Name: sequence-specific and selective recognition of double-stranded rnas over single-stranded rnas by chemically modified peptide nucleic acids
Uploaded: 2017-09-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids at JoVE.com

Bu eser Singapur Bakanlığı Eğitim (MOE) Tier 1 (RGT3/13 ve RG42/15-G.C.) ve MOE Tier 2 (MOE2013-T2-2-024 ve MOE2015-T2-1-028'e G.C.) tarafından desteklenmiştir.

Rapor burada çalışmaları temel bir patent başvurusu (PAT/179/14/15/PCT) şikayetçi oldu.

RNA çift yönlü bağlama PNA reaksiyonlar (örneğin, 10-mers) orta ölçekli moleküllerdir ve böylece elektroforetik hareketlilik shift bağlama üzerine ile karşılaştırılabilir veya biraz daha büyük bir boyut için RNA'ların gösterebilir (örneğin, 50-mer veya daha küçük). Bir RNA PNA önemli ölçüde daha büyük ise, PNA titrasyon RNA içine bir sınırlı jel hareketlilik kayma nedeniyle çalışmayabilir. Böylece, büyük RNA sigara denaturing sayfa deneyleri için kesilebilir. Fluorophore etiketli PNA içine büyük bir RNA'ın titrasyon Tripleks oluşumu bir sigara denaturing özel jel tarafından ortasında jel40yüklü örnek ile izlenmesi için izin verir.
Tarafından sigara denaturing sayfası RNA'ın sürekli bir toplam konsantrasyon ile titrasyon deneme için genellikle 1 µM etiketlenmemiş bir RNA konsantrasyonu verimli sonrası ücretsiz RNA ve Tripleks bantları etidyum bromür tarafından boyama için kullanıyoruz. 0.2 µM düşük bir RNA konsantrasyonu da RNA yapı31bağlı yeterli olabilir. Etiketlenmemiş RNA konsantrasyonu (0.2 µM) belirler doğru ölçülebilir Kd değerler hakkında 0.2 µM veya daha büyük olması gerekir. Diğer boyama boya boyama verimliliği artırmak için kullanılabilir. Alternatif olarak, bizim yayınlanmamış veri boya-RNA'ların etiketli Cy3 sigara denaturing sayfa deneylerde sıkı bağlama olayları ölçmek için kullanılabilir öneririz.
2-aminopurine sadece orta floresan nedeniyle gerçeğini, 2-aminopurine floresan titrasyon da bağlama için Kapat veya 0.2 µM31üstüne Kd değerleri ile ölçülmesi için sınırlıdır. RNA veya PNA bağlama floresan sinyallerini53,54, değişimler sonuçlanırsa solution'ı Floresans titrasyon, bir nispeten sıkı bağlama miktarının için nispeten parlak boya ile etiketli 55.
RNA yapıları dsRNA bağlama PNAs tarafından hedefleme stratejisi RNA'ların sınırlı sayıda için test edilmiştir. Bu farklı ard arda geliş ve baz çifti besteleri ile dsRNAs için bağlama özellikleri değişebilir olasıdır. TFPNAs tasarımı için bir çift yönlü pürin zengini iplikçik birini her zaman. Nasıl üst üste Q· anlamak için önemlidir C-G üç katına bir Tripleks kararlılığını etkileyebilir. Daha geniş sıra bağımlı çalışmalar açıkça TFPNAs sıra bağımlı bağlama özelliklerini anlamak için ihtiyaç vardır.
TFPNAs bağlama benzeşme daha da artan uzunluğu ve/veya daha da üsler ve omurgalarına56,57 TFPNAs değiştirme tarafından gelişmiş olabilir. Ancak, sürekli bir çift yönlü bölge kez 10'dan fazla ardışık baz çifti kesinti olmadan sigara-Watson-Crick yapılar tarafından oluşabilir değil. Bir sigara-Watson-Crick yapıları dsRNA bölgeler için bitişik tanınması için küçük moleküller ile TFPNAs eşlenik. Prensip olarak, bir TFPNA-küçük molekül eşlenik bağlama benzeşme ve özgüllük bir TFPNA ya da küçük molekül yalnız göre gelişmiş bekleniyor. Ancak, konjugasyon58,59,60,61,62,63,64 için bağlayıcı kimyasal ve fiziksel özellikleri optimize edilmiş olması gerekir.
TFPNAs seçmeli olarak dsRNAs için ssRNAs ve dsDNAs bağlayabilirsiniz aslında çok yararlı kimyasal sonda ve RNA yapısal dinamikleri ve etkileşimleri ile düzenlenmesi yoluyla potansiyel terapötik ligandlar olarak TFPNAs geliştirmek mümkün olduğunu göstermektedir proteinler ve metabolitleri. Hücresel TFPNAs alımını hücre Penetran moieties küçük moleküller, peptidler ve nano tanecikleri gibi ile fiil veya lipozomlar5,6 gibi supramolecular yapıları ile complexation üzerinden kolaylaştırılmış olacak ,12,17,25,31,41,65,66. Daha fazla TFPNAs functionalization fluorophores ve radioisotopes gibi bioimaging etiketlerle algılama, görüntüleme ve canlı organizmalar işlevsel RNA yapıların hedefleme kolaylaştırabilir.

