Yazar 2010-2014 bahar dönemlerinde benim transpozonunun mutagenez fikirlerini test benim Mikrobiyal Fizyoloji yüksek lisans öğrencilerinin benim lisans Bağımsız Araştırma Öğrenciler tüm ve tüm teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma Youngstown State Üniversitesi Biyolojik Bilimler Bölümü tarafından finanse edildi.

Competent Cells&#39;e 5,11 1. Elektroporasyon <ol><li> Enterobacter sp bir O / N LB kültürünü sulandırmak. Taze LB ortamında 50 ml YSU 1/20 ve 0.4 ve 0.6 arasında bir OD (600 nm), 30 ° C, 120 rpm&#39;de sallama ve büyür. İsteğe bağlı olarak, optimal çoğalma sıcaklığında diğer bakteri soyları büyür. </li><li> 5 dakika santrifüj 4 ° C sıcaklıkta 5 dakika boyunca 7,000 x g buz üzerinde hücreleri soğutun. </li><li> , Supernatant 4 ° C&#39;de steril buz gibi soğuk su ve santrifüj 50 ml hücreleri tekrar süspansiyon ve 5 dakika süreyle 7,000 x g. Bu adımı tekrarlayın. </li><li> Süpernatant atılır ve hücre topağı hacmine eşit buz gibi soğuk su hacminde tekrar süspansiyon hücreleri. Uzun süreli depolama için -80 ° C arasında ve çözülme buz soğukluğunda% 10 (h / h) gliserol, depo eşit pelet hacimde buz soğukluğunda% 10 (h / h) gliserol, tekrar süspansiyon 10 ml Hücreleri yıkamak Elektroporasyonun önce buz üzerinde. </li><li> 40 ul transposome 0.5 ul eklehücreler. Ticari olarak temin edilebilen transposome çözeltisi 0.33 ug / ul DNA konsantrasyonda sağlanır. 0.33 ug tavsiye edilir, ancak, 0.165 mg DNA yeterlidir. </li><li> Bir buz soğukluğunda, 0.2 mm elektroporasyon küveti içinde hücre / transposome karışım konulur ve küvetin altındaki karışımın dokunun. 25 iF 200 Ω ve 2.5 kV hücreleri Şok. , Hücreler soğutulmuş kalmasını sağlamak kullanılmadan önce -20 ° C derin dondurucuda elektroporasyon küvetleri saklamak için. </li><li> Hemen, katabolik baskı (SOC) ortamı ile süper optimum suyu sterilize filtre 960 ul ekleyin. Aşağı yukarı pipetleme ile karıştırın ve steril bir 1.5 ml mikrofüj tüpe hücreleri aktarın. NOT: Hücreler şoktan sonra ölmeye başlar, ama SOC ortamında tuz onları kurtarmak için olanak sağlar. Tasarruf için, transposome eklemek ya da negatif kontrol hücreleri şok için gerekli değildir. Sadece bunu steril SOC orta 960 ul ekleyin. </li><li> 30 ° C f hücreleri inkübeya da 120 rpm&#39;de çalkalayarak 45-60 dakika. Bu kanamisin direnci ifade transposome hücreler, konakçı genomu ile için rekombine için zaman sağlar. </li><li> LB-kan agar plakası üzerinde 100 ul hücre yayıldı ve 30 ° C de bord O / N inkübe edin. 4 ° C&#39;de buzdolabında kalan dönüşüm karışımı saklayın. Gerekirse ilk elektroporasyon 2 hafta sonra bir sonraki tarih kadar ek miktarda yayıldı. </li></ol> Transformantların 2. Gridleme <ol><li> Bant boş bir 100 x 15 mm Petri kabı kapağı için bir ızgara. &quot;Bakteriyel Genetik A Short Course&quot; 12 bir ızgara kopyalayın. </li><li> LB-kan agar levhasının alt tarafında bir çizgi çizin. Izgara agar boyunca görünür şekilde gridded kapağın onu tutturmak için bant küçük bir parça kullanın. Plakanın alt çizgi, ızgaranın üst, merkezi ile hizalanmış olduğundan emin olun. Bant ile plaka Sabitleştirilmesi bile gridding için izin kaymasını onu tutar. Hat çoğaltma sonra kaplama koloni tespitini kolaylaştırır. </li><li> Steril bir kürdan ile bir tek transforman almak ve ızgara bir kare merkezinde o noktaya. Sadece koloni ve yere dokunur. Agar içine kürdan kazmak yok. Plaka kirletmesini önlemek için, yalnızca bir ucunda kürdan anlaştım. </li><li> Adım 2.3 olarak bitişik bir karede başka dönüştürülmüşü nokta. Plaka dolduğunda, 30 ° C / o n inkübe. Bu ana plaka. </li></ol> 3. Kopya Kaplama auxotroph fenotipe 12 belirleme <ol><li> LB-kan için M-9-kan için LB-kan için bir, iki ve üç: gridded her plakanın için, bir ile üç numaralı üç taze agar plakaları destesini yapmak. Kullanımdan önce 37 ° C &#39;de, ters O / N plakaları kurutunuz. </li><li> Aşama 2.2 olarak her bir plakanın üstünde bir çizgi çizin. </li><li> % 70 etanol ile çoğaltma kaplama aracı silin kopya kaplamanın üstüne steril bir pamuklu kadife kare yerleştirmekol ve kadife kare dizginlenebileceği. Eller hatta onları yıkadıktan sonra mikroplarla iç içedir. Kenarndan kadife kare ele mikropları kirletici girişini önlemek. </li><li> Kelepçe üzerine çizilen bir çizgi ile ana plaka üzerinde çizgi hizalayın ve kadife kare üstüne plaka yerleştirin. Kadife meydanına plakadan bakteri aktarmak için hafif bir baskı uygulayın. Bakterileri smear için dikkatli olun. Kadife meydanından ana plakasını sökün. </li><li> Kelepçe üzerinde çizgi ile plaka numaralı çizilen çizgi hizalayın ve kadife kare üstüne yerleştirin. Plakasına kadife meydanından bakteri aktarmak için hafif bir baskı uygulayın. Plaka numarası teker çıkarın. </li><li> Su behere kadife kare atın ve adım 3.3 gibi çoğaltma kaplama aracı üzerinde temiz, steril pamuklu kadife kare yerleştirin. Bu adım aşırı aşılamadan atılım büyüme ve yanlış pozitif sonuçlara neden önler. </li><li> Hizalayınkelepçe üzerinde çizgi ile plaka numarasına bir line ve yeni kadife kare üstüne yerleştirin. Kadife meydanına plaka numara gelen bakteri aktarmak için hafif bir baskı uygulayın. Plaka numarası teker çıkarın. </li><li> Kelepçe üzerinde çizgi ile plaka sayısı iki çizilen çizgi hizalayın ve kadife kare üstüne yerleştirin. Plaka sayısı iki kadife meydanından bakteri aktarmak için hafif bir baskı uygulayın. Plaka numarası iki çıkarın. </li><li> Plaka numarası üç için yineleyin 3.8. Üçüncü levha ise bir diğer iki levha için ana plaka tam devri için bir kontroldür. Su ihtiva eden bir kap içine kadife kare atın. Onları kuru, yıkayın alüminyum folyoya sarın ve bunları yeniden kaynatmayın, kirlenmiş pamuklu kadife kareler içeren beher otoklavlamayın, kadife kareler tekrar kullanmak için. </li><li> 30 ° CO / N de inkübe. Her iki LB-kan agar plakaları üzerinde büyür ancak M-9-kan plakalarına büyümeye başarısız koloniler oksotroflan (olduğu düşünülmektedir <strong&gt; Şekil 2). </li><li> Streak dışarı taze LB-kan agar plaka üzerine plakası itibaren oksotroflan ve 30 ° CO / N de plaka kuluçkaya yatmaktadır. </li><li> Izolasyon taze LB-kan plaka üzerine adım 3.11 çizgi plaka 3 koloniler için dışarı Streak. 