George Kilisesi laboratuvar pJA1 plazmid tür hediye için teşekkür ederiz. Ben Fabienne Hamburger ve Alex Boehm Urs Jenal laboratuarından Biozentrum Basel, bakteriyel konjugasyon yardım ve BW20767 zorlanma sağlamak için teşekkür ederiz. Ayrıca yararlı düzenlemeler için Olin Silander teşekkür ederiz. Bu araştırma için fon fon Massey Üniversitesi Yeni Zelanda ve sistemleri biyoloji (proje "Savaş Dirk Bumann layık X") İsviçreli girişimi tarafından Basel, İsviçre Üniversitesi sağlandı.

dikkat: S. flexneri alıcı bir yük kullanılıyorsa, S. flexneri gastrointestinal hastalık neden olabilir bir insan patojen olduğuna dikkat ediniz. S. flexneri ilgili deneyler (BSL-2 Avrupa ve ABD veya Yeni Zelanda PC2 belirlenmiştir) uygun Biyogüvenlik önlemleri ile gerçekleştirilmelidir. Bu iletişim kuralıyla ilişkili video gerçekleştirilen tüm deneyler yapılmıştır iyi karakterize alıcı zorlanma patojenik olmayan E. coli kullanarak bir PC1 ortamda MG1655. Shigella flexneri çalışmak daha önce yapılan Biozentrum Basel, BSL-2 laboratuarda 6 ' da açıklandığı gibi.
 Not: aşağıdaki deneme etkili bir şekilde iki kez yapılır. İlk bölümü (adım adım 1.1 - 4.5) kaplama için en iyi seyreltme amaç konjügasyon plaka başına birçok bireysel koloniler, ama o kadar çok bu veren bir seyreltme çim formları bulmak için nerede Kütüphane bulmak için gerçekleştirilir. Bu önemli ölçüde azaltılmış fitness mutantlarla ve bu daha güçlü fitness ile arasındaki rekabet azaltmaktır. İkinci bölümü (adımları 5.1-7,4) son Kütüphane nerede birçok plakaları, Kütüphane seyreltme uygun yaymak, oluşturulmasıdır.
 1. hazırlamak bir gün önce deney için <ol><li>Inoculate, donmuş bir hisse senedi LB suyu, 2 ml donör zorlanma dan Millers tarifi (10 g/L, NaCl) medya 100 µg/mL, Ampisilin içeren. Burada kullanılan donör zorlanma E. coli yük pJA1 plazmid 11 yataklık BW20767 15 olduğunu. Ampisilin kullanımı seçimi için pJA1 plazmid korur.</li>
	<li>Inoculate, bir koloni veya dondurulmuş hisse senedi, 2 ml LB medya Ampisilin veya sefaloridin dışında bir direnç marker ile alıcı zorlanma. Burada kullanılan alıcı yük E. coli olduğunu &#34; vahşi türü &#34; MG1655 17 , 18 spontan direnç mutant nalidixic asit ile süzün. 30 µg/mL nalidixic asit büyüyor.</li>
	<li>Et suyu %1,5 agar içeren 20 Luria hazırlamak (90 mM petri yemeklerinde, yaklaşık 12,5 mL) tabaklar. Birkaç ay öncesine kadar kullanım için antibiyotik eksik Ağar kaplamalar 4 ° C'de saklanabilir.</li>
	<li>20 Luria suyu hazırlamak içeren % 1.5 agar levha (90 mM petri yemekler, yaklaşık 12,5 mL) hem 30 µg/mL nalidixic asit ve 50 µg/mL (LBA Nal30 Kan50), sefaloridin içeren. Antibiyotik içeren Ağar kaplamalar saklanabilir 4 ° C'de karanlıkta birkaç ay öncesine kadar kullanım için.</li>
	<li>200 mL steril LB ortam hazırlamak. LB medya birkaç ay için oda sıcaklığında saklanabilir.</li>
	<li>100 mm 1 mL steril IPTG, stokunun üretici göre hazırlamak &#39; s yönergeleri.</li>
</ol> 2. Bakteriyel çiftleşme veya fiil <ol><li>gecede kültür büyük donör yük 14.000 x 1 dakika santrifüj 1 mL g oda sıcaklığında. Büyüme medya atmak. Bu adım antibiyotik içeren tüm büyüme medyasını çıkarmaya olanak yapılıyor.</li>
	<li>Hücre Pelet böylece kültür konsantre 110 µL lb (antibiyotik içeren değil), resuspend.</li>
	<li>Kullanma steril forseps, pozisyon bir steril nitroselüloz filtre (alternatif olarak steril bir Bloting kağıt parçası, kullanılabilir malzemeleri görmek liste) orta (antibiyotik içeren değil) bir LBA plaka üzerine. Plaka etiket &#34; negatif kontrol: donör &#34;.</li>
	<li>Bir pipet kullanmadan bırak filtre üzerine konsantre donör kültürünün 50 µL.</li>
	<li>Plaka etiketleme 2.1-4 alıcı zorlanma için adımları yineleyin &#34; negatif kontrol: alıcı. &#34;</li>
	<li>Kitaplık için donör (Kimden adım 2.2) ve 50 µL (Kimden adım 2.5) (antibiyotikler bu tabak değil içermelidir) bir LBA plaka üzerinde alıcı baskı üzerine tek bir steril filtre 50 µL bırak. Bu plaka etiket &#34; kitaplığı. &#34; çiftleşme oluşur çünkü donör ve alıcı filtresini yakın fiziksel temas içinde.</li>
	<li>6 h. için 37 ° C'de filtreleri içeren Ağar kaplamalar yerleştirin</li>
</ol> 3. PJA1 Transposon Transposase IPTG indüksiyon tarafından aktivasyonu <ol><li>hazırla üç 15 mL konik şişeleri LB IPTG ile 2 mL, 1 mM (Yani, IPTG, 100 mM stokunun 20 µL) son bir konsantrasyon içeren. Her etiket: donör denetim, alıcı kontrol ve kitaplık.</li>
	<li>Plakaları büyüme (Kimden adım 2.4) 37 ° c 6 h sonra da kuluçka kaldırın. Bazı bakterilerin büyüme üzerinde filtre görünür olmalıdır.</li>
	<li>Kullanma steril forseps, filtre kağıdı donör denetiminden kaldırmak ve donör denetim (adımından 3.1) etiketli 15 mL konik şişeyi yere koyun. Aynı şeyi alıcı kontrol ve Kütüphane için.</li>
	<li>Filtre kağıdı 15 mL konik şişenin altına almak ve bu tamamen LB. içinde sular altında emin olmak için tüplerin musluk</li>
	<li>: Yüksek nitroselüloz filtre bakterilerden ilişkisini kaldırmak için en az bir dakika girdap tüpleri. LB bakteri hücreleri ( Şekil 2) ile bulutlu haline gelmelidir.</li>
	<li>Steril cam boncuk veya steril bir ayırıcı kullanarak plaka vortexed bakteri süspansiyon etiketli LBA Nal30 Kan50 levha üzerine donör denetiminden 200 µL &#34; donör denetim, 200 µL &#34;.</li>
	<li>(3.6) Yukarıdaki plakaları etiketleme alıcı kontrol için tekrar &#34; alıcı kontrol, 200 µL &#34;.</li>
	<li>(3,7) Yukarıdaki plakaları etiketleme kitaplık için tekrar &#34; Kütüphane, 200 µL &#34;.</li>
	<li>Yapmak ek dilutions (Yani, 1:5, 1:10 ve 1: 100 dilutions, antibiyotik bir eritici değil içeren LB kullanarak) Kütüphane. Plaka 200 µl su katılmamış Kütüphane ve üzerine ek dilutions uygun şekilde etiketli LBA Nal30 Kan50 plakaları.</li>
	<li>37 ° C yer kalıplara kuluçka fitness büyük kaybolmasına bir gen eklenmiş Transpozonlar ile 18 h. klonlar için büyümek ve plaka üzerinde görünür daha uzun sürebilir. Çeşitli koloni boyutları ( şekil 3) olmalıdır. Donör ve alıcı zorlanma plakaları yok kolonileri üzerlerinde olmalı.</li>
</ol> 4. Son Mutant kitaplığı için kullanılmak üzere kitaplık uygun seyreltme tercih <ol><li>büyüklü küçüklü birçok koloniler bu verimleri adım 3.9 kitaplığından bir seyreltme yeterince aralıklı belirleme. Amaç koloniler başka bir birleştirme ve kaynakları için rekabet gibi birçok koloniler mümkün bir plaka üzerinde ama çok fazla olarak elde etmektir. Bu sayı yaklaşık 500-2000 kolonileri tabak başı olmalıdır. Uygun koloni yoğunlukları bir plaka üzerinde bir örneği şekil 3 ' te gösterilen.</li>
	<li>Kolonileri plakaları kaydedin.</li>
	<li>Fiil (conjugants alıcı hücre başına sayısı) frekansını hesaplamak. Bu 1 x 10 -4 1 x 10 -6 19 aralığında olmalıdır.</li>
	<li>Tabanlı üzerinde aşağı akım uygulamaları son kütüphanede istenen mutantlar sayısını belirleyin. Birçok kullanıcı sade bir şekilde mümkün olduğunca çok sayıda mutantlarla bir kütüphanesi gerekli. Teorik olarak çok transposon eklemeleri mümkün oluşturmak için (bir ekleme her baz çifti), yaklaşık amacıly baz çifti olarak (örneğin, E. coli için ~4.5 x 10 6) genom aynı sayıda kolonileri tam olarak tüm olası transposon eklemeleri ile genom doyurmak için. Dikkat edilmesi gereken birçok mutantlar eklemeleri temel içinde barındıran önemli ya da işlevsel olarak önemli genler olmak yeniden elde etmek, mümkün olmayacaktır bu mutasyonlar alıcıya ölümcül olacak.</li>
	<li>İlk kütüphane ne kadar hacmi istediğiniz boyuta bir kütüphane oluşturmak için gerekli hesaplar. Örneğin, 5 x 10 4 mutantlar istediğiniz kitaplığı boyutudur. En iyi aralığı ile seyreltme kolonileri kimden adım 3,9 1:10 200 µL yapıldı seyreltme. Bu plaka üzerinde koloni sayısı yaklaşık 2.000 koloniler olduğu tahmin edilmektedir. 5 x 10 4 mutantlar ihtiyaç vardır ve her plaka 2000 kolonileri vardır, sonra 25 plakaları bu seyreltme gerekecektir.</li>
</ol> 5. Son Mutant Kütüphane yaratılması <ol><li>(bkz. Adım 4.4) gerektiği gibi adımda 1.4 tabak sayısını ayarlama adımları 1-3,8, yineleyin.</li>
	<li>3,9 adımda istediğiniz boyuta kitaplığı oluşturmak için gerektiği kadar çok sayıda tabak üzerine 4.1. adımda seçilen seyreltme plaka (bkz. Adım 4.4).</li>
</ol> 6. Kütüphane yoğunluğu tahmin <ol><li>kaç kolonileri orada plaka çoğu saymak ve böylece ne kadar yoğun kütüphanesidir, kaba bir tahmin almak. Örneğin: 2 x 10 5 kolonileri toplam kaplama. E. coli MG1655 genom 6 baz çifti yaklaşık 4.5 x 10'dur. Bu nedenle, yaklaşık 2 x 10 5 bir kitaplıkla bir INSERT ortalama yoktur anlamına gelir her 22 baz çifti ekler ve yaklaşık 1 x 10 3 baz çifti her gen yaklaşık 45 kez, o bir gen verilen mutasyona olmasıdır. Eklemeler temel genlerde bu kitaplıkta çok underrepresented olması muhtemeldir ve böylece gerekli olmayan genler dansitesi bundan daha büyük olması muhtemeldir. Bir geniş tahmini transposon yoğunluğu ile bu tür hesaplama sağlar.</li>
</ol> 7. Transposon Kütüphane ve depolama havuzu <ol><li>kolonilerin sayımı sonra 1 mL LB (veya daha fazla, gerektiği gibi) eklemek için kütüphane plaka ve plaka bakterileri kazımak için steril bir ayırıcı kullanın. Bakteriyel süspansiyon çıkarın ve 50 mL veya 15 mL konik şişede yerleştirin. Tekrar ediyorum tüm plakaları için.</li>
	<li>Girdap bir dakika için havuza alınan bakteri süspansiyon süspansiyon lunaparkçı.</li>
	<li>% 20 son bir konsantrasyon için steril gliserol ekleyin.
	<ol><li>Kolay yeniden büyüme için 100 x 20 µL aliquots 0.25 mL tüpler hazırlayın.</li>
		<li>En az iki veya daha fazla 1 mL cryovials içinde aliquot hazır olun.</li>
	</ol></li> <li>Bütün aliquots-80 ° C'de depolayın</li></ol>