RNA'ların önemli biyolojik ve yönetmelikte RNA'lar rolleri keşifler ve kataliz farklı biyolojik süreçlerin1,2,3son gelişmeler nedeniyle tedavi hedefleri olarak ortaya çıkıyor. Geleneksel olarak, antianlamlı lifler ile Watson-Crick çift yönlü oluşumu3,4,5,6,7,8, ssRNAs bağlamak için kullanılmaktadır 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27. son zamanlarda, tripleks oluşturmayan peptit nükleik asitler (TFPNAs) dsRNAs (şekil 1)3,28,29Hoogsteen hidrojen üzerinden bağlamak için tasarlanmıştır. dsRNA bölgeler pre-mRNA'ların ve mRNA'ların, ön veya PRI-miRNAs3ve birçok diğer kodlamayan RNA'ların1,26,27de dahil olmak üzere geleneksel Antisens hedefli RNA'lar çoğunda bulunur. DsRNAs TFPNAs kullanarak üçlü sarmal oluşumu ile hedefleme onun yapısı özgüllüğü nedeniyle avantajlı olabilir ve dysregulated hastalıkları, örneğin olan RNA'ların, normal işlevleri geri yükleme kullanmak için büyük potansiyel olduğunu.
Son Yayınlanan İş Rozners vd.ve bize3,28,29,30,31,32,33, 34,35,36,37,38,39,40,41, bildirilen çabaları artırma değiştirilmiş TFPNAs dsRNAs gelişmiş benzeşimli doğru seçmeli bağlama. Biz thio-pseudoisocytosine (L) monomer30 ve guanidin-modified 5-metil sitozin (S) monomer31dahil olmak üzere sentez yöntemleri için mantıklı bir şekilde tasarlanmış PNA monomer (Şekil 2) geliştirdik. Çeşitli Biyokimya ve biyofizik karakterizasyon yöntemleri, nispeten kısa PNAs (6-10 artıkları) L ve Q artıkları birleşmeyle Watson-Crick G-C ve C-G baz çifti, geliştirilmiş tanıma sırasıyla, dsRNAs içinde göstermek göstermiştir. Ayrıca, değiştirilmemiş PNAs için karşılaştırıldığında, L ve Q kalıntılar içeren PNAs daha seçici bağlama dsRNA doğru ssRNA ve dsDNA üzerinde göster. Q Base guanidin işlevselliği42 PNAs HeLa hücreleri31girmenizi sağlar.
Bizim laboratuvar PNAs manuel Boc-kimya tarafından sentez (Boc veya t- Boc duruyor tert-butyloxycarbony için (bkz: Şekil 2) katı fazlı peptid sentez yöntemi4. PNA monomer Boc grup korumak emin olarak ile sentezi Boc grup sterically fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) Amin grubu, PNA monomer kaplin sırasında yararlı olabilir korumak ile karşılaştırıldığında daha az hantal olduğu gibi uygun sağlam destek. Boc grup asit değişken ve kolayca sağlam destek 20-%50 trifluoroacetic asit (TFA) diklorometan (DCM) tarafından Filistin Ulusal Yönetimi sentezi sırasında kaldırılabilir. Bir otomatik peptid synthesizer PNA reaksiyonlar sentezlemek için istihdam edilebilir; Ancak, PNA monomer 3 5 kat fazla bir otomatik peptid synthesizer için gereklidir. El ile sentezi önemli ölçüde daha az PNA monomer (2-3-kat fazlası), kolayca Kaiser test43tarafından izlenen her MANŞONLA gerektirir. Ayrıca, birçok otomatik synthesizer Boc kaldırma adımı sırasında Boc strateji sentez aşındırıcı TFA kullanımı nedeniyle ile uyumlu değildir.
Moleküler ağırlık karakterizasyonu MALDI-TOF tarafından takip ters fazlı yüksek performanslı sıvı Kromatografi (RP-HPLC) tarafından Filistin Ulusal Yönetimi reaksiyonlar saflaştırılmış (şekil 3 ve 4)30, 31. biz Tripleks oluşumu izlemek için ücretsiz RNA dubleks oluşturur ve Filistin Ulusal Yönetimi bağlı triplexes kez nedeniyle aslında bu farklı geçiş oranları (şekil 5)30,31 göstermek sayfa denaturing istihdam . Verimli boyama sonrası, RNA çift yönlü ve PNA· için de elde edilebilir hiçbir etiketleme gereklidir RNA2 Tripleks bantları. Örnek nispeten az miktarda sigara denaturing sayfa deneyler için gereklidir. Ancak, yükleme (kuluçka) arabelleği ve çalışan arabellekleri (pH 8.3), 8.3 nispeten yüksek pH önemli ölçüde bir Tripleks istikrarsızlaştırmak çünkü kinetically istikrarlı triplexes için sınırlı olmak ölçümler sonucunda aynı olmayabilir.
2-Aminopurine olan bir izomer adenin (6-aminopurine); 2-aminopurine floresan yoğunluğu (yaklaşık 370 emisyon zirve ile nm) yerel yapısal çevre değişiklikleri duyarlıdır ve Tripleks oluşumu ile 2-aminopurine kalıntı izleme bağlama Makinası (PNA dahil için uygundur Şekil 6) 31. Floresans emisyon görünür aralığında gösteren birçok diğer boyalar farklı olarak, 2-aminopurine-etiketli RNA Oda ışık fotoğraf beyazlatma olmadan maruz kalabilirler. Sayfa deneme içinde çalışan bir tampon pH 8.3 kez gereklidir, aksine 2-aminopurine göre Floresans titrasyon bağlama ölçümü belirtilen bir pH bir çözüm sağlar ve böylece ölçüm ve nispeten zayıf tespiti izin verebilir ve Kinetically kararsız denge bağlama.
UV Absorbans algılanan termal erime deneyler dubleks (Şekil 7)31 ve tri termal istikrarı ölçümü izinPLEX30,32,44,45. Bağlı olarak uzunluğu ve sıra kompozisyon, triplexes erime veya açık bir geçiş gösterilmeyebilir. Isıtma ve soğutma eğrileri üst üste gelirse termodinamik parametreler temin edilebilir. Doğru termodinamik parametreler izotermal titrasyon Kalorimetre (ITC)32tarafından elde edilebilir; Ancak, nispeten büyük miktarda örnekleri ITC için genellikle gereklidir.

