Yazar 2010-2014 bahar dönemlerinde benim transpozonunun mutagenez fikirlerini test benim Mikrobiyal Fizyoloji yüksek lisans öğrencilerinin benim lisans Bağımsız Araştırma Öğrenciler tüm ve tüm teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma Youngstown State Üniversitesi Biyolojik Bilimler Bölümü tarafından finanse edildi.

Competent Cells&#39;e 5,11 1. Elektroporasyon <ol><li> Enterobacter sp bir O / N LB kültürünü sulandırmak. Taze LB ortamında 50 ml YSU 1/20 ve 0.4 ve 0.6 arasında bir OD (600 nm), 30 ° C, 120 rpm&#39;de sallama ve büyür. İsteğe bağlı olarak, optimal çoğalma sıcaklığında diğer bakteri soyları büyür. </li><li> 5 dakika santrifüj 4 ° C sıcaklıkta 5 dakika boyunca 7,000 x g buz üzerinde hücreleri soğutun. </li><li> , Supernatant 4 ° C&#39;de steril buz gibi soğuk su ve santrifüj 50 ml hücreleri tekrar süspansiyon ve 5 dakika süreyle 7,000 x g. Bu adımı tekrarlayın. </li><li> Süpernatant atılır ve hücre topağı hacmine eşit buz gibi soğuk su hacminde tekrar süspansiyon hücreleri. Uzun süreli depolama için -80 ° C arasında ve çözülme buz soğukluğunda% 10 (h / h) gliserol, depo eşit pelet hacimde buz soğukluğunda% 10 (h / h) gliserol, tekrar süspansiyon 10 ml Hücreleri yıkamak Elektroporasyonun önce buz üzerinde. </li><li> 40 ul transposome 0.5 ul eklehücreler. Ticari olarak temin edilebilen transposome çözeltisi 0.33 ug / ul DNA konsantrasyonda sağlanır. 0.33 ug tavsiye edilir, ancak, 0.165 mg DNA yeterlidir. </li><li> Bir buz soğukluğunda, 0.2 mm elektroporasyon küveti içinde hücre / transposome karışım konulur ve küvetin altındaki karışımın dokunun. 25 iF 200 Ω ve 2.5 kV hücreleri Şok. , Hücreler soğutulmuş kalmasını sağlamak kullanılmadan önce -20 ° C derin dondurucuda elektroporasyon küvetleri saklamak için. </li><li> Hemen, katabolik baskı (SOC) ortamı ile süper optimum suyu sterilize filtre 960 ul ekleyin. Aşağı yukarı pipetleme ile karıştırın ve steril bir 1.5 ml mikrofüj tüpe hücreleri aktarın. NOT: Hücreler şoktan sonra ölmeye başlar, ama SOC ortamında tuz onları kurtarmak için olanak sağlar. Tasarruf için, transposome eklemek ya da negatif kontrol hücreleri şok için gerekli değildir. Sadece bunu steril SOC orta 960 ul ekleyin. </li><li> 30 ° C f hücreleri inkübeya da 120 rpm&#39;de çalkalayarak 45-60 dakika. Bu kanamisin direnci ifade transposome hücreler, konakçı genomu ile için rekombine için zaman sağlar. </li><li> LB-kan agar plakası üzerinde 100 ul hücre yayıldı ve 30 ° C de bord O / N inkübe edin. 4 ° C&#39;de buzdolabında kalan dönüşüm karışımı saklayın. Gerekirse ilk elektroporasyon 2 hafta sonra bir sonraki tarih kadar ek miktarda yayıldı. </li></ol> Transformantların 2. Gridleme <ol><li> Bant boş bir 100 x 15 mm Petri kabı kapağı için bir ızgara. &quot;Bakteriyel Genetik A Short Course&quot; 12 bir ızgara kopyalayın. </li><li> LB-kan agar levhasının alt tarafında bir çizgi çizin. Izgara agar boyunca görünür şekilde gridded kapağın onu tutturmak için bant küçük bir parça kullanın. Plakanın alt çizgi, ızgaranın üst, merkezi ile hizalanmış olduğundan emin olun. Bant ile plaka Sabitleştirilmesi bile gridding için izin kaymasını onu tutar. Hat çoğaltma sonra kaplama koloni tespitini kolaylaştırır. </li><li> Steril bir kürdan ile bir tek transforman almak ve ızgara bir kare merkezinde o noktaya. Sadece koloni ve yere dokunur. Agar içine kürdan kazmak yok. Plaka kirletmesini önlemek için, yalnızca bir ucunda kürdan anlaştım. </li><li> Adım 2.3 olarak bitişik bir karede başka dönüştürülmüşü nokta. Plaka dolduğunda, 30 ° C / o n inkübe. Bu ana plaka. </li></ol> 3. Kopya Kaplama auxotroph fenotipe 12 belirleme <ol><li> LB-kan için M-9-kan için LB-kan için bir, iki ve üç: gridded her plakanın için, bir ile üç numaralı üç taze agar plakaları destesini yapmak. Kullanımdan önce 37 ° C &#39;de, ters O / N plakaları kurutunuz. </li><li> Aşama 2.2 olarak her bir plakanın üstünde bir çizgi çizin. </li><li> % 70 etanol ile çoğaltma kaplama aracı silin kopya kaplamanın üstüne steril bir pamuklu kadife kare yerleştirmekol ve kadife kare dizginlenebileceği. Eller hatta onları yıkadıktan sonra mikroplarla iç içedir. Kenarndan kadife kare ele mikropları kirletici girişini önlemek. </li><li> Kelepçe üzerine çizilen bir çizgi ile ana plaka üzerinde çizgi hizalayın ve kadife kare üstüne plaka yerleştirin. Kadife meydanına plakadan bakteri aktarmak için hafif bir baskı uygulayın. Bakterileri smear için dikkatli olun. Kadife meydanından ana plakasını sökün. </li><li> Kelepçe üzerinde çizgi ile plaka numaralı çizilen çizgi hizalayın ve kadife kare üstüne yerleştirin. Plakasına kadife meydanından bakteri aktarmak için hafif bir baskı uygulayın. Plaka numarası teker çıkarın. </li><li> Su behere kadife kare atın ve adım 3.3 gibi çoğaltma kaplama aracı üzerinde temiz, steril pamuklu kadife kare yerleştirin. Bu adım aşırı aşılamadan atılım büyüme ve yanlış pozitif sonuçlara neden önler. </li><li> Hizalayınkelepçe üzerinde çizgi ile plaka numarasına bir line ve yeni kadife kare üstüne yerleştirin. Kadife meydanına plaka numara gelen bakteri aktarmak için hafif bir baskı uygulayın. Plaka numarası teker çıkarın. </li><li> Kelepçe üzerinde çizgi ile plaka sayısı iki çizilen çizgi hizalayın ve kadife kare üstüne yerleştirin. Plaka sayısı iki kadife meydanından bakteri aktarmak için hafif bir baskı uygulayın. Plaka numarası iki çıkarın. </li><li> Plaka numarası üç için yineleyin 3.8. Üçüncü levha ise bir diğer iki levha için ana plaka tam devri için bir kontroldür. Su ihtiva eden bir kap içine kadife kare atın. Onları kuru, yıkayın alüminyum folyoya sarın ve bunları yeniden kaynatmayın, kirlenmiş pamuklu kadife kareler içeren beher otoklavlamayın, kadife kareler tekrar kullanmak için. </li><li> 30 ° CO / N de inkübe. Her iki LB-kan agar plakaları üzerinde büyür ancak M-9-kan plakalarına büyümeye başarısız koloniler oksotroflan (olduğu düşünülmektedir <strong&gt; Şekil 2). </li><li> Streak dışarı taze LB-kan agar plaka üzerine plakası itibaren oksotroflan ve 30 ° CO / N de plaka kuluçkaya yatmaktadır. </li><li> Izolasyon taze LB-kan plaka üzerine adım 3.11 çizgi plaka 3 koloniler için dışarı Streak. 