüm Aspire hazır pistons bırakacaktır.
</li>
		<li>Saat yönünün tersine büküm tarafından şırıngaları kaldırmak.</li>
		<li>Şırınga ve tekneler uygun depo gözündeki atın (veya deiyonize su ve daha sonra yeniden kullanmak üzere % 20 v/v etanol çözüm ile yıka).</li>
		<li>Plaka mühür ve yüksek viskoz çözümleri karıştığında Mikroplaka Mikser 3 dk 1000 RPM veya 10 min için üzerine yerleştirin. Plaka kristalizasyon damlacıkları nanoliter dağıtıcı üzerinde oluşturmak için hazırdır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Protokolü (kurma kristalizasyon damlacıkları ile katkı ekran önceden doldurulmuş bir 96-şey kristalizasyon plaka) 1 eleme katkı
	<ol>
<li>İlk olarak, koşul ilk %10 (dk. vol. 15 koşul bir konteyner sıvı işleyicisi ile katkı ekrana gelen transfer ederken mL) artışla reaktifler konsantrasyonları ile hazırlayın.</li>
		<li>Sıvı işleyicisi çalıştırmak hazır olduğundan emin olun. 'Tek bir tabak için ' ekran için katkı maddeleri Ekle programı açın (rezervuar birim girin: '72 µL'). İster, rakamlar ve robot seçimlere göre çalışmaya hazır olduğundan emin ile uç-yönetim sistemi (12 x 1000 µL ipuçları gerekli) yardım.
</li>
		<li>-20 ° C-kuluçka makinesi katkı ekranını ve onun alüminyum mühür hemen (kullanım plaka sahibi) kaldırmak sonra plaka sıvı işleyicisi güvertede yer. (Taşıyıcı ön sol içinde bulunan A1-köşe plaka yerleştirilir) bir dikey düzen göre program çalışır. Aynı zamanda da koşulu ile dolu kap yerleştirin. Programı çalıştırın.</li>
		<li>Plaka rezervuarlar doldurduktan sonra Mikroplaka shaker yerleştirin ve programı çalıştırın. Deiyonize su ve % 20 etanol ile durumu yeniden kullanmak üzere konteyner durulayın.</li>
		<li>
Nanoliter dağıtıcı üzerinde damlacıklar ayarlayın. İlk olarak, kristalizasyon plaka (kullanım plaka sahibi) açıldı. O zaman, plaka ve 8-iyi protein Şerit şerit-sahibi blok ilk pozisyonda yer. Kontrol eden yazılım 'Setup' sekmesinde her bileşen güvertede gerçek konumlarını görüntüler. Her yük ile protein örnek gerekli damla boyutu (Tablo 4) göre şeridinin de. Damlacıkları hazırlamak için programı çalıştırmak.
</li>
		<li>Üzerinde ikmal-in program, plaka güverteden kaldır ve hemen kapatın (plaka mühürleyen, 3-inç geniş yapışkan bant kullanın). Şeridi'nde uygun depo gözü atın.</li>
		<li>Boyut, şekil, değerlendirmek ve depolama önce mikroskop altında damlacıkları merkezleme.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Protokolü (kurma kristalizasyon damlacıkları bir 96-şey kristalizasyon plaka ile yeniden kullanılabilir bir katkı perde) 2 Eleme katkı
	<ol>
<li>İlk, belgili tanımlık katkı perde hazırlamak: 40 dakika oda sıcaklığında erimek için karşılık gelen dondurulmuş 96-şey hücre kültür plaka bırakın. O zaman, 1000 x g 2 min için katkı ekranında santrifüj kapasitesi.</li>
		<li>Koşul (dk. vol. 15 koşul bir konteyner sıvı işleyicisi ile katkı ekrana gelen transfer ederken mL) hazırlayın.</li>
		<li>96-şey kristalizasyon plaka rezervuarlar koşulu ile doldurun. Sıvı işleyicinin, protokolü 1 aynı şekilde devam, 2.2.2 adım ama rezervuar hacmindeki '80 µL' girin.</li>
		<li>Nanoliter dağıtıcı üzerinde damlacıklar (plaka ile birlikte kristalizasyon plaka ve 8-iyi protein Şerit şerit-sahibi blok, Tablo 4ilk pozisyonda katkı ekran içeren) güvertede 3 bileşenleri ile ayarlayın.</li>
		<li>Bir alüminyum levha ile ekran içeren hücre kültür plaka mühür ve -20 ° C kuluçka makinesine koyun.</li>
		<li>Boyut, şekil, değerlendirmek ve depolama önce mikroskop altında damlacıkları merkezleme.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Aşağıdaki öğeler LifeArc commercializes bu yana biz bu vesile ile çakışan bir ticari faiz devlet: 96 - 48-iyi ve MRC tabaklar, MRC asılı damla mühür, MORPHEUS, Pi, ANGSTROM ve LMB kristalizasyon ekranlar.