30 ° CO / N de plaka kuluçkaya yatmaktadır. Bu mutant iyi izole olmasını sağlar. Bir bölümde her koloninin dışarı üçte içine plaka ve çizgi bölün. </li><li> Taze LB-kan plaka üzerine adım 3.12 türetilen üzerine şerit kolonilerden Spot koloniler adımlar 2,1-2,4 gibi bir tablo oluşturmak için. Her mutant üçlü olarak yeniden test ediliyor. </li><li> Oksotrofu fenotip onaylamak için adımlar 3,1-3,10 gibi yine plaka çoğaltmak. </li></ol> 4. Gen Kurtarma <ol><li> 30 ° C de sıvı LB-kan ortamı içinde aşama 3.13 arasında bir izole edilmiş mutant bir koloni 3 mi göre O / N kültür büyütün. Bir ticari olarak temin edilebilen genomik bir DNA saflaştırma kiti kullanılarak kültürün 1 ml genomik DNA arındırın. </li><li> 0.025 U karışımı kurmakBFU CI kısıtlama endonükleaz ve buz üzerinde 20 ul reaksiyon / ul genomik DNA 1 mcg 14 ul. BFU CI oniki farklı sitelerde transpozonunda keser bu yana, restriksiyon endonükleaz, BFA I veya sırasıyla, iki ve üç farklı sitelerde transpozonunda keser Hae III, kullanmak daha verimli olabilir. </li><li> 25 dakika boyunca 37 ° C&#39;de reaksiyonu inkübe ve daha sonra 80 ° C de 20 dakika enzimler inaktive edildi. % 0.8 agaroz jeli (Şekil 3), kısmen sindirilmiş DNA 3 ul analiz eder. Jel dibine yukarıdaki 10 kb bir karalama başarılı kısmi sindirimi sonuçları. </li><li> 500 ul reaksiyon maddesi içinde T4 DNA ligazı 800 birimleri kullanarak kısmen sindirilmiş genomik DNA 15 ul Arter. Reaksiyon O / N 4 ° C&#39;de inkübe edin. Büyük bir reaksiyon hacmini kendileri tek fragmanların ligasyonu arttırır, ve iki ya da daha fazla DNA fragmanları arasındaki etkileşimi en aza indirir. </li><li> Bir çökeltite 3 M sodyum asetat, pH 5.5 ve 1 ml% 95 etanol içinde 50 ul ilave edilmesi ve 20 dakika boyunca -20 ° C&#39;de inkübe edilerek Bağlı DNA. </li><li> % 70 etanol ile yıkayın pelet, 10 dakika boyunca 4 ° C&#39;de DNA ve 13,500 xg mikrofüj santrifüj vakum yoğunlaştırıcısı kurutun ve nükleaz serbest su 10 ul içinde tekrar süspansiyon haline getirin. Seçenek olarak ise, DNA, havada 15 dakika boyunca oda sıcaklığında kurutulabilir. </li><li> E. dönüştürmek için yeniden süspanse DNA 4 ul kullanın bölüm 1. R6k γ replikasyon orijini olarak elektroporasyon ile E. coli suşu ECD100D pir veya ECD100D pir116 6 çoğaltmak için bir pir gen ile bir bakterinin gerektirir. Düşük kopya plasmidlerde pir zorlanma sonucu, ve pir116 gerginlik yüksek kopya plazmidler sonuçlanan bir pir mutant genini içerir. Her bir transformant transposon ve kesintiye kromozom (Şekil 1 E) bir bölgesi ile bir plazmid içerir. </li><li> InokülasyonlaraTek bir koloni LB-kan, ortamın 5 ml yedi, 120 rpm&#39;de ve 37 ° C&#39;de çalkalama ile G / Ç N çoğaltılmasını ve ticari bir kit kullanılarak bütün O / N kültürden plazmid DNA saflaştırılması. </li><li> Kısıtlama endonükleaz Xhol I&#39;in kullanılması suretiyle plazmidin 14 ul Digest Reaksiyonun nihai hacmi, 20 ul olduğundan emin olun. Bu enzim, kanamisin direnç geninin 5 &#39;ucundaki transpozonun ortasında bir site tanır. Sindirilmemiş 10 ul analiz eder ve bir% 0.8 agaroz jeli (Şekil 3) ile sindirilmiş plasmide. Plasmid 2 kb transpozon artı eteklenen konukçu DNA&#39;dan oluşur. </li></ol> 5. DNA Dizilimi <ol><li> Bir ticari olarak temin edilebilir dizileme kiti, transposon her bir ucuna homolog olan primerler ve bir kılcal dizilim analizi sistemi kullanılarak plazmid dizisi. Seçenek olarak ise, plazmid sekanslama için bir dış kuruma sevk edilebilir. </li><li> Moleküler ağırlık standardı (1 kb merdiven) kullanımJel plazmidin boyutunu tahmin etmek. Daha sonra, 50 fmol için gerekli olan plazmid nanogram (ng) kestirilebilir. </li><li> 260 nm (260) ve 280 nm (A 280) dalga boylarında bir spektrofotometre kullanılarak plazmid DNA konsantrasyonu ölçümü. Küvetinden geçen ışık uzunluğu 1 cm olduğundan emin olun. 50 ng / ml ile 260 nm&#39;de absorbansı çarpılarak konsantrasyonunun belirlenmesi. Yüksek kaliteli plazmid DNA, bir A 260 / 1.8 ve 2.0 arasında bir 280 oranına sahip olacaktır. </li><li> Her sekanslama reaksiyonu için gerekli DNA hacmi plazmid konsantrasyonu ile bölünen, 50 fmol için gerekli ng sayısıdır. 10 ul toplam hacmi getirmek için su ile gerektiği plazmidin miktarda karıştırın. </li><li> 1 dakika boyunca 96 ° C &#39;de plazmid DNA / su karışımının ısıtılması ve daha sonra oda sıcaklığına kadar soğutulması. </li><li> Dizileme kiti ana karışımı 8 ul ve sekanslama primerleri birinin uM 1.6 2 ul ekleyin. </li><li> Foltermal döngü programı ve reaksiyon temizliği için dizileme kiti düşük protokolü. </li><li> Bir kılcal DNA analiz sistemi kullanılarak her bir örnek analiz edin. </li><li> DNA dizisini görüntülemek için piyasada satılan bir yazılım paketi kullanın. Transposon (Şekil 4) ve son 7 bp dizisi, &quot;5&#39;-GAGACAG-3 &#39;,&quot; ara. Bu 7 bp&#39;lik segment 5 &#39;ucunda önce sırası transposon aittir. Bu 7 bp&#39;lik segment 3 &#39;ucundan sonraki sekansı kesintiye uğramış gene aittir. </li><li> Temel Yerel Hizalama Arama Aracı (BLAST) 7,8 kullanılarak kesilen genin olası fonksiyonunu belirler. Aşağıdaki kullanın link: <a href="http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&amp;BLAST_PROGRAMS=megaBlast&amp;PAGE_TYPE=BlastSearch" target="_b;ank">http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&amp;BLAST_PROGRAMS=megaBlast&amp;PAGE_TYPE=BlastSearch</a> . Interrupt&#39;ının dizisini yapıştırınsorgu kutusuna ed gen, veritabanı altında &quot;diğerleri&quot; seçeneğini seçin ve sayfanın altındaki &quot;BLAST&quot; üzerine tıklayın. Sonuç göründüğünde, hizalama sonuçları (Şekil 5) görüntülemek için sayfayı aşağı kaydırın. </li></ol>

