Bu çalışma NIH / NIGMS / dikdörtgenler (Grant 58268), Ulusal Sağlık Enstitüsü / NCRR / RCMI (Hibe G12-RR03034), Gürcistan Araştırma İttifak finansman hibe GRA.VAC08.W, NIH / NIAID / NRSA hibe F31AI091484, Emory CFAR hibe P30 tarafından desteklenmiştir A1050409. Bu araştırma NIH / NCRR gelen Araştırma Olanakları Geliştirme Hibe # C06 RR18386 desteği ile inşa bir tesis yapılmıştır. Jurkat hücreleri, 20 grubu, HIV-1 Nef peptidler, hem de tavşan anti-HIV-1 Nef antiserumu NIH AIDS Araştırma ve Referans Reaktif Programı, (Rockville, MD) &#39;den elde edilmiştir.

I. Biyolojik Analiz Kısa peptidler kullanımı I.1. Peptidler kullanarak Haritalama Biyolojik Fonksiyonel Motifler <ol><li> Nef, tarama peptidler olan hücreler Tedavisi <ol><li> Ilgi bölgenin tarama peptidler bir dizi tedarik. Deneyler, 20mer peptid, 10 amino asit çakışması ile, tüm HIV-1 Nef proteini (205 aa) kapsayan, AİDS için Reaktif Programı elde edilmiştir. Aşağıdaki gibi peptidler ayrı ayrı analiz edilir: </li><li> 10 ng / hücre kültürü ortamı ile peptid ml ilave edilir. </li><li> Jurkat hücre kültürleri için plaka başına kültür ortamı 10 ml ilave edilir. </li><li> 37, 24 saat süre ile kültür inkübe ° C. </li></ol></li><li> Apoptoz Terminal deoxynucleotidyltransferase aracılı dUTP biotin Nick Son Etiketleme (TUNEL) testi <ol><li> 1X PBS ile hücre yıkayın ve 1X PBS, pH 7.4 içinde% 4 paraformaldehid ile oda sıcaklığında 30 dakika boyunca düzeltin. </li><li> 10 1X PBS ile yıkanır ve% 0.1 ile geçirgenliği Triton X-100Oda sıcaklığında verilebilmektedir. </li><li> 1X PBS ile hücreler iki kez yıkayın. </li><li> Bilgisayar kontrollü mikroskop sisteminde Epifloresans tarafından boyanan hücreleri saymak. </li></ol></li></ol> I.2. Peptitler kullanılarak rekabetçi bir inhibisyon Analizi <ol><li> Chariot Protein Teslim Reaktif Kiti kullanarak peptidler Eş transfeksiyon <ol><li> Reaksiyon karışımı, transfeksiyon başına 100 ul son hacim olması için, wtNef-gfp plazmit DNA&#39;sı 1 ug ve yabani-tip SMR etki türetilen peptidler ya da SMR motifi içindeki tek tek amino asitler alanin yerine içeren peptidler ya da 100 ng seyreltik 1X PBS. </li><li> Steril su ile 100 ul son hacim olması için Arabası Reaktif bir 1/10 seyreltme 6 ul seyreltilir ve seyreltilmiş DNA peptid karışımı ile bir araya getirmektedir. </li><li> Arabası / DNA-peptid kompleksi oluşumuna izin vermek için 30 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> 5 dakika boyunca 600 x g&#39;de santrifüj ile pelet 3 x 10 5 Jurkat hücreleri. </li><li> 1X PBS ile iki kez hücreleri yıkayın ve Chariot / DNA-peptid kompleksi tekrar süspansiyon. </li><li> Süspansiyonuna serum içermeyen RPMI 1640 ortamında 400 ul ilave edin ve 2 saat boyunca 37 ° C&#39;de kültür plakaları içinde inkübe hücreleri. </li><li> Her plaka için% 10 FBS ihtiva eden taze RPMI 1640 ortamı içinde 1 ml ilave edilir, ve 37, 48 saat boyunca hücrelerin inkübe ° C </li><li> Hasat hücreleri ve floresan mikroskop ile transfeksiyon verimliliği belirler. </li></ol></li><li> Peptid inhibisyonu Nef-GFP floresan levha okuyucu ile salgılanması deneyi <ol><li> Toplanan hücreler, hücre içermeyen koşullandırılmış ortam toplamak, ve 96-çukurlu siyah mikrotitre plakasının her bir kuyu için 100 ul transfer. </li><li> Dalgaboyu 485 nm ve emisyon dalga boyu göreceli floresan birimlerinde 515 nm ile bir Tecan GENEios florimetresi üzerinde medyada ölçü GFP floresan. </li><li> Kontrol olarak, GFP floresans seviyesini (hücrelerden ortam Nef-GFP ile birlikte transfekte edildi ve bir peptid karıştırılmış ayarlama)% 100. </li><li> Hücrelerden ortam Nef-GFP salgılama değişiklikleri belirlemek için çeşitli SMR peptidler ile ko-transfekte edilmiş GFP floresans seviyesi ile karşılaştırın. </li></ol></li></ol> I.3. Yem olarak peptidler kullanarak Motif bağlayıcı ortakların izole <ol><li> SMR peptidler ile birlikte immunoprecipitation <ol><li> 37% 10 FBS ihtiva eden RPMI 1640 ortamı içinde Jurkat hücrelerinin büyümesini, T-75 doku kültür şişesi içinde ° C arasında ve 4, 20 dakika boyunca 1000 x g&#39;de santrifüj ile topak hücrelere ° C Transfeksiyon etkinliğini belirlemek, bir floresan mikroskop altında plaka yerleştirerek, çekim, ve daha sonra toplam ve etiketli hücreleri saymak ve yüzde etiketli hücreleri belirler. </li><li> 1 mi 1X PBS içinde hücre pelletini ve bir 1.5 ml Eppendorf tüpüne aktarılır. 1 dakika için 1000 xg mikrosantrifüj. Nazik pipetleme tarafından 1 ml α-FLAG Lizis tampon pelletini tekrar. Lisis tamponu: 50 mM Tris Karışım • HCl, pH 7.4, 150 mM sodyum CHLoride [NaCl], 1 mM fenilmetilsülfonil florid, memeli hücre ve doku özleri ile kullanım için [PMSF] ve 10 ml / ul proteaz inhibitör kokteyl ile birlikte, 1 mM EDTA,% 1 Triton X-100, [Pic, Sigma]. Kullanmadan hemen önce olun. </li><li> Diferansiyel olarak 5 dakika boyunca 2,000 x g&#39;de mikrosantrifüj süspansiyonlar ve pelet, 10 dakika hücre artıkları ve DNA sırası ile, 13.000 xg&#39;de. Süpernatant (bundan sonra &quot;lizat&quot; olarak anılacaktır) toplayın. </li><li> Lisatı, protein, 1 mg ve SMRwt veya SMRmut peptid Anti-Flag M2 bağlantı jeli (, Sigma bundan sonra &quot;reçine&quot; olarak adlandırılır), 20 ul ya 1 mg ekleyin. Burada kullanılan SMRwt ve SMRmut hem peptidler gömülü bir BAYRAK etiketi dizisi olduğunu unutmayın. Eş-IP tamponu içinde 1 mL (α-FLAG lizis tamponu eksi PMSF ve PIC) bir son hacme kadar karışım getirin. Uç üzerinde uç dönme ile bir gece süreyle 4 ° C de inkübe karışımı. Negatif bir kontrol olarak, ya da peptid yokluğunda reçine ile lizat inkübe edin. </li><li> Pellet 5.000 microcentrifugation tarafından reçine - 30 sn için 8.000 xg. Reçine örnek kullanmadan önce 2 dakika razı ve sonra süpernatant aspire izin verin. Herhangi bir reçine aktarmak için dikkatli olmak, dar uç pipet, ya da Hamilton şırınga ile süpernatantı. Dar uç pipet uçları kısmen kapalı kadar plastik bir pipet açılması çimdik forseps kullanılarak yapılabilir. 500 ul yıkama tamponu (50 mM Tris • HCl, pH 7.4, ve 150 mM NaCl). Ile reçine dört kez yıkayın Yıkama tamponu 50 ul 3X FLAG peptidin 15 mg (Sigma) ile ilişkili hücresel protein akıtılır ve oda sıcaklığında 30 dakika için döner / çalkalayıcı üzerinde inkübe edin. </li><li> Laemmli numune tamponu (Bio-Rad) içinde kaynatılarak ve ardından aseton çökeltme ile, sıvı kısımlar konsantre ediniz. Bir% 4-20 Tris-HCl, Ölçütleri prekast jele (Bio-Rad) üzerinde SDS-PAGE ile protein ayırın. Coomassie Parlak Mavi R-250 (Bio-Rad) ile jel leke. Not: kütle spektrometresi tanımlama deneyleri için ( <strong&gt; Şekil 4A), her bir durum (SMRwt, SMRmut ya da herhangi bir peptid, Co-IP) dört kat olarak gerçekleştirilmiştir ve tüm dört gelen sıvı kısımlar çoğaltır / toplam proteinin girişi, 4 mg arasında bir toplam önce aseton çökeltilmesine havuzlandı edildi durumu). </li></ol></li><li> Nef-GFP protein ile birlikte immunoprecipitation <ol><li> % 0.02 Tween 20 (PBS-T) ile 1X PBS içinde 1 ml anti-GFP monoklonal murin 2 ug ile Dynabeads Protein G manyetik boncuk (Invitrogen) 50 ul karıştırın. 