1 - hazırlık ve ilk ekranlar levha depolanan kullanımı
Kitleri eleme ışık yağış veya faz ayrımı depolama sırasında bazı tüplerde oluştuğundan kalıplara önce reçete karışık. Ne zaman bir ekran iki kitleri (2 x 48 tüpler) oluşur, ikinci seti ilk tüp soğutma taşıyıcı E1 konumda yer alır. Ne zaman bir ekran 4 setleri (4 x 24 tüpler) oluşur, ikinci seti ilk tüp C1 konumda yerleştirilir, üçüncü seti ilk tüp E1 konuma yerleştirilir ve dördüncü seti ilk tüp G1 konuma yerleştirilir. Tüpler soğutma onların taşıyıcıya eklerken, kapakları standart 96-şey yatay düzen takip bir tepsiye yerleştirilir. Bu yana iyi numaraları üzerine kapakları üreticileri tarafından belirtilir, tüm tüpler doğru sırada verildiğinde bu çapraz kontrol sağlar. Bu da tabak azaltılmış bir dizi doldururken tüpler üzerinde doğru kapakları yerine yardımcı olur.
Önceden doldurulmuş plakaları 10 ° c, donma ve depolama koşulları ve sorunları bozulma ile sızdırmazlık neden olabilir 4 ° C'de önlemek için bir uzlaşma saklıyoruz. Plakalar için depolanır normalde fark yoğunlaşmasız iç yüzünde, mühür ile birkaç ay kadar. LMB05, LMB06, LMB09 ve LMB10 plakalar için bunlar geçici reaktifler (Tablo 1) nispeten yüksek konsantrasyonları ile koşulları içeren daha az gerçek bu. Yoğunlaşma az miktarda mühür iç tarafında bulunan mühürleme verimliliği azaltır ve Çapraz bulaşma wells plakaları getirdiğin süre arasında neden olabilir. İlk Isınma sırasında yoğunlaşma önlenmesi ile yardımcı olmak için tabak ilk 4 ° C soğuk odada gecede depolanan atlıkarınca yalıtılmış bir piknik soğutucusu içine aktarılabilir. Çok yavaş soğutma mühürlü kuyu içindeki sıcaklık degradelerin gelişimi en aza indirir ve dolayısıyla yoğunlaşma azaltır genel15. Buna ek olarak, sonra plakaları 10 ° C kuluçka makinesine saklanır, bir kurum içi özel SBS polistren kapak plaka (gösterilmez) her yığının en üstüne yerleştirilir.
Bizim önceden doldurulmuş plakaları kümesinin tamamını bir roman, suda çözünen, protein örnek karşı büyük bir başlangıç ekranı olarak kullanılabilir. Alternatif olarak, daha az sayıda tabak belirli gereksinimlerini karşılamak için seçilmiş olabilir. Örneğin, LMB15 ve LMB19 özellikle membran protein örnekleri26,27için formüle ekranlar ya da LMB20 bu ağır-atomlar ile deneysel kırınım veri28 ' aşamalı kolaylaştırmak için formüle ekran (Ayrıca bkz: : <a href="https://www.youtube.com/watch?v=Gpb4SypWnQY&t=11s">MORPHEUS protein kristalizasyon ekranlar formülasyonu</a>).
2. kristalizasyon damlacıkları kurma
Sistem 2 kullanırken, kitleri ile önemli miktarda geçici reaktifler eleme ilk işlenip. Bu kapak işleme ve plaka sızdırmazlık etkileyecek SBS kapakları lastik üzerinde kalıplama yoğunlaşma önler. Bir SBS kapak izni onlar başlangıçta uyumlu hale getirilmesi gerekir neden olan bir tabak zaman, üst kısmında biraz vardır (bkz: iletişim kuralı, adım 1.2.6). Protein ölü cilt PCR plaka kuyu olarak nispeten cömert (0.8 µL, Tablo 2bkz: efsanesi) vardır. Eşit cömert ölü birimleri ne zaman nanoliter dağıtıcısı kullanarak tek tek 8-şey şeritler (Tablo 4) protein ile istihdam edilmektedir olduğunu unutmayın. Daha küçük ölü birimleri çalışabilir, ancak bazı örnekler ipuçları için uygun, kalibrasyon bir robot-ebilmek var olmak biraz tutarsız, odanın her zamanki gibi vbdaha sıcak olabilir. Tüm yaklaşım pekiştirmek için cömert ölü birimler tarafından örtülü örnek zararlara neden.
Son gelişmeler, daha fazla deney minyatür etkin ve dolayısıyla kristalizasyon koşulları eleme için gerekli örnek hacmi önemli ölçüde karşılık gelen teknoloji29,30 entegre ederek azalır . Ancak, bazı yönlerini daha da minyatür damlacıkları31 buharlaşma ve microcrystals32manipülasyon gibi dikkatli bir değerlendirme gerekir.
Son olarak, plaka (2000 rpm, 1dk) Santrifüjü rutin son bir adım olarak kristalizasyon damlacıkları (içinde küresel üst-wells) ayarlarken entegre olabilir. Daha tutarlı bir boyutu ve şekli Santrifüjü kaynaklanan damlacıkları tekrarlanabilirlik sorunları33,34azaltabilir. Kesinlikle, ortalanmış damla olarak gerekli odak uzaklığı arasında tüm plaka benzer olacak bir mikroskop kullanarak deneyler daha sonra değerlendirilmesi kolay olmayacaktır.
3. 4-köşe yönteminin avantajları
4-köşe yöntemin en önemli avantajı hataları en aza indirir ve basit otomatik protokolleri kolaylaştırır, basitliğidir. Örneğin, 4 köşe çözümler her zaman aynı düzen takip bir sıvı işleyicisi güvertede yer alacak. Ayrıca, tüm programları çözüm (şekil 3 c) arasında sabit oranlar temel alır. 4 köşe çözümleri el ile hazırlık çözümleri çok viskoz olabilen yüksek konsantrasyonlarda otomatik işleme için tercih edilir. Aspirasyon dağıtımı/nispeten hızlı ve doğru sonra üzerinde en tip-in sıvı işleyicileri sıvı sınıfların en iyi duruma getirme için en düşük gereksinimleri ile mümkündür. Yine de, bazı köşe çözümler hala çok yapışkan bir sıvı-verimli bir şekilde çalışmasına ile işletim sistemi bir robot için olabilir. Bu yüzden biz pozitif deplasmanlı (3B rakam) ile çalışan sıvı işleyici için seçti.
Konsantrasyonları 2 doğrusal gradyanlar yanı sıra üçüncü bir bileşen (örneğin, bir küme arabellekleri/katkı) uygun bir şekilde sürekli bir konsantrasyon test edilebilir. Bunun için ilk köşe çözümleri uygun daha yüksek bir konsantrasyon, çeşitlendirilecek için bileşeni hariç olmak üzere, temel bir kümesi nispeten büyük miktarda hazırlanır. O zaman, bu bileşeni içeren stok çözümleri son konsantrasyonları ayarlamak için eklenir. Örneğin, 50 mL 4 köşe çözümler kümesinin daha başlangıçta % 10 daha yüksek konsantrasyonlarda hazırlanıyor. Bu çekirdek kümesi sonra 5 daha küçük alt kümeleri 4 ikiye bölünmüş durumda. Son olarak, farklı tampon-pH çözümleri hacmi % 10 her alt kümesine eklenir.
4. biçimleri ve türleri katkı ekranlar
Ekranları beri düzenli olarak kullanılan değil normalde-20 ° C'de (şekil 4) depolanır ve geçici/kararsız bileşikleri içerir. Çünkü tamamen oda sıcaklığında erimek katkı tüm çözümler için 12-24 saat sürecek bir derin kuyu blok (1 mL Wells) depolanan bir donmuş katkı ekran kullanımı erken planlanması gerekir. Ayrıca, kullanıcılar çok sayıda potansiyel Çapraz bulaşma sorunlara neden aynı katkı ekran paylaşmak. Son olarak, derin kuyu blok yüksekliğini onları uygun olmayan çoğu nanoliter Albümler için yapar. Bu sorunları aşmak için uygun bir çözüm, ekranın düşük profilli tabak (şekil 4) Derin kuyu bloğundan aktarılmalıdır.
Tarihsel olarak, tek reaktifler (ile tek konsantrasyonları) geniş bir çeşitlilik içeren katkı ekranları çok popüler35,36olmuştur. Ancak, diğer türleri katkı ekranlarının karışımları katkı maddeleri37 veya farklı konsantrasyonlarda38, bulunan tek katkı maddeleri azaltılmış bir dizi entegre geliştirilmiştir. Son olarak, bir tamamlayıcı örnekleri kristalizasyon39,40önce katkı maddeleri etkisini araştırmak için bir yaklaşımdır.
5. daha fazla dikkat edilmesi gereken noktalar
İyi uygulama: Çoğu ekranı zararlı veya bile toksik maddeler içerir ve bu nedenle yeterli kişisel koruma sırasında protokolleri istihdam gerekir. Aynı şekilde, hareketli parçalar robotlar için yaralanmaları, özellikle (robotlar çoğunu Acil durdurma düğmesi/sistem olsa) bir program çalışırken el ile müdahale etmeye çalışırken neden olabilir. Teknik karmaşıklığı nedeniyle dahil, düzenli robotlar, ekranlar ve programları ile daha önce karakterize test örnekleri tekrarlanabilirlik sürekli yüksek düzeyde önemlidir kontrol ediyorum.
Üretilen iş: Bir göstergesi olarak 4.000-8.000 LMB arasında yıllık 1 sistemiyle (ve daha sonra başlangıç tarama için kullanıcılar tarafından istihdam) plakalar imal edilmektedir. Beklenen devir oranı 4-5 ay sonra bazı koşullar olarak çok düşük olduğunda 10 ° C'de önceden doldurulmuş tabak büyük miktarda bozulabilir ve buharlaşmasına başlayacak hisse senedi için adapte değildir. Otomasyon iletişim kuralları için farklı yaklaşımlar küçük-orta boy laboratuvarları41için uygulanmıştır.
Saklama ve deneyler değerlendirilmesi: Damlacıkları hazırladıktan sonra plakaları bir odada 4-18 ° C (+/-0,5 ° C maksimum sapma) sıkı kontrol sıcaklık düşük titreşim raflarda depolanır. Deneyler soğuk ışık kaynağı mikroskoplar kullanarak değerlendirilir. Çeşitli otomatik görüntüleme sistemleri piyasada bulunan vardır, ancak bir dikkatle tüm yönleri dikkate almanız gerekir: bir tabak inceden inceye gözden geçirmek için gereken hız için yüksek işlem hacmi yeterli olacaktır? Kristaller dışındaki nesneler ile otofokus müdahale edecek? Elde edilen görüntülerin kalitesini nokta çok küçük kristaller (özellikle kenarındaki damlacıkları) için yeterli olacak mı? 42 , 43 , 44
Kristalizasyon koşullardan karşılaştırma: Başlangıçta elde kristalleri doğası hakkında dikkatli araştırmalar sonra bir eğilimleri ve benzerlikler <a href="http://fms-3.lmb.internal/screens2/search.html">LMB ekran veritabanı</a> veya C6 <a href="http://c6.csiro.au/">Web aracı</a>45kullanarak koşulları çözümleyebilirsiniz.