<table><tbody><tr><td>Molecular sieves, 4A, 1-2 mm diameter pellets&amp;nbsp;</td><td>Alfa Aesar</td><td>87956</td><td></td></tr><tr><td>4-Methylbenzhydrylamine hydrochloride (MBHA&lt;span class=&quot;font6&quot;&gt;&amp;Yuml;&lt;/span&gt;&lt;span class=&quot;font0&quot;&gt;HCl)&lt;/span&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>532444</td><td></td></tr><tr><td>N,N-diisopropylethylamine (DIPEA)</td><td>Alfa Aesar</td><td>A11801</td><td></td></tr><tr><td>(Benzotriazol-1-yl-oxy)tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate (PyBOP)</td><td>Alfa Aesar</td><td>B25251</td><td></td></tr><tr><td>Acetic anhyride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320102</td><td></td></tr><tr><td>Kaiser Test Kit&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60017</td><td></td></tr><tr><td>Trifluoroacetic acid (TFA)</td><td>Alfa Aesar</td><td>L06374</td><td></td></tr><tr><td>Unmodified PNA monomers</td><td>ASM Research Chemicals GmbH</td><td>5004007, 5004008, 5004009, 5004010</td><td></td></tr><tr><td>Boc-Lys(Z)-OH / Fmoc-Lys(Boc)-OH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B8389 / 47624</td><td></td></tr><tr><td>Thioanisole</td><td>Alfa Aesar</td><td>A14846</td><td></td></tr><tr><td>1,2-Ethanedithiol</td><td>Alfa Aesar</td><td>L12865</td><td></td></tr><tr><td>Trifluoromethanesulfonic acid</td><td>Alfa Aesar</td><td>A10173</td><td></td></tr><tr><td>LiChrosper&amp;reg; 100 RP-18 endcapped (5 &amp;micro;m) LiChroCART&amp;reg; 250-4</td><td>Merck Millipore</td><td>150838</td><td></td></tr><tr><td>RNA Oligos&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Customized&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>39468</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td><td>Alfa Aesar</td><td>J15694</td><td></td></tr><tr><td>HEPES&amp;nbsp;</td><td>Lonza</td><td>17-737E</td><td></td></tr><tr><td>Acrylamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8887</td><td></td></tr><tr><td>N.N&#039;-methylenebisacrylamide</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>146072</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium persulfate (APS)</td><td>Bio-rad</td><td>161-0700</td><td></td></tr><tr><td>Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td><td>Bio-rad</td><td>161-0800</td><td></td></tr><tr><td>10X Tris-Borate-EDTA (TBE) Buffer, pH 8.3</td><td>1st Base</td><td>BUF-3010-10X1L</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol&amp;nbsp;</td><td>Promega&amp;nbsp;</td><td>H5433</td><td></td></tr><tr><td>Ethidium bromide (10 mg/mL)</td><td>Bio-rad&amp;nbsp;</td><td>161-0433</td><td></td></tr><tr><td>High Precision Cell (Quartz Suprasil, 200-2500 nm)</td><td>Hellma Analytics&amp;nbsp;</td><td>105.250-QS</td><td></td></tr></tbody></table>

sequence-specific and selective recognition of double-stranded rnas over single-stranded rnas by chemically modified peptide nucleic acids

RNA'ların önemli biyolojik ve tedavi hedefleri ortaya çıkıyor. Böylece, büyük bir potansiyel kimyasal sonda ve RNA sıralama ve yapı tanınması için tedavi ligandlar geliştirmede olmasıdır. Peptit nükleik asit (reaksiyonlar son zamanlarda geliştirilen RNA dubleks bir fingerprinting şekilde anlayacağı şekilde PNA) kimyasal olarak değiştirilmiş. PNAs kimyasal olarak tarafsız bir peptid gibi omurga ile stabildir. PNAs nispeten kolayca el ile Boc-kimya katı fazlı peptid sentez yöntemi tarafından sentez. PNAs ters fazlı HPLC, matris yardımlı lazer desorpsiyon/iyonlaşma-tarafından uçuş süresi (MALDI-TOF) molekül ağırlığı karakterizasyonu tarafından takip tarafından saf. Sigara denaturing polyacrylamide Jel Elektroforez (sayfa) tekniği Tripleks oluşumu görüntüleme Haritayı farklı geçiş oranları çünkü dikkatle tasarlanmış ücretsiz RNA çift yönlü oluşturur ve Filistin Ulusal Yönetimi triplexes kez bağlı kolaylaştırır. Etidyum bromür yazı boyama ile sigara denaturing sayfa kez bağlama benzeşim ve Filistin Ulusal Yönetimi reaksiyonlar özelliklerine karakterize bir kolay ve bilgilendirici tekniktir. Genellikle, birden çok RNA saç tokaları veya dubleks tek baz çifti mutasyonlar ile PNA bağlama özellikleri, benzeşim ve özelliklerine bağlama gibi karakterize etmek için kullanılabilir. 2-Aminopurine olan bir izomer adenin (6-aminopurine); 2-aminopurine floresan yoğunluğu yerel yapısal çevre değişiklikleri duyarlıdır ve Tripleks oluşumu ile yakın PNA bağlama bölgesi dahil 2-aminopurine kalıntı izleme için uygundur. 2-Aminopurine floresan titrasyon hedeflenen çift iplikçikli RNA'ların (dsRNAs) doğru değiştirilmiş PNAs bağlama selectivity üzerinde tek iplikçikli RNA'ların (ssRNAs) onaylamak için de kullanılabilir. PNA-RNA Dubleks ve PNA· termal istikrarı ölçümü UV Absorbans algılanan termal erime deneyler izin RNA2 triplexes. Burada, biz bir sentez tanımlamak ve birleşmeyle PNA reaksiyonlar arıtma artıkları değiştiren ve RNA dubleks değiştirilmiş PNAs tarafından tanınması karakterizasyonu için Biyokimya ve biyofizik yöntemleri açıklanmaktadır.

