Name: expansion and adipogenesis induction of adipocyte progenitors from perivascular adipose tissue isolated by magnetic activated cell sorting
Uploaded: 2017-06-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Expansion and Adipogenesis Induction of Adipocyte Progenitors from Perivascular Adipose Tissue Isolated by Magnetic Activated Cell Sorting at JoVE.com

Contreras and Watts Laboratuvarları ve Dr. William Raphael. Bu deneyler NHLBI F31 HL128035-01 (doku sindirim protokol standardizasyonu), NHLBI 5R01HL117847-02 ve 2P01HL070687-11A1 (hayvanlar) ve NHLBI 5R01HL117847-02 (hücre izolasyonu ve kültür) tarafından desteklenmiştir.

Bu yazıda açıklanan tüm prosedürler, Michigan Devlet Üniversitesi&#39;nin Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından oluşturulan yönergeleri izlemektedir. Tüm tamponlar ve medyalar ışığa karşı korunmalıdır. 1. Tamponların, Ortamların ve Aletlerin Hazırlanması <ol><li> 135 mM sodyum klorür, 5 mM potasyum klorür, 1 mM magnezyum sülfat, 0.4 mM potasyum fosfat dibazik, 5.5 mM glukoz,% 1 antibiyotik / antimikotik (10,000 ünite / mL penisilin, 10,000 μg) Krebs Ringer Bikarbonat Tamponlanmış çözeltiyi (KRBB) hazırlayın. / ML streptomisin, 25 ug / mL amfoterisin B) ve 10 mM HEPES (pH = 7.4). Bu solüsyon steril tutulduğunda ve 4 ° C&#39;de 3 hafta boyunca stabildir. </li><li> Kollajenaz Tip 1 Solüsyonu hazırlayın: KRBB&#39;de% 1 sığır Serum Albümini (BSA) içeren 1 mg / mL. Bu solüsyon 37 ° C&#39;de tutulmalı ve 4 saat boyunca stabildir. </li><li> Eritrosit Lizis Tamponu Çözeltisi Hazırlayın: 154 mM amonyum klorür, 10 mM potasyum bikarbonat, Ve 0.1 mM EDTA. Bir aya kadar 4 ° C&#39;de tutun. </li><li> MCS Engelleme Tamponu Hazırlayın: DMEM / F12 Ortam tabanı,% 10 Fetal Sığır Serumu (FBS),% 5 normal eşek serum, 40 uL / ​​mL F (ab) Parç편 Eşek Anti-Rat IgG. Bir aya kadar 4 ° C&#39;de tutun. </li><li> MCS Tampon Çözeltisi Hazırlayın: Fosfat Tamponlu Tuz (PBS, pH = 7.5),% 0.5 BSA ve 2 mM EDTA. Bir aya kadar 4 ° C&#39;de tutun. De-gaz çözeltisi, bir cam kap içerisinde 37 ° C&#39;ye ısıtılarak ve daha sonra 15 saniye süreyle vakum uygulanarak hazırlanır. Kullanılmayan tamponlu mühürlü bırakın. </li><li> Dulbecco&#39;s-Modifiye Kartal Ortamı (DMEM): F12,% 15 Fetal Buzağı Serumu (FCS),% 1 antibiyotik / antimikotik (10,000 ünite / mL penisilin, 10,000 μg / mL streptomisin, 25 ug / ML amfoterisin B), 44.05 mM sodyum bikarbonat, 100 uM askorbik asit, 33 uM biyotin, 17 uM pantotenat, 2 mM L-glutamin ve 20 mM HEPES. Steril olun ve 4 ° C&#39;de 2 hafta kadar tutun. </li><li> APC &amp;Lösemi inhibe edici faktör (10 ng / mL), trombosit türevli büyüme faktörü BB (10 ng / mL) ve bazik fibroblast büyüme faktörü (10 ng / mL) dahil olmak üzere ilave büyüme faktörleri olan Basal Medya 5 ng / mL). Steril olun ve 4 ° C&#39;de 2 hafta kadar tutun. </li><li> APC İndüksiyon Ortamı hazırlayın:% 10 FBS, 2.5 μg / mL insülin, 0.5 mM 2-izobütil-1-metilaksantin (IBMX), 1 uM deksametazon ve 200 pM T3 (triiodotironin tiroid hormonu) ile APC Ortamı. Steril olun ve 4 ° C&#39;de 2 hafta kadar tutun. </li></ol> 2. Adiposit Progenitörlerin İzolasyonu <ol><li> Sıçan, kurumsal kurallara göre anestezi altına alınız. Sıçanı sırt üstü yatma durumuna getirin. Anestezi derinliğini bir ayak parmak ucu ve bu acı uyarıya refleks tepkisi kaybı ile teyit edin. NOT: Bu protokol, intraperitoneal bir enjeksiyon yoluyla 10 haftalık Sprague Dawley sıçanları ve 70 mg / kg pentobarbital kullanmaktadır. </li><li> Dikey orta hat kesi wGöğüs bölgesinde sternum boyunca makas ve perineal alana. Karın boşluğuna erişin ve üst mezenterik arteri, küçük mezenterik dirençli damarları (mPVAT) ve torasik aortayı (aPVAT) ortaya çıkarın. <ol><li> Mezenterya ve aortaya olan tüm bağlantıları kesip hayvanlardan damarları çıkarın. Bir disseksiyon mikroskopu ve PVDF&#39;yi izole etmek için KRBB ile dolu Petri kabı kullanarak PVAT&#39;yi ayırın. </li><li> Bu deneyde, bir PVAT olmayan yağ deposunu temsil etmek için gonadal (GON) adipozu toplayın. İzole edilmiş yağ pedlerini KRBB&#39;de buz üzerinde 10 mM HEPES (pH = 7.4) ile yerleştirin. </li><li> Biyogüvenlikli bir kaputta yaklaşık 50 mg doku, 1 mL kollajenaz tip I solüsyonu ile 1.7 mL&#39;lik bir tüpe aktarılır ve doku makası ile kıyılır (1-3 mm&#39;lik parçalar). </li></ol></li><li> 1 saat rotisserie inkübatör (veya bir orbital çalkalayıcı ile inkübatör) 37 ° C&#39;de inkübe ederek numuneleri sindirin. Biyogüvenlikli bir davlumbazda sindirilmiş malzemeyi 100 ve 40<html> Μm hücre süzücüleri 50 mL&#39;lik bir tüp içine yerleştirin. Elde edilen süzüntü, 4 ° C&#39;de 10 dakika, 300 x g&#39;de santrifüjleyin. NOT: Buradan itibaren protokoldeki tüm basamaklar, hücreleri steril tutmak için biyogüvenlikli bir başlıkta gerçekleştirilmelidir. </li><li> Süpernatantı boşaltın ve 1 mL Eritrosit Lizis Tampon Çözeltisi içindeki SVF hücrelerini içeren topakları tekrar süspansiyon haline getirin ve 1.7 mL mikrofüj tüpüne aktarın. Işıktan korunan oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin ve 300 x g&#39;de 5 ° C&#39;de 4 ° C&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Süpernatantı boşaltın ve kalan hücre peletini SVF Basal Media&#39;da tekrar süspanse edin. Trypan Blue Solution ile canlı hücreleri saymak için 20 μL alt numune toplayın. NOT: İzole edilebilen SVF hücrelerinin sayısı siteye göre değişir. Mg doku başına hasat edilen ortalama SVF sayısı: aPVAT = 5.0 ± 2.0x103, mPVAT = 1.04 ± 0.62x104, GON = 2.4 ± 1.2x105. </li></ol> 3. Manyetik olarak aktive olan Hücre Ayırma Not: APC&#39;yi, tüm adımları 4 ° C&#39;de gerçekleştirerek CD34 ve PDGFRα hücre yüzey markerlerine dayanan SVF&#39;den ayırın. <ol><li> Hücreleri 300 x g&#39;de 5 dakika döndürün. Süpernatantı boşaltın ve hücre peletini 1 x 10 6 hücre / mL&#39;de MCS Engelleme Tamponuna tekrar süspanse edin ve 20 dakika inkübe edin. NOT: 1 x 10 6 - 2 x 10 8 hücre / mL hücre süspansiyonları etkili bir şekilde ayrılabilir. </li><li> 5 uL FITC konjuge Fare anti-CD34 (1 μg / 1 x 10 6 hücre) ile 30 dakika süreyle inkübe hücreler ° C. Hücreleri 300 xg ve 4 ° C&#39;de 5 dakika döndürün. <ol><li> CD34 + ve CD34 - hücrelerini ayırmak için karanlıkta 4 ° C&#39;de 5 dakika süreyle 4 μL anti-FITC mikro-boncukları ve 96 uL MCS tamponu (toplam hacim 100 μL) ile inkübe edin. </li></ol></li><li> Manyetik ayırıcıyı standa takın ve MultiSort (MS) Kolonunu, kolon kanatları öne gelecek şekilde ayırıcıya yerleştirin. 