4, 1 saat boyunca, 1.5 ml Eppendorf tüp uç üzerinde uç dönme ile karışım inkübe ° C. </li><li> Manyetik açılan süpernatan bunu takiben izin veren bir 1.5 ml MagnaSphere Teknolojisi Manyetik Ayırma Sehpası (Promega Corp, Madison, WI) tüpe koyarak arabellekten boncuk ayırın. Nazik pipetleme ile PBS-T, 1 ml anti-GFP kaplı boncuklar yıkayın. </li><li> M 15 1X RIPA 1 ml + tampon Nazik pipetleme ve inkübasyon ile Nef-GFP transfekte Jurkat hücreleri lysebuz üzerinde. + RIPA tamponu: 10X RIPA Liziz Tamponu, pH 7.4, [Millipore, Bedford, MA], steril su içinde 1:10 seyreltilmiş,% 0.02 sodyum azit [Sigma], ve% 0.1 sodyum dodesil sülfat [SDS], 1 mM PMSF, 10 ul / ml PIC kullanmadan önce hemen ekledi. </li><li> Pelet 10 dakika boyunca 2,000 x g&#39;de microcentrifugation tarafından hücre artıkları. Süpernatant (bundan sonra &quot;lizat&quot; olarak anılacaktır) toplayın. </li><li> Anti-GFP kaplı boncuklar ile lisatı, protein, 1 mg ekleme, 1X RIPA tamponu + 1 ml nihai hacme getirmek, ve 4 ° C sıcaklıkta 1 saat süreyle uçtan üzerinde uç dönme ile karışım inkübe Not: peptid rekabet çalışmaları için, lisatı, protein, 1 mg önce anti-GFP kaplı boncuklar eklenmeden 1X RIPA tamponu +, 1 ml SMRwt veya SMRmut peptid 2 ug ile önceden inkübe edilebilir. </li><li> Yıkama tamponu 1 ml yeniden süspansiyon ile boncuk yıkayın (50 mM Tris • HCI, pH 7.4, 150 mM NaCI ve% 0.1 Tween 20). 4 5 dakika ° C için uçtan aşırı uç rotasyon ile inkübe Boncuk f ayırınrom Manyetik Ayırma Standı kullanarak yıkama. Sırasıyla, 250 mM ve 300 mM NaCI içeren, yıkama tamponları ile boncuklar, ikinci ve üçüncü kez yıkayın. </li><li> PBS içinde 200 ul boncuk tekrar, temiz bir tüpe karışımı aktarın ve manyetik bir stand üzerine yıkama boncuk ayırın. 95 ° C de Laemmli numune tamponu 5 dakika 50 ul boncuk kaynatın, karışım oda sıcaklığında 10 dakika boyunca soğumaya bırakın ve daha sonra ayırma için manyetik bir stand üzerine karışım, koyun ve süpernatantlar (&quot;sıvı kısımlar&quot;) toplamak . </li><li> Bir% 8-16 Tris-HCl, Ölçütleri prekast jel üzerinde SDS-PAGE ile eluat proteinleri ayırın. </li></ol></li><li> Kütle spektrometrisi <ol><li> Tüketim Coomassie-lekeli jeller gelen ilgi protein bantları. </li><li> 37 ° de 45 dakika boyunca 10 mM 1,4-ditiyotretol (DTT) &#39;de örnek azaltmak ° C </li><li> 25 ° C&#39;de 45 dakika boyunca 55 mM iyodoasetamid, numuneyi alkile </li><li> Sınıf deneyin sıralama ile gecede örnekleri Digest37 psin (Promega) ° C &#39; </li><li> C-18 ZipTip (Millipore) ile örnek peptidler Desalt. Alfa-ÇHC Matrix (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) ile örnek peptidler karıştırın ve bir MTP hedef çerçeve III (Bruker Daltonics Inc, Billerica, MA) üzerine onları nokta. </li><li> Bir Bruker Daltonics ULTRAFLEX III TOF / TOF kullanarak (MALDI-TOF/TOF) Kütle Spektrometre analizi-uçuş tandem matris destekli lazer desorpsiyon / iyonizasyon zaman yapın. </li><li> MS / MS veri Maskot algoritması (kullanarak NCBI olmayan gereksiz ve İsviçre-Prot veritabanlarına karşılaştırın <a href="http://www.matrixscience.com" target="_blank">www.matrixscience.com</a> ). </li></ol></li><li> İmmünoblot Analizi <ol><li> % 4-20 ya da% 8-16 Tris-HCl, Ölçütleri hazır jel (Bio-Rad) SDS-PAGE ile protein örnekleri ayırın. Bir nitroselüloz membrana elektroforetik bantları aktarın. </li><li> 5 dakika boyunca, Tris membran yıkayın (Bio-Rad TBS) Tamponlu Salin. % 0.1 Tween 2 (TTBS içinde% 5 yağsız süt ile bloke TBS0), oda sıcaklığında çalkalanarak 1 saat boyunca. </li><li> 4 ° C de bir gece boyunca çalkalama ile% 5 yağsız süt içinde belirli bir birincil antikor ile immunoblotting membran prosesi. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca% 5 yağsız süt, ikincil bir HRP-eşlenikli IgG (H + L) antikoru, ardından 20 dakika boyunca TTBS içinde yıkayın. 30-60 dakika boyunca TTBS içinde yıkayın. </li><li> Western Blot Luminol Reaktif (Santa Cruz Biotechnology, Inc, Santa Cruz, CA) tarafından protein bantları tespit. Fotoğraf filmi için filtre Açığa. Not: Bazı deneylerde, bir soyma reaktif farklı bir birincil ve ikincil antikor ile takip eden hibridizasyon ile membran (Pierce, Rockford, İL) şerit için kullanılmıştır. </li><li> Adobe Photoshop 5.0.2 içine Röntgen filmleri tarayın. ImageJ yazılımı (Ulusal Sağlık Enstitüleri, Bethesda, MD) kullanarak yoğunluk analizi yapın. </li></ol></li></ol> II. Fonksiyonel Analizde Antikor inhibisyonu kullanımı II.1. Antibod Eş-transfeksiyonler Chariot Protein Teslim Reaktif Kiti kullanarak <ol><li> Reaksiyon karışımı, transfeksiyon başına, 1X PBS ile 100 ul bir son hacme, wtNef-gfp plazmit DNA&#39;sı 1 ug ve anti-mortalin antikoru veya anti-α-tubulin antikoru ya da 1 mg seyreltin. Not: Bu, daha önce bir anti-α-tubulin antikorun eş-transfeksiyon exNef salgılanması üzerinde hiçbir saptanabilir bir etkiye sahiptir ve bu nedenle, bu deneylerde etkili bir negatif kontrol olarak hizmet ettiği bulunmuştur. </li><li> Steril su ile 100 ul son hacim olması için seyreltilmemiş Arabası reaktifi 6 ul seyreltilir ve seyreltilmiş DNA-antikor karışımı ile bir araya getirmektedir. </li><li> Arabası / DNA-antikor kompleksinin oluşumuna izin vermek için 30 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> 5 dakika boyunca 600 x g&#39;de santrifüj ile pelet 3 x 10 5 Jurkat hücreleri. </li><li> 1X PBS ile iki kez hücreleri yıkayın ve Chariot / DNA-antikor kompleksi tekrar süspansiyon haline getirin. </li><li> Süspansiyonuna serum içermeyen RPMI 1640 ortamında 400 ul ekleyin ve C inkübe37 kültür plakaları içinde arşın ° 2 saat boyunca kurutuldu. </li><li> Her plaka için% 10 FBS ihtiva eden taze RPMI 1640 ortamı içinde 1 ml ilave edilir, ve 37, 48 saat boyunca hücrelerin inkübe ° C </li></ol> II.2. Antikor inhibisyonu Nef-GFP floresan levha okuyucu ile Salgılama Deneyi <ol><li> Toplanan hücreler, hücre içermeyen koşullandırılmış ortam toplamak, ve 96-çukurlu siyah mikrotitre plakasının her bir kuyu için 100 ul transfer. </li><li> Dalgaboyu 485 nm ve emisyon dalga boyu göreceli floresan birimlerinde 515 nm ile bir Tecan GENEios florimetresi üzerinde medyada ölçü GFP floresan. </li><li> Kontrol olarak, GFP floresans seviyesini (hücrelerden ortam Nef-GFP ve anti-α-tubulin antikoru ile birlikte-transfekte edilmiş),% 100 olarak belirlenmiştir. </li><li> Hücrelerden ortam Nef-GFP salgılama değişikliklerini belirlemek üzere anti-mortalin antikor ile birlikte transfekte GFP floresans seviyesi ile karşılaştırın. </li></ol>