<ol>
	<li>Camacho, L. R., Ensergueix, D., Perez, E., Gicquel, B., Guilhot, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+virulence+gene+cluster+of+Mycobacterium+tuberculosis+by+signature-tagged+transposon+mutagenesis.">Identification of a virulence gene cluster of Mycobacterium tuberculosis by signature-tagged transposon mutagenesis.</a> Mol Microbiol. 34 (2), 257-267 (1999).</li><li>Hensel, M., Shea, J. E., Gleeson, C., Jones, M. D., Dalton, E., Holden, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+identification+of+bacterial+virulence+genes+by+negative+selection.">Simultaneous identification of bacterial virulence genes by negative selection.</a> Science. 269 (5222), 400-403 (1995).</li><li>Glass, J. I., Assad-Garcia, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+genes+of+a+minimal+bacterium.">Essential genes of a minimal bacterium.</a> PNAS. 103 (2), 425-430 (2006).</li><li>Salama, N. R., Shepherd, B., Falkow, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+transposon+mutagenesis+and+essential+gene+analysis+of+Helicobacter+pylori.">Global transposon mutagenesis and essential gene analysis of Helicobacter pylori.</a> J Bacteriol. 186 (23), 7926-7935 (2004).</li><li>Akerley, B. J., Rubin, E. J., Camilli, A., Lampe, D. J., Robertson, H. M., Mekalanos, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+identification+of+essential+genes+by+in+vitro+mariner+mutagenesis.">Systematic identification of essential genes by in vitro mariner mutagenesis.</a> PNAS. 95 (15), 8927-8932 (1998).</li><li>Freed, N. E., Bumann, D., Silander, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+Shigella+Tn-seq+data+with+gold-standard+E.+coli+gene+deletion+data+suggests+rare+transitions+between+essential+and+non-essential+gene+functionality.">Combining Shigella Tn-seq data with gold-standard E. coli gene deletion data suggests rare transitions between essential and non-essential gene functionality.</a> BMC Microbiology. 16 (1), 1-14 (2016).</li><li>van Opijnen, T., Bodi, K. L., Camilli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tn-seq:+high-throughput+parallel+sequencing+for+fitness+and+genetic+interaction+studies+in+microorganisms.">Tn-seq: high-throughput parallel sequencing for fitness and genetic interaction studies in microorganisms.</a> Nature Methods. 6 (10), 767-772 (2009).</li><li>Langridge, G. C., Phan, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+assay+of+every+Salmonella+Typhi+gene+using+one+million+transposon+mutants.">Simultaneous assay of every Salmonella Typhi gene using one million transposon mutants.</a> Genome Research. 19 (12), 2308-2316 (2009).</li><li>Gawronski, J. D., Wong, S. M. S., Giannoukos, G., Ward, D. V., Akerley, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+insertion+mutants+within+libraries+by+deep+sequencing+and+a+genome-wide+screen+for+Haemophilus+genes+required+in+the+lung.">Tracking insertion mutants within libraries by deep sequencing and a genome-wide screen for Haemophilus genes required in the lung.</a> PNAS. 106 (38), 16422-16427 (2009).</li><li>Chan, K., Kim, C. C., Falkow, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray-based+detection+of+Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium+transposon+mutants+that+cannot+survive+in+macrophages+and+mice.">Microarray-based detection of Salmonella enterica serovar Typhimurium transposon mutants that cannot survive in macrophages and mice.</a> Infect and Immun. 73 (9), 5438-5449 (2005).</li><li>Badarinarayana, V., Estep, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+analyses+of+insertional+mutants+using+subgenic-resolution+arrays.">Selection analyses of insertional mutants using subgenic-resolution arrays.</a> Nature biotechnol. 19 (11), 1060-1065 (2001).</li><li>Bender, J., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IS10+transposase+mutations+that+specifically+alter+target+site+recognition.">IS10 transposase mutations that specifically alter target site recognition.</a> The EMBO Journal. 11 (2), 741-750 (1992).</li><li>Shafferman, A., Helinski, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+properties+of+the+beta+origin+of+replication+of+plasmid+R6K.">Structural properties of the beta origin of replication of plasmid R6K.</a> J Biol Chem. 258 (7), 4083-4090 (1983).</li><li>Langridge, G. C., Phan, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+assay+of+every+Salmonella+Typhi+gene+using+one+million+transposon+mutants.">Simultaneous assay of every Salmonella Typhi gene using one million transposon mutants.</a> Genome Research. 19 (12), 2308-2316 (2009).</li><li>Metcalf, W. W., Jiang, W., Daniels, L. L., Kim, S. K., Haldimann, A., Wanner, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditionally+replicative+and+conjugative+plasmids+carrying+lacZ+alpha+for+cloning,+mutagenesis,+and+allele+replacement+in+bacteria.">Conditionally replicative and conjugative plasmids carrying lacZ alpha for cloning, mutagenesis, and allele replacement in bacteria.</a> Plasmid. 35 (1), 1-13 (1996).</li><li>Badarinarayana, V., Estep, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+analyses+of+insertional+mutants+using+subgenic-resolution+arrays.">Selection analyses of insertional mutants using subgenic-resolution arrays.</a> Nature biotechnol. 19 (11), 1060-1065 (2001).</li><li>Guyer, M. S., Reed, R. R., Steitz, J. A., Low, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+Sex-factor-affinity+Site+in+E.+coli+as+&#947;&#948;.">Identification of a Sex-factor-affinity Site in E. coli as &#947;&#948;.</a> Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 45, 135-140 (1981).</li><li>Blattner, F. R., Plunkett, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Complete+Genome+Sequence+of+Escherichia+coli+K-12.">The Complete Genome Sequence of Escherichia coli K-12.</a> Science. 277 (5331), 1453-1462 (1997).</li><li>Alexeyev, M. F., Shokolenko, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mini-Tn10+transposon+derivatives+for+insertion+mutagenesis+and+gene+delivery+into+the+chromosome+of+gram-negative+bacteria.">Mini-Tn10 transposon derivatives for insertion mutagenesis and gene delivery into the chromosome of gram-negative bacteria.</a> Gene. 160 (1), 59-62 (1995).</li><li>Kvitko, B. H., Bruckbauer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+construction+of+pir++Enterobacterial+hosts+for+maintenance+of+R6K+replicon+plasmids.">A simple method for construction of pir+ Enterobacterial hosts for maintenance of R6K replicon plasmids.</a> BMC Res Notes. 5 (1), 157 (2012).</li><li>Barrick, J. E., Yu, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+evolution+and+adaptation+in+a+long-term+experiment+with+Escherichia+coli.">Genome evolution and adaptation in a long-term experiment with Escherichia coli.</a> Nature. 461 (7268), 1243-1247 (2009).</li><li>Jacobs, M. A., Alwood, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+transposon+mutant+library+of+Pseudomonas+aeruginosa.">Comprehensive transposon mutant library of Pseudomonas aeruginosa.</a> PNAS. 100 (24), 14339-14344 (2003).</li><li>van Opijnen, T., Camilli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposon+insertion+sequencing:+a+new+tool+for+systems-level+analysis+of+microorganisms.">Transposon insertion sequencing: a new tool for systems-level analysis of microorganisms.</a> Nature Rev Microbiol. 11 (7), 435-442 (2013).</li></ol>