5 mL yerleştirinToplama tüpünü üst boru tutucudaki MS sütununun altına yerleştirin. </li><li> MS Sütununu, MCS Tampon Çözeltisi ile durulayarak hazırlayın. Sütun üstüne 500 μL MCS Tamponu uygulayın ve arabellek geçmesine izin verin. Atık suyu atın ve toplama tüpünü değiştirin. </li><li> Hazırlanan MS sütununa antikor etiketli hücre süspansiyonu yükleyin. Etiketsiz hücreler içeren akışı toplayın. </li><li> MS sütununu 500 μL gazı alınmış MCS Tamponu 3x ile yıkayın. Etiketsiz hücreleri toplayın ve bir önceki aşamadaki akışla birleşin. </li><li> MS Sütununu manyetik ayırıcıdan çıkarın ve yeni bir toplama tüpüne yerleştirin. MS sütununa 1 mL MCS Tamponu pipetleyin. Manyetik olarak etiketlenmiş hücrelerle fraksiyonu hemen sık sık, fakat yavaşça sütun içerisine fazla gaz girmemesi için kolonla birlikte verilen pistonu uygulayarak boşaltın. NOT: Yalıtılmış hücre sayıları bölgeye göre değişir. SVF popülasyonundan izole edilmiş ortalama CD34 + APC sayısıMg doku: aPVAT = 2.6 ± 0.43x102, mPVAT = 9.6 ± 1.4x102, GON = 1.3 ± 0.22x103. </li><li> Hücreleri 5 dakika 300 × g ve 4 ° C&#39;de döndürün. 10 μL 1: 200 çözelti / 1 x 10 6 hücre tavşan anti-PDGFRα toplanan CD34 + fraksiyonu 4 ° C&#39;de 30 dakika inkübe edin. <ol><li> 300 xg ve 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca hücreleri tekrar santrifüjleyin. Etiketli hücreleri, izole etmek için 3.3-3.7 adımlarını tekrarlayarak 4 uL anti-tavşan IgG mikro-boncukları ve 96 uL MCS tamponu ile inkübe edin. NOT: Yalıtılmış hücre sayıları bölgeye göre değişir. Mg doku başına CD34 + popülasyondan izole edilen PDGFRα + APC&#39;nin ortalama sayıları: aPVAT = 2.4 ± 0.64, mPVAT = 8.4 ± 2.4, GON = 10.4 ± 1.9, ki bu daha önce izole edilen popülasyonun% 0.5-10&#39;udur. </li></ol></li></ol> 4. Hücre Kültürü ve Adipogenez İndüksiyonu <ol><li> SVF&#39;yi kültür edinVe APC&#39;yi 6-Well doku kültürü plakalarında bazal medyumda değiştirerek her 2 günde bir değiştirin. 3 seri pasajdan sonra, 8, 24, 48 ve 96 saatte ve 24 oyuklu plakalarda 50,000 hücre / çukurda değerlendirilen çoğalma tahlilleri için siyah 96-oyuklu doku kültürü plakalarını 1x102 hücre / oyuk ile veya Nitel ve nicel adipogenez analizleri için 48-Well doku kültürü plakalarında 10,000 hücre / çukur. </li><li> Konfüzyon sonrası 48 saat ve kemik morfojenik protein 4 (3.3 nmol / L) ile endüksiyon öncesi APC bazal medyasını, farklılaşma için 10 olarak belirtildiği gibi ilave edin. Hücreleri inkübe etmek için APC İndüksiyon Ortamını kullanarak 48 saatlik% 100 konfluans (gün 0) sonrasında hücreleri indükleyin. </li><li> 48 saat sonra, IBMX ve deksametazon içermeyen APC İndüksiyon ortamında hücreleri muhafaza etmek için medyayı değiştirin; medyanın her 48 saatte bir değiştirilmesi ile 14 gün boyunca. </li><li> FACS tarafından onaylanan MCS izolasyonu. <ol><li> 50 μL (50.000 hücre) alt örnek manyetik olarak ayırınAted hücreler ve FACS çözeltisi ile yıkayın. </li><li> Hücreleri santrifüjleyin ve PDGFRα + hücrelerini etiketlemek için, eşek anti-tavşan IgG Dylight 405&#39;in 1: 1000 çözeltisinden 100 uL&#39;ye tekrar süspanse edin. Işıktan ve 4 ° C&#39;de 30 dakika inkübe edin. </li><li> Hücreleri yıkayın ve bir akış sitometresinde 488 nm (FITC) ve 405 nm (Dylight 405) filtreler kullanarak analiz için zaman kadar 200 uL% 2 formaldehid solüsyonuna tekrar süspanse edin. NOT: Kültürlenmiş hücrelerin lipid birikimi, lipofilik bir adipogenezis flüoresans tahlilini kullanarak, flüoresanı ölçen bir mikroplate okuyucu kullanılarak ve lipid birikimi için kalibratörler olarak preadipositleri kullanarak niceliksel olarak değerlendirilir. Lipid birikimi ayrıca nitel olarak lipid boyası lekelenmesi ve bir kamera ile donatılmış ters mikroskop üzerinde gerçekleştirilen görüntüleme ile ölçülür ve lipid gözlemlenebilen veya içermeyen toplam hücrelerin yüzdesini oluşturur. 485 nm&#39;de uyarılma ve 572&#39;de emisyon ile flüoresanı ölçebilen herhangi bir plaka okuyucuNm, analiz için olduğu kadar dijital görüntüleri yakalayabilen bir kameraya sahip herhangi bir mikroskop için de uygundur. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Watts, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemerin+connects+fat+to+arterial+contraction.">Chemerin connects fat to arterial contraction.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33 (6), 1320-1328 (2013).</li><li>Dodson, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+depots+differ+in+cellularity,+adipokines+produced,+gene+expression,+and+cell+systems.">Adipose depots differ in cellularity, adipokines produced, gene expression, and cell systems.</a> Adipocyte. 3 (4), 236-241 (2014).</li><li>Police, S. B., Thatcher, S. E., Charnigo, R., Daugherty, A., Cassis, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity+promotes+inflammation+in+periaortic+adipose+tissue+and+angiotensin+II-induced+abdominal+aortic+aneurysm+formation.">Obesity promotes inflammation in periaortic adipose tissue and angiotensin II-induced abdominal aortic aneurysm formation.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 29 (10), 1458-1464 (2009).</li><li>Ruan, H., Zarnowski, M. J., Cushman, S. W., Lodish, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standard+isolation+of+primary+adipose+cells+from+mouse+epididymal+fat+pads+induces+inflammatory+mediators+and+down-regulates+adipocyte+genes.">Standard isolation of primary adipose cells from mouse epididymal fat pads induces inflammatory mediators and down-regulates adipocyte genes.</a> J Biol Chem. 278 (48), 47585-47593 (2003).</li><li>Stacey, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> in eLS. , (2001).</li><li>Swim, H. E., Parker, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+characteristics+of+human+fibroblasts+propagated+serially.">Culture characteristics of human fibroblasts propagated serially.