<ol>
	<li>Kim, B. H., Gadd, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bacterial physiology and metabolism. , (2008).</li><li>Hayes, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposon-based+strategies+for+microbial+functional+genomics+and+proteomics.">Transposon-based strategies for microbial functional genomics and proteomics.</a> Annual review of genetics. 37, 3-29 (2003).</li><li>Hoffman, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Random+chromosomal+gene+disruption+in+vivo+using+transposomes.">Random chromosomal gene disruption in vivo using transposomes.</a> Methods in molecular biology. 765, 55-70 (2011).</li><li>Goryshin, I. Y., Jendrisak, J., Hoffman, L. M., Meis, R., Reznikoff, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertional+transposon+mutagenesis+by+electroporation+of+released+Tn5+transposition+complexes.">Insertional transposon mutagenesis by electroporation of released Tn5 transposition complexes.</a> Nature biotechnology. 18 (1), 97-100 (2000).</li><li>Dower, W. J., Miller, J. F., Ragsdale, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+Efficiency+Transformation+of+E.+coli+by+High+Voltage+Electroporation.">High Efficiency Transformation of E. coli by High Voltage Electroporation.</a> Nucleic Acids Research. 16 (13), 6127-6145 (1988).</li><li>Metcalf, W. W., Jiang, W., Wanner, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+rep+technique+for+allele+replacement+to+construct+new+Escherichia+coli+hosts+for+maintenance+of+R6K&#947;+origin+plasmids+at+different+copy+numbers.">Use of the rep technique for allele replacement to construct new Escherichia coli hosts for maintenance of R6K&#947; origin plasmids at different copy numbers.</a> Gene. 138 (1-2), 1-7 (1994).</li><li>Morgulis, A., Coulouris, G., Raytselis, Y., Madden, T. L., Agarwala, R., Sch&#228;ffer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+Database+indexing+for+production+MegaBLAST+searches.">a Database indexing for production MegaBLAST searches.</a> Bioinformatics. 24 (16), 1757-1764 (2008).</li><li>Zhang, Z., Schwartz, S., Wagner, L., Miller, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+greedy+algorithm+for+aligning+DNA+sequences.">A greedy algorithm for aligning DNA sequences.</a> Journal of computational biology a journal of computational molecular cell biology. 7 (1-2), 203-214 (2000).</li><li>Holmes, A., Vinayak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+two+multimetal+resistant+bacterial+strains:+Enterobacter+sp.+YSU+and+Stenotrophomonas+maltophilia+OR02.">Comparison of two multimetal resistant bacterial strains: Enterobacter sp. YSU and Stenotrophomonas maltophilia OR02.</a> Current microbiology. 59 (5), 526-531 (2009).</li><li>Hoffman, L. M., Jendrisak, J. J., Meis, R. J., Goryshin, I. Y., Reznikoff, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposome+insertional+mutagenesis+and+direct+sequencing+of+microbial+genomes.">Transposome insertional mutagenesis and direct sequencing of microbial genomes.</a> Genetica. 108 (1), 19-24 (2000).</li><li>Ausubel, F., Brent, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Short Protocols in Molecular Biology. , (1997).</li><li>Miller, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A short course in bacterial genetics: a laboratory manual and handbook for Escherichia coli and related bacteria. 2, (1992).</li><li>Gibson, M. I., Gibson, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preliminary+studies+on+the+isolation+and+metabolism+of+an+intermediate+in+aromatic+biosynthesis:+chorismic+acid.">Preliminary studies on the isolation and metabolism of an intermediate in aromatic biosynthesis: chorismic acid.</a> The Biochemical journal. 90 (2), 248-256 (1964).</li><li>Jacobs, M. A., Alwood, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+transposon+mutant+library+of+Pseudomonas+aeruginosa.">Comprehensive transposon mutant library of Pseudomonas aeruginosa.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (24), (2003).</li><li>Reznikoff, W., Winterberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposon-Based+Strategies+for+the+Identification+of+Essential+Bacterial+Genes.">Transposon-Based Strategies for the Identification of Essential Bacterial Genes.</a> Microbial Gene Essentiality: Protocols and Bioinformatics SE. 2, 13-26 (2008).</li><li>Suzuki, N., Inui, M., Yukawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Random+genome+deletion+methods+applicable+to+prokaryotes.">Random genome deletion methods applicable to prokaryotes.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 79 (4), 519-526 (2008).</li><li>Malley, M. A., Powell, A., Davies, J. F., Calvert, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knowledge-making+distinctions+in+synthetic+biology.">Knowledge-making distinctions in synthetic biology.</a> BioEssays news and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 30 (1), 57-65 (2008).</li><li>Zheng, Y. -. N., Li, L. -. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Problems+with+the+microbial+production+of+butanol.">Problems with the microbial production of butanol.</a> Journal of industrial microbiolog., &amp; biotechnology. 36 (9), 1127-1138 (2009).</li></ol>

Yazar ifşa hiçbir şey vardır.