30 ° CO / N de plaka kuluçkaya yatmaktadır. Bu mutant iyi izole olmasını sağlar. Bir bölümde her koloninin dışarı üçte içine plaka ve çizgi bölün. </li><li> Taze LB-kan plaka üzerine adım 3.12 türetilen üzerine şerit kolonilerden Spot koloniler adımlar 2,1-2,4 gibi bir tablo oluşturmak için. Her mutant üçlü olarak yeniden test ediliyor. </li><li> Oksotrofu fenotip onaylamak için adımlar 3,1-3,10 gibi yine plaka çoğaltmak. </li></ol> 4. Gen Kurtarma <ol><li> 30 ° C de sıvı LB-kan ortamı içinde aşama 3.13 arasında bir izole edilmiş mutant bir koloni 3 mi göre O / N kültür büyütün. Bir ticari olarak temin edilebilen genomik bir DNA saflaştırma kiti kullanılarak kültürün 1 ml genomik DNA arındırın. </li><li> 0.025 U karışımı kurmakBFU CI kısıtlama endonükleaz ve buz üzerinde 20 ul reaksiyon / ul genomik DNA 1 mcg 14 ul. BFU CI oniki farklı sitelerde transpozonunda keser bu yana, restriksiyon endonükleaz, BFA I veya sırasıyla, iki ve üç farklı sitelerde transpozonunda keser Hae III, kullanmak daha verimli olabilir. </li><li> 25 dakika boyunca 37 ° C&#39;de reaksiyonu inkübe ve daha sonra 80 ° C de 20 dakika enzimler inaktive edildi. % 0.8 agaroz jeli (Şekil 3), kısmen sindirilmiş DNA 3 ul analiz eder. Jel dibine yukarıdaki 10 kb bir karalama başarılı kısmi sindirimi sonuçları. </li><li> 500 ul reaksiyon maddesi içinde T4 DNA ligazı 800 birimleri kullanarak kısmen sindirilmiş genomik DNA 15 ul Arter. Reaksiyon O / N 4 ° C&#39;de inkübe edin. Büyük bir reaksiyon hacmini kendileri tek fragmanların ligasyonu arttırır, ve iki ya da daha fazla DNA fragmanları arasındaki etkileşimi en aza indirir. </li><li> Bir çökeltite 3 M sodyum asetat, pH 5.5 ve 1 ml% 95 etanol içinde 50 ul ilave edilmesi ve 20 dakika boyunca -20 ° C&#39;de inkübe edilerek Bağlı DNA. </li><li> % 70 etanol ile yıkayın pelet, 10 dakika boyunca 4 ° C&#39;de DNA ve 13,500 xg mikrofüj santrifüj vakum yoğunlaştırıcısı kurutun ve nükleaz serbest su 10 ul içinde tekrar süspansiyon haline getirin. Seçenek olarak ise, DNA, havada 15 dakika boyunca oda sıcaklığında kurutulabilir. </li><li> E. dönüştürmek için yeniden süspanse DNA 4 ul kullanın bölüm 1. R6k γ replikasyon orijini olarak elektroporasyon ile E. coli suşu ECD100D pir veya ECD100D pir116 6 çoğaltmak için bir pir gen ile bir bakterinin gerektirir. Düşük kopya plasmidlerde pir zorlanma sonucu, ve pir116 gerginlik yüksek kopya plazmidler sonuçlanan bir pir mutant genini içerir. Her bir transformant transposon ve kesintiye kromozom (Şekil 1 E) bir bölgesi ile bir plazmid içerir. </li><li> InokülasyonlaraTek bir koloni LB-kan, ortamın 5 ml yedi, 120 rpm&#39;de ve 37 ° C&#39;de çalkalama ile G / Ç N çoğaltılmasını ve ticari bir kit kullanılarak bütün O / N kültürden plazmid DNA saflaştırılması. </li><li> Kısıtlama endonükleaz Xhol I&#39;in kullanılması suretiyle plazmidin 14 ul Digest Reaksiyonun nihai hacmi, 20 ul olduğundan emin olun. Bu enzim, kanamisin direnç geninin 5 &#39;ucundaki transpozonun ortasında bir site tanır. Sindirilmemiş 10 ul analiz eder ve bir% 0.8 agaroz jeli (Şekil 3) ile sindirilmiş plasmide. Plasmid 2 kb transpozon artı eteklenen konukçu DNA&#39;dan oluşur. </li></ol> 5. DNA Dizilimi <ol><li> Bir ticari olarak temin edilebilir dizileme kiti, transposon her bir ucuna homolog olan primerler ve bir kılcal dizilim analizi sistemi kullanılarak plazmid dizisi. Seçenek olarak ise, plazmid sekanslama için bir dış kuruma sevk edilebilir. </li><li> Moleküler ağırlık standardı (1 kb merdiven) kullanımJel plazmidin boyutunu tahmin etmek. Daha sonra, 50 fmol için gerekli olan plazmid nanogram (ng) kestirilebilir. </li><li> 260 nm (260) ve 280 nm (A 280) dalga boylarında bir spektrofotometre kullanılarak plazmid DNA konsantrasyonu ölçümü. Küvetinden geçen ışık uzunluğu 1 cm olduğundan emin olun. 50 ng / ml ile 260 nm&#39;de absorbansı çarpılarak konsantrasyonunun belirlenmesi. Yüksek kaliteli plazmid DNA, bir A 260 / 1.8 ve 2.0 arasında bir 280 oranına sahip olacaktır. </li><li> Her sekanslama reaksiyonu için gerekli DNA hacmi plazmid konsantrasyonu ile bölünen, 50 fmol için gerekli ng sayısıdır. 10 ul toplam hacmi getirmek için su ile gerektiği plazmidin miktarda karıştırın. </li><li> 1 dakika boyunca 96 ° C &#39;de plazmid DNA / su karışımının ısıtılması ve daha sonra oda sıcaklığına kadar soğutulması. </li><li> Dizileme kiti ana karışımı 8 ul ve sekanslama primerleri birinin uM 1.6 2 ul ekleyin. </li><li> Foltermal döngü programı ve reaksiyon temizliği için dizileme kiti düşük protokolü. </li><li> Bir kılcal DNA analiz sistemi kullanılarak her bir örnek analiz edin. </li><li> DNA dizisini görüntülemek için piyasada satılan bir yazılım paketi kullanın. Transposon (Şekil 4) ve son 7 bp dizisi, &quot;5&#39;-GAGACAG-3 &#39;,&quot; ara. Bu 7 bp&#39;lik segment 5 &#39;ucunda önce sırası transposon aittir. Bu 7 bp&#39;lik segment 3 &#39;ucundan sonraki sekansı kesintiye uğramış gene aittir. </li><li> Temel Yerel Hizalama Arama Aracı (BLAST) 7,8 kullanılarak kesilen genin olası fonksiyonunu belirler. Aşağıdaki kullanın link: <a href="http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&amp;BLAST_PROGRAMS=megaBlast&amp;PAGE_TYPE=BlastSearch" target="_b;ank">http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&amp;BLAST_PROGRAMS=megaBlast&amp;PAGE_TYPE=BlastSearch</a> . Interrupt&#39;ının dizisini yapıştırınsorgu kutusuna ed gen, veritabanı altında &quot;diğerleri&quot; seçeneğini seçin ve sayfanın altındaki &quot;BLAST&quot; üzerine tıklayın. Sonuç göründüğünde, hizalama sonuçları (Şekil 5) görüntülemek için sayfayı aşağı kaydırın. </li></ol>