</a> Am J Hyg. 66 (2), 235-243 (1957).</li><li>Van Harmelen, V., Rohrig, K., Hauner, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+proliferation+and+differentiation+capacity+of+human+adipocyte+precursor+cells+from+the+omental+and+subcutaneous+adipose+tissue+depot+of+obese+subjects.">Comparison of proliferation and differentiation capacity of human adipocyte precursor cells from the omental and subcutaneous adipose tissue depot of obese subjects.</a> Metabolism. 53 (5), 632-637 (2004).</li><li>Roncari, D. A., Lau, D. C., Kindler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exaggerated+replication+in+culture+of+adipocyte+precursors+from+massively+obese+persons.">Exaggerated replication in culture of adipocyte precursors from massively obese persons.</a> Metabolism. 30 (5), 425-427 (1981).</li><li>Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+study+of+adipocyte+precursors.">Isolation and study of adipocyte precursors.</a> Methods Enzymol. 537, 31-46 (2014).</li><li>Fontana, L., Eagon, J. C., Trujillo, M. E., Scherer, P. E., Klein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visceral+fat+adipokine+secretion+is+associated+with+systemic+inflammation+in+obese+humans.">Visceral fat adipokine secretion is associated with systemic inflammation in obese humans.</a> Diabetes. 56 (4), 1010-1013 (2007).</li><li>Tchkonia, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fat+depot-specific+characteristics+are+retained+in+strains+derived+from+single+human+preadipocytes.">Fat depot-specific characteristics are retained in strains derived from single human preadipocytes.</a> Diabetes. 55 (9), 2571-2578 (2006).</li><li>Macotela, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+differences+in+adipocyte+precursor+cells+from+different+white+fat+depots.">Intrinsic differences in adipocyte precursor cells from different white fat depots.</a> Diabetes. 61 (7), 1691-1699 (2012).</li><li>Contreras, G. A., Thelen, K., Ayala-Lopez, N., Watts, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+distribution+and+adipogenic+potential+of+perivascular+adipose+tissue+adipocyte+progenitors+is+dependent+on+sexual+dimorphism+and+vessel+location.">The distribution and adipogenic potential of perivascular adipose tissue adipocyte progenitors is dependent on sexual dimorphism and vessel location.</a> Physiol Rep. 4 (19), (2016).</li><li>Lee, Y. H., Petkova, A. P., Granneman, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+an+adipogenic+niche+for+adipose+tissue+remodeling+and+restoration.">Identification of an adipogenic niche for adipose tissue remodeling and restoration.</a> Cell Metab. 18 (3), 355-367 (2013).</li><li>Lee, Y. H., Petkova, A. P., Mottillo, E. P., Granneman, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+identification+of+bipotential+adipocyte+progenitors+recruited+by+beta3-adrenoceptor+activation+and+high-fat+feeding.">In vivo identification of bipotential adipocyte progenitors recruited by beta3-adrenoceptor activation and high-fat feeding.</a> Cell Metab. 15 (4), 480-491 (2012).</li><li>Ahrens, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+human+bone+morphogenetic+proteins-2+or+-4+in+murine+mesenchymal+progenitor+C3H10T1/2+cells+induces+differentiation+into+distinct+mesenchymal+cell+lineages.">Expression of human bone morphogenetic proteins-2 or -4 in murine mesenchymal progenitor C3H10T1/2 cells induces differentiation into distinct mesenchymal cell lineages.</a> DNA Cell Biol. 12 (10), 871-880 (1993).</li><li>Bowers, R. R., Lane, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+bone+morphogenetic+protein-4+in+adipocyte+development.">A role for bone morphogenetic protein-4 in adipocyte development.</a> Cell Cycle. 6 (4), 385-389 (2007).</li><li>Schulz, T. J., Tseng, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+role+of+bone+morphogenetic+proteins+in+adipogenesis+and+energy+metabolism.">Emerging role of bone morphogenetic proteins in adipogenesis and energy metabolism.</a> Cytokine Growth Factor Rev. 20 (5-6), 523-531 (2009).</li><li>Choi, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+normoxia+enhances+survival+and+proliferation+rate+of+human+adipose+tissue-derived+stromal+cells+without+increasing+the+risk+of+tumourigenesis.">In situ normoxia enhances survival and proliferation rate of human adipose tissue-derived stromal cells without increasing the risk of tumourigenesis.</a> PLoS One. 10 (1), 0115034 (2015).</li><li>Gupta, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zfp423+expression+identifies+committed+preadipocytes+and+localizes+to+adipose+endothelial+and+perivascular+cells.">Zfp423 expression identifies committed preadipocytes and localizes to adipose endothelial and perivascular cells.</a> Cell Metab. 15 (2), 230-239 (2012).</li><li>Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+white+adipocyte+progenitor+cells+in+vivo.">Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo.</a> Cell. 135 (2), 240-249 (2008).</li><li>Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+methods+of+adipogenic+differentiation+of+mesenchymal+stem+cells.">Current methods of adipogenic differentiation of mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells Dev. 20 (10), 1793-1804 (2011).</li><li>Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cell+culture+systems+and+their+applications+in+drug+discovery+and+cell-based+biosensors.">Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors.</a> Assay Drug Dev Technol. 12 (4), 207-218 (2014).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Bu deneyin odak noktası PVAT depolarından APC&#39;nin izolasyonu, genleşmesi ve adipogenik indüksiyonudur. Burada yüzey işaretleri CD34 ve PDGFRα ifade hücrelerin tanımlanması dayalı APC izolasyonu için bir protokol sunuyoruz. Bu yüzey proteinleri daha önce APC üzerinde yüksek proliferasyon oranları ve çeşitli yağ depoları 14,15&#39;te beyaz veya kahverengi adipositleri ayırma potansiyeli ile tanımlandı. Bu belirteçlere dayalı hücreleri seçerek, seçilen PVAT&#39;de gözlemlenen adiposit feno...

Perivasküler Adipoz Doku (PVAT), kan damarlarına yakın olması nedeniyle damar sistemi fonksiyonu 1&#39;de önemli parakrin sinyal bileşenidir. Bu yağ dokusunun genleşmesi, 2 , 3 mevcut Adiposit Progenitör Hücrelerinin (APC) fenotipine bağlıdır. Primer adipositler kırılgan, yüzen ve aralıklı olduğundan, yağ dokularından hücrelerin izolasyonu zordur. Bazı izolasyon teknikleri aynı zamanda hücrelerin bütünlüğünü koruyan bir protokolün önemini vurgulayan, inflamatuvar protein sentezini arttırarak ve adipogenik gen ekspresyonunu azaltarak hücre fenotipini ve morfolojisini değiştirebilir. Birincil hücrelerin kültürü ve spesifik preadiposit alt popülasyonları, in vivo büyümeye indirgemeci bir yaklaşım sağlar ve eşdeğer hücresel genetik yapıyı korur 5 , ancak tiYaşlanma, ya da yaşlanma 6 ile bozulma nedeniyle bu hücrelerle beni sınırlıdır. Deri altı ve omental depolar da dahil olmak üzere çeşitli yağ depolardan preadipositler, spesifik anatomik bölgelerden hücrelerin toplanmasının önemini vurgulayan proliferasyon 7&#39;deki farklılıkları da gösterir. PVAT dışı beyaz yağ depolarından öncül hücreler önceki çalışmalar 7 , 8 , 9&#39;da karakterize edilmiştir, ancak PVAT APC fenotipleri hakkında daha az bilgi bilinmektedir. Burada açıklanan teknikler, morfolojileri, yaşayabilirlikleri ve çoğalması ve farklılaşması potansiyeli üzerinde asgari düzeyde etkisi olan spesifik ve tanımlanmış APC popülasyonlarının analiz edilmesine izin verir. Manyetik olarak aktive olan Hücre Ayırma (MCS), hücrenin değiştirilmeden boncukların çözünmesi nedeniyle kültür gibi müteakip uygulamalara uygundur. MCS de ekonomiktir ve bir kez antikor koniSantitler standart hale getirildiğinden, akış sitometrisi deneylerine olan ihtiyaç azdır. PVAT öncülleri ile yapılan in vitro çalışmalar, bu primer hücrelerin sahip olabileceği potansiyelin bir görüntüsünü de verebilir.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Tissue Dissection&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dissecting Dishes</td><td>Handmade with Silicone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Culture Petri Dish</td><td>Pyrex</td><td></td><td>7740 Glass</td></tr><tr><td>Silicone Elastomer</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 170</td><td>Kit</td></tr><tr><td>Braided Silk Suture</td><td>Harvard Apparatus</td><td>51-7615</td><td>SP104</td></tr><tr><td>Stereomicroscope MZ6</td><td>Leica</td><td></td><td>10447254</td></tr><tr><td>Stereomaster Microscope Fiber-Optic Light Source</td><td>Fisher Scientific</td><td>12562-36</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Scissors</td><td>George Tiemann &amp;amp; Co</td><td>160-150</td><td></td></tr><tr><td>Splinter Forceps</td><td>George Tiemann &amp;amp; Co</td><td>160-55</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Scissors</td><td>George Tiemann &amp;amp; Co</td><td>105-400</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;KRBB Solution&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Sulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7487-88-9</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Phosphate Dibasic</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7758-114</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>50-99-7</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic/Antimicotic</td><td>Corning</td><td>30-004-CI</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Corning</td><td>25-060-CI</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Tissue Digestion&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Collagenase Type 1</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS004196</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>9048-46-8</td><td></td></tr><tr><td>Red Blood Cell Lysis Buffer</td><td>BioLegend</td><td>420301</td><td>1X Working Solution</td></tr><tr><td>Water Bath</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>2876</td><td>Reciprocal Shaking Bath</td></tr><tr><td>Biosafety Cabinet</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>1385</td><td></td></tr><tr><td>Rotisserie Incubator</td><td>Daigger</td><td>EF4894C</td><td></td></tr><tr><td>100 &amp;micro;m Cell Strainer</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>22-363-549</td><td>Yellow</td></tr><tr><td>40 &amp;micro;m Cell Strainer</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>22-363-547</td><td>Blue</td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Cole-Parmer</td><td>UX-79001-00</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93595</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Cell Isolation&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>OctoMACS Kit</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-108</td><td></td></tr><tr><td>(DMEM):F12 Medium</td><td>Corning</td><td>90-090</td><td>Medium Base</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Corning</td><td>35016CV</td><td>USA Origins</td></tr><tr><td>Normal Donkey Serum</td><td>AbCam</td><td>AB7475</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD34</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-7324</td><td>FITC-conjugated</td></tr><tr><td>Anti-PDGFR&amp;alpha;</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>PA5-17623</td><td></td></tr><tr><td>Donkey Anti-Rabbit IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>712-007-003</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-Buffered Saline (PBS) 10X</td><td>Corning</td><td>46-013-CM</td><td>1X Working Solution</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Cell Culture&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Cell Incubator</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>51030285</td><td>Heracell 160i&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>6-Well Plates</td><td>Corning</td><td>3516</td><td>TC-Treated</td></tr><tr><td>48-Well Plates</td><td>Corning</td><td>3548</td><td>TC-Treated</td></tr><tr><td>96-Well Plates, Black Wall</td><td>Corning</td><td>353376</td><td>TC-Treated</td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>144-55-8</td><td>TC-Treated</td></tr><tr><td>Fetal Calf Serum (FCS)</td><td>Corning</td><td>35011CV</td><td>USA Origins</td></tr><tr><td>Ascorbic Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>50-81-7</td><td></td></tr><tr><td>Biotin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>58-85-5</td><td></td></tr><tr><td>Pantothenate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>137-08-6</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Corning</td><td>61-030</td><td></td></tr><tr><td>Bone Morphogenic Protein 4 (BMP4)</td><td>Prospec Bio</td><td>CYT-081</td><td></td></tr><tr><td>Epidermal Growth Factor (EGF)</td><td>PeproTech</td><td>400-25</td><td></td></tr><tr><td>Leukemia Inhibitory Factor</td><td>PeproTech</td><td>250-02</td><td></td></tr><tr><td>Platelet-derived Growth Factor BB</td><td>Prospec Bio</td><td>CYT-740</td><td></td></tr><tr><td>Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF)</td><td>PeproTech</td><td>450-33</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Corning</td><td>25-800-CR</td><td>ITS Solution</td></tr><tr><td>IBMX</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>28822-58-4</td><td></td></tr><tr><td>Dexamethasone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>50-02-2</td><td></td></tr><tr><td>T3 (Triiodothyronine)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>6893-023</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Cell Analysis&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CyQUANT Proliferation Assay</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>C7026</td><td></td></tr><tr><td>AdipoRed Fluorescence Assay Reagent</td><td>Lonza</td><td>PT-7009</td><td></td></tr><tr><td>Oil Red O Lipid Dye Reagent</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O1391</td><td>In Solution</td></tr><tr><td>M1000 Microplate Reader</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eclipse Inverted Microscope</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Digital Sight DS-Qil Camera</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