Bir transposome kullanarak transpozonunun mutagenez Enterobacter sp oksotropları üretmek için etkili bir araçtır. YSU ve Gram negatif diğer türleri ve Gram pozitif bakteriler 3,4. Işlem elektroporasyon ile konakçıya Tn 5 türevi transposome katılmasıyla başlatıldı. Uçlar ile kolonilerini teşhis etmek için, dönüştürülmemiş hedef soyu transposon tarafından taşınan direnç seviyesi seçmek için kanamisine karşı duyarlı olması gerekiyordu. Bazı ana bu şekilde ko...

Prototrofik bakteri biyosentezi 1, amino asitler, nükleik asitler ve vitaminler gibi öncüleri, oluşturmak için, merkezi karbon metabolizma sentez yollan ile glikoz dönüştürücüler, orta glukoz (M-9 ortamı) ihtiva eden E-9 minimal tuz büyür. E-9 ortamı, bir karbon ve enerji kaynağı olarak bir kükürt kaynağı ve glukoz gibi bir tampon madde ve fosfor kaynağı, magnezyum sülfat gibi bir nitrojen kaynağı, sodyum ve potasyum fosfat, amonyum klorür içermektedir. Luria-Bertani (LB) tripton gelen ve maya ekstraktı vitaminler, büyüme faktörleri, amino asitler açısından zengindir. M-9 ortamı üzerinde büyüme için gerekli olan amino asitler, vitaminler ve diğer büyüme faktörleri sentezleyemediği oksotrofları gelişimini destekler. Oksotroflan M-9 ortamında LB ortamında değil, büyüyecek ise Böylece prototrofları, LB ve M-9 ortamda büyür. Okzotrofik fenotipleri neden mutasyona uğramış genleri bakteri Prototrofik nüfusu mutasyonların sokulmasıyla ve tanımlayarak, bu po olduğunubakterisel bir suş içerisinde metabolizmasının daha iyi bir anlayış elde etmek ssible. Transpozon mutagenezi M-9 ortam içinde glükoz üzerinde büyüme için gerekli olan genlerin çoğu belirlemek için kullanılabilir. Transposonlar konak genomuna 2 içerisine rastgele kendilerini eklemek. E-9, orta agar plakaları üzerine LB agar levhaları onları kaplama çoğaltma transpozon transformantları tespit ederek, oksotrofları taranması mümkündür. Interrupted genler gen kurtarma yoluyla tespit edilir. Bu çalışma, bir ticari olarak temin edilebilir, Tn 5 transposaz protein ile karıştırılmış olarak, bir lineer transpozon DNA segmentinin bir çözelti olarak sevk edildiği transposome -türevli kullanır. DNA segmenti bir transposaz gen yoksun ama kanamisin direnci için bir gen, bir R6K γ tekrarlama orijinini ve bunun sonrasında parçanın 3,4 her bir ucunda bağlama transpozaz için DNA dizileri iki mozaik motifleri ihtiva eder. Transposaz proteinin DNA, tek başına DNA segmenti doğrudan ilave edilir yanatransposon olarak tanımlanır, ve DNA / transposaz protein kompleksi transposome olarak tanımlanır. Transposome bir kanamisin duyarlı konak (Şekil 1A) içine elektroporasyon 5 tarafından dönüştürülür. Kanamisin (LB-kan) içeren LB agar plakaları üzerinde büyüyen koloniler kanamisin (M-9-kan) auksotroplan olan ihtiva eden E-9, orta agar plakaları üzerinde büyümeye başarısız transpozon ekler (Şekil 1B), ve çoğaltma kaplama, transformantların (Figire bilgisi 1C). Bir mutant genomik DNA saflaştırılmış ve kısmen 4-bazlı kesici sınırlama endonükleazı, BFU CI (Şekil 1D) ile sindirilmektedir. Bağlı DNA bu pir geni (Şekil 1E) içeren Escherichia coli (E. Coli) &#39;in bir tür haline dönüştürülür. Bu gen, plazmid transpozonu ihtiva eden ve E içinde replike konak kromozomal komşu bölge sağlar coli 6. Kanamisin e dirençli gen olarak hizmet ederYeni plazmid için seçilebilir sıralarda kalem. Son olarak, kesilmiş olan genlerin kimliğini belirlemek için kullanılan transposon ve elde edilen dizinin Temel Lokal Hizalama Arama Aracı (BLAST) Analiz 7,8 her ucuna tamamlayıcı olan primerler kullanılarak sıralanmasıyla gerçekleştirilmesidir. Bu transposome bir mütajenez stratejisi üç avantaj 3 içerir. Transposaz protein transposon ye direkt olarak bağlı olduğu için ilk, ekleme konak içinde, transposaz gen ifadesi üzerindeki bağlı değildir. Transpozonları bir konakçı genom içine kendisini içerir sonra, transposaz transpozonun ilave hareketinin önlenmesi, parçalanır. Ev sahibi bir endojen Tn 5 transpositional eleman sahip, ancak ilave hareketi önlenememektedir. İkinci olarak, elektroporasyon ile transposome katılması mümkün ana çok çeşitli kullanılmasını mümkün kılmaktadır. Ayrıca, bakteriyel birleşme ya da VI ile transpozonun tanıtmak ihtiyacını ortadan kaldırırral enfeksiyon. Her iki süreç konak duyarlılık gerektirir. Üçüncü olarak, kanamisin direnç geni ve transposome içinde R6K γ replikasyon kaynağının dahil edilmesi daha kolay kesilen genini belirlemek için yapar. Transpozon kesintili bölgeler kaydedilir ve gen tanımlaması için ters polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) tekniğini kullanmak için olan ihtiyacı ortadan kaldırarak, plazmidler gibi dizilenebilmektedir. Bu video sunulan protokol Enterobacter sp transpozon mutagenezi için her bir aşamasını tarif etmektedir. YSU 9 kesintiye farazi geninin tanımlanması için bakteri hücreleri içine getirilmesi, bir transposome kullanılmıştır. Daha önce yayınlanmış protokollere 3,4,10 ek olarak, oksotrofları taranması için çoğaltma kaplama nasıl kullanıldığına ilişkin yöntemler sunulmaktadır. Bu mutagenez tekniği ident için, farklı bakteri türleri, örneğin antibiyotik ve metal dirençleri gibi diğer fenotipleri, araştırmak için kullanılabilmektedirveya bunun genetik veya mikrobik fizyolojisi doğal bir laboratuar bileşeni öğretmek için sentetik biyolojisi çalışmalarında tanımlanmış bir kültür koşulları altında büyüme için gerekli olan genlerin az sayıda seçmek ile.