<ol>
	<li>Forsman, A., Weiss, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+is+HIV+a+pathogen?.">Why is HIV a pathogen?.</a> Trends Microbiol. 16 (12), 555-560 (2008).</li><li>Moir, S., Chun, T. W., Fauci, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenic+mechanisms+of+HIV+disease.">Pathogenic mechanisms of HIV disease.</a> Annu. Rev. Pathol. 6, 223-248 (2011).</li><li>Smith, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathogenesis+of+HIV+infection:+Stupid+may+not+be+so+dumb+after+all.">The pathogenesis of HIV infection: Stupid may not be so dumb after all.</a> Retrovirology. 3 (1), 60 (2006).</li><li>Levacher, M., Hulstaert, F., Tallet, S., Ullery, S., Pocidalo, J. J., Bach, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+significance+of+activation+markers+on+CD8+lymphocytes+in+human+immunodeficiency+syndrome:+staging+and+prognostic+value.">The significance of activation markers on CD8 lymphocytes in human immunodeficiency syndrome: staging and prognostic value.</a> Clin. Exp. Immunol. 90 (3), 376-382 (1992).</li><li>Giorgi, J. V., Liu, Z., Hultin, L. E., Cumberland, W. G., Hennessey, K., Detels, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+levels+of+CD38++CD8++T+cells+in+HIV+infection+add+to+the+prognostic+value+of+low+CD4++T+cell+levels:+results+of+6+years+of+follow-up.+The+Los+Angeles+Center,+Multicenter+AIDS+Cohort+Study.">Elevated levels of CD38+ CD8+ T cells in HIV infection add to the prognostic value of low CD4+ T cell levels: results of 6 years of follow-up. The Los Angeles Center, Multicenter AIDS Cohort Study.</a> J. Acquir. Immune. Defic. Syndr. 6 (8), 904-912 (1993).</li><li>Bofill, M., Mocroft, A., Lipman, M., Medina, E., Borthwick, N. J., Sabin, C. A., Timms, A., Winter, M., Baptista, L., Johnson, M. A., Lee, C. A., Phillips, A. N., Janossy, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+numbers+of+primed+activated+CD8+CD38+CD45RO++T+cells+predict+the+decline+of+CD4++T+cells+in+HIV-1-infected+patients.">Increased numbers of primed activated CD8+CD38+CD45RO+ T cells predict the decline of CD4+ T cells in HIV-1-infected patients.</a> AIDS. 10 (8), 827-834 (1996).</li><li>Liu, Z., Cumberland, W. G., Hultin, L. E., Prince, H. E., Detels, R., Giorgi, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+CD38+antigen+expression+on+CD8++T+cells+is+a+stronger+marker+for+the+risk+of+chronic+HIV+disease+progression+to+AIDS+and+death+in+the+Multicenter+AIDS+Cohort+Study+than+CD4++cell+count,+soluble+immune+activation+markers,+or+combinations+of+HLA-DR+and+CD38+expression.">Elevated CD38 antigen expression on CD8+ T cells is a stronger marker for the risk of chronic HIV disease progression to AIDS and death in the Multicenter AIDS Cohort Study than CD4+ cell count, soluble immune activation markers, or combinations of HLA-DR and CD38 expression.</a> J Acquir. Immune. Defic. Syndr. Hum. Retrovirol. 16 (2), 83-92 (1997).</li><li>Douek, D. C., Roederer, M., Koup, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+concepts+in+the+immunopathogenesis+of+AIDS.">Emerging concepts in the immunopathogenesis of AIDS.</a> Annu. Rev. Med. 60, 471-484 (2009).</li><li>Roberts, L., Passmore, J. A., Williamson, C., Little, F., Bebell, L. M., Mlisana, K., Burgers, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+cytokine+levels+during+acute+HIV-1+infection+predict+HIV+disease+progression.">Plasma cytokine levels during acute HIV-1 infection predict HIV disease progression.</a> AIDS. 24 (6), 819-831 (2010).</li><li>Mueller, Y. M., Petrovas, C., Bojczuk, P. M., Dimitriou, I. D., Beer, B., Silvera, P., Villinger, F., Cairns, J. S., Gracely, E. J., Lewis, M. G., Katsikis, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-15+increases+effector+memory+CD8++t+cells+and+NK+Cells+in+simian+immunodeficiency+virus-infected+macaques.">Interleukin-15 increases effector memory CD8+ t cells and NK Cells in simian immunodeficiency virus-infected macaques.</a> J. Virol. 79 (8), 4877-4885 (2005).</li><li>Picker, L. J., Reed-Inderbitzin, E. F., Hagen, S. I., Edgar, J. B., Hansen, S. G., Legasse, A., Planer, S., Piatak, M., Lifson, J. D., Maino, V. C., Axthelm, M. K., Villinger, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-15+induces+CD4+effector+memory+T+cell+production+and+tissue+emigration+in+nonhuman+primates.">IL-15 induces CD4 effector memory T cell production and tissue emigration in nonhuman primates.</a> J. Clin. Invest. 116 (6), 1514-1524 (2006).</li><li>Mueller, Y. M., Do, D. H., Altork, S. R., Artlett, C. M., Gracely, E. J., Katsetos, C. D., Legido, A., Villinger, F., Altman, J. D., Brown, C. R., Lewis, M. G., Katsikis, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-15+treatment+during+acute+simian+immunodeficiency+virus+(SIV)+infection+increases+viral+set+point+and+accelerates+disease+progression+despite+the+induction+of+stronger+SIV-specific+CD8++T+cell+responses.">IL-15 treatment during acute simian immunodeficiency virus (SIV) infection increases viral set point and accelerates disease progression despite the induction of stronger SIV-specific CD8+ T cell responses.</a> J. Immunol. 180 (1), 350-360 (2008).</li><li>Ali, S. A., Huang, M. B., Campbell, P. E., Roth, W. W., Campbell, T., Khan, M., Newman, G., Powell, F., Powell, M. D., Bond, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Characterization+of+HIV+Type+1+Nef-Induced+Vesicle+Secretion.">Genetic Characterization of HIV Type 1 Nef-Induced Vesicle Secretion.</a> AIDS Res. Hum. Retroviruses. 26 (2), 173-192 (2010).</li><li>Raymond, A. D., Campbell-Sims, T. C., Khan, M., Lang, M., Huang, M. B., Bond, V. C., Powell, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+Type+1+Nef+Is+Released+from+Infected+Cells+in+CD45++Microvesicles+and+Is+Present+in+the+Plasma+of+HIV-Infected+Individuals.">HIV Type 1 Nef Is Released from Infected Cells in CD45+ Microvesicles and Is Present in the Plasma of HIV-Infected Individuals.</a> AIDS. 27 (2), 167-178 (2011).</li><li>James, C. O., Huang, M. -. B., Khan, M., Garcia-Barrio, M., Powell, M. D., Bond, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Nef+Protein+Targets+CD4++T+Cells+for+Apoptosis+by+Interacting+with+CXCR4+Surface+Receptors.">Extracellular Nef Protein Targets CD4+ T Cells for Apoptosis by Interacting with CXCR4 Surface Receptors.</a> J. Virol. 78 (6), 3099-3109 (2004).</li><li>Huang, M. B., Jin, L. L., James, C. O., Khan, M., Powell, M. D., Bond, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Nef-CXCR4+Interactions+Important+for+Apoptosis+Induction.">Characterization of Nef-CXCR4 Interactions Important for Apoptosis Induction.</a> J. Virol. 78 (20), 11084-11096 (2004).</li><li>Heveker, N., Montes, M., Germeroth, L., Amara, A., Trautmann, A., Alizon, M., Schneider-Mergener, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissociation+of+the+signalling+and+antiviral+properties+of+SDF-1-derived+small+peptides.">Dissociation of the signalling and antiviral properties of SDF-1-derived small peptides.</a> Curr. Biol. 8 (7), 369-376 (1998).</li><li>Shelton, M. N., Huang, M. B., Ali, S. A., Powell, M. D., Bond, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SMR-derived+peptide+disrupts+HIV-1+Nef's+interaction+with+mortalin+and+blocks+virus+and+Nef+exosome+release.">SMR-derived peptide disrupts HIV-1 Nef's interaction with mortalin and blocks virus and Nef exosome release.</a> J. Virol. 86 (1), 406-419 (2012).</li><li>Ptak, R. G., Fu, W., Sanders-Beer, B. E., Dickerson, J. E., Pinney, J. W., Robertson, D. L., Rozanov, M. N., Katz, K. S., Maglott, D. R., Pruitt, K. D., Dieffenbach, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cataloguing+the+HIV+type+1+human+protein+interaction+network.">Cataloguing the HIV type 1 human protein interaction network.</a> AIDS Res. Hum. Retroviruses. 24 (12), 1497-1502 (2008).</li><li>Shugars, D. C., Smith, M. S., Glueck, D. H., Nantermet, P. V., Seillier-Moiseiwitsch, F., Swanstrom, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+nef+gene+sequences+present+in+vivo.">Analysis of human immunodeficiency virus type 1 nef gene sequences present in vivo.</a> J. Virol. 67 (8), 4639-4650 (1993).</li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