Ters fazlı HPLC PNA reaksiyonlar arıtma sağlar. Biz saf PNA reaksiyonlar HPLC arıtma (şekil 3) iki tur ile elde edebilirsiniz. PNAs kimliğini MALDI-TOF analiz (şekil 4) tarafından onaylanabilir.
Sigara denaturing sayfa bağlama benzeşim ve Filistin Ulusal Yönetimi reaksiyonlar özelliklerine karakterize için kolay ve bilgilendirici bir tekniktir. Biz genellikle birden fazla RNA saç tokaları veya dubleks tek baz çifti mutasyonlar ile bağlama özellikleri (şekil 5) tanımlamak için kullanın. Şekil 5 ' te gösterilen sigara denaturing sayfa veri açıkça Q - ve L-modified PNA dsRNA bölge C-G çift (şekil 5B, alt paneli) ile tanıyabilir (topşekil 5B, C-G çift olmadan tek değil ama tavsiye ederim paneli). Bu özel ve gelişmiş tanıma T· olduğunu A-U, L· G-C ve Q· C-G PNA· RNA2 temel üçlü (şekil 1A, C, D) oluşumu. Tek veya birden fazla mutasyon ile çeşitli PNAs değiştirilmiş bir Filistin Gelişmiş bağlama özelliklerini göstermek için de kullanılabilir. Biz 2 mM Mg2 + kuluçka arabellekte ekleme bağlama etkilemez göstermiştir önemli ölçüde31.
Hedeflenen dsRNA bölgesi (şekil 6A, 6 C, 6 D) ama değil ssRNA (şekil 6B, 6E, 6F) Q ve L modifiye PNA bağlar 2-aminopurine floresan titrasyon tarafından göstermiştir. PNA P3 0,8 ± 0,1 µM Kd değeri 2 aminopurine etiketli dsRNA bağlar. 370 Floresans yoğunlukta nm 2 aminopurine etiketli ssRNA için PNA P3 bağlama ssRNA için eksikliği gösteren çeşitli P3 konsantrasyon ile nispeten sabit kalır.
PNAs Q artıkları (P2 ve P3) gösteri yok termal geçişler (Şekil 7), ssRNA için hiçbir bağlama düşündüren erime içeren. Bu Q-G çift gibi Watson-Crick mevcut steric çatışma kaynaklanmaktadır. Değiştirilmemiş PNA P1 için karşılaştırıldığında, PNAs P4 ve P5 içeren L artıkları ama hiçbir Q artıkları modifiye, gösteri için karşılık gelen RNA-PNA dubleks L-G çift gibi Watson-Crick mevcut steric çatışma nedeniyle erime sıcaklıkları azalmıştır. UV Absorbans algılanan termal erime veri de Q ve L kalıntılar içeren bir PNA ssRNA için kayda değer bağlanmaz göstermek 2-aminopurine floresan titrasyon veri ile tutarlı (şekil 6B, 6E, 6F). Watson-Crick-gibi L-G çift (şekil 1E göre bir Watson-Crick-gibi Q-G çift (şekil 1F) oluşumunda daha önemli bir steric çatışma bir Q Bankası olduğu gibi bir Q Bankası birleştiren bir L Bankası daha fazla destabilizing ).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig1v2.jpg"> 
Resim 1 : Kimyasal yapıları istikrarlı temel üçlü ve kararsız baz çifti yapıların. (A-D) Binbaşı-oluk PNA· RNA2 temel üç katına, T· A-U (A), C+· G-C (B), L· G-C (C) ve Q· C-G (D). (E, F) Kararsız Watson-Crick PNA-RNA baz çifti L-G (E) ve Q-G (F) gibi. R harfi RNA şeker-fosfat omurgası temsil eder. Hidrojen bağları siyah Kesikli çizgilerle gösterilir. Rakam tekrar başvuru31oluşturulur. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig2v2.jpg"> 
Resim 2 : PNA monomerleri kimyasal yapılarının. Dört PNA monomer (T, C, L ve Q) gösterilir. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig3.jpg"> 
Şekil 3 : Kimyasal yapısı PNA oligomer ve RP-HPLC tarafından arıtma. (A)P3 PNA sırasının kimyasal yapısı. (B, C) RP-HPLC veri ham PNA P3, (B) ve yeniden saf PNA P3 (C). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig4.jpg"> 
Şekil 4 : Arıtılmış PNA P3 MALDI-TOF spektrum. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig5.jpg"> 
Şekil 5 : RNA saç tokası ve Filistin Ulusal Yönetimi dizileri ve bağlama karakterizasyonu tarafından sayfası olmayan denaturing. (A) RNA tokalar (rHP1 ve rHP2), PNA P3 ve bir PNA· RNA2 Tripleks PNA P3 ve rHP2 arasında kurdu. (B) sayfa (% 12) sigara denaturing rHP1 ve Filistin Ulusal Yönetimi P3 rHP2 bağlama için sonuçlar. Kuluçka arabellek 200 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 20 mM HEPES, pH 7.5 olur. Yüklenen RNA tokalar (rHP1 ve rHP2) 20 µL 1 µM altındadır. PNA konsantrasyonları Lanes soldan sağa vardır 0, 0,2, 0,4, 1, 1.6, 2, 4, 10, 16, 20, 28, ve 50 µM. PNA P3 değil bağlamak için rHP1 (üst panel) ama rHP2 için bağlar (alt paneli). (C) Kd belirlenmesi P3 bağlama için rHP2 için. Tripleks oluşumu (Y) kısmını PNA konsantrasyon karşı çizildi. Başvuru31adapte bir rakamdır. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig6.jpg"> 
Şekil 6 : Floresan titrasyon çalışma PNA P3 bağlamaRNA'ların 2 aminopurine etiketli için. 2-aminopurine kalıntı RNA dizisi '2' olarak belirlenmiştir. Kuluçka arabellek 200 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 20 mM HEPES, pH 7.5 olur. (A) bir PNA· RNA2 Tripleks P3 ve 2 aminopurine etiketli dsRNA (dsRNA2-2AP) arasında kurdu. (B) A varsayımsal PNA-RNA dubleks P3 ve 2 aminopurine etiketli ssRNA (ssRNA2-2AP) arasında kurdu. (C, E) Floresans emisyon spectra RNA çift yönlü (1 µM) 2 aminopurine etiketli ve ssRNA (1 µM), sırasıyla, P3 konsantrasyon pH 7.5 ile çeşitli. Yaklaşık 475 zirvesinde nm olduğunu L Bankası PNA'zayıf Floresans emisyon nedeniyle. (D, F) K d belirlenmesi dayanarak 2-aminopurine floresan yoğunluğu araziler üzerinde (, 370 nm) RNA Dubleks ve ssRNA, sırasıyla, PNA P3 konsantrasyon karşı. Başvuru31adapte bir rakamdır. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig7.jpg"> 
Şekil 7 : RNA-PNA dubleks için sonuçlar erime termal. Kuluçka arabellek 200 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 20 mM NaH2PO4, pH 7.5 olur. Tüm örneklerini tek iplikçikli RNA (ssRNA1) ve Filistin Ulusal Yönetimi 130 µL.(a)tek iplikçikli RNA (ssRNA1) içinde PNAs (P1, P2, P3, P4 ve P5) ve Filistin Ulusal Yönetimi P3 ve ssRNA1 paralel yönde arasında oluşturulmuş bir varsayımsal PNA-RNA dubleks 5 mikron içerir. Steric çatışma Watson-Crick Q-G ve M-G çift gibi için endikedir. (B) erime Eğriler için farklı PNAs ssRNA1 için bağlama. Erime sıcaklıkları geçişler erime ile Eğriler için gösterilir. Başvuru31adapte bir rakamdır.