X-ışını kristalografisi yoğun daha fazla biyolojik ve hastalık mekanizmaları atomik düzeyde bizim anlayışı ilerletmek için ve daha sonra ilaç keşif1akılcı yaklaşımlar yardımcı olmak için uygulanır. Bunun için saflaştırılmış ve konsantre (2-50 mg/mL) makromoleküllerin protein, DNA, RNA, diğer ligandlar ve kendi kompleksleri örneklerdir yargılandın kristalizasyon2,3 boyutlu duvarlar, Korkuluk onların eğilimi formu için sipariş için ,4. Yüksek kaliteli kristaller bu röntgen diffract elde edilen zaman kristal yapısı, atom çözünürlük5,6çözülmüş. En önemlisi, bir roman örnek kristalize koşulları bilinemez ve genellikle çok düşük kaliteli kristaller verimidir. İlgi birçok örnekleri onları kararsız kristalizasyon (genellikle bir kaç gün) için karşılık gelen zaman ölçeğini yapmak zor biyokimyasal özellikleri vardır bir temel nedenidir. Son olarak, işlem örnekleri ve örnek çeşitleri üretmek ve onların arıtma ve kristalizasyon7,8en iyi duruma getirmek için gereken süreyi tarafından bileşik olduğunu.
Kristalizasyon durumu örnek çözünürlük azaltır bir precipitant ile bir çözümdür ve koşullar kez de arabellekleri ve katkı maddeleri içerir. Böyle reaktifler yüzlerce gibi onlar örnek bütünlüğünü (örneğin, protein veya nükleik asit unfolding) müdahale eğilimi düşük kristalizasyon deneyler parametrelerini değiştirmek için uygundur. Kristalizasyon reaktifler kombinasyonları milyonlarca test mümkün olmasa da, birçok tarama kitleri - çeşitli stratejileri9ile formüle için birkaç test,10 - Mini denemeler ve otomatik protokolleri ile mümkün. Bu açıdan en mükellef muhtemelen buharı difüzyon ile 100-200 nL damlacıkları küçük oldukça özel kristalizasyon tabak11 ' uygulanan kristalizasyon koşulu (25-250 µL) içeren bir rezervuar üzerinde oturan bir tekniktir , 12. protein örnek ve koşul kez 200 toplam hacmi için 1:1 oranında birleştirilir üst-Wells damlacıkları ayarlarken nL. Robot nanoliter protein kristalizasyon alternatif teknikleri ve levha altında petrol toplu13 ve Lipidic üçüncü aşama14 (özellikle olan trans-membran proteinlerinin uygulanan en son bir gibi uygulanabilir çok kötü çözünür su).
<a href="http://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/groups/JYL/WWWrobots/robot.html">MRC LMB kristalizasyon tesisinde</a> erken 2000'li yıllarda başladı ve otomatik protokolümüze erken bir özetini 200515dakika içinde sunuldu. Protein kristalizasyon tarihsel bir giriş sunuldu ve ayrıca robot nanoliter avantajları bir taslağını yaklaşım (sonra yeni bir yaklaşımın rutin deneyler için). Beri makromoleküllerin kristalizasyon aslında bir Stokastik süreç (uygun) başlangıç koşullarını geniş bir istihdam çok az veya hiç yararlı önceki bilgilerle artırmak verim kalitesi kırınım kristalleri16. Ayrıca, örnekleri ve birçok durumda kristalleri duruma getirilmesi ihtiyacını önemli ölçüde azaltmak için büyük bir başlangıç ekranı genellikle gözden kaçan bir avantajı olduğunu. Tabii ki, bir-ebilmek hareketsiz lüzum-optimizasyon bazı başlangıç koşullarını ile daha sonra devam etmek. Genellikle, reaktifler ve pH konsantrasyon sonra sistematik olarak incelenmiştir. Daha fazla reaktifler da daha fazla kristalizasyon parametrelerini değiştirmek için en iyi duruma getirilmiş koşulları tanıttı olabilir. Kesinlikle, bir taze hazırlanmış bir örnek ile kristalizasyon denemeniz gerekir, bu nedenle ilgili iletişim kuralları her zaman basit ve kullanılabilir olmalıdır.
Burada, iki MRC-LMB (sistemleri 1 ve 2) tasarlanmış sistemleri otomatiğe ve ilgili protokolleri tam olarak açıklanmıştır. Bu iki sistem ana uygulama tarafından açılan kristalizasyon plakaları defada buharı difüzyon eleme ilk. Sistem 1 sıvı bir işleyici, hisse senedi plakaları için otomatik bir carousel, plaka etiketleme için bir mürekkep püskürtmeli yazıcı ve bir yapışkan plaka mühürleyen entegre. Sistemdeki 1, 72 96-şey plakaları piyasada bulunan tarama kitleri (80 µL koşulun rezervuar için test tüpleri 10 mL başlangıç hacmi transfer) ile dolu, etiketli ve mühürlü. Plakayı daha sonra nerede onlar her zaman ('LMB plakaları' adı verilen ilk) kullanıcılarının ekranlardır 10 ° C kuluçka saklanır.
Sistem 2 sıvı işleyicisi, bir nanoliter pınarı ve bir yapışkan plaka mühürleyen entegre. Sistem üzerinde 2, damlacıkları (100-1000 nL) buharı difüzyon deneyler için oturma koşullarını birleştirme tarafından üretilen ve örnek üst-Wells 20 48 veya 96 iyi plakaların ön koşulları ile dolu. Bu 1920 başlangıç tarama koşulları 20 LMB plaka sistemi 2 kullanırken yargılandın olduðu anlamýna gelir.
Robotlar da tek tek Seçilen koşulları optimizasyonu için kullanılır ve karşılık gelen yarı otomatik iletişim kuralları da açıklanmıştır. 4-köşe yöntemi17 düzenli olarak en iyi duruma getirme ekranlar üretmek için istihdam edilmektedir. İlgili iletişim kuralı ilk 4 Çözümleri ('A, B, C ve D') el ile hazırlanması gerekir. Konsantrasyonları (iki ana kristalizasyon aracıları için) iki doğrusal degradeleri doğrudan kristalizasyon plaka rezervuar otomatik olarak oluşturulur. Bunun için farklı oranlar 4 köşe Solutions'da şırınga bağlı sıvı işleyici dağıtır.
Daha fazla koşul en iyi duruma getirmek için potansiyel olarak elde edilen kristalleri18özelliklerini geliştirmek katkı ekranlar istihdam edebilirsiniz. Katkı tarama için iki yaklaşım vardır: damlacıkları (Protokolü 1) ayarlamadan önce kristalizasyon plakaları rezervuar reçete katkı maddeleri ile başlayan bir protokol ve başka bir protokol nerede katkı ekran reçete doğrudan damlacıkları (2 iletişim kuralı).
MRC-otomatik makromoleküllerin kristalizasyon kolaylaştırmak için LMB başlatılan diğer yararlı gelişmeler de sunulmaktadır. Esasen, kristalizasyon plakaları ve ilişkili aygıtları gibi bir stackable toplum, biyomoleküler eleme (SBS) bu kapak en aza indirir buharlaşma koşullardan sistemi 2 kullanırken.
Kısalık için bu kullanıcıların temel işlevleri ve bakım nanoliter dağıtıcısı, mürekkep püskürtmeli yazıcı ve yapışkan plaka mühürleyen ile aşina olduğu varsayılır. Aksi belirtilmediği sürece, tabaklar robotlar güvertede konumlandırılmış öyle ki iyi A1 ('A1-köşe') bir levha taşıyıcı arka sol köşesine doğru olduğunu.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	
	<tbody>
		<tr >
			<td >Robots</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Freedom EVO&#174;</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Liquid handler (System 1). Aspiration/Dispense based on system liquid. Integrates an automated carousel. EVOware plus controlling software v.2.4.12.0.&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microlab&#174; STAR&#8482;</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Liquid handler (System 2). Aspiration/Dispense based on positive displacement (CO-RE&#8482; technology). Hamilton STAR controlling software v.4.3.5.4785 with method management interface.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mosquito&#174;</td>
			<td >TTP Labtech</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Microsyringe-based nanoliter dispenser used to set up droplets (System 2 and stand-alone), 3-position deck. Controlling software v.3.11.0.1422.&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dragonfly&#174;</td>
			<td >TTP Labtech</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Syringe-based liquid handler used to produce optimization screens (4-corner method). Controlling software v.1.2.1.10196.&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Adhesive plate sealer</td>
			<td>Brandel</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Integrated to Systems 1 and 2 (also used as stand-alone robot).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Inkjet printer 9232</td>
			<td>Markem-Imaje</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Integrated to System 1. Touchscreen interface.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Crystallization screens</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Crystal Screen&#8482; 1</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-110</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB01</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Crystal Screen 2&#8482;</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-112</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB01</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Wizard&#8482; Classic 1</td>
			<td >Rigaku</td>
			<td >1009530</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB02</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Wizard&#8482; Classic 2</td>
			<td >Rigaku</td>
			<td >1009531</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB02</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Grid Screen&#8482; Ammonium Sulfate</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-211</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB03</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Grid Screen&#8482; PEG/LiCl</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-217</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB03</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Quick Screen&#8482;</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-221</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB03</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Grid Screen&#8482; Sodium Chloride</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-219</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB03</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Grid Screen&#8482; PEG 6000</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-213</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB04</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Grid Screen&#8482; MPD</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-215</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB04</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MemFac&#8482;</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-114</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB04</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PEG/Ion&#8482;</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-126</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB05</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Natrix&#8482;</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-116</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB05</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Crystal Screen Lite&#8482;</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-128</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB06</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Custom Lite screen</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >n/a</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB06</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Wizard&#8482; Cryo 1</td>
			<td >Rigaku</td>
			<td >1009536</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB07</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Wizard&#8482; Cryo 2</td>
			<td >Rigaku</td>