Exosomal ticareti yolu exNef salgısının mühendislik roman inhibitörleri yararlı olacaktır işlemek için Nef yeteneğini altında yatan mekanizmaların anlaşılması. ExNef salgısının inhibisyonu CD4 T hücre tükenmesi ve CIA bu sürücü HIV / AIDS patogenezi düşecektir. Bu hedefe doğru, bize exNef salgılanması genetik analiz ve ilgili hücresel proteinleri belirlemek için başlamak için izin yeni maddeler ve yöntemler geliştirmiştir. Bu yaklaşım, aynı zamanda doğrudan exNef salgılanması SMR...

Antiretroviral tedavi ile birlikte, batı dünyasında AIDS salgını yavaşladı, ama kısıtlandığını değil, ve HIV yayılmasını dünya çapında önemli bir sağlık yük olmaya devam edilmiştir. Marjinal etkili RV144 Tay deneme dışında, HIV aşı bugüne kadar enfeksiyondan korumak için başarısızlık göstermiştir. Böylece, ek, potansiyel terapötik hedefler araştırma hala garanti edilir. CD4 T hücre tükenmesi ile birlikte, kalıcı genel immün aktivasyon HIV enfeksiyonunun bir özelliğidir. Bu Kronik Bağışıklık Aktivasyon (CIA) hücre yenilenmesini, aktif ve ayırt lenfositik alt popülasyonlar, hücresel yorgunluk ve yaşlanma ve Aktivasyon Bağlı Hücre Ölümü (AICD) 1,2,3 ile T hücreleri ve B hücrelerinin öldürülmesi artar yol açar ve iyi hastalığın ilerlemesi 4,5,6,7,8,9,10,11,12 en güçlü belirleyicileri biri olarak kurulmuştur. Bununla birlikte, mekanizma CIA ve CD4 yatanHIV enfeksiyonunda tükenmesi T-hücresi tam olarak aydınlatılmış kalır. Bizim laboratuvar ve diğerlerinden kanıt HIV protein Nef (Negatif Düzenleme Faktörü) HIV-1 ile infekte hücreleri 13,14 den exosomes kendi salgı neden neyin hastalığın ilerlemesi için bir model (Şekil 1) götürdü. Bu Nef-içeren exosomes (exNef) enfekte CD4 + T-hücreleri de dahil olmak üzere 15,16 hücre soylarının bir dizi apoptoza neden olur. Alternatif olarak, monositlerde / makrofajlar exNef değiştiren gen ekspresyonu, örneğin sitokin ifade ve programsız immün aktivasyon bir devlet neden görünüyor. Bu delil vücut CIA ve CD4 T hücre tükenmesi exNef için önemli bir rol göstermektedir. Exosomal ticareti yolu exNef salgısının mühendislik roman inhibitörleri yararlı olacaktır işlemek için Nef yeteneğini altında yatan mekanizmaların anlaşılması. ExNef salgısının inhibisyonu CD4 + T-hücre deplesyonu düşecektirve CIA sürücü HIV / AIDS patogenezinde bu. HIV / AIDS hastalığın ilerlemesi ve bu model üzerine inşa sonraki veri için bizim modeli neden kanıt toplamak için, bize exNef salgılanması genetik analiz için izin yeni maddeler ve yöntemler geliştirmiştir ve belirlemek başlar hücresel protein çıkıyor. İlk çalışmada, Nef proteini bekleme hücrelerde apoptozu indükler ve Nef-transfekte edilmiş ve HIV bulaşmış hücrelerden hücre dışında 15 serbest olduğu bulundu. SDF-1α (alternatif yapıştırma alfa faktörü-1 kaynaklı stromal hücre) türetilen peptitler daha önce çok tam uzunluktaki molekülün 17 bağlayıcı ve sinyal aktivitesi korudukları gösterilmiştir edilmiştir. Biz Nef peptidler tam protein apoptotik aktivite bazıları ve bu peptidler mutlaka Nef apoptotik alanı (ler) içeren olacağını korumak yönünde söylentiler. Bu peptidlerin tespit ve dolayısıyla Nefapoptotik etki (ler), böylece NIH AIDS Araştırma ve Referans Reaktif Programı 20, HIV-1 Nef tarama peptidler bir dizi elde edilmiştir. Bu 20-AA peptitler, komşu 10 amino asit üst üste binen her biri, son amino asidi, yani, N20 açıklıklı Nef, amino asitler 1-20, N30 açıklıklı Nef, amino asitler 11-30, vb 16 sayısına göre adlandırılır. Bu hücrelerdeki tam uzunluktaki Nef proteini apoptosis, iki ayrı 10-AA etki çakışan peptidlere özgü T-hücrelerinin, hücre dışında açığa bulundu. Bu Nef-apoptotik türetilmiş peptidlerin sonraki analiz fiziksel olarak bu peptidlerin rekabetçi CXCR4 ve doğal ligandı SDF-1α arasındaki bağlanmayı inhibe izin bağlanma kinetiği ile T-hücrelerinin yüzeyi üzerinde kemokin reseptörü CXCR4 ile etkileşme kabiliyeti olduğu ortaya çıkmıştır. Son olarak, CXCR4 ile Nef-apoptotik türetilen peptidleri &#39;etkileşimi apoptoza yol açan, bu T-hücrelerinde, bir stres yanıtı neden olduğu bulunmuştur. Bu kanıt bize quic izinkıy haritası Nef fonksiyonel etki, bu tür alanin tarama mutagenez gibi standart DNA mutajenik teknikleri kullanılarak çok daha uzun almış bir süreç. Ayrıca, bu kısa bir Nef-türevli peptitler, tam uzunluktaki protein ile apoptotik etki biyolojik fonksiyonu muhafaza ettiğini gösterdi. Nef, hücre dışı bir rolü tespit ettikten sonra, T-hücrelerinin, yani, apoptoz, böylece Nef hücrelerinden salgılanan ne kadar daha iyi bir anlayış aranır. Nef, mutasyona uğramış yapıların bir dizi kullanarak, HIV Nef, hem N-terminal bölgelerinde yüksek ölçüde korunmuş Nef proteini motifleri eşlenir ve exNef salgılanması 13 için kritik olan Rhesus macaque eşdeğer SIV Mac ​​(Maymun bağışıklık eksikliği Virüsü) Nef,. Bu motiflerinden biri, Salgı Değişiklik Bölgesi (SMR, 66VGFPV70), beş amino asitlerin herhangi birini büyük ölçüde exNef salgısı azaltılması veya tamamen kaldırılması bir alanin yerine, özellikle kritik oldu. Aktif Motif C üzerinden hücrelerine verildiği