Yazar ifşa etmek hiçbir şey vardır.

Burada açıklanan iletişim kuralı yoğun ekleme Kütüphane yapımı için izin verir. Bu yöntemi bir transposon kitaplığı oluşturma kullanma altındaki Kültür Cilt65 mL 2 x 10 üzerinden5 benzersiz transposon mutantlar ile olanak sağlar. Bunu gerçekleştirmek nispeten kolaydır, reaktifler en temel Mikrobiyoloji laboratuarlarında kullanılabilir kullanır ölçeklenebilir ve az pahalı ekipman veya elektroporasyon cuvettes gibi sarf malzemeleri şekilde gerektirir.
Bu yöntemin önemli bir yararı teorisinde, kullanıcı geniş enlem enterobacterial alıcı suş seçiminde, olmasıdır. Bu kağıt, diğerlerinin yanı sıra11, E. coli pJA1 plazmid Shigella flexneri6 ve Salmonella enterica gibi diğer enterobacterial alıcı türleri ile başarılı bir şekilde kullanılmıştır ancak alıcı bir yük kullanın serovar Typhimurium süzün SL134410. Teorik olarak, pJA1 (oriR6Kγ) çoğaltmasında γ kökeni bu plazmid alıcı zorlanma olduğunu sağlayan bir geniş ana Aralık19, devam etmesine izin verir pır +. Son zamanlarda, yeni yöntemler pır + enterobacterial suşları20ek bir esneklik veren, bir dizi yapımı için izin tarif edilmistir. Buna ek olarak, pJA1 içinde RP4 plazmid300 baz çifti çete bölgesinden bu plazmid Konjügatif transferini gram negatif bakteri suşları19geniş bir yelpazesi için sağlar. Çeşitli şartlar yerine getirildiği sürece Basitçe söylemek gerekirse, bu yöntem teorik olarak alıcı suşları, çeşitli ile kullanılabilir: piryük olduğunu + ve sefaloridin dışında ve donör zorlanma dışında bir antibiyotik direnci ile işaretlenir.
Protokol kritik bir adımda dışarı adım 4.1 plaka hücrelerinin doğru sayısı tahmini yaparken yatıyor. Koloniler çok yakından aralıklı, plaka üzerinde besinler için rekabet ve daha az uygun mutant outcompeted. Bu mutant toplam sayısı bir azalma neden olabilir. Alternatif olarak, koloniler aralıklandırılmış Eğer çok çok ayrı plaka üzerinde çok az kolonileri olacak ve büyük bir kütüphane ulaşmak için gereken Ağar kaplamalar toplam sayısı külfetli olur. Bu nedenle, plaka başına koloni numara açısından doğru dengeyi elde etmek önemlidir.
Listelenen adımları açıklandığı gibi çalıştığınızdan emin olmak için iletişim kuralında denetimleri gerçekleştirmek önemlidir. Özellikle, nalidixic asit donör zorlanma karşı karşı bir seçim olarak kullanırken, negatif donör denetim plakaları kolonileri ücretsizdir emin olmak önemlidir. Nalidixic asit, yanlış pozitif verimli spontan direnç oranı düşük (yaklaşık 1 x 10-10)21 olabileceğinden bu. Tipik olarak, yaklaşık 2 x 10-4 19konjügasyon ve devralınmasına oranıdır. Bu nedenle, fiil ve devralınmasına büyüklükte birkaç emir nalidixic asit spontan direnç hızından daha büyük oranıdır. Bu nedenle, doğru yansıtılması olaylarına göre yanlış pozitif oranı çok düşüktür ve protokol çalışırken ihmal edilebilir sayılır. Ancak, konjugasyon veya hukuka oranları önemli ölçüde azalır, (den düşük çiftleşme verimliliği ve/veya transposase gen IPTG ile indüksiyon eksikliği) ve iletişim kuralını ölçekli Eğer bu, o zaman yanlış pozitif sayı için telafi etmek için (Bu klonlar eklenen transposon var mı) da artırabilir.
Adımları 3.2 ve 3.10 kuluçka zamanlarında bazı değişiklikler yapılabilir. Konjugasyon 6 h için gerçekleşmesi gereken 3.2 Birleşik adım, ama deneyim, bu saat adım olabilir (Yani, 4-7 h) sonuçları önemli ölçüde değiştirmeden farklı. Ayrıca, 3.10 adımda koloniler agar Tabaklarda inkübe süreyi da ayarlanabilir. Bu alıcı zorlanma zaman ya da büyüme oranını iki katına ortalama bağlı olarak farklı olabilir. Buna ek olarak, deneyim, 18 h çeşitli koloni boyutları, kitaplığa farklı uygunluk gösteren vermiştir. Ancak, büyük ölçüde azaltılmış fitness ile kolonileri büyümek için daha uzun sürebilir ve bu nedenle 18 h sonra görünür olmayabilir. Bu yöntem son derece düşük fitness klonları bulmak için kullanılıyorsa uzun kuluçka süreleri ve daha az kolonileri kalabalık (Yani, 48 h, 50-300 kolonileri) azaltmak için plaka üzerinde kullanılabilir.
Bu yöntemin ek tuzaklar zaten sefaloridin dayanıklıdır alıcı bir yük kullanmak mümkün değil içerir. PJA1 plazmid sefaloridin direnç işaretleyicisinde bu engeli aşmak için kloramfenikol direnç gibi alternatif bir seçilebilir marker için takas mümkün olabilir. Teorik olarak, bu alıcı bir gerginlik, Ampisilin dayanıklıdır kullanmak mümkün, dikkati de olabilir, pJA1 plazmid Ampisilin direnç işaretçiyi içeren transpozisyonu kısa bir süre sonra kaybolur.
Yoğun transposon kütüphane seçim genetik arka planda oluşturulmasını birçok aşağı akım uygulama için potansiyel olarak avantajlıdır. Örneğin, bir yoğun transposon Kütüphane auxotrophic mutantlar yineleme kaplama22 kullanarak veya bir enfeksiyon1,2kurulması kusurlu mutantlar tanımlamak için kullanılabilir. Daha yakın zamanlarda, DNA sıralama maliyeti düşmüş ve sonraki nesil sıralama gibi yeni teknolojileri hale gelmiş gibi sıradan, transposon kütüphaneler derin DNA sıralama ile gen zorunluluk, gen işlevi, bir anlayış kazanmak için daha önce kullanılmış ve genetik etkileşimler. Bu yöntemlerden bazıları 23 ' te incelenir ve transposon Yönetmen: ekleme site sıralama (TraDIS), transposon sıralama (Tn-seq), derin sıralama (sayısı) ve ekleme sıralama (izleme yüksek üretilen iş ekleme gibi yöntemleri içerir INSeq). Aşağı akım yöntemlerin yoğun transposon ekleme kitaplıklar inşaat üzerinde güveniyor. Diğer vektörel çizimler için belirli aşağı akım yöntemlerin kullanılması gerekebilir, burada açıklanan protokolü takip etmek en göze çarpan yordam puanları genel olarak verir.