Watch this Scientific Journal Video about Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids at JoVE.com

Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids

Çift iplikçikli RNA'ların tek iplikçikli RNA'ların tarafından üzerinde fingerprinting ve seçici tanınması, kimyasal olarak peptit nükleik asitler modifiye

Biz iletişim kuralları için bir sentez raporu ve peptit nükleik asit (PNA) reaksiyonlar birleşmeyle arıtma artıkları değiştirilebilir. RNA dubleks değiştirilmiş PNAs tarafından tanınması karakterizasyonu için Biyokimya ve biyofizik yöntemleri açıklanmıştır.

RNAs are emerging as important biomarkers and therapeutic targets. Thus, there is great potential in developing chemical probes and therapeutic ligands ...

sequence-specific-selective-recognition-double-stranded-rnas-over

Research

JoVE Journal

Genetics

9.4K Görüntüleme.  Nanyang Technological University. Biz iletişim kuralları için bir sentez raporu ve peptit nükleik asit (PNA) reaksiyonlar birleşmeyle arıtma artıkları değiştirilebilir. RNA dubleks değiştirilmiş PNAs tarafından tanınması karakterizasyonu için Biyokimya ve biyofizik yöntemleri açıklanmıştır.

Video: Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids

Isolation of Cognate RNA-protein Complexes from Cells Using Oligonucleotide-directed Elution

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. They are composed of position-dependent, cis-acting RNA elements and unique combinations of RNA binding proteins. Defining the composition of a specific RNP is essential to achieving a fundamental understanding of gene regulation. The isolation of a select RNP is akin to finding a needle in a haystack. Here, we demonstrate an approach to isolate RNPs associated at the 5' untranslated region of a select mRNA in asynchronous, transfected cells. This cognate RNP has been demonstrated to be necessary for the translation of select viruses and cellular stress-response genes.
The demonstrated RNA-protein co-precipitation protocol is suitable for the downstream analysis of protein components through proteomic analyses, immunoblots, or suitable biochemical identification assays. This experimental protocol demonstrates that DHX9/RNA helicase A is enriched at the 5' terminus of cognate retroviral RNA and provides preliminary information for the identification of its association with cell stress-associated huR and junD cognate mRNAs.