zamanhariot proteini dağıtım reaktifi, bir FLAG peptid dizisi (SMRwt) bağlı olan bir peptid ihtiva eden SMR 18 hücre Nef-transfekte edilmiş ve HIV ile enfekte hem de exNef sekresyonunu inhibe ettiği bulunmuştur. Peptidler ile önceki deneyimlere dayanarak, biz moleküller ve exNef salgılanması Nef SMR rolü altında yatan mekanizmaları aydınlatmak için bu peptid kullanmaya karar verdi. Bizim &quot;yem protein&quot; olarak SMRwt peptid kullanarak, enfekte edilmemiş T hücre lizatları 18 SMR hücresel bağlama ortakları co-immünopresipitasyon. FLAG peptid dizisi Anti-Flag afinite reçinesi kullanılarak SMRwt peptid yakalamak için uygun bir sap sağladı. SMRwt peptid mutasyon alanin tek bir valin exNef salgısının inhibisyonu kaldırılması için yeterli olduğunu daha önceki bulgu biz SMR için özel olmayan eş immunoprecipitated proteinler ekarte etmek için kullanılan uygun, son derece özel kontrol peptid (SMRmut) tespit. S sahip olan bir peptit kullanılarakyerine tam uzunluktaki protein daha ilgi çekici pecific etki bize Nef 19 diğer etki bağlanan hücresel faktörleri onlarca tarama geçebileceğinden. Bir kez bir sonraki mantıklı adım tespit hücresel bağlama ortakları biyolojik fonksiyonu 18 için önemli olduğunu göstermekti, SMR-bağlama ortakları tespit. Bunu gerçekleştirmek için standart bir prosedür biyolojik fonksiyonu hedef protein özel miRNA veya siRNA ve daha sonra tahlil etkisini kullanarak demonte protein düzeyleri etmektir. Bu durumda, bir SMR-bağlayıcı protein olarak, bu hedef üretimini azaltarak, hedef mRNA translasyonunu önlerler MiRNA demonte, gerçekleştirilir. Hedef proteinin bu azalma, dolaylı bir etkisi olduğunu, ve muhtemelen de hedeflenen bir proteinin Sonuç olarak içeri bir rol oynayan biyolojik fonksiyonu üzerinde gecikmiş bir etkiye sahiptir, aynı zamanda doğrudan bölgesinin aktivitesini kesintiye olup olmadığını belirlemek için, daha az yaygın antikor engellenmesi tekniği uygulanmıştırHedef proteinin biyolojik fonksiyonu azaltır veya ortadan kaldırır. Bu işlemde, antikorlar, hedeflenen bir proteinin karşı yükseltilmiş Arabası reaktifi kullanarak hücre içine transfekte edildi ve hedef protein işlevi ya da onun sitesinden kenetleme bu, ya da ilgili bağlama alanı bloke ile doğrudan etkileşim vardır. Bu prosedür sayesinde hedef proteinin inhibisyonu doğrudan fonksiyonunu bozan ve daha da biyolojik işlevi olan hedef proteinin önemini teyit RNA demonte işlemleri tamamlayabilir. Chariot Reaktif hücrelere peptidler ve proteinler teslim etkili iken, bu süreci zaman alıcı ve, deney türleri sınırlar örneğin uzun süreli veya tekrarlanan maruz kalmaların ve in vivo hayvan çalışmalarında yapılabilir ki. Sonuç olarak, pasif hücreleri tarafından alınabilir bir peptid oluşturmak için SMRwt peptid (SMRwt-CPP) 18 bir hücre delici peptid (CPP) dizisi eklendikültür ortamından. Bu sürüm inhibe exNef salgılanması da eski kadar etkili oldu. Bu yayınlanan deneylerden elde edilen kanıtlar, rekabetçi inhibisyonu yoluyla tam uzunluktaki protein işlevini antagonize etmek için, ve bu motiflerin bağlayan proteinlerin izole edilmesi için özel bir fonksiyonel motifini ihtiva eden küçük peptidlerin yeteneğini göstermektedir. Bir bu teknikler birçok deneysel protokolleri yararlı olması gerektiğini beklenebilir. Ayrıca, birçok hücresel süreçlerin mühendislik yeni peptid inhibitörleri etkili olmalıdır, CPP dizilerine bağ ile daha da arttırılabilir bir işlevi kapsar.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent </td>
 <td>Company </td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>20mer peptide set with 10 amino acid overlap</td>
 <td>NIH AIDS Research and Reference Reagent Program</td>
 <td>4641</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TUNEL Assay</td>
 <td>Roche</td>
 <td>11 684 809 910</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Chariot Protein Delivery Reagent</td>
 <td>Active Motif</td>
 <td>30100</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tecan GENEios fluorimeter</td>
 <td> (Tecan Group, Switzerland)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>96-well black microtiter plate</td>
 <td>Corning</td>
 <td>3792</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>anti-FLAG M2 Affinity Gel</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>A2220</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dynabeads Protein G magnetic beads </td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>100.03D</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MagnaSphere Technology Magnetic Separation Stand (two position)</td>
 <td>Promega Corp., Madison, WI</td>
 <td>Z5332</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>C-18 ZipTip </td>
 <td>Millipore</td>
 <td>ZTC18S096</td>
 <td>C18 Resin (0.6 &mu;l or 0.2 &mu;l bed volumes). Oligonucleotides or small (&lt;50 kDa) proteins/ peptides in aqueous solution</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MALDI TOF/TOF</td>
 <td>Bruker Daltonics ultraflex III TOF/TOF</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

peptide-based identification of functional motifs and their binding partners

Bizim örneğimizde, HIV-1 Nef, tam uzunlukta proteinler bulunur motifleri türetilmiş spesifik bir kısa peptitler, bunların biyolojik fonksiyonu muhafaza, aynı zamanda rekabetçi tam uzunluktaki protein fonksiyonunu inhibe değil sadece. 20 Nef tarama peptidler, her biri komşu 10 amino asit uzunluğunda ve üst üste gelen 20 amino asit, bir dizi apoptoz, endüksiyon sorumlu NEF motifleri tanımlamak için kullanıldı. Bu apoptotik motifleri içeren peptidler, tam uzunluktaki Nef proteini ile karşılaştırılabilir düzeyde apoptoza neden olmuştur. Nef en salgılanması Değişiklik Bölgesi (SMR) elde edilen ikinci bir peptid, exosomes yılında Nef en salgı (exNef) dahil hücresel proteinlerle etkileşim yeteneği korudu. Bu SMRwt peptid Nef, en SMR motifi özellikle bağlanan hücresel proteinlerin izole edilmesi için ko-immünopresipitasyon deneylerde &quot;yem&quot; bir protein olarak kullanılmıştır. Protein transfeksiyon ve antikor inhibe fiziksel etkileşimi bahsi bozmak için kullanılanween Nef ve mortalin, izole edilmiş SMR bağlayıcı proteinlerin biri, ve bu etki, bir floresan bazlı exNef salgılama tahlili ile ölçüldü. SMR motifi bağlanan hücresel protein için tam uzunlukta Nef outcompete SMRwt peptid yeteneği, bu exNef salgılanması ilk inhibitörünün etkisi. Bu nedenle, tam uzunlukta proteinler bulunur motifleri türetilmiş spesifik bir kısa peptidlerin eşsiz özelliklerini kullanan burada tarif edilen teknikler kullanılarak, tek bir protein işlevsel motiflerin belirlenmesi ve patojenik fonksiyonları peptit bazlı inhibitörlerinin geliştirilmesi hızlandırabilir.

Peptidler kullanarak Biyolojik Fonksiyonel Motifler Haritalama. İki bölge apoptoz neden Nef proteinler üzerinde tespit edilmiştir. Peptit odaklı apoptoz N60 (aa40-60) ve N70 (aa50-70) zirve ve peptid N100 (aa80-100) de arka plan seviyelere azalan, peptid N50 (AA30-50) (Şekil 2) başında gözlendi. Aa50-60 merkezleme büyük Motif 1 (M1), tepe, tam uzunluktaki Nef proteini apoptotik seviyelerinin&gt;% 80 indükler. İkinci bir, küçük apoptotik tepe peptidler N180 (aa160-180) ve...

Watch this Scientific Journal Video about Peptide-based Identification of Functional Motifs and their Binding Partners at JoVE.com

Peptide-based Identification of Functional Motifs and their Binding Partners | Immunology and Infection | Video

Peptide-based Identification of Functional Motifs and their Binding Partners

Exosomes HIV-1 Nef salgılanmasını altında yatan mekanizmaları incelemek için teknikler tarif edilmiştir. Nef ve protein transfeksiyon elde edilen özel kısa peptitler yapısı, işlevi, ve Nef en Salgı Değişiklik Bölgesi bağlayıcı ortakları belirlemek için istismar edildi. Bu prosedürler birçok mekanik çalışmalar genel ilgisi var.

Fonksiyonel Motifler ve Bağlama Ortaklar peptid bazlı Kimlik

Specific short  peptides derived from motifs found in full-length proteins, in our case HIV-1  Nef, not only retain their biological function, but can ...

peptide-based-identification-functional-motifs-their-binding

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Immunology and Infection

Fundamentals

Macromolecules

SCIENTISTS IN ACTION

12.3K Görüntüleme.  Morehouse School of Medicine. Exosomes HIV-1 Nef salgılanmasını altında yatan mekanizmaları incelemek için teknikler tarif edilmiştir. Nef ve protein transfeksiyon elde edilen özel kısa peptitler yapısı, işlevi, ve Nef en Salgı Değişiklik Bölgesi bağlayıcı ortakları belirlemek için istismar edildi. Bu prosedürler birçok mekanik çalışmalar genel ilgisi var.

Video: Peptide-based Identification of Functional Motifs and their Binding Partners

Particle Agglutination Method for Poliovirus Identification

In the Global Polio Eradication Initiative, laboratory diagnosis plays a critical role by isolating and identifying PV from the stool samples of acute flaccid paralysis (AFP) cases. In the World Health Organization (WHO) Global Polio Laboratory Network, PV isolation and identification are currently being performed by using cell culture system and real-time RT-PCR, respectively. In the post-eradication era of PV, simple and rapid identification procedures would be helpful for rapid confirmation of polio cases at the national laboratories. In the present study, we will show the procedure of novel PA assay developed for PV identification. This PA assay utilizes interaction of PV receptor (PVR) molecule and virion that is specific and uniform affinity to all the serotypes of PV. The procedure is simple (one step procedure in reaction plates) and rapid (results can be obtained within 2 h of reaction), and the result is visually observed (observation of agglutination of gelatin particles).

A recently developed novel particle agglutination (PA) assay utilizing virus receptor molecule allowed a rapid and easy identification of poliovirus (PV). In this article, we will show the procedure for the PA assay for PV identification.