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/56216/creation-dense-transposon-insertion-library-using-bacterial">Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri</a>. The Discussion and References sections have been corrected.
The second paragraph in the Discussion section was updated from:
A significant benefit of this method is that, in theory, the user has wide latitude in the choice of enterobacterial recipient strains. This paper, as well as others11, use&#160;E. coli&#160;as a recipient strain, however the pJA1 plasmid has been used successfully with other enterobacterial recipient species such as&#160;Shigella flexneri6&#160;and&#160;Salmonella enterica&#160;serovar Typhimurium strain SL134410. Theoretically, the &#947; origin of replication (oriR6K&#947;) in pJA1 allows this plasmid to be maintained in a broad host range19, allowing that the recipient strain is&#160;pir+.&#160;Recently, new methods have been described that allow for construction of the&#160;pir+&#160;in a range of enterobacterial strains20, giving additional flexibility. Additionally, the300 base pair mob&#160;region from the RP4 plasmid in pJA1 allows conjugative transfer of this plasmid to a wide range of gram negative bacterial strains19. Simply put, this method could theoretically be used with a variety of recipient strains, as long as several conditions are met: the strain is&#160;pir+, and is marked with an antibiotic resistance other than kanamycin and other than the donor strain.
to:
A significant benefit of this method is that, in theory, the user has wide latitude in the choice of enterobacterial recipient strains. This paper, as well as others11, use&#160;E. coli&#160;as a recipient strain, however the pJA1 plasmid has been used successfully with other enterobacterial recipient species such as&#160;Shigella flexneri6&#160;and&#160;Salmonella enterica&#160;serovar Typhimurium strain SL134410. Theoretically, the &#947; origin of replication (oriR6K&#947;) in pJA1 allows this plasmid to be maintained in a broad host range19, allowing that the recipient strain is&#160;pir-.&#160;The&#160;300 base pair mob&#160;region from the RP4 plasmid in pJA1 allows conjugative transfer of this plasmid to a wide range of gram negative bacterial strains19. Simply put, this method could theoretically be used with a variety of recipient strains, as long as several conditions are met: the strain is&#160;pir-, and is marked with an antibiotic resistance other than kanamycin and other than the donor strain.
The References&#160;section was updated from:
<ol start="18">
	<li>Blattner, F. R., Plunkett, G.,&#160;et al.&#160;The Complete Genome Sequence of Escherichia coli K-12.&#160;Science.&#160;277&#160;(5331), 1453-1462 (1997).</li>
	<li>Alexeyev, M. F., &#38; Shokolenko, I. N. Mini-Tn10 transposon derivatives for insertion mutagenesis and gene delivery into the chromosome of gram-negative bacteria.&#160;Gene.&#160;160&#160;(1), 59-62 (1995).</li>
	<li>Kvitko, B. H., Bruckbauer, S.,&#160;et al.&#160;A simple method for construction of pir+ Enterobacterial hosts for maintenance of R6K replicon plasmids.&#160;BMC Res Notes.&#160;5&#160;(1), 157 (2012).</li>
	<li>Barrick, J. E., Yu, D. S.,&#160;et al.&#160;Genome evolution and adaptation in a long-term experiment with Escherichia coli.&#160;Nature.&#160;461&#160;(7268), 1243-1247 (2009).</li>
	<li>Jacobs, M. A., Alwood, A.,&#160;et al.&#160;Comprehensive transposon mutant library of Pseudomonas aeruginosa.&#160;PNAS.&#160;100&#160;(24), 14339-14344 (2003).</li>
	<li>van Opijnen, T., &#38; Camilli, A. Transposon insertion sequencing: a new tool for systems-level analysis of microorganisms.&#160;Nature Rev Microbiol.&#160;11&#160;(7), 435-442 (2013).</li>
</ol>
to:
<ol start="18">
	<li>Blattner, F. R., Plunkett, G.,&#160;et al.&#160;The Complete Genome Sequence of Escherichia coli K-12.&#160;Science.&#160;277&#160;(5331), 1453-1462 (1997).</li>
	<li>Alexeyev, M. F., &#38; Shokolenko, I. N. Mini-Tn10 transposon derivatives for insertion mutagenesis and gene delivery into the chromosome of gram-negative bacteria.&#160;Gene.&#160;160&#160;(1), 59-62 (1995).</li>
	<li>Barrick, J. E., Yu, D. S.,&#160;et al.&#160;Genome evolution and adaptation in a long-term experiment with Escherichia coli.&#160;Nature.&#160;461&#160;(7268), 1243-1247 (2009).</li>
	<li>Jacobs, M. A., Alwood, A.,&#160;et al.&#160;Comprehensive transposon mutant library of Pseudomonas aeruginosa.&#160;PNAS.&#160;100&#160;(24), 14339-14344 (2003).</li>
	<li>van Opijnen, T., &#38; Camilli, A. Transposon insertion sequencing: a new tool for systems-level analysis of microorganisms.&#160;Nature Rev Microbiol.&#160;11&#160;(7), 435-442 (2013).</li>
</ol>

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/56216/creation-dense-transposon-insertion-library-using-bacterial">Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri</a>.&#160;The Discussion and References sections have been corrected.