<table><tbody><tr><td>EZ-Tn5 R6K&amp;gamma;ori/KAN-2 Tnp Transposome Kit</td><td>Epicentre (Illumina)</td><td>TSM08KR</td><td></td></tr><tr><td>EC100D pir&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; Electrocompetent E. coli</td><td>Epicentre (Illumina)</td><td>ECP09500</td><td>Capable of replicating plasmids with an R6K&amp;gamma; replication origin at a low copy number</td></tr><tr><td>EC100D pir-116 Electrocompetent E. coli</td><td>Epicentre (Illumina)</td><td>EC6P095H</td><td>Capable of replicating plasmids with an R6K&amp;gamma; replication origin at a high copy number</td></tr><tr><td>5X M-9 Salts</td><td>Thermo Fisher</td><td>DF048517</td><td></td></tr><tr><td>Lennox LB Broth</td><td>Thermo Fisher</td><td>BP1427-2</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Amresco, Inc.</td><td>J637-1KG</td><td>Solid media contained 1.6% (w/v) agar</td></tr><tr><td>Kanamycin Sulfate&amp;nbsp;</td><td>Amresco, Inc.</td><td>0408-25G</td><td>When required, media contained 50 &amp;mu;g/ml kanamycin sulfate</td></tr><tr><td>D-Glucose Monohydrate</td><td>Amresco, Inc.</td><td>0643-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Yeast Extract</td><td>Amresco, Inc.</td><td>J850-500G</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Amresco, Inc.</td><td>J859-500G</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4504-500G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Amresco, Inc.</td><td>X190-1KG</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP213-1</td><td></td></tr><tr><td>Super Optimal Broth with Catabolite Repression (SOC) medium</td><td></td><td></td><td>0.5% (w/v) yeast extract, 2% (w/v) tryptone, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 20 mM MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; and 20 mM Glucose</td></tr><tr><td>BfuC I</td><td>NEB</td><td>R0636S</td><td>Partial digestion of genomic DNA</td></tr><tr><td>Xho I</td><td>NEB</td><td>R0146S</td><td>Plasmid digestion</td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>NEB</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease Free Water</td><td>Amresco, Inc.</td><td>E476-1L</td><td>For dissolving precipitated DNA and restriction endonuclease reactions</td></tr><tr><td>GenomeLab DTCS - Quick Start Kit</td><td>Beckman Coulter</td><td>608120</td><td>DNA sequencing</td></tr><tr><td>Wizard Genomic DNA Purification Kit</td><td>Promega</td><td>A1120A</td><td></td></tr><tr><td>Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System</td><td>Promega</td><td>A1460</td><td>Plasmid purification</td></tr><tr><td>Replica Plating Block</td><td>Thermo Fisher</td><td>09-718-1</td><td></td></tr><tr><td>Velveteen Squares</td><td>Thermo Fisher</td><td>09-718-2</td><td>Replica plating</td></tr><tr><td>PetriStickers</td><td>Diversified Biotech</td><td>PSTK-1100</td><td>Grid for replica plating</td></tr><tr><td>Petri Dishes</td><td>Thermo Fisher</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>Gene Pulser II</td><td>BioRad</td><td></td><td>Electroporation</td></tr><tr><td>Electroporation Cuvettes &amp;ndash; 2 mm</td><td>BioExpress</td><td>E-5010-2</td><td></td></tr><tr><td>CentriVap DNA Vacuum Concentrator</td><td>Labconco</td><td>7970010</td><td>Drying DNA</td></tr><tr><td>CEQ 2000XL DNA Analysis System</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>DNA sequencing</td></tr><tr><td>Vector NTI Advance 11.5.0</td><td>Life Technologies</td><td>12605099</td><td>DNA sequence analysis</td></tr></tbody></table>

generation of enterobacter sp. ysu auxotrophs using transposon mutagenesis

Prototrofik bakteri, bir karbon ve enerji kaynağı olarak kullanılan bir ortam glukoz (M-9 ortamı) ile takviye edilmiş M-9 az tuzlar üzerinde büyür. Oksotroflan bir transposome kullanılarak üretilebilir. Bu protokolde kullanılan ticari olarak temin edilebilir, Tn 5 türevi transposome transposaz bağlanma bölgeleri olarak görev yapabilmeleri bir R6K γ replikasyon orijini, kanamisin direnci ve iki mozaik dizisi ucu için bir geni ihtiva eden bir DNA doğrusal bir segmentten teşekkül eder. Bir DNA / transposaz protein kompleksi olarak sağlanır transposome, prototrofik soyu Enterobachter içine elektroporasyon ile dahil edilir. YSU ve rastgele bu konağın genomuna kendisini içerir. Transformantlar kanamisin, (LB-kan) ihtiva eden agar plakaları, Luria-Bertani üzerine ekildi çoğaltma ve kanamisin (M-9-kan) içeren E-9, orta agar plakaları üzerine bulunmaktadır. M-9-kan plakalarına LB-kan plakalarına büyür ancak Transformantlar oksotroflan olduğu kabul edilir. Saflaştırılmış genomikBir oksotrofdan DNA kısmen sindirilmiş bir pir + Escherichia coli (E. coli) suşu lige ve dönüşür. R6Kγ replikasyon orijini plazmid pir + E. çoğaltmak için izin verir E. coli suşu ve kanamisin direnç marker plazmid seçimi sağlar. Her transformantı kesilen kromozomal bölgeye çevrili transpozonunda içeren yeni bir plazmid sahiptir. Sanger dizileme ve Temel Yerel Hizalama Arama Aracı (BLAST) kesilen genin bir varsayımsal kimliğini öneririz. Bu transposome mutajenez stratejiyi kullanarak üç avantajı vardır. İlk olarak, ana bilgisayar tarafından bir transposaz gen ifadesi üzerindeki dayanmaz. İkinci olarak, transposome elektroporasyon ile yerine konjugasyon veya transdüksiyonu ile hedef konakçı içine dahil edilir ve bu nedenle daha verimli olur. Üçüncü olarak, R6Kγ kopya kökenini kolay mutasyona uğramış g belirlemek için yaparkısmen yeniden birleştirici bir plazmit geri kazanılır en. Bu teknik, Enterobacter sp başka özellikleri ile ilgili genleri araştırmak için kullanılabilir. YSU veya bakteriyel suşlar için daha çeşitli.