<ol>
	<li>Kim, B. H., Gadd, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bacterial physiology and metabolism. , (2008).</li><li>Hayes, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposon-based+strategies+for+microbial+functional+genomics+and+proteomics.">Transposon-based strategies for microbial functional genomics and proteomics.</a> Annual review of genetics. 37, 3-29 (2003).</li><li>Hoffman, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Random+chromosomal+gene+disruption+in+vivo+using+transposomes.">Random chromosomal gene disruption in vivo using transposomes.</a> Methods in molecular biology. 765, 55-70 (2011).</li><li>Goryshin, I. Y., Jendrisak, J., Hoffman, L. M., Meis, R., Reznikoff, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertional+transposon+mutagenesis+by+electroporation+of+released+Tn5+transposition+complexes.">Insertional transposon mutagenesis by electroporation of released Tn5 transposition complexes.</a> Nature biotechnology. 18 (1), 97-100 (2000).</li><li>Dower, W. J., Miller, J. F., Ragsdale, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+Efficiency+Transformation+of+E.+coli+by+High+Voltage+Electroporation.">High Efficiency Transformation of E. coli by High Voltage Electroporation.</a> Nucleic Acids Research. 16 (13), 6127-6145 (1988).</li><li>Metcalf, W. W., Jiang, W., Wanner, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+rep+technique+for+allele+replacement+to+construct+new+Escherichia+coli+hosts+for+maintenance+of+R6K&#947;+origin+plasmids+at+different+copy+numbers.">Use of the rep technique for allele replacement to construct new Escherichia coli hosts for maintenance of R6K&#947; origin plasmids at different copy numbers.</a> Gene. 138 (1-2), 1-7 (1994).</li><li>Morgulis, A., Coulouris, G., Raytselis, Y., Madden, T. L., Agarwala, R., Sch&#228;ffer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+Database+indexing+for+production+MegaBLAST+searches.">a Database indexing for production MegaBLAST searches.</a> Bioinformatics. 24 (16), 1757-1764 (2008).</li><li>Zhang, Z., Schwartz, S., Wagner, L., Miller, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+greedy+algorithm+for+aligning+DNA+sequences.">A greedy algorithm for aligning DNA sequences.</a> Journal of computational biology a journal of computational molecular cell biology. 7 (1-2), 203-214 (2000).</li><li>Holmes, A., Vinayak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+two+multimetal+resistant+bacterial+strains:+Enterobacter+sp.+YSU+and+Stenotrophomonas+maltophilia+OR02.">Comparison of two multimetal resistant bacterial strains: Enterobacter sp. YSU and Stenotrophomonas maltophilia OR02.</a> Current microbiology. 59 (5), 526-531 (2009).</li><li>Hoffman, L. M., Jendrisak, J. J., Meis, R. J., Goryshin, I. Y., Reznikoff, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposome+insertional+mutagenesis+and+direct+sequencing+of+microbial+genomes.">Transposome insertional mutagenesis and direct sequencing of microbial genomes.</a> Genetica. 108 (1), 19-24 (2000).</li><li>Ausubel, F., Brent, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Short Protocols in Molecular Biology. , (1997).</li><li>Miller, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A short course in bacterial genetics: a laboratory manual and handbook for Escherichia coli and related bacteria. 2, (1992).</li><li>Gibson, M. I., Gibson, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preliminary+studies+on+the+isolation+and+metabolism+of+an+intermediate+in+aromatic+biosynthesis:+chorismic+acid.">Preliminary studies on the isolation and metabolism of an intermediate in aromatic biosynthesis: chorismic acid.</a> The Biochemical journal. 90 (2), 248-256 (1964).</li><li>Jacobs, M. A., Alwood, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+transposon+mutant+library+of+Pseudomonas+aeruginosa.">Comprehensive transposon mutant library of Pseudomonas aeruginosa.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (24), (2003).</li><li>Reznikoff, W., Winterberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposon-Based+Strategies+for+the+Identification+of+Essential+Bacterial+Genes.">Transposon-Based Strategies for the Identification of Essential Bacterial Genes.</a> Microbial Gene Essentiality: Protocols and Bioinformatics SE. 2, 13-26 (2008).</li><li>Suzuki, N., Inui, M., Yukawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Random+genome+deletion+methods+applicable+to+prokaryotes.">Random genome deletion methods applicable to prokaryotes.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 79 (4), 519-526 (2008).</li><li>Malley, M. A., Powell, A., Davies, J. F., Calvert, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knowledge-making+distinctions+in+synthetic+biology.">Knowledge-making distinctions in synthetic biology.</a> BioEssays news and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 30 (1), 57-65 (2008).</li><li>Zheng, Y. -. N., Li, L. -. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Problems+with+the+microbial+production+of+butanol.">Problems with the microbial production of butanol.</a> Journal of industrial microbiolog., &amp; biotechnology. 36 (9), 1127-1138 (2009).</li></ol>