			<td >1009537</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB07</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >JBS1</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-101L</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB08</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >JBS2</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-102L</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB08</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >JBS3</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-103L</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB08</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >JBS4</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-104L</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB08</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >JBS5</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-105L</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB09</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >JBS6</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-106L</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB09</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >JBS7</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-107L</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB09</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >JBS8</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-108L</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB09</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >JBS9</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-109L</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB10</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >JBS10</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-110L</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB10</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear Strategy&#8482; Screen 1 pH 4.5</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-16LMB</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB10</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear Strategy&#8482; Screen 1 pH 5.5</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-16LMB</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB10</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear Strategy&#8482; Screen 1 pH 6.5</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-16LMB</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB11</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear Strategy&#8482; Screen 1 pH 7.5</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-16LMB</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB11</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear Strategy&#8482; Screen 1 pH 8.5</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-16LMB</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB11</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear Strategy&#8482; Screen 2 pH 4.5</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-16LMB</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB11</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear Strategy&#8482; Screen 2 pH 5.5</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-16LMB</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB12</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear Strategy&#8482; Screen 2 pH 6.5</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-16LMB</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB12</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear Strategy&#8482; Screen 2 pH 7.5</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-16LMB</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB12</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear Strategy&#8482; Screen 2 pH 8.5</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-16LMB</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB12</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Index&#8482;</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-144</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB13</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SaltRX&#8482; 1</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-107</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB14</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SaltRX&#8482; 2</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-109</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB14</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MemStar&#8482;</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-21</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB15</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MemSys&#8482;</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-25</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB15</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >JCSG-plus&#8482; Suite</td>
			<td >Qiagen</td>
			<td >130720</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB16</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MORPHEUS&#174; screen</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-46</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB17</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pi minimal screen</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-127</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB18</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pi-PEG screen</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-128</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB19</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MORPHEUS&#174; II screen</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-91</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB20</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >LMB crystallization screen&#8482;</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-98</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB21</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Additive screens</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HT additive screen</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-138</td>
			<td >Frozen in 96-well deepwell block (1 mL per well).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MORPHEUS&#174; additive screen</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-93-500</td>
			<td >Frozen in 96-well deepwell block (500 &#181;L per well).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ANGSTROM additive screen&#8482;&#160;</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD1-100</td>
			<td >Frozen in 96-well deepwell block (1 mL per well).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MORPHEUS&#174; additive screen</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD1-93</td>
			<td >Frozen in 96-well cell culture Costar&#174; plate with V-shaped wells (100 &#181;L per well).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ANGSTROM additive screen&#8482;&#160;</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD1-100-FX</td>
			<td >Frozen in 96-well cell culture Costar&#174; plate with V-shaped well (100 &#181;L per well).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HIPPOCRATES additive screen</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>n/a</td>
			<td >48 single additives (drug compounds found in MORPHEUS&#174; III).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Other consumables</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >96-well MRC 2-drop plate</td>
			<td >Swissci</td>
			<td >MRC 96T-UVP</td>
			<td >Sitting-drop, vapor diffusion plate. Reservoir recommended volume: 80&#160; &#181;L. Range of useful droplet volumes: 10-1000 nL. UV transmissible.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >48-well MRC 1-drop plate&#160; (&#39;MAXI plate&#39;)</td>
			<td >Swissci</td>
			<td >MMX01-UVP&#160;</td>
			<td >Sitting-drop, vapor diffusion plate for scale-up/optimization. Reservoir recommended volume: 200&#160; &#181;L. Range of useful droplet volumes: 0.1-10 &#181;L. UV transmissible.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MRC hanging drop seal</td>
			<td >Swissci</td>
			<td >n/a</td>
			<td >Hanging-drop, compatible with both MRC vapor diffusion plates (MRC 96T-UVP and MMX01-UVP ). UV and X-ray transmissible.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Adhesive sealing tape</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR4-50</td>
			<td >3-inch wide Duck&#174; HD Clear&#8482; for sealer and manual sealing.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Adhesive aluminium sheet</td>
			<td >Beckman Coulter</td>
			<td >538619</td>
			<td >Used to reseal additive screens.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ink cartridge</td>
			<td >Markem-Imaje</td>
			<td>9651</td>
			<td >System 1 (inkjet printer).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Solvent cartridge</td>
			<td >Markem-Imaje</td>
			<td>8652</td>
			<td >System 1 (inkjet printer).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >50 &#181;L tips&#160;</td>
			<td >Hamilton</td>
			<td>235947</td>
			<td >System 2 (STAR&#8482; liquid handler). Box of 6 sets with 1920 x CO-RE&#8482; tips in disposable stacks.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Reagent container</td>
			<td >Hamilton</td>
			<td>194052</td>
			<td >Used to dispense a condition into plate(s) during additive screening protocols.&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PCR plate</td>
			<td >Thermo Scientific&#8482;</td>
			<td >AB-2150</td>
			<td >System 2 (contains protein to be transfer to the Mosquito&#174;). Abgene Diamond ultra, 384 V-shaped wells.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >microsyringes</td>
			<td >TTP Labtech</td>
			<td >4150-03020</td>
			<td >Spool of 26,000 microsyringes for the Mosquito&#174; nanoliter dispenser (9mm spacing).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >strip-holder block</td>
			<td >TTP Labtech</td>
			<td >3019-05013</td>
			<td >SSB device for the Mosquito&#174; strips, aka &#39;4-way Reagent Holder&#39;.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2 &#181;L 8-well strip</td>
			<td >TTP Labtech</td>
			<td >4150-03110</td>
			<td >Contains protein on the deck of the Mosquito&#174;. Box of 40 strips, max. vol. in well is 3.2 &#181;L.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >5 &#181;L 8-well strip</td>
			<td >TTP Labtech</td>
			<td >4150-03100</td>
			<td >Contains protein on the deck of the Mosquito&#174;. Box of 40 strips, max. vol. in well is 7.5 &#181;L.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >5 mL syringes</td>
			<td >TTP Labtech</td>
			<td >4150-07100</td>
			<td >Syringe body and piston for the Dragonfly&#174; liquid handler. Pack of 100.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Troughs/Reservoirs</td>
			<td >TTP Labtech</td>
			<td >4150-07103</td>
			<td >Contains stock solutions on the deck of the Dragonfly&#174;. Pack of 50.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Orbital microplate shaker</td>
			<td>CamLab Limited</td>
			<td>n/a</td>
			<td >Variomag&#174; for mixing conditions in a single plate (0-2000 rpm).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microplate mixer</td>
			<td >TTP Labtech</td>
			<td>3121-01015</td>
			<td>MxOne. Mixing condition in a single plate with 96 vibrating pins.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated protocols for macromolecular crystallization at the mrc laboratory of molecular biology

Yüksek kaliteli kristaller bu röntgen diffract elde edilen zaman kristal yapısı, atom çözünürlük çözülmüş. Proteinler, DNA'lar, RNA'ların ve kendi kompleksleri kristalize koşullar ancak değil olabilir tahmin. Koşulları geniş bir istihdam kalite kırınım kristalleri verimini artırmak için bir yoldur. İki tam otomatik sistemleri, moleküler kristalizasyon tarama 1920 başlangıç koşullarını karşı kolaylaştıran Biyoloji laboratuarında (Cambridge, İngiltere, MRC-LMB) nanoliter damlacıkları buharı difüzyon tarafından geliştirilmiştir. Yarı otomatik iletişim kuralları da reaktifler, pH, konsantrasyonları değiştirerek veya potansiyel olarak elde edilen kristalleri özelliklerini geliştirmek katkı maddeleri tanıtımı koşulları optimize etmek için geliştirilmiştir. Karşılık gelen tüm iletişim kuralları ayrıntılı olarak açıklanan ve kısaca tartışıldı. Birlikte ele alındığında, onlar onların deneyler anahtar parametreleri üzerinde kontrol kullanıcılar verirken uygun ve yüksek verimli makromoleküllerin kristalizasyon bir çok kullanıcılı tesisi sağlar.

Watch this Scientific Journal Video about Automated Protocols for Macromolecular Crystallization at the MRC Laboratory of Molecular Biology at JoVE.com

Automated Protocols for Macromolecular Crystallization at the MRC Laboratory of Molecular Biology

Otomatik sistemler ve ekranlar çok sayıda rutin hazırlanması için protokoller ve nanoliter kristalizasyon damlacıkları buharı difüzyon deneyler için açıklanan ve tartışıldı.

MRC Laboratuvarı moleküler biyolojinin makromoleküllerin kristalizasyon için protokolleri otomatik

When high quality crystals are obtained that diffract X-rays, the crystal structure may be solved at near atomic resolution. The conditions to crystallize ...

automated-protocols-for-macromolecular-crystallization-at-mrc

Research

JoVE Journal

Biochemistry

16.2K Görüntüleme.  Medical Research Council. Otomatik sistemler ve ekranlar çok sayıda rutin hazırlanması için protokoller ve nanoliter kristalizasyon damlacıkları buharı difüzyon deneyler için açıklanan ve tartışıldı.

Video: Automated Protocols for Macromolecular Crystallization at the MRC Laboratory of Molecular Biology

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to precisely maneuver the nucleation and crystal growth towards desired sizes of protein crystals. The controlled crystallization is based on sample investigation with in situ Dynamic Light Scattering (DLS) while all visual changes in the droplet are monitored online with the help of a microscope coupled to a CCD camera, thus enabling a full investigation of the protein droplet during all stages of crystallization. The use of in situ DLS measurements throughout the entire experiment allows a precise identification of the highly supersaturated protein solution transitioning to a new phase &#8211; the formation of crystal nuclei. By identifying the protein nucleation stage, the crystallization can be optimized from large protein crystals to the production of protein microcrystals. The experimental protocol shows an interactive crystallization approach based on precise automated steps such as precipitant addition, water evaporation for inducing high supersaturation, and sample dilution for slowing induced homogeneous nucleation or reversing phase transitions.

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Here we present a protocol for controlled production of protein microcrystals. The process uses an automated device allowing controlled manipulation of several crystallization parameters. The protein crystallization is carried-out by controlled and automated addition of crystallization solutions while monitoring and investigating the radius distribution of particles in the crystallization droplet.

Situ dinamik ışık saçılma ile birleştiğinde kristalizasyon büyüyen Protein kristalleri kullanarak farklı boyutları ile otomatik

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to ...

Biyokimya

Single-step Purification of Macromolecular Complexes Using RNA Attached to Biotin and a Photo-cleavable Linker

For many years, the exceptionally strong and rapidly formed interaction between biotin and streptavidin has been successfully utilized for partial purification of biologically important RNA/protein complexes. However, this strategy suffers from one major disadvantage that limits its broader utilization: the biotin/streptavidin interaction can be broken only under denaturing conditions that also disrupt the integrity of the eluted complexes, hence precluding their subsequent functional analysis and/or further purification by other methods. In addition, the eluted samples are frequently contaminated with the background proteins that nonspecifically associate with streptavidin beads, complicating the analysis of the purified complexes by silver staining and mass spectrometry. To overcome these limitations, we developed a variant of the biotin/streptavidin strategy in which biotin is attached to an RNA substrate via a photo-cleavable linker and the complexes immobilized on streptavidin beads are selectively eluted to solution in a native form by long wave UV, leaving the background proteins on the beads. Shorter RNA binding substrates can be synthesized chemically with biotin and the photo-cleavable linker covalently attached to the 5&#39; end of the RNA, whereas longer RNA substrates can be provided with the two groups by a complementary oligonucleotide. These two variants of the UV-elution method were tested for purification of the U7 snRNP-dependent processing complexes that cleave histone pre-mRNAs at the 3&#39; end and they both proved to compare favorably to other previously developed purification methods. The UV-eluted samples contained readily detectable amounts of the U7 snRNP that was free of major protein contaminants and suitable for direct analysis by mass spectrometry and functional assays. The described method can be readily adapted for purification of other RNA binding complexes and used in conjunction with single- and double-stranded DNA binding sites to purify DNA-specific proteins and macromolecular complexes.

RNA/protein complexes purified using botin-streptavidin strategy are eluted to solution under denaturing conditions in a form unsuitable for further purification and functional analysis. Here, we describe a modification of this strategy that utilizes a photo-cleavable linker in RNA and a gentle UV-elution step, yielding native and fully functional RNA/protein complexes.

Tek adım arıtma RNA bağlı Biotin ve fotoğraf yarilabilir bir bağlayıcı kullanarak makromoleküllerin kompleksleri

For many years, the exceptionally strong and rapidly formed interaction between biotin and streptavidin has been successfully utilized for partial ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a fluorescent dye and are spotted by a photodetector following their separation. Single molecule fluorescence imaging can provide ultrasensitive protein detection with its ability for visualizing individual fluorescent molecules. However, the application of this powerful imaging method to electrophoresis assays is hampered by the lack of ways to characterize the homogeneity of fluorescent labeling of each protein species across the proteome. Here, we developed a method to evaluate the labeling homogeneity across the proteome based on a single molecule fluorescence imaging assay. In our measurement using a HeLa cell sample, the proportion of proteins labeled with at least one dye, which we termed &#8216;labeling occupancy&#8217; (LO), was determined to range from 50% to 90%, supporting the high potential of the application of single molecule imaging to sensitive and precise proteome analysis.

Here, we present a protocol to assess the labeling homogeneity for each protein species in a complex protein sample at the single molecule level.

Proteom çapında Quantification maddelerinin homojenliği tek molekül düzeyinde etiketlenmesi

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important roles for the cell and may unravel new cellular processes. Among proteins, kinases are major actors as they belong to cell signaling pathways and have the ability to switch on or off many processes crucial to the fate of the cell, such as cell growth, division, differentiation, motility, and death.
In this study, we focused on a new potential kinase protein, LIMK2-1. We demonstrated its existence by Western Blot using a specific antibody. We evaluated its interaction with an upstream regulating protein using coimmunoprecipitation experiments. Coimmunoprecipitation is a very powerful technique able to detect the interaction between two target proteins. It may also be used to detect new partners of a bait protein. The bait protein may be purified either via a tag engineered to its sequence or via an antibody specifically targeting it. These protein complexes may then be separated by SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamide Gel) and identified using mass spectrometry. Immunoprecipitated LIMK2-1 was also used to test its kinase activity in vitro by &#947;[32P] ATP labeling. This well-established assay may use many different substrates, and mutated versions of the bait may be used to assess the role of specific residues. The effects of pharmacological agents may also be evaluated since this technique is both highly sensitive and quantitative. Nonetheless, radioactivity handling requires particular caution. Kinase activity may also be assessed with specific antibodies targeting the phospho group of the modified amino acid. These kinds of antibodies are not commercially available for all the phospho modified residues.

We characterized a new kinase protein using robust biochemical approaches: Western Blot analysis with a dedicated specific antibody on different cell lines and tissues, interactions by coimmunoprecipitation experiments, kinase activity detected by Western Blot using a phospho-specific antibody and by &#947;[32P] ATP labeling.

Yeni kinaz proteinin sağlam biyokimyasal yaklaşımlar kullanılarak moleküler düzeyde karakterize edilmesi

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...

Strategic Screening and Characterization of the Visual GPCR-mini-G Protein Signaling Complex for Successful Crystallization

The key to determining crystal structures of membrane protein complexes is the quality of the sample prior to crystallization. In particular, the choice of detergent is critical, because it affects both the stability and monodispersity of the complex. We recently determined the crystal structure of an active state of bovine rhodopsin coupled to an engineered G protein, mini-Go, at 3.1 &#197; resolution. Here, we detail the procedure for optimizing the preparation of the rhodopsin&#8211;mini-Go complex. Dark-state rhodopsin was prepared in classical and neopentyl glycol (NPG) detergents, followed by complex formation with mini-Go under light exposure. The stability of the rhodopsin was assessed by ultraviolet-visible (UV-VIS) spectroscopy, which monitors the reconstitution into rhodopsin of the light-sensitive ligand, 9-cis retinal. Automated size-exclusion chromatography (SEC) was used to characterize the monodispersity of rhodopsin and the rhodopsin&#8211;mini-Go complex. SDS-polyacrylamide electrophoresis (SDS-PAGE) confirmed the formation of the complex by identifying a 1:1 molar ratio between rhodopsin and mini-Go after staining the gel with Coomassie blue. After cross-validating all this analytical data, we eliminated unsuitable detergents and continued with the best candidate detergent for large-scale preparation and crystallization. An additional problem arose from the heterogeneity of N-glycosylation. Heterologously-expressed rhodopsin was observed on SDS-PAGE to have two different N-glycosylated populations, which would probably have hindered crystallogenesis. Therefore, different deglycosylation enzymes were tested, and endoglycosidase F1 (EndoF1) produced rhodopsin with a single species of N-glycosylation. With this strategic pipeline for characterizing protein quality, preparation of the rhodopsin&#8211;mini-Go complex was optimized to deliver the crystal structure. This was only the third crystal structure of a GPCR&#8211;G protein signaling complex. This approach can also be generalized for other membrane proteins and their complexes to facilitate sample preparation and structure determination.

This report describes screening of different detergents for preparing the visual GPCR, rhodopsin, and its complex with mini-Go. Biochemical methods characterizing the quality of the complex at different stages during purification are demonstrated. This protocol can be generalized to other membrane protein complexes for their future structural studies.

Başarılı Kristalizasyon Için Görsel GPCR-mini-G Protein Sinyal Kompleksi Stratejik Tarama ve Karakterizasyonu

The key to determining crystal structures of membrane protein complexes is the quality of the sample prior to crystallization. In particular, the choice ...

Spot Variation Fluorescence Correlation Spectroscopy for Analysis of Molecular Diffusion at the Plasma Membrane of Living Cells

Dynamic biological processes in living cells, including those associated with plasma membrane organization, occur on various spatial and temporal scales, ranging from nanometers to micrometers and microseconds to minutes, respectively. Such a broad range of biological processes challenges conventional microscopy approaches. Here, we detail the procedure for implementing spot variation Fluorescence Correlation Spectroscopy (svFCS) measurements using a classical fluorescence microscope that has been customized. The protocol includes a specific performance check of the svFCS setup and the guidelines for molecular diffusion measurements by svFCS on the plasma membrane of living cells under physiological conditions. Additionally, we provide a procedure for disrupting plasma membrane raft nanodomains by cholesterol oxidase treatment and demonstrate how these changes in the lateral organization of the plasma membrane might be revealed by svFCS analysis. In conclusion, this fluorescence-based method can provide unprecedented details on the lateral organization of the plasma membrane with the appropriate spatial and temporal resolution.

This article aims to present a protocol on how to build a spot variation Fluorescence Correlation Spectroscopy (svFCS) microscope to measure molecular diffusion at the plasma membrane of living cells.

Canlı Hücrelerin Plazma Membranında Moleküler Difüzyonun Analizi için Spot Varyasyon Floresan Korelasyon Spektroskopisi

Dynamic biological processes in living cells, including those associated with plasma membrane organization, occur on various spatial and temporal scales, ...

PCR Mutagenesis, Cloning, Expression, Fast Protein Purification Protocols and Crystallization of the Wild Type and Mutant Forms of Tryptophan Synthase

Structural studies with tryptophan synthase (TS) bienzyme complex (&#945;2&#946;2 TS) from Salmonella typhimurium have been performed to better understand its catalytic mechanism, allosteric behavior, and details of the enzymatic transformation of substrate to product in PLP-dependent enzymes. In this work, a novel expression system to produce the isolated &#945;- and isolated &#946;-subunit allowed the purification of high amounts of pure subunits and &#945;2&#946;2 StTS complex from the isolated subunits within 2 days. Purification was carried out by affinity chromatography followed by cleavage of the affinity tag, ammonium sulfate precipitation, and size exclusion chromatography (SEC). To better understand the role of key residues at the enzyme &#946;-site, site-direct mutagenesis was performed in prior structural studies. Another protocol was created to purify the wild type and mutant &#945;2&#946;2 StTS complexes. A simple, fast and efficient protocol using ammonium sulfate fractionation and SEC allowed purification of &#945;2&#946;2 StTS complex in a single day. Both purification protocols described in this work have considerable advantages when compared with previous protocols to purify the same complex using PEG 8000 and spermine to crystalize the &#945;2&#946;2 StTS complex along the purification protocol. Crystallization of wild type and some mutant forms occurs under slightly different conditions, impairing the purification of some mutants using PEG 8000 and spermine. To prepare crystals suitable for x-ray crystallographic studies several efforts were made to optimize crystallization, crystal quality and cryoprotection. The methods presented here should be generally applicable for purification of tryptophan synthase subunits and wild type and mutant &#945;2&#946;2 StTS complexes.

This article presents a series of consecutive methods for the expression and purification of Salmonella typhimurium tryptophan synthase comp this protocol a rapid system to purify the protein complex in a day. Covered methods are site-directed mutagenesis, protein expression in Escherichia coli, affinity chromatography, gel filtration chromatography, and crystallization.

PCR Mutagenezi, Klonlama, İfade, Hızlı Protein Saflaştırma Protokolleri ve Triptofan Synthase'in Vahşi Tipinin ve Mutant Formlarının Kristalizasyonu

Structural studies with tryptophan synthase (TS) bienzyme complex (&#945;2&#946;2 TS) from Salmonella typhimurium have been performed to better understand ...

Fixed Target Serial Data Collection at Diamond Light Source

Serial data collection is a relatively new technique for synchrotron users. A user manual for fixed target data collection at I24, Diamond Light Source is presented with detailed step-by-step instructions, figures, and videos for smooth data collection.

We present a comprehensive guide to fixed target sample preparation, data collection, and data processing for serial synchrotron crystallography at Diamond beamline I24.

Diamond Light Source'da Sabit Hedef Seri Veri Toplama

Serial data collection is a relatively new technique for synchrotron users. A user manual for fixed target data collection at I24, Diamond Light Source is ...

Workflow and Tools for Crystallographic Fragment Screening at the Helmholtz-Zentrum Berlin

Fragment screening is a technique that helps to identify promising starting points for ligand design. Given that crystals of the target protein are available and display reproducibly high-resolution X-ray diffraction properties, crystallography is among the most preferred methods for fragment screening because of its sensitivity. Additionally, it is the only method providing detailed 3D information of the binding mode of the fragment, which is vital for subsequent rational compound evolution. The routine use of the method depends on the availability of suitable fragment libraries, dedicated means to handle large numbers of samples, state-of-the-art synchrotron beamlines for fast diffraction measurements and largely automated solutions for the analysis of the results.
Here, the complete practical workflow and the included tools on how to conduct crystallographic fragment screening (CFS) at the Helmholtz-Zentrum Berlin (HZB) are presented. Preceding this workflow, crystal soaking conditions as well as data collection strategies are optimized for reproducible crystallographic experiments. Then, typically in a one to two-day procedure, a 96-membered CFS-focused library provided as dried ready-to-use plates is employed to soak 192 crystals, which are then flash-cooled individually. The final diffraction experiments can be performed within one day at the robot-mounting supported beamlines BL14.1 and BL14.2 at the BESSY&#160; II electron storage ring operated by the HZB in Berlin-Adlershof (Germany). Processing of the crystallographic data, refinement of the protein structures, and hit identification is fast and largely automated using specialized software pipelines on dedicated servers, requiring little user input.
Using the CFS workflow at the HZB enables routine screening experiments. It increases the chances for successful identification of fragment hits as starting points to develop more potent binders, useful for pharmacological or biochemical applications.

Crystallographic fragment screening at the Helmholtz-Zentrum Berlin is performed using a workflow with dedicated compound libraries, crystal handling tools, fast data collection facilities&#160;and largely automated data analysis. The presented protocol intends to maximize the output of such experiments to provide promising starting points for downstream structure-based ligand design.

Helmholtz-Zentrum Berlin'de Kristalografik Parça Taraması için İş Akışı ve Araçlar

Fragment screening is a technique that helps to identify promising starting points for ligand design. Given that crystals of the target protein are ...

The Automated Crystallography Pipelines at the EMBL HTX Facility in Grenoble

EMBL Grenoble operates the High Throughput Crystallization Laboratory (HTX Lab), a large-scale user facility offering high throughput crystallography services to users worldwide. The HTX lab has a strong focus in the development of new methods in macromolecular crystallography. Through the combination of a high throughput crystallization platform, the CrystalDirect technology for fully automated crystal mounting and cryocooling and the CRIMS software we have developed fully automated pipelines for macromolecular crystallography that can be remotely operated over the internet. These include a protein-to-structure pipeline for the determination of new structures, a pipeline for the rapid characterization of protein-ligand complexes in support of medicinal chemistry, and a large-scale, automated fragment screening pipeline enabling evaluation of libraries of over 1000 fragments. Here we describe how to access and use these resources.

Here, we describe how to use the automated macromolecular crystallography pipelines for protein-to-structure, rapid ligand-protein complex analysis and large-scale fragment screening based on the CrystalDirect technology at the HTX Laboratory in EMBL Grenoble.

Grenoble'daki EMBL HTX Tesisinde Otomatik Kristalografi Boru Hatları

EMBL Grenoble operates the High Throughput Crystallization Laboratory (HTX Lab), a large-scale user facility offering high throughput crystallography ...