Enterobacter sp dönüşümü. Transposome ile elektroporasyon yöntemiyle YSU bunlar, konakçı genomu (Şekil 1A, B) rastgele genom ekleme başlatmıştır. Başarılı bir elektroporasyon LB-kan plakaları üzerinde büyüdü birkaç bin Transformantları vermiştir. 300-400 elde edilmesi için, plaka başına koloni iyi aralıklı, her bir LB-kan agar plakası üzerinde bir dönüşüm karışımı, toplam yayılan optimize edilmiştir. Her Transformant en az bir transposon eki içerdiği, ...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Enterobacter sp. YSU Auxotrophs Using Transposon Mutagenesis at JoVE.com

Generation of Enterobacter sp. YSU Auxotrophs Using Transposon Mutagenesis

Enterobacter sp. YSU glukoz az tuz ortamında büyür. Oksotroflan rastgele bir konakçı genom içine kendisini ekleyen bir transposome ile dönüştürülmesiyle oluşturulur. Mutantlar minimal orta karmaşık ortamdan replika plaka tarafından bulundu. Kesilen gen, kurtarma ve dizileme ile tespit edilir.

Üretilmesi<em&gt; Enterobacter</em&gt; Sp. YSU oksotroflan transpozon mutajenezi kullanarak,

Prototrophic bacteria grow on M-9 minimal salts medium supplemented with glucose (M-9 medium), which is used as a carbon and energy source. Auxotrophs can ...

generation-enterobacter-sp-ysu-auxotrophs-using-transposon

Research

JoVE Journal

Biology

Generation of Enterobacter sp. YSU Auxotrophs Using Transposon Mutagenesis

13.8K Görüntüleme.  Youngstown State University.  Enterobacter sp. YSU glukoz az tuz ortamında büyür. Oksotroflan rastgele bir konakçı genom içine kendisini ekleyen bir transposome ile dönüştürülmesiyle oluşturulur. Mutantlar minimal orta karmaşık ortamdan replika plaka tarafından bulundu. Kesilen gen, kurtarma ve dizileme ile tespit edilir. 

Video: Generation of Enterobacter sp. YSU Auxotrophs Using Transposon Mutagenesis

Genetic Engineering of an Unconventional Yeast for Renewable Biofuel and Biochemical Production

Yarrowia lipolytica is a non-pathogenic, dimorphic and strictly aerobic yeast species. Owing to its distinctive physiological features and metabolic characteristics, this unconventional yeast is not only a good model for the study of the fundamental nature of fungal differentiation but is also a promising microbial platform for biochemical production and various biotechnological applications, which require extensive genetic manipulations. However, genetic manipulations of Y. lipolytica have been limited due to the lack of an efficient and stable genetic transformation system as well as very high rates of non-homologous recombination that can be mainly attributed to the KU70 gene. Here, we report an easy and rapid protocol for the efficient genetic transformation and for gene deletion in Y. lipolytica Po1g. First, a protocol for the efficient transformation of exogenous DNA into Y. lipolytica Po1g was established. Second, to achieve the enhanced double-crossover homologous recombination rate for further deletion of target genes, the KU70 gene was deleted by transforming a disruption cassette carrying 1 kb homology arms. Third, to demonstrate the enhanced gene deletion efficiency after deletion of the KU70 gene, we individually deleted 11 target genes encoding alcohol dehydrogenase and alcohol oxidase using the same procedures on the KU70 knockout platform strain. It was observed that the rate of precise homologous recombination increased substantially from less than 0.5% for deletion of the KU70 gene in Po1g to 33%-71% for the single gene deletion of the 11 target genes in Po1g KU70&#916;. A replicative plasmid carrying the hygromycin B resistance marker and the Cre/LoxP system was constructed, and the selection marker gene in the yeast knockout strains was eventually removed by expression of Cre recombinase to facilitate multiple rounds of targeted genetic manipulations. The resulting single-gene deletion mutants have potential applications in biofuel and biochemical production.

We herein report methods on the molecular genetic manipulation of the Yarrowia lipolytica Po1g strain for improved gene deletion efficiency. The resulting engineered Y. lipolytica strains have potential applications in biofuel and biochemical production.

Yenilenebilir Biyoyakıt ve Biyokimyasal Üretim için bir Sıradışı Maya Genetik Mühendisliği

Yarrowia lipolytica is a non-pathogenic, dimorphic and strictly aerobic yeast species. Owing to its distinctive physiological features and metabolic ...

Genetik

Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In bacteria, the impact of the genetic context on the function of a genetic element can be difficult to assess. Several mechanisms, including topological effects, transcriptional interference from neighboring genes, and/or replication-associated gene dosage, may affect the function of a given genetic element. Here, we describe a method that permits the random integration of a DNA element into the chromosome of Escherichia coli and select the most favorable locations using a simple growth competition experiment. The method takes advantage of a well-described transposon-based system of random insertion, coupled with a selection of the fittest clone(s) by growth advantage, a procedure that is easily adjustable to experimental needs. The nature of the fittest clone(s) can be determined by whole-genome sequencing on a complex multi-clonal population or by easy gene walking for the rapid identification of selected clones. Here, the non-coding DNA region DARS2, which controls the initiation of chromosome replication in E. coli, was used as an example. The function of DARS2 is known to be affected by replication-associated gene dosage; the closer DARS2 gets to the origin of DNA replication, the more active it becomes. DARS2 was randomly inserted into the chromosome of a DARS2-deleted strain. The resultant clones containing individual insertions were pooled and competed against one another for hundreds of generations. Finally, the fittest clones were characterized and found to contain DARS2 inserted in close proximity to the original DARS2 location.

Determination of the Optimal Chromosomal Locations for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Here, the power of a transposon-mediated random insertion of a non-coding DNA element was used to resolve its optimal chromosomal position.

En iyi kromozom Location(s) belirlenmesi için yeni bir Transposon-aracılı yaklaşımın kullanarak Escherichia coli DNA öğesinde

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In ...

Gene-targeted Random Mutagenesis to Select Heterochromatin-destabilizing Proteasome Mutants in Fission Yeast

Random mutagenesis of a target gene is commonly used to identify mutations that yield the desired phenotype. Of the methods that may be used to achieve random mutagenesis, error-prone PCR is a convenient and efficient strategy for generating a diverse pool of mutants (i.e., a mutant library). Error-prone PCR is the method of choice when a researcher seeks to mutate a pre-defined region, such as the coding region of a gene while leaving other genomic regions unaffected. After the mutant library is amplified by error-prone PCR, it must be cloned into a suitable plasmid. The size of the library generated by error-prone PCR is constrained by the efficiency of the cloning step. However, in the fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, the cloning step can be replaced by the use of a highly efficient one-step fusion PCR to generate constructs for transformation. Mutants of desired phenotypes may then be selected using appropriate reporters. Here, we describe this strategy in detail, taking as an example, a reporter inserted at centromeric heterochromatin.