Erratum: Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Transposon mutagenesis kütüphaneler bakterilerde oluşturulması uygulamaları keşifler bakteriyel patojenler1,2, virülans genlerin için gerekli genler3, çalışmalar arasında değişen, çok çeşitli için yararlıdır 4 , 5 , 6, genetik etkileşim tanımlaması için7,8,9ağlar. Bu çalışmalar için kritik mutantlar büyük bir kütüphanesi oluşturmak için yeteneğidir. Bir transposon veya bir gen düzenleyici bölgeye ait açık okuma çerçevesi ekleme kez işlev veya ifade bozabilir olacaktır gibi Transpozonlar (rasgele bir genom eklediğiniz kısa parçaları DNA) gen işlevi, dağıtmak için basit bir yol kullanılır Gen.
Burada özetlenen E. coli ya da S. flexneri transposon kitaplıkta bakteriyel konjugasyon istimal plazmid pJA110tarafından oluşturulması için bir yöntemdir. Bu plazmid kullanarak iki ana avantajı vardır. PJA1 plazmid ifade Tn10 transposase türevi indüklenebilir ve düşük ekleme önyargı11,12transposon rastgele genom entegre olacak anlamı, vardır ilk avantajdır zaman isopropil Β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) medyaya eklenir. Transposon transposon ekler mutantlarla seçim içine alıcı zorlanma kromozom için izin veren bir sefaloridin direnç işaretçisi içerir. PJA1 plazmid ikinci avantajı R6K mutant kökeni çoğaltma içerir olduğunu. Çoğaltma R6K mutant kökeni lambda pir gen plazmid13bakımı için sırayla gerektirir. Plazmid pir - suşları içinde çoğaltma yapamaz gibi alıcı zorlanma (şekil 1) kaybolur. Bu Tn10 transposase hücreden kaldırılır ve artık daha fazla mutasyonlar ilk transpozisyon olayından sonra azaltarak etkin değildir sağlar.
Bakteriyel konjugasyon pJA1 plazmid donör zorlanma alıcı zorlanma için taşımak için çeşitli nedenlerden dolayı avantajlı kullanmaktır. Konjugasyon basit ve ucuz gerçekleştirmek ve bir electroporator gibi özel ekipman ihtiyacı yoktur. Ayrıca, bakteriyel konjugasyon yüksek verimlilik için çok büyük bir kütüphane sağlar (&#62; 2 x 105 benzersiz eklemeleri) sadece bir kaç mililitre (mL) gecede bakteri kültürü6ile elde edilebilir. Süreç yaklaşık iki saatlik uygulamalı kuluçka kez birlikte ve bakterilerin büyümesini alır. Langridge vd. 130 electroporations gerçekleştirme transposon mutagenesis kitaplığa bir boyuttaki bir benzer oluşturmak için rapor 14 tek bir fiil ile elde8, burada açıklanan. Emek yoğun ve zaman alıcı hazırlık electrocompetent hücre ve malzemelerin kullanımı pek çok pahalı (örneğin, elektroporasyon cuvettes), vasıl a fiyat daha--dan $1.000 USD sarf malzemeleri yalnız içinde 130 electroporations kullanımını gerektirir. Diğer çalışmalar10 benzer yöntemler kullandık ama farklı bakteri suşları ve elde çok daha küçük kütüphane (5 x 104 koloni oluşturan birimler) daha boyutları ile rapor burada.
Donör zorlanma ile ilgili notlar: Burada kullanılan donör zorlanma E. coli yük pJA1 transposon plazmid16içeren BW2076715 olduğunu. Soy BW20767 pJA1 plazmid transferini yüksek verimli yapma diğer suşları için eşlenik. Ayrıca, önemlisi, lambda BW20767 mi pır +. Daha önce de belirtildiği gibi plazmid pJA1 sadece lambda pir gen içeren suşları muhafaza edilmesi yapabiliyor. Bu yük sefaloridin ve Ampisilin dayanıklı olduğunu. PJA1 plazmid Ampisilin direnç işaretçisi içeren ve bir sefaloridin direnç işaretçisi transposon içinde yer alıyor. Bu zorlanma Ampisilin 100 µg/mL istimal plazmid seçimi ile büyüyor. Bu da ifade edilen yapısal transposase genler barındıran diğer suşların kararsız olduğu bilinmektedir kayda değer, kullanılan transposase ise işte altında ise indüklenebilir kontrol, sızan ifade düşük riski kalır. Bu nedenle, bu bu zorlanma geçirilmesi indirilmelidir ve taze bir çizgi her yeni kütüphane hazırlık için dondurulmuş bir kültürden alınması gereken önerilmektedir. Burada kullanılan donör baskı laboratuarımızın istek üzerine mevcuttur.
Alıcı zorlanma ile ilgili notlar: alıcı zorlanma seçim, E. coli K12 kaynaklı laboratuar suşları veya soy-in S.flexneri (Ayrıca bkz: tartışma) gibi büyük bir yük olabilir. Alıcı zorlanma sefaloridin direnmek, değil bir ek antibiyotik direnci işaretleyici olmalıdır, böylece donör zorlanma karşı seçilebilir. İçin alıcı zor, bir E. coli MG1655 zorlanma burada tanıtılan spontan nalidixic asit mutasyon ile kullanılır. Spontan nalidixic asit mutant kaplama gecede kültür 200 µL aliquots 30 µg/mL nalidixic asit içeren levhalar üzerine 2 mL dışarı tarafından seçildi. MG1655 tek bir klonu alıcı zorlanma olmak nalidixic aside dayanıklı seçilmiş. Ayrıca, alıcı zorlanma lambda pir negatif, yukarıda açıklandığı gibi olması gerekir.
Genel bakış: bakteriyel konjugasyon yerini almıştır ve pJA1 plazmid donör zorlanma alıcı zorlanma taşındı sonra IPTG ek olarak medya IPTG indüklenebilir kontrolü altında olduğunu tnp gen ifade neden lacIq/Ptac organizatörü (şekil 1). PJA1 üzerinde tnp gen ekleme daha düşük bir frekans sıcak noktalar6,10,11, sahip bir mutant transposase var. Ek ve indüksiyon IPTG ile transposon aktif ve rastgele genom eklenmiş. Plazmid lambda pir-alıcı zorlanma muhafaza ve kaybolur.

<table><tbody><tr><td>0.45 micron nitrocellulose filters (sterile)</td><td>Millipore</td><td>HAWP02500</td><td>Alternatively blotting paper can be used (listed below)</td></tr><tr><td>Blotting paper cut into ~ 1 inch circles, then autoclave/sterilized in foil. There is no difference in efficiency between the nitrocellulose filters or blotting paper</td><td>GE life Sciences: product Grade 3MM Chr Blotting Paper, sheet, 46 &amp;times; 57 cm</td><td>3030-917</td><td>Alternatively nitrocellose filters can be used (listed above)</td></tr><tr><td>Metal Forceps, sterile</td><td>VWR/Global Science New Zealand</td><td>MURRE009/01</td><td></td></tr><tr><td>Petri dishes, sterile, 90 mm diameter, 68 mL volume,&amp;nbsp; 12.5 mL working volume.</td><td>Interlab New Zealand</td><td>2303-1090</td><td></td></tr><tr><td>Sterile glass spreaders</td><td>VWR/Global Science New Zealand</td><td>NZNZSPREADER</td><td>Alternatively sterile glass beads can be used for spreading culture onto plates (listed below)</td></tr><tr><td>Sterile glass beads</td><td>VWR/Global Science New Zealand</td><td>HERE1080603</td><td>Alternatively a sterile glass spreader can be used for spreading culture onto plates (listed above)</td></tr><tr><td>Nalidixic acid (optional)</td><td>GoldBio.com</td><td>N-015-250</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin sodium salt BioChemica</td><td>VWR/Global Science New Zealand</td><td>APLIA0839.0025</td><td>prepare according to manufacturer recommendation</td></tr><tr><td>Kanamycin sulfate BioChemica</td><td>VWR/Global Science New Zealand</td><td>APLIA1493.0010</td><td></td></tr><tr><td>IPTG (Isopropyl &amp;beta;-D-1-thiogalactopyranoside)&amp;nbsp;</td><td>Thermofisher New Zealand</td><td>FMTR0393</td><td></td></tr><tr><td>Difco Agar granulated</td><td>Fort Richard Laboratries/Interlab New Zealand</td><td>214530</td><td></td></tr><tr><td>Luria Broth Base (Miller&#039;s LB Broth Base)</td><td>Thermofisher</td><td>12795-084</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol bidistilled 99,5 %</td><td>VWR/Global Science New Zealand</td><td>VWRC24388.320</td><td></td></tr><tr><td>15 ml polypropelene sterile conical vials&amp;nbsp;</td><td>VWR/Global Science New Zealand</td><td>CORN430791</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge tubes, flat cap, 1.7ml, Ultra-clear PP, graduated, autoclavable and freezable</td><td>VWR/Global Science New Zealand</td><td>AXYGMCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>50ml Centrifuge tubes, Falcon, PP, conical, printed graduation, with flat screw caps, sterile</td><td>VWR/Global Science New Zealand</td><td>BDAA352070</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubator at 37C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Autoclave for sterilizing media&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

creation of a dense transposon insertion library using bacterial conjugation in enterobacterial strains such as escherichia coli or shigella flexneri

Transposon mutagenesis gene bozulma rasgele genomik ekleme bir transposon adı verilen DNA parçasının üzerinden sağlayan bir yöntemdir. İletişim kuralı aşağıdaki sefaloridin direnç işaretleyicisi içeren bir transposon barındıran bir plazmid bakteri suşları arasında yüksek verim aktarmak için bir yöntem özetliyor. Plazmid kaynaklı transposase alıcı gerilme çok düşük insertional önyargı ile genom transposon ekler bir varyant tnp gen tarafından kodlanır. Bu yöntem böylece hangi Transpozonlar genomik konumlarda benzersiz alıcı bir zorlanma, Escherichia coli ya Shigella flexneri bakterilerin içine eklenmiş olan büyük mutant kitaplıkları oluşturulmasına izin verir. Elektroporasyon ya da kimyasal dönüştürme gibi diğer yöntemlerin aksine bakteriyel konjugasyon kullanarak benzersiz klonlar yüzbinlerce ile büyük kütüphaneleri oluşturulabilir. Bu yüksek yoğunluklu ekleme kütüphaneler, gerekli olmayan genlerdeki her 4-6 baz çifti olarak sık sık olarak ortaya çıkan eklemeleri ile verir. Bir ucuz, kolay ve yüksek verimliliği yöntemi yoğun transposon ekleme Kütüphane yaratılması için izin veren bir yayın gibi diğer yöntemler için bu yöntem üstündür. Transposon Kütüphane-ebilmek var olmak kullanılmış (Tn-Seq), genetik etkileşim ağları, anlaması için sıralama transposon gibi aşağı akım uygulamalarda veya daha açıkçası, mutational (ileri genetik) ekranlar.

Büyüme 18 saat sonra çeşitli koloni boyutları ile birçok kolonileri tabak içermelidir (şekil 3). Farklı koloni boyutları değişen fitness klonları gösterir ve protokol çalıştı iyi bir işaret vardır. Donör ve alıcı denetimleri hiçbir büyüme tabakaları üzerinde olmalıdır. Yukarıdaki protokolü kullanarak üzerinde 2 x 105 koloni oluşturan birimler (CFU) verim. Aynı anda beş Çoğalt conjugations protokole kadar ölçekleme yaklaşık 1 x 106 CFU verim. Önceki çalışmalarda, sonraki nesil sıralama kullanarak analiz kurmak ölçeklendirilen bir kütüphane verim belirtilen &#62; 2 x 105 benzersiz eklemeleri6. Tüm kullanılabilir (ölümcül olmayan) eklemeleri temsil olmak gibi çok yüksek CFU (Yani, 1 x 106 CFU) benzersiz eklemeleri oranı Plato bekleniyor.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56216/56216fig1.jpg"> 
Resim 1 : Bakteriyel konjugasyon ve kromozom transposon ekleme şematik. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56216/56216fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56216/56216fig2.jpg"> 
Resim 2 : Önce ve sonra vortexing LB medyada örtülü filtreleri görüntüsünü. Vortexing önce hücreleri için filtre sıkışmış ve medya açıktır. Olarak hücreleri filtre kapalı gelmiş ve medyada vortexing sonra medya bulutlu olur. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56216/56216fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56216/56216fig3.jpg"> 
Şekil 3 : (A)transposon kütüphaneden sonra büyüme 18 h temsilcisi tabak. (B) koloni boyutlarda yakın. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56216/56216fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri at JoVE.

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Burada sunulan Escherichia coli veya bakteriyel konjugasyon kullanarak Shigella flexneri yüksek yoğunluklu transposon ekleme kütüphane oluşturmak için basit bir yöntemdir. Bu iletişim kuralı bir transposon rastgele genomik ekleme tarafından bakterilerde benzersiz mutantlar, yüz binlerce topluluğu oluşturulmasına izin verir.

Bir yoğun Transposon ekleme kütüphane kullanarak bakteriyel konjugasyon Escherichia Coli Enterobacterial suşları gibi veya Shigella flexneri oluşturulması

Transposon mutagenesis is a method that allows gene disruption via the random genomic insertion of a piece of DNA called a transposon. The protocol below ...

creation-dense-transposon-insertion-library-using-bacterial

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

15.8K Görüntüleme.  Massey University. Burada sunulan Escherichia coli veya bakteriyel konjugasyon kullanarak Shigella flexneri yüksek yoğunluklu transposon ekleme kütüphane oluşturmak için basit bir yöntemdir. Bu iletişim kuralı bir transposon rastgele genomik ekleme tarafından bakterilerde benzersiz mutantlar, yüz binlerce topluluğu oluşturulmasına izin verir.

Video: Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia coli, these transfer proteins make up a DNA transfer machinery known as the mating pair formation, or DNA transfer complex, which facilitates conjugative plasmid transfer. The objective of this paper is to provide a method that can be used to determine the role of a specific transfer protein that is involved in conjugation using a series of deletions and/or point mutations in combination with mating assays. The target gene is knocked out on the conjugative plasmid and is then provided in trans through the use of a small recovery plasmid harboring the target gene. Mutations affecting the target gene on the recovery plasmid can reveal information about functional aspects of the target protein that result in the alteration of mating efficiency of donor cells harboring the mutated gene. Alterations in mating efficiency provide insight into the role and importance of the particular transfer protein, or a region therein, in facilitating conjugative DNA transfer. Coupling this mating assay with detailed three-dimensional structural studies will provide a comprehensive understanding of the function of the conjugative transfer protein as well as provide a means for identifying and characterizing regions of protein-protein interaction.

Here, we present a protocol to knockout a gene of interest involved in plasmid conjugation and subsequently analyze the impact of its absence using mating assays. The function of the gene is further explored to a specific region of its sequence using deletion or point mutations.

Bakteriyel Konjugasyon ilgilendim Transferi Proteinlerin Dizi özgü Analiz konjugatif Çiftleşme Tahliller

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia ...

Genetik

Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In bacteria, the impact of the genetic context on the function of a genetic element can be difficult to assess. Several mechanisms, including topological effects, transcriptional interference from neighboring genes, and/or replication-associated gene dosage, may affect the function of a given genetic element. Here, we describe a method that permits the random integration of a DNA element into the chromosome of Escherichia coli and select the most favorable locations using a simple growth competition experiment. The method takes advantage of a well-described transposon-based system of random insertion, coupled with a selection of the fittest clone(s) by growth advantage, a procedure that is easily adjustable to experimental needs. The nature of the fittest clone(s) can be determined by whole-genome sequencing on a complex multi-clonal population or by easy gene walking for the rapid identification of selected clones. Here, the non-coding DNA region DARS2, which controls the initiation of chromosome replication in E. coli, was used as an example. The function of DARS2 is known to be affected by replication-associated gene dosage; the closer DARS2 gets to the origin of DNA replication, the more active it becomes. DARS2 was randomly inserted into the chromosome of a DARS2-deleted strain. The resultant clones containing individual insertions were pooled and competed against one another for hundreds of generations. Finally, the fittest clones were characterized and found to contain DARS2 inserted in close proximity to the original DARS2 location.

Determination of the Optimal Chromosomal Locations for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Here, the power of a transposon-mediated random insertion of a non-coding DNA element was used to resolve its optimal chromosomal position.

En iyi kromozom Location(s) belirlenmesi için yeni bir Transposon-aracılı yaklaşımın kullanarak Escherichia coli DNA öğesinde

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In ...

Site-specific Bacterial Chromosome Engineering: &#934;C31 Integrase Mediated Cassette Exchange (IMCE)

The bacterial chromosome may be used to stably maintain foreign DNA in the mega-base range1. Integration into the chromosome circumvents issues such as plasmid replication, plasmid stability, plasmid incompatibility, and plasmid copy number variance. This method uses the site-specific integrase from the Streptomyces phage (&Phi;) C312,3. The &Phi;C31 integrase catalyzes a direct recombination between two specific DNA sites: attB and attP (34 and 39 bp, respectively)4. This recombination is stable and does not revert5. A "landing pad" (LP) sequence consisting of a spectinomycin- resistance gene, aadA (SpR), and the E. coli &szlig;-glucuronidase gene (uidA) flanked by attP sites has been integrated into the chromosomes of Sinorhizobium meliloti, Ochrobactrum anthropi, and Agrobacterium tumefaciens in an intergenic region, the ampC locus, and the tetA locus, respectively. S. meliloti is used in this protocol. Mobilizable donor vectors containing attB sites flanking a stuffer red fluorescent protein (rfp) gene and an antibiotic resistance gene have also been constructed. In this example the gentamicin resistant plasmid pJH110 is used. The rfp gene6 may be replaced with a desired construct using SphI and PstI. Alternatively a synthetic construct flanked by attB sites may be sub-cloned into a mobilizable vector such as pK19mob7. The expression of the &Phi;C31 integrase gene (cloned from pHS628) is driven by the lac promoter, on a mobilizable broad host range plasmid pRK78139.
A tetraparental mating protocol is used to transfer the donor cassette into the LP strain thereby replacing the markers in the LP sequence with the donor cassette. These cells are trans-integrants. Trans-integrants are formed with a typical efficiency of 0.5%. Trans-integrants are typically found within the first 500-1,000 colonies screened by antibiotic sensitivity or blue-white screening using 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-glucuronic acid (X-gluc). This protocol contains the mating and selection procedures for creating and isolating trans-integrants.

A quick and efficient method to integrate foreign DNA of interest into pre-made acceptor strains, termed landing pad strains, is described. The method allows site-specific integration of a DNA cassette into the engineered landing pad locus of a given strain, through conjugation and expression of the &#934;C31 integrase.

Siteye özgü Bakteriyel Kromozom Mühendislik: ΦC31 integraz Aracılı Kaset Borsası (IMCE)

The bacterial chromosome may be used to stably maintain foreign DNA in the mega-base range1. Integration into the chromosome circumvents issues such as ...

Biyomühendislik

Generating Transgenic Plants with Single-copy Insertions Using BIBAC-GW Binary Vector

When generating transgenic plants, generally the objective is to have stable expression of a transgene. This requires a single, intact integration of the transgene, as multi-copy integrations are often subjected to gene silencing. The Gateway-compatible binary vector based on bacterial artificial chromosomes (pBIBAC-GW), like other pBIBAC derivatives, allows the insertion of single-copy transgenes with high efficiency. As an improvement to the original pBIBAC, a Gateway cassette has been cloned into pBIBAC-GW, so that the sequences of interest can now be easily incorporated into the vector transfer DNA (T-DNA) by Gateway cloning. Commonly, the transformation with pBIBAC-GW results in an efficiency of 0.2&#8211;0.5%, whereby half of the transgenics carry an intact single-copy integration of the T-DNA. The pBIBAC-GW vectors are available with resistance to Glufosinate-ammonium or DsRed fluorescence in seed coats for selection in plants, and with resistance to kanamycin as a selection in bacteria. Here, a series of protocols is presented that guide the reader through the process of generating transgenic plants using pBIBAC-GW: starting from recombining the sequences of interest into the pBIBAC-GW vector of choice, to plant transformation with Agrobacterium, selection of the transgenics, and testing the plants for intactness and copy number of the inserts using DNA blotting. Attention is given to designing a DNA blotting strategy to recognize single- and multi-copy integrations at single and multiple loci.

Using a pBIBAC-GW binary vector makes generating transgenic plants with intact single-copy insertions, an easy process. Here, a series of protocols is presented that guide the reader through the process of generating transgenic Arabidopsis plants, and testing the plants for intactness and copy number of the inserts.

Transgenik bitkiler BIBAC-GW ikili vektör kullanarak tek kopya ekleme ile oluşturma

When generating transgenic plants, generally the objective is to have stable expression of a transgene. This requires a single, intact integration of the ...

High-Resolution Comparison of Bacterial Conjugation Frequencies

Bacterial conjugation is an important step in the horizontal transfer of antibiotic resistance genes via a conjugative DNA element. In-depth comparisons of conjugation frequency under different conditions are required to understand how the conjugative element spreads in nature. However, conventional methods for comparing conjugation frequency are not appropriate for in-depth comparisons because of the high background caused by the occurrence of additional conjugation events on the selective plate. We successfully reduced the background by introducing a most probable number (MPN) method and a higher concentration of antibiotics to prevent further conjugation in selective liquid medium. In addition, we developed a protocol for estimating the probability of how often donor cells initiate conjugation by sorting single donor cells into recipient pools by fluorescence-activated cell sorting (FACS). Using two plasmids, pBP136 and pCAR1, the differences in conjugation frequency in Pseudomonas putida cells could be detected in liquid medium at different stirring rates. The frequencies of conjugation initiation were higher for pBP136 than for pCAR1. Using these results, we can better understand the conjugation features in these two plasmids.

With an aim to understand the behaviors of various bacterial conjugative DNA elements under different conditions, we describe a protocol for detecting differences in conjugation frequency, with high resolution, to estimate how efficiently the donor bacterium initiates conjugation.

Bakteriyel konjugasyon frekans yüksek çözünürlüklü karşılaştırma

Bacterial conjugation is an important step in the horizontal transfer of antibiotic resistance genes via a conjugative DNA element. In-depth comparisons ...

Detection of Horizontal Gene Transfer Mediated by Natural Conjugative Plasmids in E. coli

Conjugation represents one of the main mechanisms facilitating horizontal gene transfer in Gram-negative bacteria. This work describes methods for the study of the mobilization of naturally occurring conjugative plasmids, using two naturally-occurring plasmids as an example. These protocols rely on the differential presence of selectable markers in donor, recipient, and conjugative plasmid. Specifically, the methods described include 1) the identification of natural conjugative plasmids, 2) the quantification of conjugation rates in solid culture, and 3) the diagnostic detection of the antibiotic resistance genes and plasmid replicon types in transconjugant recipients by polymerase chain reaction (PCR). The protocols described here have been developed in the context of studying the evolutionary ecology of horizontal gene transfer, to screen for the presence of conjugative plasmids carrying antibiotic-resistance genes in bacteria found in the environment. The efficient transfer of conjugative plasmids observed in these experiments in culture highlights the biological relevance of conjugation as a mechanism promoting horizontal gene transfer in general and the spread of antibiotic resistance in particular.

Detection of Horizontal Gene Transfer Mediated by Natural Conjugative Plasmids in E. coli

Conjugation mediates horizontal gene transfer by mobilizing plasmid DNA across two different cells, facilitating the spread of beneficial genes. This work describes a widely-used method for the efficient detection of conjugative plasmid transfer, based on the use of differential markers in the conjugative plasmid, donor, and recipient to detect transconjugation.

E. coli'de Doğal Konjugatif Plazmidlerin Aracılık Ettiği Yatay Gen Transferinin Saptanması

Conjugation represents one of the main mechanisms facilitating horizontal gene transfer in Gram-negative bacteria. This work describes methods for the ...

High-throughput Parallel Sequencing to Measure Fitness of Leptospira interrogans Transposon Insertion Mutants During Golden Syrian Hamster Infection

In this manuscript, we describe a transposon sequencing (Tn-Seq) technique to identify and quantify Leptospira interrogans mutants altered in fitness during infection of Golden Syrian hamsters. Tn-Seq combines random transposon mutagenesis with the power of high-throughput sequencing technology. Animals are challenged with a pool of transposon mutants (input pool), followed by harvesting of blood and tissues a few days later to identify and quantify the number of mutants in each organ (output pools). The output pools are compared to the input pool to evaluate the in vivo fitness of each mutant. This approach enables screening of a large pool of mutants in a limited number of animals. With minor modifications, this protocol can be performed with any animal model of leptospirosis, reservoir host models such as rats and acute infection models such as hamsters, as well as in vitro studies. Tn-Seq provides a powerful tool to screen for mutants with in vivo and in vitro fitness defects.

High-throughput Parallel Sequencing to Measure Fitness of Leptospira interrogans Transposon Insertion Mutants During Golden Syrian Hamster Infection

We describe here a technique that combines transposon mutagenesis with high-throughput sequencing to identify and quantify transposon leptospiral mutants in tissues after a challenge of hamsters. This protocol can be used to screen mutants for survival and dissemination in animals and can also be applied to in vitro studies.

Yüksek üretilen iş paralel sıralama ölçü Fitness Leptospira interrogans Transposon ekleme mutantlar sırasında altın Suriye Hamster enfeksiyon için

In this manuscript, we describe a transposon sequencing (Tn-Seq) technique to identify and quantify Leptospira interrogans mutants altered in fitness ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Generation of Enterobacter sp. YSU Auxotrophs Using Transposon Mutagenesis

Prototrophic bacteria grow on M-9 minimal salts medium supplemented with glucose (M-9 medium), which is used as a carbon and energy source. Auxotrophs can be generated using a transposome. The commercially available, Tn5-derived transposome used in this protocol consists of a linear segment of DNA containing an R6K&#947; replication origin, a gene for kanamycin resistance and two mosaic sequence ends, which serve as transposase binding sites. The transposome, provided as a DNA/transposase protein complex, is introduced by electroporation into the prototrophic strain, Enterobacter sp. YSU, and randomly incorporates itself into this host&#8217;s genome. Transformants are replica plated onto Luria-Bertani agar plates containing kanamycin, (LB-kan) and onto M-9 medium agar plates containing kanamycin (M-9-kan). The transformants that grow on LB-kan plates but not on M-9-kan plates are considered to be auxotrophs. Purified genomic DNA from an auxotroph is partially digested, ligated and transformed into a pir+ Escherichia coli (E. coli) strain. The R6K&#947; replication origin allows the plasmid to replicate in pir+ E. coli strains, and the kanamycin resistance marker allows for plasmid selection. Each transformant possesses a new plasmid containing the transposon flanked by the interrupted chromosomal region. Sanger sequencing and the Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) suggest a putative identity of the interrupted gene. There are three advantages to using this transposome mutagenesis strategy. First, it does not rely on the expression of a transposase gene by the host. Second, the transposome is introduced into the target host by electroporation, rather than by conjugation or by transduction and therefore is more efficient. Third, the R6K&#947; replication origin makes it easy to identify the mutated gene which is partially recovered in a recombinant plasmid. This technique can be used to investigate the genes involved in other characteristics of Enterobacter sp. YSU or of a wider variety of bacterial strains.

Generation of Enterobacter sp. YSU Auxotrophs Using Transposon Mutagenesis

Enterobacter sp. YSU grows in glucose minimal salts medium. Auxotrophs are generated by transforming it with a transposome which randomly inserts itself into the host genome. Mutants are found by replica plating from complex medium to minimal medium. Interrupted genes are identified by gene rescue and sequencing.

Üretilmesi<em&gt; Enterobacter</em&gt; Sp. YSU oksotroflan transpozon mutajenezi kullanarak,

Prototrophic bacteria grow on M-9 minimal salts medium supplemented with glucose (M-9 medium), which is used as a carbon and energy source. Auxotrophs can ...

Biyoloji

Generating Transposon Insertion Libraries in Gram-Negative Bacteria for High-Throughput Sequencing

Transposon sequencing (Tn-seq) is a powerful method that combines transposon mutagenesis and massive parallel sequencing to identify genes and pathways that contribute to bacterial fitness under a wide range of environmental conditions. Tn-seq applications are extensive and have not only enabled examination of genotype-phenotype relationships at an organism level but also at the population, community and systems levels. Gram-negative bacteria are highly associated with antimicrobial resistance phenotypes, which has increased incidents of antibiotic treatment failure. Antimicrobial resistance is defined as bacterial growth in the presence of otherwise lethal antibiotics. The &#8220;last-line&#8221; antimicrobial colistin is used to treat Gram-negative bacterial infections. However, several Gram-negative pathogens, including Acinetobacter baumannii can develop colistin resistance through a range of molecular mechanisms, some of which were characterized using Tn-seq. Furthermore, signal transduction pathways that regulate colistin resistance vary within Gram-negative bacteria. Here we propose an efficient method of transposon mutagenesis in A. baumannii that streamlines generation of a saturating transposon insertion library and amplicon library construction by eliminating the need for restriction enzymes, adapter ligation, and gel purification. The methods described herein will enable in-depth analysis of molecular determinants that contribute to A. baumannii fitness when challenged with colistin. The protocol is also applicable to other Gram-negative ESKAPE pathogens, which are primarily associated with drug resistant hospital-acquired infections.

We describe a method to generate saturating transposon mutant libraries in Gram-negative bacteria and subsequent preparation of DNA amplicon libraries for high-throughput sequencing. As an example, we focus on the ESKAPE pathogen, Acinetobacter baumannii, but this protocol is amenable to a wide range of Gram-negative organisms.

Yüksek İşlem Likör Sıralaması Için Gram-Negatif Bakterilerde Transposon Ekleme Kitaplıkları Oluşturma

Transposon sequencing (Tn-seq) is a powerful method that combines transposon mutagenesis and massive parallel sequencing to identify genes and pathways ...

Transposon-insertion Sequencing as a Tool to Elucidate Bacterial Colonization Factors in a Burkholderia gladioli Symbiont of Lagria villosa Beetles

Inferring the function of genes by manipulating their activity is an essential tool for understanding the genetic underpinnings of most biological processes. Advances in molecular microbiology have seen the emergence of diverse mutagenesis techniques for the manipulation of genes. Among them, transposon-insertion sequencing (Tn-seq) is a valuable tool to simultaneously assess the functionality of many candidate genes in an untargeted way. The technique has been key to identify&#160;molecular mechanisms for the colonization of eukaryotic hosts in several pathogenic microbes and a few beneficial symbionts.
Here, Tn-seq is established as a method to identify colonization factors in a mutualistic Burkholderia gladioli symbiont of the beetle Lagria villosa. By conjugation, Tn5 transposon-mediated insertion of an antibiotic-resistance cassette is&#160;carried out at random genomic locations in B. gladioli. To identify the effect of gene disruptions on the ability of the bacteria to colonize the beetle host, the generated B. gladioli transposon-mutant library is inoculated on the beetle eggs, while a control is grown in vitro in a liquid culture medium. After allowing sufficient time for colonization, DNA is extracted from the in vivo and in vitro grown libraries. Following a DNA library preparation protocol, the DNA samples are prepared for transposon-insertion sequencing. DNA fragments that contain the transposon-insert edge and flanking bacterial DNA are selected, and the mutation sites are determined by sequencing away from the transposon-insert edge. Finally, by analyzing and comparing the frequencies of each mutant between the in vivo and in vitro libraries, the importance of specific symbiont genes during beetle colonization can be predicted.

Transposon-insertion Sequencing as a Tool to Elucidate Bacterial Colonization Factors in a Burkholderia gladioli Symbiont of Lagria villosa Beetles

This is an adapted method for identifying candidate insect colonization factors in a Burkholderia beneficial symbiont. The beetle host is infected with a random mutant library generated via transposon mutagenesis, and library complexity after colonization is compared to a control grown in vitro.

Lagria villosa Böcekleri burkholderia gladioli Symbiont Bakteriyel Kolonizasyon Faktörlerini Elucidate için Bir Araç Olarak Transposon-ekleme Dizileme