Poliovirüs Kimlik Parçacık Aglütinasyon Yöntemi

In the Global Polio Eradication Initiative, laboratory diagnosis plays a critical role by isolating and identifying PV from the stool samples of acute ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Isolation of Functional Cardiac Immune Cells

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5 These immune cells, which include mast cells, T-cells and macrophages; store and release a variety of biologically active mediators including cytokines and proteases such as tryptase.6-8 These mediators have been shown to be key players in extracellular matrix metabolism by activating matrix metalloproteinases or causing collagen accumulation by modulating the cardiac fibroblasts' function.9-11 However, available techniques for isolating cardiac immune cells have been problematic because they use bacterial collagenase to digest the myocardial tissue. This technique causes activation of the immune cells and thus a loss of function. For example, cardiac mast cells become significantly less responsive to compounds that cause degranulation.12 Therefore, we developed a technique that allows for the isolation of functional cardiac immune cells which would lead to a better understanding of the role of these cells in cardiac disease.13, 14
This method requires a familiarity with the anatomical location of the rat's xiphoid process, axilla and falciform ligament, and pericardium of the heart. These landmarks are important to increase success of the procedure and to ensure a higher yield of cardiac immune cells. These isolated cardiac immune cells can then be used for characterization of functionality, phenotype, maturity, and co-culture experiments with other cardiac cells to gain a better understanding of their interactions.

This method for isolating functional immune cells from the heart provides an alternative to the conventional methods of collagenase digestion, which causes unwanted immune cell activation, resulting in a decreased responsiveness of these cells. Our method of isolation yields functional cardiac immune cells by avoiding problems associated with enzymatic digestion.

Fonksiyonel Kardiyak Bağışıklık Hücreleri İzolasyon

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5  These immune cells, which ...

Following in Real Time the Impact of Pneumococcal Virulence Factors in an Acute Mouse Pneumonia Model Using Bioluminescent Bacteria

Pneumonia is one of the major health care problems in developing and industrialized countries and is associated with considerable morbidity and mortality. Despite advances in knowledge of this illness, the availability of intensive care units (ICU), and the use of potent antimicrobial agents and effective vaccines, the mortality rates remain high1. Streptococcus pneumoniae is the leading pathogen of community-acquired pneumonia (CAP) and one of the most common causes of bacteremia in humans. This pathogen is equipped with an armamentarium of surface-exposed adhesins and virulence factors contributing to pneumonia and invasive pneumococcal disease (IPD). The assessment of the in vivo role of bacterial fitness or virulence factors is of utmost importance to unravel S. pneumoniae pathogenicity mechanisms. Murine models of pneumonia, bacteremia, and meningitis are being used to determine the impact of pneumococcal factors at different stages of the infection. Here we describe a protocol to monitor in real-time pneumococcal dissemination in mice after intranasal or intraperitoneal infections with bioluminescent bacteria. The results show the multiplication and dissemination of pneumococci in the lower respiratory tract and blood, which can be visualized and evaluated using an imaging system and the accompanying analysis software.

Streptococcus pneumoniae is the leading pathogen causing severe community-acquired pneumonia and responsible for over 2&#160;million deaths worldwide. The impact of bacterial factors implicated in fitness or virulence can be monitored in real-time in an acute mouse pneumonia or bacteremia model using bioluminescent bacteria.

Biyoluminesen Bakteriler Kullanılarak Gerçek Zamanda Bir Akut Fare Pnömoni Modelinde Pnömokok virulans faktörlerinin etkisi aşağıdaki

Pneumonia is one of the major health care problems in developing and industrialized countries and is associated with considerable morbidity and mortality. ...

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques enable the observation of live cellular behavior inside the organ but can be challenging in some types of cancer due to organ and tumor accessibility such as intestine. Direct observation of intestinal tumors has not been previously reported. A surgical procedure described here allows direct observation of myeloid cell dynamics within the intestinal tumors in live mice by using transgenic fluorescent reporter mice and injectable tracers or antibodies. For this purpose, a four-color, multi-region, micro-lensed spinning disk confocal microscope that allows long-term continuous imaging with rapid image acquisition has been used. ApcMin/+ mice that develop multiple adenomas in the small intestine are crossed with c-fms-EGFP mice to visualize myeloid cells and with ACTB-ECFP mice to visualize intestinal epithelial cells of the crypts. Procedures for labeling different tumor components, such as blood vessels and neutrophils, and the procedure for positioning the tumor for imaging through the serosal surface are also described. Time-lapse movies compiled from several hours of imaging allow the analysis of myeloid cell behavior in situ in the intestinal microenvironment.

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

By using transgenic reporter mice and injectable fluorescent labels, long-term intravital spinning disk confocal microscopy enables direct visualization of myeloid cell behavior into intestinal adenoma in the ApcMin/+ colorectal cancer model.

Miyeloid hücrelerin Dynamics Gerçek zamanlı Görüntüleme<em&gt; Süm<sup&gt; Min / +</sup</em&gt; Bağırsak Tümörleri Disk Eşodaklı Mikroskopi Spinning tarafından

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. Polysaccharides such as glycogen, glycoproteins, and glycolipids stain bright magenta making it easy to enumerate positive and negative cells within the tissue. In muscle cells PAS staining is used to determine the glycogen content in different types of muscle cells, while in blood cell samples PAS staining has been explored as a diagnostic tool for a variety of conditions. Blood contains a proportion of white blood cells that belong to the immune system. The notion that cells of the immune system possess glycogen and use it as an energy source has not been widely explored. Here, we describe an adapted version of the PAS staining protocol that can be applied on peripheral blood mononuclear immune cells from human venous blood. Small cells with PAS-positive granules and larger cells with diffuse PAS staining were observed. Treatment of samples with amylase abrogates these patterns confirming the specificity of the stain. An alternate technique based on enzymatic digestion confirmed the presence and amount of glycogen in the samples. This protocol is useful for hematologists or immunologists studying polysaccharide content in blood-derived lymphocytes.

Periodic acid Schiff staining is a technique that visualizes the polysaccharide content of tissues. This article demonstrates periodic acid Schiff staining protocol adapted for use on peripheral blood mononuclear cells purified from human venous blood. Such samples are enriched for lymphocytes and other white blood cells of the immune system.

Periyodik Asit Schiff Boyama ile periferik kan mononükleer hücreleri glikojen algılama

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle (GUV) Membranes

The structural protein of HIV-1, Pr55Gag (or Gag), binds to the plasma membrane in cells during the virus assembly process. Membrane binding of Gag is an essential step for virus particle formation, since a defect in Gag membrane binding results in severe impairment of viral particle production. To gain mechanistic details of Gag-lipid membrane interactions, in vitro methods based on NMR, protein footprinting, surface plasmon resonance, liposome flotation centrifugation, or fluorescence lipid bead binding have been developed thus far. However, each of these in vitro methods has its limitations. To overcome some of these limitations and provide a complementary approach to the previously established methods, we developed an in vitro assay in which interactions between HIV-1 Gag and lipid membranes take place in a &#34;cell-like&#34; environment. In this assay, Gag binding to lipid membranes is visually analyzed using YFP-tagged Gag synthesized in a wheat germ-based in vitro translation system and GUVs prepared by an electroformation technique. Here we describe the background and the protocols to obtain myristoylated full-length Gag proteins and GUV membranes necessary for the assay and to detect Gag-GUV binding by microscopy.

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle GUV Membranes

We illustrate here an in vitro membrane binding assay in which interactions between HIV-1 Gag and lipid membranes are visually analyzed using YFP-tagged Gag synthesized in a wheat germ-based in vitro translation system and GUVs prepared by an electroformation technique.

Dev ünilamellar vesikül (GUV) membranlanna bağlanan, HIV-1 Gag Görselleştirme

The structural protein of HIV-1, Pr55Gag (or Gag), binds to the plasma membrane in cells during the virus assembly process. Membrane binding of Gag is an ...