This article describes a detailed methodology for random mutagenesis of a target gene in fission yeast. As an example, we target rpt4+, which encodes a subunit of the 19S proteasome, and screen for mutations that destabilize heterochromatin.

Fisyon mayası Heterochromatin kararsız hale Proteasome mutantlar seçmek için rasgele Mutagenesis Gene hedefli

Random mutagenesis of a target gene is commonly used to identify mutations that yield the desired phenotype. Of the methods that may be used to achieve ...

Identification of Host Pathways Targeted by Bacterial Effector Proteins using Yeast Toxicity and Suppressor Screens

Intracellular bacteria secrete virulence factors called effector proteins into the host cytosol that act to subvert host proteins and/or their associated biological pathways to the benefit of the bacterium. Identification of putative bacterial effector proteins has become more manageable due to advances in bacterial genome sequencing and the advent of algorithms that allow in silico identification of genes encoding secretion candidates and/or eukaryotic-like domains. However, identification of these important virulence factors is only an initial step. Naturally, the goal is to determine the molecular function of effector proteins and elucidate how they interact with the host. In recent years, techniques like the yeast two-hybrid screen and large-scale immunoprecipitations coupled with mass spectrometry have aided in the identification of protein-protein interactions. Although identification of a host binding partner is the crucial first step toward elucidating the molecular function of a bacterial effector protein, sometimes the host protein is found to have multiple biological functions (e.g., actin, clathrin, tubulin), or the bacterial protein may not physically bind host proteins, depriving the researcher of crucial information about the precise host pathway being manipulated. A modified yeast toxicity screen coupled with a suppressor screen has been adapted to identify host pathways impacted by bacterial effector proteins. The toxicity screen relies on a toxic effect in yeast caused by the effector protein interfering with the host biological pathways, which often manifests as a growth defect. Expression of a yeast genomic library is used to identify host factors that suppress the toxicity of the bacterial effector protein and thus identify proteins in the pathway that the effector protein targets. This protocol contains detailed instructions for both the toxicity and suppressor screens. These techniques can be performed in any lab capable of molecular cloning and cultivation of yeast and Escherichia coli.

Bacterial pathogens secrete proteins into the host that target crucial biological processes. Identifying the host pathways targeted by bacterial effector proteins is key to addressing molecular pathogenesis. Here, a method using a modified yeast suppressor and toxicity screen to elucidate host pathways targeted by toxic bacterial effector proteins is described.

Maya Toksisitesi ve Bastırıcı Ekranlar Kullanılarak Bakteriyel Efektör Proteinlertarafından Hedeflenen Konak Yollarının Belirlenmesi

Intracellular bacteria secrete virulence factors called effector proteins into the host cytosol that act to subvert host proteins and/or their associated ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence factors, which can subvert and manipulate key host functions. The study of host/pathogen interactions is therefore extremely important to understand bacterial infections and develop alternative strategies to counter infectious diseases. This approach however, requires the development of new high-throughput assays for the unbiased, automated identification and characterization of bacterial virulence determinants. Here, we describe a method for the generation of a GFP-tagged mutant library by transposon mutagenesis and the development of high-content screening approaches for the simultaneous identification of multiple transposon-associated phenotypes. Our working model is the intracellular bacterial pathogen Coxiellaburnetii, the etiological agent of the zoonosis Q fever, which is associated with severe outbreaks with a consequent health and economic burden. The obligate intracellular nature of this pathogen has, until recently, severely hampered the identification of bacterial factors involved in host pathogen interactions, making of Coxiella the ideal model for the implementation of high-throughput/high-content approaches.

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Coxiella burnetii is an obligate intracellular Gram-negative bacterium responsible for the zoonotic disease Q fever. Here we describe methods for the generation of Coxiella fluorescent transposon mutants as well as the automated identification and analysis of the resulting internalization, replication and cytotoxic phenotypes.

Üretim ve Çok fenotipik Yüksek içerik Eleme<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Transposon Mutantlar

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Transposon mutagenesis is a method that allows gene disruption via the random genomic insertion of a piece of DNA called a transposon. The protocol below outlines a method for high efficiency transfer between bacterial strains of a plasmid harboring a transposon containing a kanamycin resistance marker. The plasmid-borne transposase is encoded by a variant tnp gene that inserts the transposon into the genome of the recipient strain with very low insertional bias. This method thus allows the creation of large mutant libraries in which transposons have been inserted into unique genomic positions in a recipient strain of either Escherichia coli or Shigella flexneri bacteria. By using bacterial conjugation, as opposed to other methods such as electroporation or chemical transformation, large libraries with hundreds of thousands of unique clones can be created. This yields high-density insertion libraries, with insertions occurring as frequently as every 4-6 base pairs in non-essential genes. This method is superior to other methods as it allows for an inexpensive, easy to use, and high efficiency method for the creation of a dense transposon insertion library. The transposon library can be used in downstream applications such as transposon sequencing (Tn-Seq), to infer genetic interaction networks, or more simply, in mutational (forward genetic) screens.

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Presented here is a simple method for creating a high-density transposon insertion library in Escherichia coli or Shigella flexneri using bacterial conjugation. This protocol allows the creation of a collection of hundreds of thousands of unique mutants in bacteria by the random genomic insertion of a transposon.

Bir yoğun Transposon ekleme kütüphane kullanarak bakteriyel konjugasyon Escherichia Coli Enterobacterial suşları gibi veya Shigella flexneri oluşturulması

Transposon mutagenesis is a method that allows gene disruption via the random genomic insertion of a piece of DNA called a transposon. The protocol below ...

High-throughput Parallel Sequencing to Measure Fitness of Leptospira interrogans Transposon Insertion Mutants During Golden Syrian Hamster Infection

In this manuscript, we describe a transposon sequencing (Tn-Seq) technique to identify and quantify Leptospira interrogans mutants altered in fitness during infection of Golden Syrian hamsters. Tn-Seq combines random transposon mutagenesis with the power of high-throughput sequencing technology. Animals are challenged with a pool of transposon mutants (input pool), followed by harvesting of blood and tissues a few days later to identify and quantify the number of mutants in each organ (output pools). The output pools are compared to the input pool to evaluate the in vivo fitness of each mutant. This approach enables screening of a large pool of mutants in a limited number of animals. With minor modifications, this protocol can be performed with any animal model of leptospirosis, reservoir host models such as rats and acute infection models such as hamsters, as well as in vitro studies. Tn-Seq provides a powerful tool to screen for mutants with in vivo and in vitro fitness defects.