This manuscript describes an approach to isolate select cognate RNPs formed in eukaryotic cells via a specific oligonucleotide-directed enrichment. We demonstrate the applicability of this approach by isolating a cognate RNP bound to the retroviral 5' untranslated region that is composed of DHX9/RNA helicase A.

Oligonükleotid yönelik elüsyon kullanılarak Hücreler Aynı Kökenli RNA-protein kompleksleri izolasyonu

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. ...

Biyokimya

Novel RNA-Binding Proteins Isolation by the RaPID Methodology

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern biology. Only a few in vitro and in vivo methods enable the identification of RBPs associated with a particular target mRNA. However, their main limitations are the identification of RBPs in a non-cellular environment (in vitro) or the low efficiency isolation of RNA of interest (in vivo). An RNA-binding protein purification and identification (RaPID) methodology was designed to overcome these limitations in yeast and enable efficient isolation of proteins that are associated in vivo. To achieve this, the RNA of interest is tagged with MS2 loops, and co-expressed with a fusion protein of an MS2-binding protein and a streptavidin-binding protein (SBP). Cells are then subjected to crosslinking and lysed, and complexes are isolated through streptavidin beads. The proteins that co-purify with the tagged RNA can then be determined by mass spectrometry. We recently used this protocol to identify novel proteins associated with the ER-associated PMP1 mRNA. Here, we provide a detailed protocol of RaPID, and discuss some of its limitations and advantages.

RNA-protein interactions lie at the heart of many cellular processes. Here, we describe an in vivo method to isolate specific RNA and identify novel proteins that are associated with it. This could shed new light on how RNAs are regulated in the cell.

Rapid Metodoloji tarafından Roman RNA Bağlayıcı Proteinler İzolasyon

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern ...

Genetik

Nucleoside Triphosphates - From Synthesis to Biochemical Characterization

The traditional strategy for the introduction of chemical functionalities is the use of solid-phase synthesis by appending suitably modified phosphoramidite precursors to the nascent chain. However, the conditions used during the synthesis and the restriction to rather short sequences hamper the applicability of this methodology. On the other hand, modified nucleoside triphosphates are activated building blocks that have been employed for the mild introduction of numerous functional groups into nucleic acids, a strategy that paves the way for the use of modified nucleic acids in a wide-ranging palette of practical applications such as functional tagging and generation of ribozymes and DNAzymes. One of the major challenges resides in the intricacy of the methodology leading to the isolation and characterization of these nucleoside analogues.
	
	In this video article, we present a detailed protocol for the synthesis of these modified analogues using phosphorous(III)-based reagents. In addition, the procedure for their biochemical characterization is divulged, with a special emphasis on primer extension reactions and TdT tailing polymerization. This detailed protocol will be of use for the crafting of modified dNTPs and their further use in chemical biology.

The protocol described herein aims to explain and abridge the numerous obstacles in the way of the intricate route leading to modified nucleoside triphosphates. Consequently, this protocol facilitates both the synthesis of these activated building-blocks and their availability for practical applications.

Nükleosid trifosfatlar - sentezinden Biyokimyasal Karakterizasyonu için

The  traditional strategy for the introduction of chemical functionalities is the  use of solid-phase synthesis by appending suitably modified ...

Kimya

A Novel Saturation Mutagenesis Approach: Single Step Characterization of Regulatory Protein Binding Sites in RNA Using Phosphorothioates

Gene regulation plays an important role in development. Numerous DNA- and RNA-binding proteins bind their target sequences with high specificity to control gene expression. These regulatory proteins control gene expression either at the level of DNA (transcription) or at the level of RNA (pre-mRNA splicing, polyadenylation, mRNA transport, decay, and translation). Identification of regulatory sequences helps understand not only how a gene is switched on or off, but also which downstream genes are regulated by a particular regulatory protein. Here, we describe a one-step approach that allows saturation mutagenesis of a protein binding site in RNA. It involves doping DNA template with non-wild-type nucleotides within the binding site, synthesis of separate RNAs with each phosphorothioate nucleotide, and isolation of the bound fraction following incubation with protein. Interference from non-wild-type nucleotides results in their preferential exclusion from the protein-bound fraction. This is monitored by gel electrophoresis following selective chemical cleavage with iodine of phosphodiester bonds containing phosphorothioates (phosphorothioate mutagenesis or PTM). This single-step saturation mutagenesis approach is applicable to the characterization of any protein binding site in RNA.

Proteins that bind specific RNA sequences play critical roles in gene expression. Detailed characterization of these binding sites is crucial for our understanding of gene regulation. Here, a single-step approach for saturation mutagenesis of protein-binding sites in RNA is described. This approach is relevant for all protein-binding sites in RNA.

Bir roman doygunluk Mutagenesis yaklaşım: Tek adım karakterizasyonu düzenleyici protein RNA Phosphorothioates kullanarak siteleri bağlama

Gene regulation plays an important role in development. Numerous DNA- and RNA-binding proteins bind their target sequences with high specificity to ...