expansion and adipogenesis induction of adipocyte progenitors from perivascular adipose tissue isolated by magnetic activated cell sorting

Parakrin sinyal vasıtasıyla vasküler fonksiyonların büyük düzenleyicisi olan perivasküler yağ dokusunun (PVAT) genişlemesi, obezite sırasında hipertansiyonun gelişimi ile doğrudan ilişkilidir. Hipertrofi ve hiperplazinin derecesi, depo yer, cinsiyet ve mevcut Adiposit Progenitör Hücre (APC) fenotiplerinin türüne bağlıdır. Son 10 yılda APC ve preadipositler izolasyonu için kullanılan teknikler, spesifik hücre yüzeyi belirteçlerine dayalı olarak tek tek hücrelerin tanımlanabileceği doğruluğunu büyük ölçüde geliştirmiştir. Bununla birlikte, APC ve adipositlerin izolasyonu, özellikle hücrelerin hücre kültürü uygulamaları için muhafaza edilmesi gerekiyorsa, hücrenin kırılganlığından dolayı bir meydan okuma olabilir. Manyetik olarak aktive olan Hücre Ayırma ( MCS), yağ dokusunun ağırlık birimi başına daha fazla canlı APC&#39;yi izole etmek için bir yöntem sağlar. MCS tarafından hasat edilen APC, preapeni genişletmek için in vitro protokoller için kullanılabilirDipositleri ve büyüme faktörü kokteyllerini kullanarak hücreler tarafından tutulan üretken ve adipojenik potansiyelin analizine izin vererek adipositlere ayırdık. Bu deney genişleme sırasında kardiyovasküler hastalığın gelişiminde kilit rol oynayan aortik ve mezenterik PVAT depoları üzerine odaklanmıştır. Bu protokoller, APC&#39;nin tanımlanmış bir popülasyonunu izole etmek, genişletmek ve ayırmak için kullanılan yöntemleri tanımlamaktadır. Bu MCS protokolü, hücrenin sınıflandırılmasına minimum ekipman veya eğitimle ihtiyaç duyulan herhangi bir deneyde izolasyonun kullanılmasını sağlar. Bu teknikler, hücre yüzeyi markörlerinin varlığına dayanan spesifik hücre popülasyonlarının işlevselliğini belirlemek için ileri deneylere yardımcı olabilir.

Preadipositlerin proliferatif kapasitesi ve adiposit öncüllerinin adipojenik potansiyeli, in vitro 11&#39;de muhafaza edilen özelliklerdir. İzole SVF&#39;nin ve APC&#39;nin, erkek sıçanlardan aPVAT, mPVAT ve GON&#39;dan in vitro proliferasyonu, kantitatif bir DNA testi kullanılarak kaplamadan 8, 24, 48 ve 96 saat sonra değerlendirildi. Aynı bölgedeki SVF hücrelerine kıyasla 96 saat daha az proliferasyona sahip olan bir PVA&#3...

Watch this Scientific Journal Video about Expansion and Adipogenesis Induction of Adipocyte Progenitors from Perivascular Adipose Tissue Isolated by Magnetic Activated Cell Sorting at JoVE.com

Expansion and Adipogenesis Induction of Adipocyte Progenitors from Perivascular Adipose Tissue Isolated by Magnetic Activated Cell Sorting

Burada Manyetik Aktif Hücre Ayırma (MCS) kullanarak Perivasküler Adipoz Doku (PVAT) Adiposit Progenitör Hücre (APC) popülasyonlarının izolasyonu için bir yöntem rapor. Bu yöntem, floresan-Aktive Hücre Ayırma (FACS) ile karşılaştırıldığında, yağ dokusunun gramı başına APC&#39;nin artan bir izolasyonuna izin verir.

Manyetik Aktive Hücre Ayırma ile İzole Edilen Perivasküler Adipoz Doku&#39;ndan Adiposit Progenitörlerinin Genleşmesi ve Adipogenez İndüksiyonu

Expansion of Perivascular Adipose Tissue (PVAT), a major regulator of vascular function through paracrine signaling, is directly related to the ...

expansion-adipogenesis-induction-adipocyte-progenitors-from

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.4K Görüntüleme.  Michigan State University.  Burada Manyetik Aktif Hücre Ayırma (MCS) kullanarak Perivasküler Adipoz Doku (PVAT) Adiposit Progenitör Hücre (APC) popülasyonlarının izolasyonu için bir yöntem rapor. Bu yöntem, floresan-Aktive Hücre Ayırma (FACS) ile karşılaştırıldığında, yağ dokusunun gramı başına APC'nin artan bir izolasyonuna izin verir. 

Video: Expansion and Adipogenesis Induction of Adipocyte Progenitors from Perivascular Adipose Tissue Isolated by Magnetic Activated Cell Sorting

Immunomagnetic Separation of Fat Depot-specific Sca1high Adipose-derived Stem Cells (ASCs)

The isolation of adipose-derived stem cells (ASCs) is an important method in the field of adipose tissue biology, adipogenesis, and extracellular matrix (ECM) remodeling. In vivo, ECM-rich environment consisting of fibrillar collagens provides a structural support to adipose tissues during the progression and regression of obesity. Physiological ECM remodeling mediated by matrix metalloproteinases (MMPs) plays a major role in regulating adipose tissue size and function1,2. The loss of physiological collagenolytic ECM remodeling may lead to excessive collagen accumulation (tissue fibrosis), macrophage infiltration, and ultimately, a loss of metabolic homeostasis including insulin resistance3,4. When a phenotypic change of the adipose tissue is observed in gene-targeted mouse models, isolating primary ASCs from fat depots for in vitro studies is an effective approach to define the role of the specific gene in regulating the function of ASCs. In the following, we define an immunomagnetic separation of Sca1high ASCs.

Immunomagnetic Separation of Fat Depot-specific Sca1high Adipose-derived Stem Cells ASCs

We present the techniques required to isolate the stromal vascular fraction (SVF) from mouse inguinal (subcutaneous) and perigonadal (visceral) adipose tissue depots to assess their gene expression and collagenolytic activity. This method includes the enrichment of Sca1high adipose-derived stem cells (ASCs) using immunomagnetic cell separation.

Yağ Deposu özgü SCA1 ve İmmunomanyetik Ayırma<sup&gt; yüksek</sup&gt; Yağ türetilmiş Kök Hücreler (TSK)

The isolation of adipose-derived stem cells (ASCs) is an important method in the field of adipose tissue biology, adipogenesis, and extracellular matrix ...

Gelişim Biyolojisi

Isolation, Culture, and Adipogenic Induction of Neural Crest Original Adipose-Derived Stem Cells from Periaortic Adipose Tissue

An excessive amount of adipose tissue surrounding the blood vessels (perivascular adipose tissue, also known as PVAT) is associated with a high risk of cardiovascular disease. ADSCs derived from different adipose tissues show distinct features, and those from the PVAT have not been well characterized. In a recent study, we reported that some ADSCs in the periaortic arch adipose tissue (PAAT) descend from the neural crest cells (NCCs), a transient population of migratory cells originating from the ectoderm.
In this paper, we describe a protocol for isolating red fluorescent protein (RFP)-labeled NCCs from the PAAT of Wnt-1 Cre+/-;Rosa26RFP/+ mice and inducing their adipogenic differentiation in vitro. Briefly, the stromal vascular fraction (SVF) is enzymatically dissociated from the PAAT, and the RFP+ neural crest derived ADSCs (NCADSCs) are isolated by fluorescence activated cell sorting (FACS). The NCADSCs differentiate into both brown and white adipocytes, can be cryopreserved, and retain their adipogenic potential for ~3&#8211;5 passages. Our protocol can generate abundant ADSCs from the PVAT for modeling PVAT adipogenesis or lipogenesis in vitro. Thus, these NCADSCs can provide a valuable system for studying the molecular switches involved in PVAT differentiation.

We present a protocol for the isolation, culture, and adipogenic induction of neural crest derived adipose-derived stem cells (NCADSCs) from the periaortic adipose tissue of Wnt-1 Cre+/-;Rosa26RFP/+ mice. The NCADSCs can be an easily accessible source of ADSCs for modeling adipogenesis or lipogenesis in vitro.

Periaortik Yağ Dokusundan Nöral Adipoz-Türetilmiş Kök Hücrelerin İzolasyon, Kültür ve Adipojenik İndüksiyonu

An excessive amount of adipose tissue surrounding the blood vessels (perivascular adipose tissue, also known as PVAT) is associated with a high risk of ...

<meta charset="utf8"></head><body>Fibro-Adipojenik Progenitör Kültür için Fare Kalbi ve İskelet Kası Sindirimi

Fibro-Adipogenic Progenitor Isolation, Expansion, and Differentiation from the Spiny Mouse Model

Due to its exceptional repair program, the spiny mouse is an emerging research model for regenerative medicine. Fibro-adipogenic progenitors are tissue-resident cells that are able to differentiate into adipocytes, fibroblasts, and chondrocytes. Fibro-adipogenic progenitors are fundamental for orchestrating tissue regeneration as they are responsible for extracellular matrix remodeling after injury. This study focuses on investigating the specific role of fibro-adipogenic progenitors in spiny mouse cardiac repair and skeletal muscle regeneration. To this end, a protocol has been optimized for the purification of spiny mouse fibro-adipogenic progenitors by flow cytometry from enzymatically dissociated skeletal and cardiac muscle. The population obtained from this protocol is capable of expanding in vitro, and can be differentiated to myofibroblasts and adipocytes. This protocol offers a valuable tool for researchers to examine the distinctive properties of spiny mouse, and to compare them to the Mus musculus. This will provide insights that could advance the understanding of regenerative mechanisms in this intriguing model.