Unravelling the Function of a Bacterial Effector from a Non-cultivable Plant Pathogen Using a Yeast Two-hybrid Screen

Unravelling the molecular mechanisms of disease manifestations is important to understand pathologies and symptom development in plant science. Bacteria have evolved different strategies to manipulate their host metabolism for their own benefit. This bacterial manipulation is often coupled with severe symptom development or the death of the affected plants. Determining the specific bacterial molecules responsible for the host manipulation has become an important field in microbiological research. After the identification of these bacterial molecules, called &#34;effectors,&#34; it is important to elucidate their function. A straightforward approach to determine the function of an effector is to identify its proteinaceous binding partner in its natural host via a yeast two-hybrid (Y2H) screen. Normally the host harbors numerous potential binding partners that cannot be predicted sufficiently by any in silico algorithm. It is thus the best choice to perform a screen with the hypothetical effector against a whole library of expressed host proteins. It is especially challenging if the causative agent is uncultivable like phytoplasma. This protocol provides step-by-step instructions for DNA purification from a phytoplasma-infected woody host plant, the amplification of the potential effector, and the subsequent identification of the plant&#39;s molecular interaction partner with a Y2H screen. Even though Y2H screens are commonly used, there is a trend to outsource this technique to biotech companies that offer the Y2H service at a cost. This protocol provides instructions on how to perform a Y2H in any decently equipped molecular biology laboratory using standard lab techniques.

Bacterial effector proteins are important for establishing successful infections. This protocol describes the experimental identification of proteinaceous binding partners of a bacterial effector protein in its natural plant host. Identifying these effector interactions via yeast two-hybrid screens has become an important tool in unravelling molecular pathogenicity strategies.

Bir Maya İki hibrid Ekran kullanarak Olmayan ekilebilir Bitki Patojen bir Bakteriyel Efektör Fonksiyonu aydınlatmak

Unravelling the molecular mechanisms of disease manifestations is important to understand pathologies and symptom development in plant science. Bacteria ...

Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

Plasmodesmata (Pd) are cell-to-cell connections that function as gateways through which small and large molecules are transported between plant cells. Whereas Pd transport of small molecules, such as ions and water, is presumed to occur passively, cell-to-cell transport of biological macromolecules, such proteins, most likely occurs via an active mechanism that involves specific targeting signals on the transported molecule. The scarcity of identified plasmodesmata (Pd) localization signals (PLSs) has severely restricted the understanding of protein-sorting pathways involved in plant cell-to-cell macromolecular transport and communication. From a wealth of plant endogenous and viral proteins known to traffic through Pd, only three PLSs have been reported to date, all of them from endogenous plant proteins. Thus, it is important to develop a reliable and systematic experimental strategy to identify a functional PLS sequence, that is both necessary and sufficient for Pd targeting, directly in the living plant cells. Here, we describe one such strategy using as a paradigm the cell-to-cell movement protein (MP) of the Tobacco mosaic virus (TMV). These experiments, that identified and characterized the first plant viral PLS, can be adapted for discovery of PLS sequences in most Pd-targeted proteins.

Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

Plant intercellular connections, the plasmodesmata (Pd), play central roles in plant physiology and plant-virus interactions. Critical to Pd transport are sorting signals that direct proteins to Pd. However, our knowledge about these sequences is still in its infancy. We describe a strategy to identify Pd localization signals in Pd-targeted proteins.

Proteinlerin içinde Planta serilerinde Plasmodesmal yerelleştirme tanımlaması

Plasmodesmata (Pd) are cell-to-cell connections that function as gateways through which small and large molecules are transported between plant cells. ...

Isolation of Peritoneum-derived Mast Cells and Their Functional Characterization with Ca2+-imaging and Degranulation Assays

Mast cells (MCs), as a part of the immune system, play a key role in defending the host against several pathogens and in the initiation of the allergic immune response. The activation of MCs via the cross-linking of surface IgE bound to high affinity IgE receptor (Fc&#949;RI), as well as through the stimulation of several other receptors, initiates the rise of the free intracellular Ca2+ level ([Ca2+]i) that promotes the release of inflammatory and allergic mediators. The identification of molecular constituents involved in these signaling pathways is crucial for understanding the regulation of MC function. In this article, we describe a protocol for the isolation of murine connective tissue type MCs by peritoneal lavage and cultivation of peritoneal MCs (PMCs). Cultures of MCs from various knockout mouse models by this methodology represent a useful approach to the identification of proteins involved in MC signaling pathways. In addition, we also describe a protocol for single cell Fura-2 imaging as an important technique for the quantification of Ca2+ signaling in MCs. Fluorescence-based monitoring of [Ca2+]i is a reliable and commonly used approach to study Ca2+ signaling events, including store-operated calcium entry, which is of utmost importance for MC activation. For the analysis of MC degranulation, we describe a &#946;-hexosaminidase release assay. The amount of &#946;-hexosaminidase released into the culture medium is considered as a degranulation marker for all three different secretory subsets described in MCs. &#946;-hexosaminidase can easily be quantified by its reaction with a colorigenic substrate in a microtiter plate colorimetric assay. This highly reproducible technique is cost-effective and requires no specialized equipment. Overall, the provided protocol demonstrates a high yield of MCs expressing typical MC surface markers, displaying typical morphological and phenotypic features of MCs, and demonstrating highly reproducible responses to secretagogues in Ca2+-imaging and degranulation assays.

Isolation of Peritoneum-derived Mast Cells and Their Functional Characterization with Ca2+-imaging and Degranulation Assays

Here, we present a protocol to isolate and cultivate murine peritoneal mast cells. We also describe two protocols for their functional characterization: a fluorescent imaging of intracellular free Ca2+ concentration and a degranulation assay based on colorimetric quantification of the released &#946;-hexosaminidase.

Yalıtım Karın zarını kaynaklı Mast hücreleri ve onların fonksiyonel karakterizasyonu ile Ca2 +-görüntüleme ve Degranulation deneyleri

Mast cells (MCs), as a part of the immune system, play a key role in defending the host against several pathogens and in the initiation of the allergic ...

Assays for the Specific Growth Rate and Cell-binding Ability of Rotavirus

Rotavirus is the main etiological factor for infantile diarrhea. It is a double-stranded (ds) RNA virus and forms a genetically diverse population, known as quasispecies, owing to their high mutation rate. Here, we describe how to measure the specific growth rate and the cell-binding ability of rotavirus as its phenotypes. Rotavirus is treated with trypsin to recognize the cell receptor and then inoculated into MA104 cell culture. The supernatant, including viral progenies, is collected intermittently. The plaque assay is used to confirm the virus titer (plaque-forming unit: pfu) of each collected supernatant. The specific growth rate is estimated by fitting time-course data of pfu/mL to the modified Gompertz model. In the assay of cell-binding, MA104 cells in a 24-well plate are infected with rotavirus and incubated for 90 min at 4 &#176;C for rotavirus adsorption to cell receptors. A low temperature restrains rotavirus from invading the host cell. After washing to remove unbound virions, RNA is extracted from virions attached to cell receptors followed by cDNA synthesis and reverse-transcription quantitative PCR (RT-qPCR). These protocols can be applied for investigating the phenotypic differences among viral strains.

Here we present two protocols, one for measuring the specific growth rate and the other for the cell-binding ability of rotavirus using the plaque assay and RT-qPCR. These protocols are available for confirming the differences in phenotypes between rotavirus strains.

Belirli büyüme oranı ve hücre-bağlama yeteneği Rotavirüs deneyleri

Rotavirus is the main etiological factor for infantile diarrhea. It is a double-stranded (ds) RNA virus and forms a genetically diverse population, known ...