Exploring Sequence Space to Identify Binding Sites for Regulatory RNA-Binding Proteins

Gene regulation plays an important role in all cells. Transcriptional, post-transcriptional (or RNA processing), translational, and post-translational steps are used to regulate specific genes. Sequence-specific nucleic acid-binding proteins target specific sequences to control spatial or temporal gene expression. The binding sites in nucleic acids are typically characterized by mutational analysis. However, numerous proteins of interest have no known binding site for such characterization. Here we describe an approach to identify previously unknown binding sites for RNA-binding proteins. It involves iterative selection and amplification of sequences starting with a randomized sequence pool. Following several rounds of these steps-transcription, binding, and amplification-the enriched sequences are sequenced to identify a preferred binding site(s). Success of this approach is monitored using in vitro binding assays. Subsequently, in vitro and in vivo functional assays can be used to assess the biological relevance of the selected sequences. This approach allows identification and characterization of a previously unknown binding site(s) for any RNA-binding protein for which an assay to separate protein-bound and unbound RNAs exists.

Sequence specificity is critical for gene regulation. Regulatory proteins that recognize specific sequences are important for gene regulation. Defining functional binding sites for such proteins is a challenging biological problem. An iterative approach for identification of a binding site for an RNA-binding protein is described here and is applicable to all RNA-binding proteins.

Düzenleyici RNA Bağlayıcı Proteinler için Bağlayıcı Siteleri Belirlemek için Sıra Alanını Keşfetmek

Gene regulation plays an important role in all cells. Transcriptional, post-transcriptional (or RNA processing), translational, and post-translational ...

Peptide-based Identification of Functional Motifs and their Binding Partners

Specific short peptides derived from motifs found in full-length proteins, in our case HIV-1 Nef, not only retain their biological function, but can also competitively inhibit the function of the full-length protein. A set of 20 Nef scanning peptides, 20 amino acids in length with each overlapping 10 amino acids of its neighbor, were used to identify motifs in Nef responsible for its induction of apoptosis. Peptides containing these apoptotic motifs induced apoptosis at levels comparable to the full-length Nef protein. A second peptide, derived from the Secretion Modification Region (SMR) of Nef, retained the ability to interact with cellular proteins involved in Nef's secretion in exosomes (exNef). This SMRwt peptide was used as the "bait" protein in co-immunoprecipitation experiments to isolate cellular proteins that bind specifically to Nef's SMR motif. Protein transfection and antibody inhibition was used to physically disrupt the interaction between Nef and mortalin, one of the isolated SMR-binding proteins, and the effect was measured with a fluorescent-based exNef secretion assay. The SMRwt peptide's ability to outcompete full-length Nef for cellular proteins that bind the SMR motif, make it the first inhibitor of exNef secretion. Thus, by employing the techniques described here, which utilize the unique properties of specific short peptides derived from motifs found in full-length proteins, one may accelerate the identification of functional motifs in proteins and the development of peptide-based inhibitors of pathogenic functions.

Techniques to dissect the mechanisms underlying the secretion of HIV-1 Nef in exosomes are described. Specific short peptides derived from Nef and protein transfection were exploited to determine the structure, function, and binding partners of Nef&#x2019;s Secretion Modification Region. These procedures have general relevance in many mechanistic studies.

Fonksiyonel Motifler ve Bağlama Ortaklar peptid bazlı Kimlik

Specific short  peptides derived from motifs found in full-length proteins, in our case HIV-1  Nef, not only retain their biological function, but can ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Identification of RNAs Engaged in Direct RNA-RNA Interaction with a Long Non-Coding RNA

The growing role attributed nowadays to long non-coding RNAs (lncRNA) in physiology and pathophysiology makes it crucial to characterize their interactome by identifying their molecular partners, DNA, proteins and/or RNAs. The latter can interact with lncRNA through networks involving proteins, but they can also be engaged in direct RNA/RNA interactions. We, therefore, developed an easy-to-use RNA pull-down procedure that allowed identification of RNAs engaged in direct RNA/RNA interaction with a lncRNA using psoralen, a molecule that cross-links only RNA/RNA interactions. Bioinformatics modeling of the lncRNA secondary structure allowed the selection of several specific antisense DNA oligonucleotide probes with a strong affinity for regions displaying a low probability of internal base pairing. Since the specific probes that were designed targeted accessible regions throughout the length of the lncRNA, the RNA-interaction zones could be delineated in the sequence of the lncRNA. When coupled with a high throughput RNA sequencing, this protocol can be used for the whole direct RNA interactome studies of a lncRNA of interest.

An easy-to-use RNA pull-down protocol is designed for the identification of RNAs engaged in direct RNA/RNA interaction with a long non-coding RNA. The protocol uses psoralen as a fixative to cross-link only RNA/RNA interactions and provides the whole direct RNA interactome of a long non-coding RNA when coupled with RNA sequencing.

The growing role attributed nowadays to long non-coding RNAs (lncRNA) in physiology and pathophysiology makes it crucial to characterize their interactome ...