<meta charset="utf8"></head><body>Yazar Spotlight: Dikenli Fare Modellerini İncelemek İçin Yenilikçi Bir Protokolle Hücre Analizini Kolaylaştırma

This protocol outlines the isolation of skeletal and cardiac muscle fibro-adipogenic progenitors (FAPs) from spiny mouse (Acomys) via enzymatic dissociation and fluorescence-activated cell sorting. The FAPs obtained from this protocol can be effectively expanded and differentiated to myofibroblasts and adipocytes.

Dikenli Fare Modelinden Fibro-Adipojenik Progenitör İzolasyonu, Genişlemesi ve Farklılaşması

Due to its exceptional repair program, the spiny mouse is an emerging research model for regenerative medicine. Fibro-adipogenic progenitors are ...

Isolation, Expansion, and Adipogenic Induction of CD34+CD31+ Endothelial Cells from Human Omental and Subcutaneous Adipose Tissue

Obesity is accompanied by an extensive remodeling of adipose tissue primarily via adipocyte hypertrophy. Extreme adipocyte growth results in a poor response to insulin, local hypoxia, and inflammation. By stimulating the differentiation of functional white adipocytes from progenitors, radical hypertrophy of the adipocyte population can be prevented and, consequently, the metabolic health of adipose tissue can be improved along with a reduction of inflammation. Also, by stimulating a differentiation of beige/brown adipocytes, the total body energy expenditure can be increased, resulting in weight loss. This approach could prevent the development of obesity co-morbidities such as type 2 diabetes and cardiovascular disease.
This paper describes the isolation, expansion, and differentiation of white and beige adipocytes from a subset of human adipose tissue endothelial cells that co-express the CD31 and CD34 markers. The method is relatively cheap and is not labor-intensive. It requires access to human adipose tissue and the subcutaneous depot is suitable for sampling. For this protocol, fresh adipose tissue samples from morbidly obese subjects [body mass index (BMI) &#62;35] are collected during bariatric surgery procedures. Using a sequential immunoseparation from the stromal vascular fraction, enough cells are produced from as little as 2&#8211;3 g of fat. These cells can be expanded in culture over 10&#8211;14 days, can be cryopreserved, and retain their adipogenic properties with passaging up to passage 5&#8211;6. The cells are treated for 14 days with an adipogenic cocktail using a combination of human insulin and the PPAR&#947; agonist-rosiglitazone.
This methodology can be used for obtaining proof of concept experiments on molecular mechanisms that drive adipogenic responses in adipose endothelial cells, or for screening new drugs that can enhance the adipogenic response directed either towards white or beige/brown adipocyte differentiation. Using small subcutaneous biopsies, this methodology can be used to screen out non-responder subjects for clinical trials aimed to stimulate beige/brown and white adipocytes for the treatment of obesity and co-morbidities.

The differentiation of white and beige adipocytes from adipose tissue vascular progenitors bears potential for metabolic improvement in obesity. We describe protocols for a CD34+CD31+ endothelial cell isolation from human fat and for a subsequent in vitro expansion and differentiation into white and beige adipocytes. Several downstream applications are discussed.

Yalıtım, genişleme ve Adipojenik indüksiyon CD34 + CD31 + insan Omental ve deri altı yağ dokusu endotel hücrelerden

Obesity is accompanied by an extensive remodeling of adipose tissue primarily via adipocyte hypertrophy. Extreme adipocyte growth results in a poor ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Isolation of Adipogenic and Fibro-Inflammatory Stromal Cell Subpopulations from Murine Intra-Abdominal Adipose Depots

The stromal-vascular fraction (SVF) of white adipose tissue (WAT) is remarkably heterogeneous and consists of numerous cell types that contribute functionally to the expansion and remodeling of WAT in adulthood. A tremendous barrier to studying the implications of this cellular heterogeneity is the inability to readily isolate functionally distinct cell subpopulations from WAT SVF for in vitro and in vivo analyses. Single-cell sequencing technology has recently identified functionally distinct fibro-inflammatory and adipogenic PDGFR&#946;+ perivascular cell subpopulations in intra-abdominal WAT depots of adult mice. Fibro-inflammatory progenitors (termed, &#8220;FIPs&#8221;) are non-adipogenic collagen producing cells that can exert a pro-inflammatory phenotype. PDGFR&#946;+ adipocyte precursor cells (APCs) are highly adipogenic both in vitro and in vivo upon cell transplantation. Here, we describe multiple methods for the isolation of these stromal cell subpopulations from murine intra-abdominal WAT depots. FIPs and APCs can be isolated by fluorescence-activated cell sorting (FACS) or by taking advantage of biotinylated antibody-based immunomagnetic bead technology. Isolated cells can be used for molecular and functional analysis. Studying the functional properties of stromal cell subpopulation in isolation will expand our current knowledge of adipose tissue remodeling under physiological or pathological conditions on the cellular level.

This protocol describes the technical approach to isolate adipogenic and fibro-inflammatory stromal cell subpopulations from murine intra-abdominal white adipose tissue (WAT) depots by fluorescence-activated cell sorting or immunomagnetic bead separation.

Murin İntraabdominal Yağ Depolarından Adipojenik ve Fibroinflamatuar Stromal Hücre Alt Popülasyonlarının İzolasyonu

The stromal-vascular fraction (SVF) of white adipose tissue (WAT) is remarkably heterogeneous and consists of numerous cell types that contribute ...