Yazar ifşa hiçbir şey vardır.

Bir transposome kullanarak transpozonunun mutagenez Enterobacter sp oksotropları üretmek için etkili bir araçtır. YSU ve Gram negatif diğer türleri ve Gram pozitif bakteriler 3,4. Işlem elektroporasyon ile konakçıya Tn 5 türevi transposome katılmasıyla başlatıldı. Uçlar ile kolonilerini teşhis etmek için, dönüştürülmemiş hedef soyu transposon tarafından taşınan direnç seviyesi seçmek için kanamisine karşı duyarlı olması gerekiyordu. Bazı ana bu şekilde ko...

Prototrofik bakteri biyosentezi 1, amino asitler, nükleik asitler ve vitaminler gibi öncüleri, oluşturmak için, merkezi karbon metabolizma sentez yollan ile glikoz dönüştürücüler, orta glukoz (M-9 ortamı) ihtiva eden E-9 minimal tuz büyür. E-9 ortamı, bir karbon ve enerji kaynağı olarak bir kükürt kaynağı ve glukoz gibi bir tampon madde ve fosfor kaynağı, magnezyum sülfat gibi bir nitrojen kaynağı, sodyum ve potasyum fosfat, amonyum klorür içermektedir. Luria-Bertani (LB) tripton gelen ve maya ekstraktı vitaminler, büyüme faktörleri, amino asitler açısından zengindir. M-9 ortamı üzerinde büyüme için gerekli olan amino asitler, vitaminler ve diğer büyüme faktörleri sentezleyemediği oksotrofları gelişimini destekler. Oksotroflan M-9 ortamında LB ortamında değil, büyüyecek ise Böylece prototrofları, LB ve M-9 ortamda büyür. Okzotrofik fenotipleri neden mutasyona uğramış genleri bakteri Prototrofik nüfusu mutasyonların sokulmasıyla ve tanımlayarak, bu po olduğunubakterisel bir suş içerisinde metabolizmasının daha iyi bir anlayış elde etmek ssible. Transpozon mutagenezi M-9 ortam içinde glükoz üzerinde büyüme için gerekli olan genlerin çoğu belirlemek için kullanılabilir. Transposonlar konak genomuna 2 içerisine rastgele kendilerini eklemek. E-9, orta agar plakaları üzerine LB agar levhaları onları kaplama çoğaltma transpozon transformantları tespit ederek, oksotrofları taranması mümkündür. Interrupted genler gen kurtarma yoluyla tespit edilir. Bu çalışma, bir ticari olarak temin edilebilir, Tn 5 transposaz protein ile karıştırılmış olarak, bir lineer transpozon DNA segmentinin bir çözelti olarak sevk edildiği transposome -türevli kullanır. DNA segmenti bir transposaz gen yoksun ama kanamisin direnci için bir gen, bir R6K γ tekrarlama orijinini ve bunun sonrasında parçanın 3,4 her bir ucunda bağlama transpozaz için DNA dizileri iki mozaik motifleri ihtiva eder. Transposaz proteinin DNA, tek başına DNA segmenti doğrudan ilave edilir yanatransposon olarak tanımlanır, ve DNA / transposaz protein kompleksi transposome olarak tanımlanır. Transposome bir kanamisin duyarlı konak (Şekil 1A) içine elektroporasyon 5 tarafından dönüştürülür. Kanamisin (LB-kan) içeren LB agar plakaları üzerinde büyüyen koloniler kanamisin (M-9-kan) auksotroplan olan ihtiva eden E-9, orta agar plakaları üzerinde büyümeye başarısız transpozon ekler (Şekil 1B), ve çoğaltma kaplama, transformantların (Figire bilgisi 1C). Bir mutant genomik DNA saflaştırılmış ve kısmen 4-bazlı kesici sınırlama endonükleazı, BFU CI (Şekil 1D) ile sindirilmektedir. Bağlı DNA bu pir geni (Şekil 1E) içeren Escherichia coli (E. Coli) &#39;in bir tür haline dönüştürülür. Bu gen, plazmid transpozonu ihtiva eden ve E içinde replike konak kromozomal komşu bölge sağlar coli 6. Kanamisin e dirençli gen olarak hizmet ederYeni plazmid için seçilebilir sıralarda kalem. Son olarak, kesilmiş olan genlerin kimliğini belirlemek için kullanılan transposon ve elde edilen dizinin Temel Lokal Hizalama Arama Aracı (BLAST) Analiz 7,8 her ucuna tamamlayıcı olan primerler kullanılarak sıralanmasıyla gerçekleştirilmesidir. Bu transposome bir mütajenez stratejisi üç avantaj 3 içerir. Transposaz protein transposon ye direkt olarak bağlı olduğu için ilk, ekleme konak içinde, transposaz gen ifadesi üzerindeki bağlı değildir. Transpozonları bir konakçı genom içine kendisini içerir sonra, transposaz transpozonun ilave hareketinin önlenmesi, parçalanır. Ev sahibi bir endojen Tn 5 transpositional eleman sahip, ancak ilave hareketi önlenememektedir. İkinci olarak, elektroporasyon ile transposome katılması mümkün ana çok çeşitli kullanılmasını mümkün kılmaktadır. Ayrıca, bakteriyel birleşme ya da VI ile transpozonun tanıtmak ihtiyacını ortadan kaldırırral enfeksiyon. Her iki süreç konak duyarlılık gerektirir. Üçüncü olarak, kanamisin direnç geni ve transposome içinde R6K γ replikasyon kaynağının dahil edilmesi daha kolay kesilen genini belirlemek için yapar. Transpozon kesintili bölgeler kaydedilir ve gen tanımlaması için ters polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) tekniğini kullanmak için olan ihtiyacı ortadan kaldırarak, plazmidler gibi dizilenebilmektedir. Bu video sunulan protokol Enterobacter sp transpozon mutagenezi için her bir aşamasını tarif etmektedir. YSU 9 kesintiye farazi geninin tanımlanması için bakteri hücreleri içine getirilmesi, bir transposome kullanılmıştır. Daha önce yayınlanmış protokollere 3,4,10 ek olarak, oksotrofları taranması için çoğaltma kaplama nasıl kullanıldığına ilişkin yöntemler sunulmaktadır. Bu mutagenez tekniği ident için, farklı bakteri türleri, örneğin antibiyotik ve metal dirençleri gibi diğer fenotipleri, araştırmak için kullanılabilmektedirveya bunun genetik veya mikrobik fizyolojisi doğal bir laboratuar bileşeni öğretmek için sentetik biyolojisi çalışmalarında tanımlanmış bir kültür koşulları altında büyüme için gerekli olan genlerin az sayıda seçmek ile.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="707">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name of Reagent</td>
			<td style="width:145px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:227px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">EZ-Tn5 R6K&#947;ori/KAN-2 Tnp Transposome Kit</td>
			<td style="width:145px;">Epicentre (Illumina)</td>
			<td style="width:119px;">TSM08KR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">EC100D pir+ Electrocompetent E. coli</td>
			<td style="width:145px;">Epicentre (Illumina)</td>
			<td style="width:119px;">ECP09500</td>
			<td style="width:227px;">Capable of replicating plasmids with an R6K&#947; replication origin at a low copy number</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">EC100D pir-116 Electrocompetent E. coli</td>
			<td style="width:145px;">Epicentre (Illumina)</td>
			<td style="width:119px;">EC6P095H</td>
			<td style="width:227px;">Capable of replicating plasmids with an R6K&#947; replication origin at a high copy number</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">5X M-9 Salts</td>
			<td style="width:145px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">DF048517</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Lennox LB Broth</td>
			<td style="width:145px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP1427-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Agar</td>
			<td style="width:145px;">Amresco, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">J637-1KG</td>
			<td style="width:227px;">Solid media contained 1.6% (w/v) agar</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Kanamycin Sulfate&#160;</td>
			<td style="width:145px;">Amresco, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">0408-25G</td>
			<td style="width:227px;">When required, media contained 50 &#956;g/ml kanamycin sulfate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">D-Glucose Monohydrate</td>
			<td style="width:145px;">Amresco, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">0643-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Yeast Extract</td>
			<td style="width:145px;">Amresco, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">J850-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tryptone</td>
			<td style="width:145px;">Amresco, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">J859-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">KCl</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P4504-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NaCl</td>
			<td style="width:145px;">Amresco, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">X190-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">MgCl2</td>
			<td style="width:145px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP214-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">MgSO2</td>
			<td style="width:145px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP213-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="92">
			<td height="92" style="height:92px;width:216px;">Super Optimal Broth with Catabolite Repression (SOC) medium</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:227px;">0.5% (w/v) yeast extract, 2% (w/v) tryptone, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20 mM MgSO4 and 20 mM Glucose</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BfuC I</td>
			<td style="width:145px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">R0636S</td>
			<td>Partial digestion of genomic DNA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Xho I</td>
			<td style="width:145px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">R0146S</td>
			<td>Plasmid digestion</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">T4 DNA Ligase</td>
			<td style="width:145px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Nuclease Free Water</td>
			<td style="width:145px;">Amresco, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">E476-1L</td>
			<td style="width:227px;">For dissolving precipitated DNA and restriction endonuclease reactions</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">GenomeLab DTCS - Quick Start Kit</td>
			<td style="width:145px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">608120</td>
			<td>DNA sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Wizard Genomic DNA Purification Kit</td>
			<td style="width:145px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">A1120A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System</td>
			<td style="width:145px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">A1460</td>
			<td>Plasmid purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Replica Plating Block</td>
			<td style="width:145px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">09-718-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Velveteen Squares</td>
			<td style="width:145px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">09-718-2</td>
			<td>Replica plating</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PetriStickers</td>
			<td style="width:145px;">Diversified Biotech</td>
			<td style="width:119px;">PSTK-1100</td>
			<td>Grid for replica plating</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Petri Dishes</td>
			<td style="width:145px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gene Pulser II</td>
			<td style="width:145px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Electroporation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Electroporation Cuvettes &#8211; 2 mm</td>
			<td style="width:145px;">BioExpress</td>
			<td style="width:119px;">E-5010-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">CentriVap DNA Vacuum Concentrator</td>
			<td style="width:145px;">Labconco</td>
			<td style="width:119px;">7970010</td>
			<td>Drying DNA</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">CEQ 2000XL DNA Analysis System</td>
			<td style="width:145px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>DNA sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vector NTI Advance 11.5.0</td>
			<td style="width:145px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">12605099</td>
			<td>DNA sequence analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of enterobacter sp. ysu auxotrophs using transposon mutagenesis

Prototrofik bakteri, bir karbon ve enerji kaynağı olarak kullanılan bir ortam glukoz (M-9 ortamı) ile takviye edilmiş M-9 az tuzlar üzerinde büyür. Oksotroflan bir transposome kullanılarak üretilebilir. Bu protokolde kullanılan ticari olarak temin edilebilir, Tn 5 türevi transposome transposaz bağlanma bölgeleri olarak görev yapabilmeleri bir R6K γ replikasyon orijini, kanamisin direnci ve iki mozaik dizisi ucu için bir geni ihtiva eden bir DNA doğrusal bir segmentten teşekkül eder. Bir DNA / transposaz protein kompleksi olarak sağlanır transposome, prototrofik soyu Enterobachter içine elektroporasyon ile dahil edilir. YSU ve rastgele bu konağın genomuna kendisini içerir. Transformantlar kanamisin, (LB-kan) ihtiva eden agar plakaları, Luria-Bertani üzerine ekildi çoğaltma ve kanamisin (M-9-kan) içeren E-9, orta agar plakaları üzerine bulunmaktadır. M-9-kan plakalarına LB-kan plakalarına büyür ancak Transformantlar oksotroflan olduğu kabul edilir. Saflaştırılmış genomikBir oksotrofdan DNA kısmen sindirilmiş bir pir + Escherichia coli (E. coli) suşu lige ve dönüşür. R6Kγ replikasyon orijini plazmid pir + E. çoğaltmak için izin verir E. coli suşu ve kanamisin direnç marker plazmid seçimi sağlar. Her transformantı kesilen kromozomal bölgeye çevrili transpozonunda içeren yeni bir plazmid sahiptir. Sanger dizileme ve Temel Yerel Hizalama Arama Aracı (BLAST) kesilen genin bir varsayımsal kimliğini öneririz. Bu transposome mutajenez stratejiyi kullanarak üç avantajı vardır. İlk olarak, ana bilgisayar tarafından bir transposaz gen ifadesi üzerindeki dayanmaz. İkinci olarak, transposome elektroporasyon ile yerine konjugasyon veya transdüksiyonu ile hedef konakçı içine dahil edilir ve bu nedenle daha verimli olur. Üçüncü olarak, R6Kγ kopya kökenini kolay mutasyona uğramış g belirlemek için yaparkısmen yeniden birleştirici bir plazmit geri kazanılır en. Bu teknik, Enterobacter sp başka özellikleri ile ilgili genleri araştırmak için kullanılabilir. YSU veya bakteriyel suşlar için daha çeşitli.

Enterobacter sp dönüşümü. Transposome ile elektroporasyon yöntemiyle YSU bunlar, konakçı genomu (Şekil 1A, B) rastgele genom ekleme başlatmıştır. Başarılı bir elektroporasyon LB-kan plakaları üzerinde büyüdü birkaç bin Transformantları vermiştir. 300-400 elde edilmesi için, plaka başına koloni iyi aralıklı, her bir LB-kan agar plakası üzerinde bir dönüşüm karışımı, toplam yayılan optimize edilmiştir. Her Transformant en az bir transposon eki içerdiği, ...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Enterobacter sp. YSU Auxotrophs Using Transposon Mutagenesis at JoVE.com

Generation of Enterobacter sp. YSU Auxotrophs Using Transposon Mutagenesis

Enterobacter sp. YSU glukoz az tuz ortamında büyür. Oksotroflan rastgele bir konakçı genom içine kendisini ekleyen bir transposome ile dönüştürülmesiyle oluşturulur. Mutantlar minimal orta karmaşık ortamdan replika plaka tarafından bulundu. Kesilen gen, kurtarma ve dizileme ile tespit edilir.

Üretilmesi<em&gt; Enterobacter</em&gt; Sp. YSU oksotroflan transpozon mutajenezi kullanarak,

Prototrophic bacteria grow on M-9 minimal salts medium supplemented with glucose (M-9 medium), which is used as a carbon and energy source. Auxotrophs can ...

generation-enterobacter-sp-ysu-auxotrophs-using-transposon

Research

JoVE Journal

Biology

Generation of Enterobacter sp. YSU Auxotrophs Using Transposon Mutagenesis

13.8K Görüntüleme.  Youngstown State University.  Enterobacter sp. YSU glukoz az tuz ortamında büyür. Oksotroflan rastgele bir konakçı genom içine kendisini ekleyen bir transposome ile dönüştürülmesiyle oluşturulur. Mutantlar minimal orta karmaşık ortamdan replika plaka tarafından bulundu. Kesilen gen, kurtarma ve dizileme ile tespit edilir. 

Video: Generation of Enterobacter sp. YSU Auxotrophs Using Transposon Mutagenesis

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

Mikroenjeksiyon Kararlı Transgenik C. elegans Üretimi

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Biyoloji

Homemade Site Directed Mutagenesis of Whole Plasmids

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned target gene can be altered by substitution, deletion or insertion of a few bases directly into a plasmid. It works by simply amplifying the whole plasmid, in a non PCR-based thermocycling reaction. During the reaction mutagenic primers, carrying the desired mutation, are integrated into the newly synthesized plasmid. In this video tutorial we demonstrate an easy and cost effective way to introduce base substitutions into a plasmid. The protocol works with standard reagents and is independent from commercial kits, which often are very expensive. Applying this protocol can reduce the total cost of a reaction to an eighth of what it costs using some of the commercial kits. In this video we also comment on critical steps during the process and give detailed instructions on how to design the mutagenic primers.

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. Here we demonstrate an easy and cost effective way to introduce base substitutions into a plasmid using standard reagents.

Tüm Plazmidler Homemade Sitesi Yönetmen Mutagenez

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned ...

Generation of RNA/DNA Hybrids in Genomic DNA by Transformation using RNA-containing Oligonucleotides

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be produced to contain any desired DNA or RNA sequence and can be prepared to include a wide variety of base and sugar modifications. Moreover, oligos can be designed to mimic specific nucleic acid alterations and thus, can serve as important tools to investigate effects of DNA damage and mechanisms of repair. We found that Thermo Scientific Dharmacon RNA-containing oligos with a length between 50 and 80 nucleotides can be particularly suitable to study, in vivo, functions and consequences of chromosomal RNA/DNA hybrids and of ribonucleotides embedded into DNA. RNA/DNA hybrids can readily form during DNA replication, repair and transcription, however, very little is known about the stability of RNA/DNA hybrids in cells and to which extent these hybrids can affect the genetic integrity of cells. RNA-containing oligos, therefore, represent a perfect vector to introduce ribonucleotides into chromosomal DNA and generate RNA/DNA hybrids of chosen length and base composition. Here we present the protocol for the incorporation of ribonucleotides into the genome of the eukaryotic model system yeast /Saccharomyces cerevisiae/. Yet, our lab has utilized Thermo Scientific Dharmacon RNA-containing oligos to generate RNA/DNA hybrids at the chromosomal level in different cell systems, from bacteria to human cells.

This work shows how to form an RNA/DNA hybrid at the chromosomal level and reveal transfer of genetic information from RNA to genomic DNA in yeast cells.

RNA içeren Oligonükleotidler kullanarak Dönüşüm Genomik DNA, RNA / DNA Hibritlerin Üretimi

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

İyon Kanalları ve Fonksiyonel Analiz Mutagenez Heterologously Memeli Hücreleri cinsinden ifade edilir

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

An Introduction to Worm Lab: from Culturing Worms to Mutagenesis

This protocol describes procedures to maintain nematodes in the laboratory and how to mutagenize them using two alternative methods: ethyl methane sulfonate (EMS) and 4, 5', 8-trimethylpsoralen combined with ultraviolet light (TMP/UV). Nematodes are powerful biological systems for genetics studies because of their simple body plan and mating system, which is composed of self-fertilizing hermaphrodites and males that can generate hundreds of progeny per animal. Nematodes are maintained in agar plates containing a lawn of bacteria and can be easily transferred from one plate to another using a pick. EMS is an alkylating agent commonly used to induce point mutations and small deletions, while TMP/UV mainly induces deletions. Depending on the species of nematode being used, concentrations of EMS and TMP will have to be optimized. To isolate recessive mutations of the nematode Pristionchus pacificus, animals of the F2 generation were visually screened for phenotypes. To illustrate these methods, we mutagenized worms and looked for Uncoordinated (Unc), Dumpy (Dpy) and Transformer (Tra) mutants.

Screening for mutants with phenotypic defects is a straightforward method for identifying genes that function in a given biological process. In this article we describe how to culture free living worms (e.g., Pristionchus pacificus) in the laboratory and show two different mutagenesis methods, EMS and TMP/UV.

Solucan Lab An Introduction to: Kültürleme Worms Mutagenez

This protocol describes procedures to maintain nematodes in the laboratory and how to mutagenize them using two alternative methods: ethyl methane ...

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular signatures, or to evolve proteins in the laboratory. Here, we present a protocol that allows the generation of large (>1011) mutant libraries for a given target sequence. This method is based on replication of a ColE1 plasmid encoding the desired sequence by a low-fidelity variant of DNA polymerase I (LF-Pol I). The target plasmid is transformed into a mutator strain of E. coli and plated on solid media, yielding between 0.2 and 1 mutations/kb, depending on the location of the target gene. Higher mutation frequencies are achieved by iterating this process of mutagenesis. Compared to alternative methods of mutagenesis, our protocol stands out for its simplicity, as no cloning or PCR are involved. Thus, our method is ideal for mutational labeling of plasmids or other Pol I templates or to explore large sections of sequence space for the evolution of activities not present in the original target. The tight spatial control that PCR or randomized oligonucleotide-based methods offer can also be achieved through subsequent cloning of specific sections of the library. Here we provide protocols showing how to create a random mutant library and how to establish drug-based selections in E. coli to identify mutants exhibiting new biochemical activities.

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

Here we demonstrate a simple protocol to create a random mutant library for a given target sequence. We show how this method, which is performed in vivo in Escherichia coli, can be coupled with functional selections to evolve new enzymatic activities.

Proteinlerin Yönetmen Evolution Mutagenez ve Fonksiyonel Seçim Protokolleri E. coli</em

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular ...

Single Oocyte Bisulfite Mutagenesis

Epigenetics encompasses all heritable and reversible modifications to chromatin that alter gene accessibility, and thus are the primary mechanisms for regulating gene transcription1. DNA methylation is an epigenetic modification that acts predominantly as a repressive mark. Through the covalent addition of a methyl group onto cytosines in CpG dinucleotides, it can recruit additional repressive proteins and histone modifications to initiate processes involved in condensing chromatin and silencing genes2. DNA methylation is essential for normal development as it plays a critical role in developmental programming, cell differentiation, repression of retroviral elements, X-chromosome inactivation and genomic imprinting.
One of the most powerful methods for DNA methylation analysis is bisulfite mutagenesis. Sodium bisulfite is a DNA mutagen that deaminates cytosines into uracils. Following PCR amplification and sequencing, these conversion events are detected as thymines. Methylated cytosines are protected from deamination and thus remain as cytosines, enabling identification of DNA methylation at the individual nucleotide level3. Development of the bisulfite mutagenesis assay has advanced from those originally reported4-6 towards ones that are more sensitive and reproducible7. One key advancement was embedding smaller amounts of DNA in an agarose bead, thereby protecting DNA from the harsh bisulfite treatment8. This enabled methylation analysis to be performed on pools of oocytes and blastocyst-stage embryos9. The most sophisticated bisulfite mutagenesis protocol to date is for individual blastocyst-stage embryos10. However, since blastocysts have on average 64 cells (containing 120-720 pg of genomic DNA), this method is not efficacious for methylation studies on individual oocytes or cleavage-stage embryos.
Taking clues from agarose embedding of minute DNA amounts including oocytes11, here we present a method whereby oocytes are directly embedded in an agarose and lysis solution bead immediately following retrieval and removal of the zona pellucida from the oocyte. This enables us to bypass the two main challenges of single oocyte bisulfite mutagenesis: protecting a minute amount of DNA from degradation, and subsequent loss during the numerous protocol steps. Importantly, as data are obtained from single oocytes, the issue of PCR bias within pools is eliminated. Furthermore, inadvertent cumulus cell contamination is detectable by this method since any sample with more than one methylation pattern may be excluded from analysis12. This protocol provides an improved method for successful and reproducible analyses of DNA methylation at the single-cell level and is ideally suited for individual oocytes as well as cleavage-stage embryos.

Bisulfite mutagenesis is the gold standard for analyzing DNA methylation. Our modified protocol allows for DNA methylation analysis at the single-cell level and was specifically designed for individual oocytes. It can also be used for cleavage-stage embryos.

Tek Oosit Bisülfit Mutagenez

Epigenetics encompasses all heritable and reversible modifications to chromatin that alter gene accessibility, and thus are the primary mechanisms for ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic tools have been introduced, including multiple strategies for inducing mutations and generating transgenic lines. However, large-scale screening is limited by traditional genotyping methods, which are time-consuming and labor-intensive. Here we describe a technique to analyze zebrafish genotypes by PCR combined with high-resolution melting analysis (HRMA).&#160;This approach is rapid, sensitive, and inexpensive, with lower risk of contamination artifacts.&#160;Genotyping by PCR with HRMA can be used for embryos or adult fish, including in high-throughput screening protocols.

PCR combined with high-resolution melt analysis (HRMA) is demonstrated as a rapid and efficient method to genotype zebrafish.

Yüksek çözünürlüklü Melt Analizi ile PCR kullanarak hızlı ve verimli Zebra Genotiplemesi

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

Efficient iPS Cell Generation from Blood Using Episomes and HDAC Inhibitors

This manuscript illustrates a protocol for efficiently creating integration-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) from peripheral blood using episomal plasmids and histone deacetylase (HDAC) inhibitors. The advantages of this approach include: (1) the use of a minimal amount of peripheral blood as a source material; (2) nonintegrating reprogramming vectors; (3) a cost effective method for generating vector free iPSCs; (4) a single transfection; and (5) the use of small molecules to facilitate epigenetic reprogramming. Briefly, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are isolated from routine phlebotomy samples and then cultured in defined growth factors to yield a highly proliferative erythrocyte progenitor cell population that is remarkably amenable to reprogramming. Nonintegrating, nontransmissible episomal plasmids expressing OCT4, SOX2, KLF4, MYCL, LIN28A, and a p53 short hairpin (sh)RNA are introduced into the derived erythroblasts via a single nucleofection. Cotransfection of an episome that expresses enhanced green fluorescent protein (eGFP) allows for easy identification of transfected cells. A separate replication-deficient plasmid expressing Epstein-Barr nuclear antigen 1 (EBNA1) is also added to the reaction mixture for increased expression of episomal proteins. Transfected cells are then plated onto a layer of irradiated mouse embryonic fibroblasts (iMEFs) for continued reprogramming. As soon as iPSC-like colonies appear at about twelve days after nucleofection, HDAC inhibitors are added to the medium to facilitate epigenetic remodeling. We have found that the inclusion of HDAC inhibitors routinely increases the generation of fully reprogrammed iPSC colonies by 2 fold. Once iPSC colonies exhibit typical human embryonic stem cell (hESC) morphology, they are gently transferred to individual iMEF-coated tissue culture plates for continued growth and expansion.

Here we describe a protocol for generating human induced pluripotent stem cells from peripheral blood using an episome based reprogramming strategy and histone deacetylase inhibitors.

Epizomlar ve HDAC inhibitörleri kullanarak Blood Verimli iPS Hücre Üretimi

This manuscript illustrates a protocol for efficiently creating integration-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) from peripheral blood using ...

A Protocol for Functional Assessment of Whole-Protein Saturation Mutagenesis Libraries Utilizing High-Throughput Sequencing

Site-directed mutagenesis has long been used as a method to interrogate protein structure, function and evolution. Recent advances in massively-parallel sequencing technology have opened up the possibility of assessing the functional or fitness effects of large numbers of mutations simultaneously. Here, we present a protocol for experimentally determining the effects of all possible single amino acid mutations in a protein of interest utilizing high-throughput sequencing technology, using the 263 amino acid antibiotic resistance enzyme TEM-1 &#946;-lactamase as an example. In this approach, a whole-protein saturation mutagenesis library is constructed by site-directed mutagenic PCR, randomizing each position individually to all possible amino acids. The library is then transformed into bacteria, and selected for the ability to confer resistance to &#946;-lactam antibiotics. The fitness effect of each mutation is then determined by deep sequencing of the library before and after selection. Importantly, this protocol introduces methods which maximize sequencing read depth and permit the simultaneous selection of the entire mutation library, by mixing adjacent positions into groups of length accommodated by high-throughput sequencing read length and utilizing orthogonal primers to barcode each group. Representative results using this protocol are provided by assessing the fitness effects of all single amino acid mutations in TEM-1 at a clinically relevant dosage of ampicillin. The method should be easily extendable to other proteins for which a high-throughput selection assay is in place.

We present a protocol for the functional assessment of comprehensive single-site saturation mutagenesis libraries of proteins utilizing high-throughput sequencing. Importantly, this approach uses orthogonal primer pairs to multiplex library construction and sequencing. Representative results using TEM-1 &#946;-lactamase selected at a clinically relevant dosage of ampicillin are provided.

Yüksek verimlilik sıralaması kullanılması Tüm-Protein Doygunluk Mutagenez Kütüphaneleri Fonksiyonel Değerlendirme Protokolü

Site-directed mutagenesis has long been used as a method to interrogate protein structure, function and evolution. Recent advances in massively-parallel ...