Identification of RNA Fragments Resulting from Enzymatic Degradation using MALDI-TOF Mass Spectrometry

RNA is a biopolymer present in all domains of life, and its interactions with other molecules and/or reactive species, e.g., DNA, proteins, ions, drugs, and free radicals, are ubiquitous. As a result, RNA undergoes various reactions that include its cleavage, degradation, or modification, leading to biologically relevant species with distinct functions and implications. One example is the oxidation of guanine to 7,8-dihydro-8-oxoguanine (8-oxoG), which may occur in the presence of reactive oxygen species (ROS). Overall, procedures that characterize such products and transformations are largely valuable to the scientific community. To this end, matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight (MALDI-TOF) mass spectrometry is a widely used method. The present protocol describes how to characterize RNA fragments formed after enzymatic treatment. The chosen model uses a reaction between RNA and the exoribonuclease Xrn-1, where enzymatic digestion is halted at oxidized sites. Two 20-nucleotide long RNA sequences [5&#39;-CAU GAA ACA A(8-oxoG)G CUA AAA GU] and [5&#39;-CAU GAA ACA A(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU] were obtained via solid-phase synthesis, quantified by UV-vis spectroscopy, and characterized via MALDI-TOF. The obtained strands were then (1) 5&#39;-phosphorylated and characterized via MALDI-TOF; (2) treated with Xrn-1; (3) filtered and desalted; (4) analyzed via MALDI-TOF. This experimental setup led to the unequivocal identification of the fragments associated with the stalling of Xrn-1: [5&#39;-H2PO4-(8-oxoG)G CUA AAA GU], [5&#39;-H2PO4-(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU], and [5&#39;-H2PO4-(8-oxoG) CUA AAA GU]. The described experiments were carried out with 200 picomols of RNA (20 pmol used for MALDI analyses); however, lower amounts may result in detectable peaks with spectrometers using laser sources with more power than the one used in this work. Importantly, the described methodology can be generalized and potentially extended to product identification for other processes involving RNA and DNA, and may aid in the characterization/elucidation of other biochemical pathways.

MALDI-TOF was used to characterize fragments obtained from the reactivity between oxidized RNA and the exoribonuclease Xrn-1. The present protocol describes a methodology that can be applied to other processes involving RNA and/or DNA.

MALDI-TOF Kütle Spektrometrisi Kullanılarak Enzimatik Bozunmadan Kaynaklanan RNA Fragmanlarının Tanımlanması

RNA is a biopolymer present in all domains of life, and its interactions with other molecules and/or reactive species, e.g., DNA, proteins, ions, drugs, ...

<meta charset="utf8"></head><body>Diskrimatif RNA ve DNA Analizi için Hassas DNA Nanomakineleri

DNAzyme 10-23 - Based Nanomachines for Nucleic Acid Recognition

DNAzyme-based nanomachines (DNM) for the detection of DNA and RNA sequences (analytes) are multifunctional structures made of oligonucleotides. Their functions include tight analyte binding, highly selective analyte recognition, fluorescent signal amplification by multiple catalytic cleavages of a fluorogenic reporter substrate, and fluorogenic substrate attraction for an increase in sensor response. Functional units are attached to a common DNA scaffold for their cooperative action. The RNA-cleaving 10-23 DNMs feature&#160;improved sensitivity in comparison with non-catalytic hybridization probes. The stability of the DNM and the increased chances of substrate recognition are provided&#160;by a double-stranded DNA fragment,&#160;a tile. DNM can differentiate two analytes with a single nucleotide difference in a folded RNA and a double-stranded DNA and detect analytes at concentrations ~1000 times lower than other protein-free hybridization probes. This article presents the concept behind the diagnostic potential of DNA-nanomachine activity and overviews DNM design, assembly, and application&#160;in nucleic acid detection assays.

<meta charset="utf8"></head><body>Yazar Gündemi: DNA Nanosensörlerindeki Gelişmeler - Moleküler Algılamada Hassasiyet ve Seçicilik Zorluklarının Ele Alınması

The DNAzyme-based nanomachines can be used for highly selective and sensitive detection of nucleic acids. This article describes a detailed protocol for the design of DNAzyme-based nanomachines with a 10-23 core using free software and their application in the detection of an Epstein-Barr virus fragment as an example.

DNAzyme 10-23 - Nükleik Asit Tanıma için Tabanlı Nanomakineler

DNAzyme-based nanomachines (DNM) for the detection of DNA and RNA sequences (analytes) are multifunctional structures made of oligonucleotides. Their ...

Çift iplikçikli RNA'ların tek iplikçikli RNA'ların tarafından üzerinde fingerprinting ve seçici tanınması, kimyasal olarak peptit nükleik asitler modifiye

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Oligonükleotid yönelik elüsyon kullanılarak Hücreler Aynı Kökenli RNA-protein kompleksleri izolasyonu

Rapid Metodoloji tarafından Roman RNA Bağlayıcı Proteinler İzolasyon

Nükleosid trifosfatlar - sentezinden Biyokimyasal Karakterizasyonu için

Bir roman doygunluk Mutagenesis yaklaşım: Tek adım karakterizasyonu düzenleyici protein RNA Phosphorothioates kullanarak siteleri bağlama

Düzenleyici RNA Bağlayıcı Proteinler için Bağlayıcı Siteleri Belirlemek için Sıra Alanını Keşfetmek

Fonksiyonel Motifler ve Bağlama Ortaklar peptid bazlı Kimlik

Identification of RNAs Engaged in Direct RNA-RNA Interaction with a Long Non-Coding RNA

MALDI-TOF Kütle Spektrometrisi Kullanılarak Enzimatik Bozunmadan Kaynaklanan RNA Fragmanlarının Tanımlanması

DNAzyme 10-23 - Nükleik Asit Tanıma için Tabanlı Nanomakineler

DNAzyme 10-23 - Nükleik Asit Tanıma için Tabanlı Nanomakineler