Differentiation Capacity of Human Aortic Perivascular Adipose Progenitor Cells

Adipose tissue is a rich source of multi-potent mesenchymal stem cells (MSC) capable of differentiating into osteogenic, adipogenic, and chondrogenic lineages. Adipogenic differentiation of progenitor cells is a major mechanism driving adipose tissue expansion and dysfunction in response to obesity. Understanding changes to perivascular adipose tissue (PVAT) is thus clinically relevant in metabolic disease. However, previous studies have been predominately performed in the mouse and other animal models. This protocol uses human thoracic PVAT samples collected from patients undergoing coronary artery bypass graft surgery. Adipose tissue from the ascending aorta was collected and used for explantation of the stromal vascular fraction. We previously confirmed the presence of adipose progenitor cells in human PVAT with the capacity to differentiate into lipid-containing adipocytes. In this study, we further analyzed the differentiation potential of cells from the stromal vascular fraction, presumably containing multi-potent progenitor cells. We compared PVAT-derived cells to human bone marrow MSC for differentiation into adipogenic, osteogenic, and chondrogenic lineages. Following 14 days of differentiation, specific stains were utilized to detect lipid accumulation in adipocytes (Oil red O), calcific deposits in osteogenic cells (Alizarin Red), or glycosaminoglycans and collagen in chondrogenic cells (Masson&#8217;s Trichrome). While bone marrow MSC efficiently differentiated into all three lineages, PVAT-derived cells had adipogenic and chondrogenic potential, but lacked robust osteogenic potential.

The goal of this protocol is to test the ability of progenitor cells derived from human perivascular adipose tissue to differentiate into multiple cell lineages. Differentiation was compared to mesenchymal stem cells derived from human bone marrow, which is known to differentiate into adipocyte, osteocyte, and chondrocyte lineages.

İnsan aort Perivasküler yağ progenitör hücre farklılaşması kapasitesi

Adipose tissue is a rich source of multi-potent mesenchymal stem cells (MSC) capable of differentiating into osteogenic, adipogenic, and chondrogenic ...

Biyoloji

Preparation of Adipose Progenitor Cells from Mouse Epididymal Adipose Tissues

Obesity and metabolic disorders such as diabetes, heart disease, and cancer, are all associated with dramatic adipose tissue remodeling. Tissue-resident adipose progenitor cells (APCs) play a key role in adipose tissue homeostasis and can contribute to the tissue pathology. The growing use of single cell analysis technologies &#8211; including single-cell RNA-sequencing and single-cell proteomics &#8211; is transforming the stem/progenitor cell field by permitting unprecedented resolution of individual cell expression changes within the context of population- or tissue-wide changes. In this article, we provide detailed protocols to dissect mouse epididymal adipose tissue, isolate single adipose tissue-derived cells, and perform fluorescence activated cell sorting (FACS) to enrich for viable Sca1+/CD31-/CD45-/Ter119- APCs. These protocols will allow investigators to prepare high quality APCs suitable for downstream analyses such as single cell RNA sequencing.

We present a simple method to isolate highly viable adipose progenitor cells from mouse epididymal fat pads using fluorescence activated cell sorting.

Fare Epidididimal Yağ Dokularından Yağ Progenitör Hücrelerinin Hazırlanması

Obesity and metabolic disorders such as diabetes, heart disease, and cancer, are all associated with dramatic adipose tissue remodeling. Tissue-resident ...

Murin Beyaz Yağ Dokusunun Yarı Otomatik İzolasyonu

Semi-Automated Isolation of the Stromal Vascular Fraction from Murine White Adipose Tissue Using a Tissue Dissociator

The in vitro study of white, brown, and beige adipocyte differentiation enables the investigation of cell-autonomous functions of adipocytes and their mechanisms. Immortalized white preadipocyte cell lines are publicly available and widely used. However, the emergence of beige adipocytes in white adipose tissue in response to external cues is difficult to recapitulate to the full extent using publicly available white adipocyte cell lines. Isolation of the stromal vascular fraction (SVF) from murine adipose tissue is commonly executed to obtain primary preadipocytes and perform adipocyte differentiation. However, mincing and collagenase digestion of adipose tissue by hand can result in experimental variation and is prone to contamination. Here, we present a modified semi-automated protocol that utilizes a tissue dissociator for collagenase digestion to achieve easier isolation of the SVF, with the aim of reducing experimental variation, reducing contamination, and increasing reproducibility. The obtained preadipocytes and differentiated adipocytes can be used for functional and mechanistic analyses.

Yazar Spotlight: Murin Beyaz Yağ Dokusundan Stromal Vasküler Fraksiyonun Bir Doku Ayrıştırıcı Kullanılarak Yarı Otomatik İzolasyonu  

This protocol describes the semi-automated isolation of the stromal vascular fraction (SVF) from murine adipose tissue to obtain preadipocytes and achieve adipocyte differentiation in vitro. Using a tissue dissociator for collagenase digestion reduces experimental variation and increases reproducibility.

Bir Doku Dissosiyatör Kullanarak Stromal Vasküler Fraksiyonun Murin Beyaz Yağ Dokusundan Yarı Otomatik İzolasyonu

The in vitro study of white, brown, and beige adipocyte differentiation enables the investigation of cell-autonomous functions of adipocytes and their ...

Manyetik Aktive Hücre Ayırma ile İzole Edilen Perivasküler Adipoz Doku'ndan Adiposit Progenitörlerinin Genleşmesi ve Adipogenez İndüksiyonu

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Yağ Deposu özgü SCA1 ve İmmunomanyetik Ayırma

Periaortik Yağ Dokusundan Nöral Adipoz-Türetilmiş Kök Hücrelerin İzolasyon, Kültür ve Adipojenik İndüksiyonu

Dikenli Fare Modelinden Fibro-Adipojenik Progenitör İzolasyonu, Genişlemesi ve Farklılaşması

Dikenli Fare Modelinden Fibro-Adipojenik Progenitör İzolasyonu, Genişlemesi ve Farklılaşması

Dikenli Fare Modelinden Fibro-Adipojenik Progenitör İzolasyonu, Genişlemesi ve Farklılaşması

Yalıtım, genişleme ve Adipojenik indüksiyon CD34 + CD31 + insan Omental ve deri altı yağ dokusu endotel hücrelerden

Murin İntraabdominal Yağ Depolarından Adipojenik ve Fibroinflamatuar Stromal Hücre Alt Popülasyonlarının İzolasyonu

İnsan aort Perivasküler yağ progenitör hücre farklılaşması kapasitesi

Fare Epidididimal Yağ Dokularından Yağ Progenitör Hücrelerinin Hazırlanması

Bir Doku Dissosiyatör Kullanarak Stromal Vasküler Fraksiyonun Murin Beyaz Yağ Dokusundan Yarı Otomatik İzolasyonu