High-throughput Parallel Sequencing to Measure Fitness of Leptospira interrogans Transposon Insertion Mutants During Golden Syrian Hamster Infection

We describe here a technique that combines transposon mutagenesis with high-throughput sequencing to identify and quantify transposon leptospiral mutants in tissues after a challenge of hamsters. This protocol can be used to screen mutants for survival and dissemination in animals and can also be applied to in vitro studies.

Yüksek üretilen iş paralel sıralama ölçü Fitness Leptospira interrogans Transposon ekleme mutantlar sırasında altın Suriye Hamster enfeksiyon için

In this manuscript, we describe a transposon sequencing (Tn-Seq) technique to identify and quantify Leptospira interrogans mutants altered in fitness ...

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Pseudomonas aeruginosa is a phenotypically and genotypically diverse and adaptable Gram-negative bacterium ubiquitous in human environments. P. aeruginosa is able to form biofilms, develop antibiotic resistance, produce virulence factors, and rapidly evolve in the course of a chronic infection. Thus P. aeruginosa can cause both acute and chronic, difficult to treat infections, resulting in significant morbidity in certain patient populations. P. aeruginosa strain PA14 is a human clinical isolate with a conserved genome structure that infects a variety of mammalian and nonvertebrate hosts making PA14 an attractive strain for studying this pathogen. In 2006, a nonredundant transposon insertion mutant library containing 5,459 mutants corresponding to 4,596 predicted PA14 genes was generated. Since then, distribution of the PA14 library has allowed the research community to better understand the function of individual genes and complex pathways of P. aeruginosa. Maintenance of library integrity through the replication process requires proper handling and precise techniques. To that end, this manuscript presents protocols that describe in detail the steps involved in library replication, library quality control and proper storage of individual mutants.

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Pseudomonas aeruginosa infection causes significant morbidity in vulnerable hosts. The nonredundant transposon insertion mutant library of P. aeruginosa strain PA14, designated as PA14NR Set, facilitates analysis of gene functionality in numerous processes. Presented here is a protocol to generate high-quality copies of the PA14NR Set mutant library.

Sipariş edilmiş, Pseudomonas aeruginosa baskı PA14 Transposon ekleme mutantlar Nonredundant Kütüphane çoğaltılması

Pseudomonas aeruginosa is a phenotypically and genotypically diverse and adaptable Gram-negative bacterium ubiquitous in human environments. P. aeruginosa ...

Rapid Assembly of Multi-Gene Constructs using Modular Golden Gate Cloning

The Golden Gate cloning method enables the rapid assembly of multiple genes in any user-defined arrangement. It utilizes type IIS restriction enzymes that cut outside of their recognition sites and create a short overhang. This modular cloning (MoClo) system uses a hierarchical workflow in which different DNA parts, such as promoters, coding sequences (CDS), and terminators, are first cloned into an entry vector. Multiple entry vectors then assemble into transcription units. Several transcription units then connect into a multi-gene plasmid. The Golden Gate cloning strategy is of tremendous advantage because it allows scar-less, directional, and modular assembly in a one-pot reaction. The hierarchical workflow typically enables the facile cloning of a large variety of multi-gene constructs with no need for sequencing beyond entry vectors. The use of fluorescent protein dropouts enables easy visual screening. This work provides a detailed, step-by-step protocol for assembling multi-gene plasmids using the yeast modular cloning (MoClo) kit. We show optimal and suboptimal results of multi-gene plasmid assembly and provide a guide for screening for colonies. This cloning strategy is highly applicable for yeast metabolic engineering and other situations in which multi-gene plasmid cloning is required.

The goal of this protocol is to provide a detailed, step-by-step guide for assembling multi-gene constructs using the modular cloning system based on Golden Gate cloning. It also gives recommendations on critical steps to ensure optimal assembly based on our experiences.

Modüler Altın Kapı Klonlama Kullanılarak Çok Genli Yapıların Hızlı Montajı

The Golden Gate cloning method enables the rapid assembly of multiple genes in any user-defined arrangement. It utilizes type IIS restriction enzymes that ...

Biyomühendislik

The Green Monster Process for the Generation of Yeast Strains Carrying Multiple Gene Deletions

Phenotypes for a gene deletion are often revealed only when the mutation is tested in a particular genetic background or environmental condition1,2. There are examples where many genes need to be deleted to unmask hidden gene functions3,4. Despite the potential for important discoveries, genetic interactions involving three or more genes are largely unexplored. Exhaustive searches of multi-mutant interactions would be impractical due to the sheer number of possible combinations of deletions. However, studies of selected sets of genes, such as sets of paralogs with a greater a priori chance of sharing a common function, would be informative.
In the yeast Saccharomyces cerevisiae, gene knockout is accomplished by replacing a gene with a selectable marker via homologous recombination. Because the number of markers is limited, methods have been developed for removing and reusing the same marker5,6,7,8,9,10. However, sequentially engineering multiple mutations using these methods is time-consuming because the time required scales linearly with the number of deletions to be generated.
Here we describe the Green Monster method for routinely engineering multiple deletions in yeast11. In this method, a green fluorescent protein (GFP) reporter integrated into deletions is used to quantitatively label strains according to the number of deletions contained in each strain (Figure 1). Repeated rounds of assortment of GFP-marked deletions via yeast mating and meiosis coupled with flow-cytometric enrichment of strains carrying more of these deletions lead to the accumulation of deletions in strains (Figure 2). Performing multiple processes in parallel, with each process incorporating one or more deletions per round, reduces the time required for strain construction.
The first step is to prepare haploid single-mutants termed 'ProMonsters,' each of which carries a GFP reporter in a deleted locus and one of the 'toolkit' loci&#x2014;either Green Monster GMToolkit-a or GMToolkit-&alpha; at the can1&Delta; locus (Figure 3). Using strains from the yeast deletion collection12, GFP-marked deletions can be conveniently generated by replacing the common KanMX4 cassette existing in these strains with a universal GFP-URA3 fragment. Each GMToolkit contains: either the a- or &alpha;-mating-type-specific haploid selection marker1 and exactly one of the two markers that, when both GMToolkits are present, collectively allow for selection of diploids.
The second step is to carry out the sexual cycling through which deletion loci can be combined within a single cell by the random assortment and/or meiotic recombination that accompanies each cycle of mating and sporulation.

The Green Monster method enables the rapid assembly of multiple deletions marked with a reporter gene encoding green fluorescent protein. This method is based on driving yeast strains through repeated cycles of sexual assortment of deletions and fluorescence-based enrichment of cells carrying more deletions.

Çoklu Gen Delesyonlar Taşıma Maya Suşlarında Nesil için Yeşil Canavar Süreci

Phenotypes  for a gene deletion are often revealed only when the mutation is tested in a  particular genetic background or environmental condition1,2. ...

Üretilmesi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler