Yazarlar Chantal Cros yararlı teknik destek için teşekkür etmek istiyorum. Bu araştırma gelen hibe tarafından finanse edildi "Komiserliği à l'Energie Atomique et aux enerji alternatifleri" (URANOs - programı enine de Toxicologie du CEA ve CPRR CEA-AREVA) ve ANR üzerinden (uranyum toksisite: biomineralization çok düzeyli yaklaşım «««işlem) kemik, ANR-16-CE34-0003. Bu eser de CNRS ve güzel Sophia Antipolis Üniversitesi tarafından desteklenmiştir.

1. Uranyl asetat çözüm hazırlanması
<ol><li>Uranyl asetat (UO2(OCOCH3)2, 2 H2O; 85 mg 2 mL 100 mM uranyl asetat çözeltisi hazırlamak için Ekle M 424 g.mol-1=) 5 mL plastik tüp için sağlam durumda.</li>
	<li>Plastik tüp 2 mL distile su ekleyin ve plastik bir tıpa ile uygun.</li>
	<li>Tüp katı toplam dağılmasına kadar şiddetle çalkalanır. Çözüm 24 h için buzdolabına koyun. Dikkat: Uranyl [U(VI)] manipülasyonu bazı kimyasal ve radyolojik tehlike sunar. Tüm örneklerini hazırlanan ve belirli laboratuarlarında özel ekipman ile karakterize. Tüm U VI içeren sıvılar ve özel olarak atanan atık kaplarda toplanan olmalıdır zehirli atık bertaraf. Kuru atık (pipets, tüpler, vb) 0.1 N HNO3 çözüm ile solubilize ve U(VI) kaldırmak yıkanmış.</li>
	<li>Bir elektrot ve pH-metre kullanarak çözüm pH doğrulayın. Not: Elektrot daha önce ticari tampon çözeltiler kullanarak ayarlanması (pH = 4 ve pH = 7).</li>
</ol>2. ham 264.7 hücre kültürü
<ol><li>
Bakım hücre.
	<ol>
<li>75 cm2 şişeler aşağıdaki büyüme orta ham 264.7 hücreler (ATCC, TIB-71) yetiştirmek: Dulbecco'nın modifiye kartal orta (DMEM) %5 Fetal sığır Serum ve antibiyotik ile desteklenmiş: 100 IU/mL penisilin, 100 µg/mL streptomisin. Kuluçka 37 ° c, % 5 CO2hücreleri korumak.</li>
		<li>Orta 2-3 günde değiştirin. Hücreleri % 85-90 birleşmesi olduğunuzda, mekanik bir hücre kazıyıcı (ATCC tarafından önerilen gibi) kullanarak kültür şişeye onları kaldırmak ve 1:6 oranında bölüp. Not: yalnızca hücreleri pasajlar 3 ile 10 arasındaki farklılaşma denemeleri için kullanılır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Deneyler için hücreleri hazırlanması
	<ol>
<li>Yukarıda açıklandığı gibi şişesi substrat hücrelerden çıkarmak ve steril 50 mL tüp aktarabilirsiniz. Hücreleri yukarı ve aşağı kümeleri kırmaya pipetting tarafından karıştırın. Bir hemasitometre ile Sayın. 75 cm2 şişe başına 35-40 milyon hücre bekliyoruz.</li>
		<li>Birim hücre süspansiyon her deneme için gerekli, aşağıdaki gibi hesaplar: Deneysel sayısı x 3 (triplicates) x 1 mL/iyi + 3-4 mL (pipetting zararları) koşulları. Not: Bu protokol için açıklanan tüm deneyleri için yoğunluğu tohum 5000 hücre/cm2' dir. Bu nedenle, bir 24-şey plaka orta 1 mL bir kuyu başına 10.000 hücre anlamına gelir, ve hücre süspansiyon böylece 10.000 hücre/mL yoğunluğudur.</li>
		<li>Gerekli hacmi 10.000 hücre/mL hücre süspansiyon hazırlamak ve hücreleri 24-şey kalıplara temel olarak belirler. Sitotoksisite deneyleri için normal büyüme aracı kullanın. Farklılaşma ve rezorpsiyonu deneyleri için en az gerekli orta (2 mM L-glutamin, 5 ile desteklenmiş αMEM) kullanım Alfa değiştiren % FBS ve GST-RANKL1750 ng/mL. Not: GST-RANKL şirket içinde üretilen protein herhangi bir ticari olarak mevcut RANKL sitokin tarafından değiştirilebilir. Yeni bir RANKL toplu işlemi ile çalışırken, 20 ila 150 ng/mL aralığında değişen RANKL konsantrasyon ile bir doz yanıt deney yaparak osteoclastogenesis inducing etkinliğini test etmek yararlı olabilir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Kültür orta 100 mM Uranyl asetat çözümde seyreltme
Not: Uranyl iyonu [U(VI)] kültür orta onun hücresel toksisite18,19,20,21değiştirebilir orta diğer bileşenleri ile birden fazla kompleksler oluşturur. Bu nedenle, uranyl içeren medya altercations atlama veya denge adımları kısaltmak hazırlanmalıdır.
<ol><li>Pozlama konsantrasyonları uranyl seçti ve kültür (her koşul nüsha gerçekleştirilir dikkate alarak) deney için gerekli ortam birimleri hesaplamak.</li>
	<li>Steril hücre kültüründen başlayarak test % 7.5 sodyum bikarbonat sulu çözüm ([HCO3-] = 893 mM), 100 mM HCO3- çözüm su hazırlamak ve buz üzerinde sakin ol.</li>
	<li>Damla damla 1 birim uranyl asetat 100 mM hisse senedi çözüm buz gibi 100 mM HCO3- çözüm, hafifçe sallayarak karıştırma tüp 9 birimleri için ekleyin. Bu işlem uranyl asetat hisse senedi çözüm seyreltik ([UO22 +] = 100 mM, pH 4) 10 mm ve pH 7'ye getir.</li>
	<li>Buz gibi 100 mM HCO3- çözüm denetimi hazırlamak için hizmet edecek 90 mM HCO3- (HCO3- konsantrasyonu 10 mM uranyl çözümünde eşit), ulaşmak için 9 birimlerine steril su 1 birim ekleme Orta.</li>
	<li>Denge için (RT) oda sıcaklığında 3 h için durmak hazırlanan çözümleri sağlar.</li>
	<li>Bu arada, temel pozlama orta hazırlamak: 2 mM L-glutamin ve % 5 ile αMEM FBS. Not: farklılaşma ve rezorpsiyonu deneyleri için temel pozlama orta GST-RANKL 50 ng/mL ekleyin.</li>
	<li>3 saat sonra uygun miktarda 10 mM uranyl çözüm konsantrasyonları çalışma istenilen uranyl elde etmek için pozlama ortamda damla damla seyreltik. Aynı anda kontrol orta pozlama orta en yoğun uranyl tedavi durumda kullanılan bikarbonat miktarının ekleyerek hazırlayın.</li>
	<li>Denge için RT, 3 h için durmak hazırlanan medya izin.</li>
	<li>Kuyulardan büyüme ortamını çıkarın ve denetimi ve uranyl içeren medya ile değiştirin.</li>
</ol>4. analiz ham 264.7 öncüleri canlılık U(VI) (ÇMT sitotoksik deneyleri) huzurunda
Dikkat: Her iki MTT ve DMSO cilt neden ve tahriş göz. Eldiven ve göz koruma onları ele alırken giymek. Atık ürünler özel olarak atanan atık konteyner içinde toplamak.
<ol><li>Uygun bir miktar 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromür (MTT) toz içinde 5 mg/mL, 10 x hisse senedi çözüm elde etmek için PBS çözülür. 0,22 µm filtrenin filtrasyon tarafından sterilize ve aliquots-20 ° C'de depolayın</li>
	<li>24-şey plakaları (deneysel koşul plaka başına başına 3 Kuyu) plaka hücreleri. Spektrofotometre bulunmasını içeren sorulardan plaka başına 3 boş wells rezerve etmek unutmayın.</li>
	<li>22-24 h önce hücreleri eklemek bildirmek için uranyum pozlama için 37 ° C'de hücreler kuluçkaya.</li>
	<li>Uranyl içeren medya madde 3 te açıklandığı şekilde hazırlayın.</li>
	<li>Uranyl ile içeren hücre numaralı seribaşı plakaları büyüme orta yerine medya. 24 saat kuluçkaya.</li>
	<li>1 x MTT çözüm gerekli hacmi aşağıdaki gibi hesaplar: (Deneysel koşullar + boşluk sayısı) x 3 (triplicates) x 0.4 mL/iyi + % 10 birim pipetting kayıplar için.</li>
	<li>1 x MTT çözüm gerekli hacmi 10 x hisse senedi MTT çözüm içinde kartal'ın en az gerekli orta (EMEM) fenol red olmadan sulandrarak hazırlayın. Not: başarılı bir Renkölçer tahlil için MTT ışıktan korunmalıdır. Bu arka plan sinyal sınırlamak için MTT EMEM içine DMEM ziyade sulandırmak için tavsiye edilir.</li>
	<li>Kuyulardan uranyl içeren medyayı çıkarın, PBS ile yıka ve 400 µL MTT çözüm (3 boş kuyular için boşluklar da dahil olmak üzere) her şey ekleyin. Karanlıkta 37 ° C'de 2,5 h kuluçkaya. Mikroskop altında koyu mor formazan kristalleri hücrelerin içinde oluşmuş doğrulayın.</li>
	<li>MTT çözüm atın ve dimetil sülfoksit iyi (DMSO) 220 µL ekleyin. Tabak gelen ışık onları korumak ve yavaşça formazan kristalleri çözülmeye 10 dakikadır kışkırtmak alüminyum folyo şal.</li>
	<li>Mikroplaka Spektrometre okuyucu 570, optik yoğunluk (OD) belirlemek için kullanın nm (formazan özel) ve 690 nm (arka plan). Her şey için olası belirsiz OD değer dalgalanma nedeniyle çizik veya bulanıklık22için ayarlamak için 570 nm OD dan 690 nm OD çıkarma.</li>
	<li>Her şey için boş düzeltilmiş OD önceki adımda elde OD dan boş demek OD çıkararak hesaplar. Demek OD değeri deneysel her koşul için belirleyin.</li>
	<li>Ayarla denetim durumu kötü OD ([UO22 +] = 0 mM) için % 100 canlılık ve hücre canlılığı diğer test uranyl konsantrasyonları için karşılık gelen yüzdesini hesaplamak. Bir doz-yanıt eğrisi çizmek. Sitotoksisite dizin 50 (CI50), uranyl konsantrasyonu % 50 hücre ölümüne 24 h maruz kaldıktan sonra lider olarak tanımlanan değerlendirin.</li>
</ol>5. analiz U(VI) huzurunda Osteoklast farklılaşma
<ol><li>
HAM 264.7 farklılaşma hücreleri uranyl ve tuzak varlığında (tartarat-dayanıklı asit fosfataz) boyama.
	<ol>
<li>Plaka ham 264.7 hücreleri deneysel koşul başına 3 Kuyu 24-şey tabakta. Yaklaşık 6 h, 37 ° C'de kuluçkaya hazırlamak ve uranyl içeren pozlama medya equilibrate vakti.</li>
		<li>Farklılaşma medya bölümünde 3 (GST-RANKL ortamına Ekle unutmayın) açıklandığı gibi istenen uranyl konsantrasyonları ile hazırlayın.</li>
		<li>Yavaşça uranyl içeren ile Wells temel orta yerine orta. Bu gün mediatörlerin farklılaşma günü 0 olarak kabul edilir.</li>
		<li>Orta günde 2 veya 3 mediatörlerin farklılaşma 5.1.2 ve 5.1.3 adımları yineleyerek değiştirin. Multinucleated Osteoklastlar 3 ve 4 gün arasında görünmelidir.</li>
		<li>TUZAK üreticinin yönergeleri izleyerek ticari olarak mevcut lökosit asit fosfataz kiti ile boyama gerçekleştirmek. Not: tartarat-asit fosfataz 5, tartarat dayanıklı (ACP5) olarak da adlandırılan dayanıklı asit fosfataz (tuzak) son derece olgun Osteoklastlar dile getirdi ve yoğun Osteoklast farklılaşma avans olarak kullanılan. Bu nedenle, tuzak boyama Osteoklastlar görselleştirmek için gerçekleştirilir. Deneysel koşullar ve osteoclastogenesis hızına bağlı olarak, 4 gün veya gün 5 farklılaşma süreci üzerinde yapılabilir.</li>
		<li>TUZAK lekeli wells (onlar 3 veya 4 hafta kadar bu koşullarda muhafaza edilebilir) daha fazla çözümleme için 4 ° C'de PBS içinde tutun.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Osteoklast boyutu/Morfoloji analizi.
	<ol>
<li>Her şey bütün yüzeyi görüntüsünü elde etmek. Resmin çözünürlüğünü hücre çekirdeği ayırt etmek için yeterli olmalıdır. TUZAK-pozitif hücreler ile 3 veya daha fazla hücre çekirdeği, Osteoklastlar düşünün.</li>
		<li>ImageJ yazılımında bir şey görüntüsünü açın: "Dosya" → "Aç".</li>
		<li>Görüntünün sol üst köşesinde ölçek birimlerini doğrulayın. Göreli miktar için herhangi bir birimi kullanılabilir. Osteoklast boyutu mutlak değerini gerekli ise, µm için ölçek birimlerini dönüştürün: "Resim" → "özellikleri". Daha sonra tüm resimlere uygulanan yeni ölçek birimler için açılan pencerede "küresel" kutuyu işaretleyin. Not: mikroskop resim alma için kullanıldıysa, düşsel bilgisayar yazılımı her amaç için µm piksel boyutunda gösterilir.</li>
		<li>Çözümlenmesi için ölçüm parametreleri belirtin: "→"ölçümleri ayarla"analiz". Ölçümler ayarla penceresinde "Alan" ve "Etiketi göster" kutuları işaretleyin ve diğerleri uncheck kutuları.</li>
		<li>Yatırım Getirisi (faiz bölgesi) Yöneticisi'ni açın: "→"Araçlar"analiz" → "ROI Yöneticisi".</li>
		<li>Ana penceresinde, dikdörtgen seçim aracını seçin. Yaklaşık 1000 x 1000 µm bir sektör anahat için görüntünün içinde her yerde kullanın. Bu seçim şimdi hangi Osteoklast boyutu analiz edilecek ilk bölge tanımlar.</li>
		<li>ROI Yöneticisi penceresinde, yörenin ilgi ROI Yöneticisi'ne ekleyin ve "Daha fazla" → "Kaydet" tıklayarak kaydetmek için "Ekle" düğmesini tıklayın. Kaydedilmiş ROI şimdi ROI Yöneticisi her zaman "Daha fazla" → "Aç" ı tıklatarak yeniden yüklenebilir.</li>
		<li>Aygıtlarından 5.2.5 - Osteoklast boyut analizi için 4 ek bölge tanımlamak için 5.2.6 (şekil 2A ve 2D). Not: Tüm görüntüleri boyutlarda Osteoklast çözümlemek için tanımlanmış bölgeleri kullanılacaktır.</li>
		<li>Analiz edilecek 5 bölgelerinden biri bir kopyasını oluşturun: Bu ROI (karşılık gelen seçimi ana görüntü görünür) ROI Yöneticisi ana açmadı → seçimi → "Yinelenen" içinde sağ tıklatın. Bu yinelenen daha ayrıntılı bir çözümleme için kullanın.</li>
		<li>ROI Yöneticisi penceresinde kutuları "Göstermek Al" l ve "Etiketler" kontrol.</li>
		<li>Ana pencerede bir seçimdeki Osteoklastlar anahatlarını el ile belirlemeniz çokgen seçim aracını seçin. Bu anahat ROI Yöneticisi için "Ekle" ROI Yöneticisi penceresinde tıklatarak ekleyin. Benzer şekilde tamamen seçilen bölge içinde yalan tüm Osteoklastlar için devam (şekil 2B ve 2E).</li>
		<li>ROI Yöneticisi penceresinde tüm anahatlar seçin ve "Ölçü" tıklayarak onların yüzey ölçmek. Yeni bir pencere (sonuçları penceresi, şekil 2C ve 2F) göründüğü ölçümleri bir e-tabloya aktarmak. Not: Bu noktada, analiz Osteoklastlar anahatları ile bölge bağımsız bir resim olarak kaydedilmiş olabilir: "Dosya" → "Farklı Kaydet" tercih biçimi.</li>
		<li>5.2.8 - 5.2.12'den analiz geçerli görüntünün kalan bölgeler için yineleyin. Sonra tüm diğer resimler için tüm prosedürü tekrarlayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Osteoklast numara analizi ImageJ yazılımı ile. Not: Osteoklast dağıtım iyi nadiren homojen olduğu gibi bütün iyi yerine birkaç seçilen bölgeler üzerinde sayım gerçekleştirin. Osteoklastlar formu ve boyut, hücre yöntemi sayma Hayır otomatik olarak heterojen verilen uygulanabilir 's.<ol>
<li>Bütün iyi görüntü ImageJ yazılım (çözümlenmek kullanım imge--dan önceki alt bölümde) açın.</li>
		<li>Hücre sayaç penceresini açın: "Eklentiler" → "analiz" → "Hücre Counter". Tıklayın "Başlat" ve "tip 1" onay kutusunu (ya da her türlü sen tercih etmek sayı yazın). "Numarasını göster" onay kutusunun seçili olduğundan ve "Silme modu" kutusunun işaretli olmadığından emin olun.</li>
		<li>Resmin üzerine tıklayın bir Osteoklast: tıklandığında nerede renkli nokta ve bir sayı görünür. Benzer şekilde tüm Osteoklastlar için devam edin. Veri işaretleyicilerini düzenli olarak yanında tıkırtı üstünde "Kaydetmek işaretleri" hücre sayaç penceresinde Kaydet Not: son nokta sayımdan kaldırılacak ise, "Delete" hücre sayaç penceresinde tıklatın. Kaldırmak için birden fazla nokta ise, "Silme modu" kutuyu işaretleyin ve tüm geçersiz yanında tıkırtı üstünde onları gösteriyor. O zaman sayımı devam etmek için "Silme modu" kutunun işaretini kaldırın.</li>
		<li>Hücre sayaç penceresinde sonuçları tıklayarak sayım sonucu görüntüler. Son sayım sonuçları elektronik tabloya aktarmak.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Osteoklast işlevi U(VI) huzurunda analizi
<ol><li>
Çukur rezorpsiyonu tahlil.
	<ol>
<li>Plaka ham 264.7 hücreleri Osteoklastlar tarafından resorbed bir sentetik inorganik osteomimetic yüzey sağlar bir 24-şey osteo tahlil plaka üzerinde. Not: hücreleri biomimetic yüzeye eklemek amacıyla, bu kez onları farklılaşma orta eklemeden önce gün plaka daha iyi olur.</li>
		<li>HAM 246.7 hücre Osteoklastlar 5 (Adım 5.1.2 - 5.1.4) bölümünde açıklandığı gibi ayırt etmek</li>
		<li>Günü osteoclastogenesis 5, % 10 çamaşır suyu Çözümle uranyl içeren orta değiştirerek kemik mimetic yüzeyden Osteoklastlar kaldırın. Oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya. Wells iki kez deiyonize su ile yıkayın ve onlara kuruması.</li>
		<li>Bir % 1 Alizarin Red S sodyum tuz solüsyonu kalsiyum tuzları resorbed olmayan alanlarda leke wells ekleyin. Sonra 10-15 s, kuluçka alizarin çözümü kaldırmak ve yavaşça wells 3 - 4 kez su ile yıkayın. Kuyuları kurumasına izin verin. Not: yukarıda açıklanan boyama yordamı ardışık analiz kolaylaştırmak için resorbed ve resorbed olmayan alanları arasındaki kontrastı artırmak için tasarlanmıştır. Boyama önce kuyu tamamen kuru değilseniz, kalan kemik mimetic yüzey bölümlerini yanlışlıkla kaldırılmış olabilir çünkü bu yordamı dikkatle yapılmalıdır. Alizarin çözüm wells çok uzun süre bırakılırsa, Ayrıca, non-spesifik kalıcı bir boyama-ecek gözükmek. Bu bölümde anlatılan test uranyum etkisi mediatörlerin farklılaşma ve fonksiyonu ilişkili olduğu unutulmamalıdır. Uranyum etkisi rezorpsiyonu Osteoklast oluşumu bağımsız olarak çalışmaya, ham 264.7 hücreleri ile uranyl içeren tedavi edilebilir orta boy olgun Osteoklastlar (gününde 4 ya da 5 farklılaşma süreci) sadece oluşmuş bir kez 24 saat 23.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Çukur rezorpsiyonu analizi.
	<ol>
<li>Her şey osteo tahlil plaka tüm yüzeyi görüntüsünü elde etmek. Not: Görüntü edinme yöntemleri değişebilir ancak Çoğalt deneyler tutarlı olmalıdır. Onlar sabit bir kamera, yüksek çözünürlüklü bir tarama veya bir otomatik yüksek işlem hacmi mikroskobu ile yapılan bir mozaik görüntü makro amacı ile çekilen bir resim içerebilir.</li>
		<li>5.2.2-5.2.4'ten önceki bölümdeki adımları yineleyerek çözümlemesi'ni başlatmak.</li>
		<li>RGB görüntüyü gri tonlama 8 bit biçimine dönüştürme: "Resim" → "Yazın" → "8 bit".</li>
		<li>Ana penceresinde, oval seçim aracını seçin. Rezorpsiyonu için analiz edilecek şey tüm yüzeyini özetleyen bir daire çizmek için kullanın.</li>
		<li>Bu yeni yatırım Getirisi olduğu gibi adım 5.2.6 kaydedin.</li>
		<li>Eşik seçimi kolaylaştırmak için tüm özellikleri dışında tanımlanmış ROI temizleyin: "Düzenle" → "Dış açık". Not: Bu noktada, bu kez bir kaç resim kopyalarının yapmak daha iyi olur: ROI seçilen bölge → sağ tıklayın görüntü → "Yinelenen" dışında tıklatarak seçimini kaldırın. Bu eylem bir sonraki adımda seçilen eşik tatmin edici ise yukarıda açıklanan resim tedavi tekrarı önlemek yardımcı olur.</li>
		<li>"Resim" → "Ayarlama" → "eşik" seçin. Eşik penceresinde, uygun bir eşik seçmek için kaydırma çubuğunu kullanın. Tüm resorbed alanları (beyaz) eşiğin altına olmalıdır ve sigara-, (kırmızı) resorbed. Eşik seçimi sonuçlandırmak için "Uygula" eşik penceresinde tıklatın.</li>
		<li>Son ikili görüntü kaydetmek: "Dosya" → "Farklı Kaydet" → biçimini seçtiğiniz.</li>
		<li>Faiz bölgede alınacak ölçüler tanımlayın: "→"ölçümleri ayarla"analiz". Ölçümleri ayarla penceresinde "Alanı", "Alan kesir" ve "Eşik sınırı" kutuları kontrol edin ve diğerleri işaretini kaldırın.</li>
		<li>"Resorbed" alan sonuçları penceresinde doğrudan kısmını elde etmek için ("→"Ters"Edit") ikili görüntü tersine çevirin. Ana yatırım Getirisi üzerinde son ikili resim seçili olduğundan emin olun (aksi takdirde resorbed alan kesir hesaplanabilir dayalı tüm görüntü penceresinin yüzeyinde). Ölçü resorbed alan kesir yanında ikisinden biri "Ölçü" ROI Yöneticisi penceresinde tıkırtı üstünde ya da "→"Tedbir"analiz". Sonucu kaydedin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Keith, S., Faroon, O., Roney, N., Scinicariello, F., Wilbur, S., Ingerman, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicological+profile+for+uranium.">Toxicological profile for uranium.</a> Agency for Toxic Substances and Disease Registry. , (2013).</li><li>Ballou, J. E., Gies, R. A., Case, A. C., Haggard, D. L., Buschbom, R. L., Ryan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deposition+and+early+disposition+of+inhaled+233UO2(NO3)2+and+232UO2(NO3)2+in+the+rat.">Deposition and early disposition of inhaled 233UO2(NO3)2 and 232UO2(NO3)2 in the rat.</a> Health Phys. 51 (6), 755-771 (1986).</li><li>Kathren, R. L., McInroy, J. F., Moore, R. H., Dietert, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uranium+in+the+tissues+of+an+occupationally+exposed+individual.">Uranium in the tissues of an occupationally exposed individual.</a> Health Phys. 57 (1), 17-21 (1989).</li><li>Kurttio, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Renal+effects+of+uranium+in+drinking+water.">Renal effects of uranium in drinking water.</a> Environ.Health Perspect. 110 (4), 337-342 (2002).</li><li>Leggett, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basis+for+the+ICRP's+age-specific+biokinetic+model+for+uranium.">Basis for the ICRP's age-specific biokinetic model for uranium.</a> Health Phys. 67 (6), 589-610 (1994).</li><li>Vidaud, C., Bourgeois, D., Meyer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+as+target+organ+for+metals:+the+case+of+f-elements.">Bone as target organ for metals: the case of f-elements.</a> Chem. Res. Toxicol. 25 (6), 1161-1175 (2012).</li><li>Arzuaga, X., Gehlhaus, M., Strong, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modes+of+action+associated+with+uranium+induced+adverse+effects+in+bone+function+and+development.">Modes of action associated with uranium induced adverse effects in bone function and development.</a> Toxicol. Lett. 236 (2), 123-130 (2015).</li><li>Ikeda, K., Takeshita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+osteoclast+differentiation+and+function+in+skeletal+homeostasis.">The role of osteoclast differentiation and function in skeletal homeostasis.</a> J. Biochem. 159 (1), 1-8 (2016).</li><li>Teiltelbaum, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+osteoclast+and+its+unique+cytoskeleton.">The osteoclast and its unique cytoskeleton.</a> Ann N Y Acad Sci. 1240, 14-17 (2011).</li><li>Nesbitt, S. A., Horton, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trafficking+of+matrix+collagens+through+bone-resorbing+osteoclasts.">Trafficking of matrix collagens through bone-resorbing osteoclasts.</a> Science. 276 (5310), 266-269 (1997).</li><li>Salo, J., Lehenkari, P., Mulari, M., Metsikko, K., Vaananen, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+osteoclast+bone+resorption+products+by+transcytosis.">Removal of osteoclast bone resorption products by transcytosis.</a> Science. 276 (5310), 270-273 (1997).</li><li>Pierrefite-Carle, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+natural+uranium+on+the+UMR-106+osteoblastic+cell+line:+impairment+of+the+autophagic+process+as+an+underlying+mechanism+of+uranium+toxicity.">Effect of natural uranium on the UMR-106 osteoblastic cell line: impairment of the autophagic process as an underlying mechanism of uranium toxicity.</a> Arch. Toxicol. 91 (4), 1903-1914 (2017).</li><li>Ubios, A. M., Guglielmotti, M. B., Steimetz, T., Cabrini, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uranium+inhibits+bone+formation+in+physiologic+alveolar+bone+modeling+and+remodeling.">Uranium inhibits bone formation in physiologic alveolar bone modeling and remodeling.</a> Environ. Res. 54 (1), 17-23 (1991).</li><li>Bozal, C. B., Martinez, A. B., Cabrini, R. L., Ubios, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+ethane-1-+hydroxy-1,1-bisphosphonate+(EHBP)+on+endochondral+ossification+lesions+induced+by+a+lethal+oral+dose+of+uranyl+nitrate.">Effect of ethane-1- hydroxy-1,1-bisphosphonate (EHBP) on endochondral ossification lesions induced by a lethal oral dose of uranyl nitrate.</a> Arch. Toxicol. 79 (8), 475-481 (2005).</li><li>Kurttio, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+as+a+possible+target+of+chemical+toxicity+of+natural+uranium+in+drinking+water.">Bone as a possible target of chemical toxicity of natural uranium in drinking water.</a> Environ. Health Perspect. 113 (1), 68-72 (2005).</li><li>Collin-Osdoby, P., Osdoby, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RANKL-mediated+osteoclast+formation+from+murine+RAW+264.7+cells.">RANKL-mediated osteoclast formation from murine RAW 264.7 cells.</a> Methods Mol. Biol. 816, 187-202 (2012).</li><li>Beranger, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+binding+of+poly(ADP-Ribose)+polymerase-1+and+JunD/Fra2+accounts+for+RANKL-induced+Tcirg1+gene+expression+during+osteoclastogenesis.">Differential binding of poly(ADP-Ribose) polymerase-1 and JunD/Fra2 accounts for RANKL-induced Tcirg1 gene expression during osteoclastogenesis.</a> J. Bone Miner. Res. 22 (7), 975-983 (2007).</li><li>Mirto, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+uranium(VI)+speciation+for+the+evaluation+of+in+vitro+uranium+cytotoxicity+on+LLC-PK1+cells.">Influence of uranium(VI) speciation for the evaluation of in vitro uranium cytotoxicity on LLC-PK1 cells.</a> Hum. Exp. Toxicol. 18 (3), 180-187 (1999).</li><li>Carri&#232;re, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+uranium+speciation+on+normal+rat+kidney+(NRK-52E)+proximal+cell+cytotoxicity.">Influence of uranium speciation on normal rat kidney (NRK-52E) proximal cell cytotoxicity.</a> Chem. Res. Toxicol. 17 (3), 446-452 (2004).</li><li>Milgram, S., Carri&#232;re, M., Malaval, L., Gouget, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+accumulation+and+distribution+of+uranium+and+lead+in+osteoblastic+cells+as+a+function+of+their+speciation.">Cellular accumulation and distribution of uranium and lead in osteoblastic cells as a function of their speciation.</a> Toxicology. 252 (1-3), 26-32 (2008).</li><li>Milgram, S., Carri&#232;re, M., Thiebault, C., Malaval, L., Gouget, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxic+and+phenotypic+effects+of+uranium+and+lead+on+osteoblastic+cells+are+highly+dependent+on+metal+speciation.">Cytotoxic and phenotypic effects of uranium and lead on osteoblastic cells are highly dependent on metal speciation.</a> Toxicology. 250 (1), 62-69 (2008).</li><li>Studzinski, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cell Growth, Differentiation and Senescence A Practical Approach. , (1999).</li><li>Gritsaenko, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+uranium+impairs+the+differentiation+and+the+resorbing+function+of+osteoclasts.">Natural uranium impairs the differentiation and the resorbing function of osteoclasts.</a> Biochim Biophys Acta. 1861 (4), 715-726 (2017).</li><li>Motiur Rahman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation-coupled+osteoclast+differentiation+by+RANKL:+Cell+density+as+a+determinant+of+osteoclast+formation.">Proliferation-coupled osteoclast differentiation by RANKL: Cell density as a determinant of osteoclast formation.</a> Bone. 81, 392-399 (2015).</li></ol>

Yazarlar ifşa yoktur

Bildiğimiz gibi doğal uranyum etkisi kemik hücreleri resorbing çalışmaya yönelik ayrıntılı yönerge açıklanan ilk kez bu. Bu yaklaşım uranyum etkisi kemik fizyolojisi üzerinde daha iyi bir anlayış elde etmek için yararlı olacağını ve uranyum şelatörlerin tarama için ilginç bir yeni bir araç sağlayabilir. Ayrıca, burada açıklanan protokol diğer ağır metaller osteoclatogenesis üzerinde etkisini incelemek için uygulanan olabilir inanıyoruz.
O uranyl complexed ...

Uranyum doğal olarak meydana gelen radyoaktif element toprak, hava ve su mevcut olduğunu; Bu nedenle, insan ve hayvanlar doğal uranyum besinlerinde maruz kalır. Doğal kaynaklara ek olarak, uranyum antropojenik aktiviteler hangi ortamda onun bereket artar kaynaklanır. Uranyum kimyasal ve radyolojik tehlike teşkil etmektedir. (Bu bir izotopik karışımı içeren %99.27 238U, %0,72 235U ve %0,006 234U) doğal uranyum düşük özel etkinlik (25.103 Bq.g-1) olduğundan, ancak, sağlık üzerinde etkileri atfedilir onun kimyasal toksisitesi.
Ne olursa olsun onun giriş rota (inhalasyon, yenmesi veya dermal pozlama), çoğu uranyum, vücut girerek dışkı ile atılır ve yalnızca küçük bir bölümü sistemik dolaşım ulaşır. Uranyum kan yaklaşık % 67 sırayla böbrekler tarafından süzülür ve vücut idrar 24 h1içinde bırakır. Geri kalan, çoğunlukla böbrek ve kemikler, iki ana hedef organlar uranyum toksisite2,3,4yatırılır. İskelet uranyum uzun süreli saklama2,3,4,5,6birincil site belirlenmiştir çünkü çeşitli çalışmalar keşfetmek için yapılmıştır kemik Fizyoloji7uranyum etkisi.
Ömrü sürekli remodeled mineralized doku kemiktir. Kemik remodeling özel hücre tipleri üzerinde bağlıdır ve çoğunlukla iki aşamadan oluşmaktadır karmaşık bir süreç olduğunu: rezorpsiyonu önceden varolan eski Matrix Osteoklastlar tarafından takip de novo kemik İnşaat tarafından dokusunu tarafından. Osteoklastlar nerede onlar8kemik eklemek rezorpsiyonu sitelere göç öncül hücreleri hematopoetik kökenli füzyonu kaynaklanan büyük multinuclear hücrelerdir. Kendi eki aynı anda onların sitoiskeleti9kapsamlı bir yeniden yapılanma ile oluşur. Bu yeniden yapılanma içine Osteoklast salgılar proton, hidroksiapatit ve proteaz bozulması dahil dağılmasına yol açan kemik yüzeyi arasındaki hücre izole bir bölme kurulması için gereklidir Organik matris. Ortaya çıkan bozulma ürünleri endocytosed, membran alanı kemik yüzeyine ters hücreye aracılığıyla taşınan ve salgılanan, transcytosis10,11adı verilen bir işlem.
Vivo ve in vitro çalışmalar sonuçları uranyum kemik oluşumunu engeller ve numarayı ve etkinlik dokusunu7,12değiştirir gösterir. Buna ek olarak, kemik rezorpsiyonu ve Osteoklastlar uranyum etkileri kötü araştırılmalıdır. Çeşitli in vivo çalışmalarda kemik rezorpsiyonu bir donanım, fare ya da sıçan13,14uranyl nitrat yönetimi sonra bildirdin. Ayrıca, bir epidemiyolojik araştırma uranyum alımı içme suyu ile artış erkekler15kemik rezorpsiyonu işaretleyicisinde serum düzeyinde bir artış ile ilişkili olma eğilimi önerdi. Birlikte ele alındığında, bu bulgular kemik içinde biriken uranyum kemik rezorpsiyonu teşvik verebilecek sonuca yol açtı. Ancak, hücresel mekanizmaları uranyum bu potansiyel etkisi içinde yer alan bir açık soru kalır. Bu nedenle, uranyum kemik hücreleri resorbing davranışı üzerinde etkisini incelemeye karar verdik.
Burada, biz biz kurduk Protokolü tarif karakterize ve doğal uranyum etkileri öncesi Osteoklastlar canlılığı, Osteoklastlar farklılaşma ve resorptive etkinliği ölçmek için. Hangi kolayca ne zaman 4 veya 5 gün boyunca sitokin RANKL huzurunda kültürlü Osteoklastlar içine ayırt edebilir ve hangi klasik incelemek için kullanılır ham 264.7 fare dönüştürülmüş makrofaj hücre satırıyla, burada açıklanan deneyler yapmış Osteoklast16farklılaşma ve işlev. Geliştirilen yordamlar güvenilir, vermek son derece tekrarlanabilir sonuçlar ve are için birincil Osteoklastlar tam olarak uygulanabilir. Tüm bu nedenlerden dolayı bu metodoloji moleküler mekanizmaları kemik uranyum toksisite dahil daha iyi anlaşılmasını almak için yararlı olduğunu düşünüyoruz. Ayrıca, bu yaklaşım yeni uranyum şelat ajanlar tanımlamak için bir tarama aracı olarak adapte olabileceğini düşünüyorum.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE12-604F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-MEM</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE12-169F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMEM without phenol red</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-668E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water for cell culture</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-724F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;L-Glutamine solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution 0.4%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone fetal bovine serum</td>
			<td>GE Life Sciences</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7.5% sodium bicarbonate aqueous solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid Phosphatase, Lekocyte (TRAP) kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>387A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT) powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alizarin Red S sodium salt, 1% w/v aq. sol.</td>
			<td>Alfa Aeros</td>
			<td>42746</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osteoassay bone resorption plates, 24 well plates</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>3987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiwell 24 well plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flask 75 cm2</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene Conical Tubes 50 ml</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scrapers 30 cm</td>
			<td>TPP</td>
			<td>90003</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods for analyzing the impacts of natural uranium on in vitro osteoclastogenesis

Uranyum kemik fizyolojisi ile müdahale için gösterilmiştir ve de bu metal kemik içinde birikir kuruldu. Ancak, az kemik hücreleri davranışını doğal uranyum etkisi hakkında bilinir. Özellikle, uranyum Osteoklastlar, kemik matrisi rezorpsiyonu için sorumlu hücreler üzerinde etkisini belgelenmemiştir. Bu sorunu araştırmaya, uranyl asetat bir kaynak doğal uranyum ve fare ham 264.7 hücre satırı Osteoklast öncüleri bir model olarak kullanarak yeni bir protokol kurduk. Burada, uranyum sitotoksisite Osteoklast öncüleri üzerinde test etmek ve etkisini osteoclastogenesis ve olgun Osteoklastlar resorbing işlevini değerlendirmek için gerekli bütün testleri ayrıntılı. Koşullar biz geliştirdik, özellikle uranyl içeren kültür medya hazırlanması ve ham 264.7 tohum hücreleri güvenilir ve yüksek üreme sonuçları elde etmek için izin vermek. Ayrıca, Osteoklastlar boyutunu veya resorbed matris yüzdesi gibi çeşitli parametrelerin analiz kolaylaştırmak için yazılım araçları kullanımı optimize.

Tartarat dayanıklı asit fosfataz boyama Osteoklastlar 3 veya daha fazla hücre çekirdeği olan büyük mor hücreler olarak görselleştirmek için kullanıldı. Osteoklastlar temsilcisi görüntülerini RANKL huzurunda kültürlü ham 264.7 hücrelerden elde edilen ve uranyl iyonları şekil 1' de gösterilmiştir. Osteoklastlar uranyum yanıt boyutunu ve sayısını değişiklikleri bütün Wells bileşik görüntüler ve büyütülmüş resimler kolayca...

Watch this Scientific Journal Video about Methods for Analyzing the Impacts of Natural Uranium on In Vitro Osteoclastogenesis at JoVE.com

Methods for Analyzing the Impacts of Natural Uranium on In Vitro Osteoclastogenesis

Uranyum kemik metabolizması etkilediği bilinmektedir. Burada, doğal uranyum pozlama etkisini canlılığı, farklılaşma ve Osteoklastlar, kemik rezorpsiyonu sorumlu hücrelerin fonksiyonlarını araştıran amaçlı bir iletişim kuralı mevcut.

Vitro Osteoclastogenesis üzerinde doğal uranyum etkileri analiz yöntemleri

Uranium has been shown to interfere with bone physiology and it is well established that this metal accumulates in bone. However, little is known about ...

methods-for-analyzing-impacts-natural-uranium-on-vitro

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Methods for Analyzing the Impacts of Natural Uranium on In Vitro Osteoclastogenesis

8.1K Görüntüleme.  Université Nice Sophia-Antipolis. Uranyum kemik metabolizması etkilediği bilinmektedir. Burada, doğal uranyum pozlama etkisini canlılığı, farklılaşma ve Osteoklastlar, kemik rezorpsiyonu sorumlu hücrelerin fonksiyonlarını araştıran amaçlı bir iletişim kuralı mevcut.

Video: Methods for Analyzing the Impacts of Natural Uranium on In Vitro Osteoclastogenesis

Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays

Myelination is a complex process that involves both neurons and the myelin forming glial cells, oligodendrocytes in the central nervous system (CNS) and Schwann cells in the peripheral nervous system (PNS). We use an in vitro myelination assay, an established model for studying CNS myelination in vitro. To do this, oligodendrocyte precursor cells (OPCs) are added to the purified primary rodent dorsal root ganglion (DRG) neurons to form myelinating co-cultures. In order to specifically interrogate the roles that particular proteins expressed by oligodendrocytes exert upon myelination we have developed protocols that selectively transduce OPCs using the lentivirus overexpressing wild type, constitutively active or dominant negative proteins before being seeded onto the DRG neurons. This allows us to specifically interrogate the roles of these oligodendroglial proteins in regulating myelination. The protocols can also be applied in the study of other cell types, thus providing an approach that allows selective manipulation of proteins expressed by a desired cell type, such as oligodendrocytes for the targeted study of signaling and compensation mechanisms. In conclusion, combining the in vitro myelination assay with lentiviral infected OPCs provides a strategic tool for the analysis of molecular mechanisms involved in myelination.

Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays

Here we present protocols that offer a flexible and strategic foundation for virally manipulating oligodendrocyte precursor cells to overexpress proteins of interest in order to specifically interrogate their role in oligodendrocytes via the in vitro model of central nervous system myelination.

Üretim ve seçici transduce İlköğretim Oligodendrosit Öncü Hücreler için Lentivirüste kullanımı için<em&gt; İn Vitro</em&gt; Myelinasyon Tahliller

Myelination is a complex process that involves both neurons and the myelin forming glial cells, oligodendrocytes in the central nervous system (CNS) and ...

Gelişim Biyolojisi

Alginate Encapsulation of Pluripotent Stem Cells Using a Co-axial Nozzle

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening. However, the development of a mass culture system would be required for using PS cells in these applications. Suspension culture is one promising culture method for the mass production of PS cells, although some issues such as controlling aggregation and limiting shear stress from the culture medium are still unsolved. In order to solve these problems, we developed a method of calcium alginate (Alg-Ca) encapsulation using a co-axial nozzle. This method can control the size of the capsules easily by co-flowing N2 gas. The controllable capsule diameter must be larger than 500 &#181;m because too high a flow rate of N2 gas causes the breakdown of droplets and thus heterogeneous-sized capsules. Moreover, a low concentration of Alg-Na and CaCl2 causes non-spherical capsules. Although an Alg-Ca capsule without a coating of Alg-PLL easily dissolves enabling the collection of cells, they can also potentially leak out from capsules lacking an Alg-PLL coating. Indeed, an alginate-PLL coating can prevent cellular leakage but is also hard to break. This technology can be used to research the stem cell niche as well as the mass production of PS cells because encapsulation can modify the micro-environment surrounding cells including the extracellular matrix and the concentration of secreted factors.

We established a method of encapsulating pluripotent stem cells (PS cells) into alginate hydrogel capsules using a co-axial nozzle. This prevents cells from aggregating excessively and limits the shear stress experienced by cells in suspension culture. The technique is applicable to the mass production of PS cells as well as research on stem cell niche.

Bir Koaksiyel Memesini kullanma Pluripotent Kök Hücre Aljinat Encapsulation

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening.  However, the ...

Protocols for Analyzing the Role of Paneth Cells in Regenerating the Murine Intestine using Conditional Cre-lox Mouse Models

The epithelial surface of the mammalian intestine is a dynamic tissue that renews every 3 - 7 days. Understanding this renewal process identified a population of rapidly cycling intestinal stem cells (ISCs) characterized by their expression of the Lgr5 gene. These are supported by a quiescent stem cell population, marked by Bmi-1 expression, capable of replacing them in the event of injury. Investigating the interactions between these populations is crucial to understanding their roles in disease and cancer. The ISCs exist within crypts on the intestinal surface, these niches support the ISC in replenishing the epithelia. The interaction between active and quiescent ISCs likely involves other differentiated cells within the niche, as it has previously been demonstrated that the &#8216;&#8216;stemness&#8217;&#8217; of the Lgr5 ISC is closely tied to the presence of their neighboring Paneth cells. Using conditional cre-lox mouse models we tested the effect of deleting the majority of active ISCs in the presence or absence of the Paneth cells. Here we describe the techniques and analysis undertaken to characterize the intestine and demonstrate that the Paneth cells play a crucial role within the ISC niche in aiding recovery following substantial insult.

Protocols for Analyzing the Role of Paneth Cells in Regenerating the Murine Intestine using Conditional Cre-lox Mouse Models

Intestinal epithelial stem cells (ISCs) are intermingled with Paneth cells. These cells are differentiated progeny of the ISC, which support the ISCs and provide antibacterial protection. Here we demonstrate how we used transgenic conditional mouse models to establish that Paneth cells play a crucial role in maintaining the intestinal epithelia.

Şartlı kullanarak Fare İnce Bağırsağında Yenileyici içinde Paneth Hücrelerinin Rolü analiz için protokoller<em&gt; Cre-lox</em&gt; Fare Modelleri

The epithelial surface of the mammalian intestine is a dynamic tissue that renews every 3 - 7 days. Understanding this renewal process identified a ...

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize mammalian adaptive immunity. Drosophila and mammalian hematopoiesis occur in spatially and temporally distinct phases to produce several blood cell lineages. Both systems maintain reservoirs of blood cell progenitors with which to expand or replace mature lineages. The hematopoietic system allows Drosophila and mammals to respond to and to adapt to immune challenges. Importantly, the transcriptional regulators and signaling pathways that control the generation, maintenance, and function of the hematopoietic system are conserved from flies to mammals. These similarities allow Drosophila to be used to genetically model hematopoietic development and disease.
Here we detail assays to examine the hematopoietic system of Drosophila larvae. In particular, we outline methods to measure blood cell numbers and concentration, visualize a specific mature lineage in vivo, and perform immunohistochemistry on blood cells in circulation and in the hematopoietic organ. These assays can reveal changes in gene expression and cellular processes including signaling, survival, proliferation, and differentiation and can be used to investigate a variety of questions concerning hematopoiesis. Combined with the genetic tools available in Drosophila, these assays can be used to evaluate the hematopoietic system upon defined genetic alterations. While not specifically outlined here, these assays can also be used to examine the effect of environmental alterations, such as infection or diet, on the hematopoietic system.

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Drosophila and mammalian hematopoietic systems share many common features, making Drosophila an attractive genetic model to study hematopoiesis. Here we demonstrate dissection and mounting of the major larval hematopoietic organ for immunohistochemistry. We also describe methods to assay various larval hematopoietic compartments including circulating hemocytes and sessile crystal cells.

Yöntemler Lenf Bezi ve Hemocytes içinde incelemek için<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize ...

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

Changes in intracellular pH (pHi) play important roles in the regulation of many cellular functions, including metabolism, proliferation, and differentiation. Typically, pHi dynamics are determined in cultured cells, which are amenable to measuring and experimentally manipulating pHi. However, the recent development of new tools and methodologies has made it possible to study pHi dynamics within intact, live tissue. For Drosophila research, one important development was the generation of a transgenic line carrying a pHi biosensor, mCherry::pHluorin. Here, we describe a protocol that we routinely use for imaging live Drosophila ovarioles to measure pHi in the epithelial follicle stem cell (FSC) lineage in mCherry::pHluorin transgenic wild type lines; however, the methods described here can be easily adapted for other tissues, including the wing discs and eye epithelium. We describe techniques for expressing mCherry::pHluorin in the FSC lineage, maintaining ovarian tissue during live imaging, and acquiring and analyzing images to obtain pHi values.

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

We provide a protocol for imaging intracellular pH of an epithelial stem cell lineage in live Drosophila ovarian tissue. We describe methods to generate transgenic flies expressing a pH biosensor, mCherry::pHluorin, image the biosensor using quantitative fluorescence imaging, generate standard curves, and convert fluorescence intensity values to pH values.

Canlı Drosophila yumurtalık dokusu içinde folikül kök hücre soyundan Imaging hücre içi pH için yöntemleri

Changes in intracellular pH (pHi) play important roles in the regulation of many cellular functions, including metabolism, proliferation, and ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain and protect cellular identities. The conversion of germ cells into specific neurons in the nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a powerful tool for performing genetic screens in order to dissect regulatory pathways that safeguard established cell identities. Reprogramming of germ cells to a specific type of neurons termed ASE requires transgenic animals that allow broad over-expression of the Zn-finger transcription factor (TF) CHE-1. Endogenous CHE-1 is expressed exclusively in two head neurons and is required to specify the glutamatergic ASE neurons fate, which can easily be visualized by the gcy-5prom::gfp reporter. A trans gene containing the heat-shock promoter-driven che-1 gene expression construct allows broad mis-expression of CHE-1 in the entire animal upon heat-shock treatment. The combination of RNAi against the chromatin-regulating factor LIN-53 and heat-shock-induced che-1 over-expression leads to reprogramming of germ cell into ASE neuron-like cells. We describe here the specific RNAi procedure and appropriate conditions for heat-shock treatment of transgenic animals in order to successfully induce germ cell to neuron conversion.

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

This protocol describes how to study cellular processes during cell fate conversion in Caenorhabditis elegans in vivo. Using transgenic animals, allowing heat-shock promoter-driven overexpression of the neuron fate-inducing transcription factor CHE-1 and RNAi-mediated depletion of the chromatin-regulating factor LIN-53 germ cell to neuron reprogramming can be observed in vivo.

Uygulama için yeniden programlamak Germ hücreleri için C. elegans nöronlarda RNAi ve transkripsiyon faktörü ifade ısı şok bağlı

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Methods for the Study of Regeneration in Stentor

Cells need to be able to regenerate their parts to recover from external perturbations. The unicellular ciliate Stentor coeruleus is an excellent model organism to study wound healing and subsequent cell regeneration. The Stentor genome became available recently, along with modern molecular biology methods, such as RNAi. These tools make it possible to study single-cell regeneration at the molecular level. The first section of the protocol covers establishing Stentor cell cultures from single cells or cell fragments, along with general guidelines for maintaining Stentor cultures. Culturing Stentor in large quantities allows for the use of valuable tools like biochemistry, sequencing, and mass spectrometry. Subsequent sections of the protocol cover different approaches to inducing regeneration in Stentor. Manually cutting cells with a glass needle allows studying the regeneration of large cell parts, while treating cells with either sucrose or urea allows studying the regeneration of specific structures located at the anterior end of the cell. A method for imaging individual regenerating cells is provided, along with a rubric for staging and analyzing the dynamics of regeneration. The entire process of regeneration is divided in three stages. By visualizing the dynamics of the progression of a population of cells through the stages, the heterogeneity in regeneration timing is demonstrated.

Methods for the Study of Regeneration in Stentor

The giant ciliate, Stentor coeruleus, is an excellent system to study regeneration and wound healing. We present procedures for establishing Stentor cell cultures from single cells or cell fragments, inducing regeneration by cutting cells, chemically inducing the regeneration of membranellar band and oral apparatus, imaging, and analysis of cell regeneration.

Rejenerasyon Stentor içinde çalışma yöntemleri

Cells need to be able to regenerate their parts to recover from external perturbations. The unicellular ciliate Stentor coeruleus is an excellent model ...

HUVEC Tube-formation Assay to Evaluate the Impact of Natural Products on Angiogenesis

Angiogenesis is a phenomenon that includes different processes, such as endothelial cell proliferation, differentiation, and migration, that lead to the formation of new blood vessels and involve several signal transduction pathways. Here we show that the tube formation assay is a simple in vitro method to evaluate the impact of natural products on angiogenesis and to investigate the molecular mechanisms involved. In particular, in the presence of the water extract of Ruta graveolens (RGWE), endothelial cells are no longer able to form a cell-cell network and that the RGWE effects on human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) tube formation is abolished by the constitutive activation of MEK.

Here, we evaluate the effects of the water extract of Ruta graveolens on vessel network formation by using a tube formation assay on a gelled basement matrix.

HUVEC tüp-formasyon assay doğal ürünlerin anjiyogenezi üzerinde etkisini değerlendirmek için

Angiogenesis is a phenomenon that includes different processes, such as endothelial cell proliferation, differentiation, and migration, that lead to the ...

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

In recent years there has been growing evidence that all organisms and the environment are exposed to hormone-like chemicals, known as endocrine disruptor chemicals (EDCs). These chemicals may alter the normal balance of endocrine systems and lead to adverse effects, as well as an increasing number of hormonal disorders in the human population or disturbed growth and reduced reproduction in the wildlife species. For some EDCs, there are documented health effects and restrictions on their use. However, for most of them, there is still no scientific evidence in this sense. In order to verify potential endocrine effects of a chemical in the full organism, we need to test it in appropriate model systems, as well as in the fruit fly, Drosophila melanogaster. Here we report detailed in vivo protocols to study endocrine disruption in Drosophila, addressing EDC effects on the fecundity/fertility, developmental timing, and lifespan of the fly. In the last few years, we used these Drosophila life traits to investigate the effects of exposure to 17-&#945;-ethinylestradiol (EE2), bisphenol A (BPA), and bisphenol AF (BPA F). Altogether, these assays covered all Drosophila life stages and made it possible to evaluate endocrine disruption in all hormone-mediated processes. Fecundity/fertility and developmental timing assays were useful to measure the EDC impact on the fly reproductive performance and on developmental stages, respectively. Finally, the lifespan assay involved chronic EDC exposures to adults and measured their survivorship. However, these life traits can also be influenced by several experimental factors that had to be carefully controlled. So, in this work, we suggest a series of procedures we have optimized for the right outcome of these assays. These methods allow scientists to establish endocrine disruption for any EDC or for a mixture of different EDCs in Drosophila, although to identify the endocrine mechanism responsible for the effect, further essays could be needed.

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

Endocrine disruptor chemicals (EDCs) represent a serious problem for organisms and for natural environments. Drosophila melanogaster represents an ideal model to study EDC effects in vivo. Here, we present methods to investigate endocrine disruption in Drosophila, addressing EDC effects on fecundity, fertility, developmental timing, and lifespan of the fly.

Drosophila melanogaster endokrin bozulma test yöntemleri

In recent years there has been growing evidence that all organisms and the environment are exposed to hormone-like chemicals, known as endocrine disruptor ...

Isolation of Rat Adipose Tissue Mesenchymal Stem Cells for Differentiation into Insulin-producing Cells

Mesenchymal stem cells (MSCs)-especially those isolated from adipose tissue (Ad-MSCs)-have gained special attention as a renewable, abundant source of stem cells that does not pose any ethical concerns. However, current methods to isolate Ad-MSCs are not standardized and employ complicated protocols that require special equipment. We isolated Ad-MSCs from the epididymal fat of Sprague-Dawley rats using a simple, reproducible method. The isolated Ad-MSCs usually appear within 3 days post isolation, as adherent cells display fibroblastic morphology. Those cells reach 80% confluency within 1 week of isolation. Afterward, at passage 3-5 (P3-5), a full characterization was carried out for the isolated Ad-MSCs by immunophenotyping for characteristic MSC cluster of differentiation (CD) surface markers such as CD90, CD73, and CD105, as well as inducing differentiation of these cells down the osteogenic, adipogenic, and chondrogenic lineages. This, in turn, implies the multipotency of the isolated cells. Furthermore, we induced the differentiation of the isolated Ad-MSCs toward the insulin-producing cells (IPCs) lineage via a simple, relatively short protocol by incorporating high glucose Dulbecco&#39;s modified Eagle medium (HG-DMEM), &#946;-mercaptoethanol, nicotinamide, and exendin-4. IPCs differentiation was genetically assessed, firstly, via measuring the expression levels of specific &#946;-cell markers such as MafA, NKX6.1, Pdx-1, and Ins1, as well as dithizone staining for the generated IPCs. Secondly, the assessment was also carried out functionally by a glucose-stimulated insulin secretion (GSIS) assay. In conclusion, Ad-MSCs can be easily isolated, exhibiting all MSC characterization criteria, and they can indeed provide an abundant, renewable source of IPCs in the lab for diabetes research.

Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells (Ad-MSCs) can be a potential source of MSCs that differentiate into insulin-producing cells (IPCs). In this protocol, we provide detailed steps for the isolation and characterization of rat epididymal Ad-MSCs, followed by a simple, short protocol for the generation of IPCs from the same rat Ad-MSCs.

Sıçan Yağ Dokusu Mezenkimal Kök Hücrelerinin İnsülin Üreten Hücrelere Farklılaşması İçin İzolasyonu

Mesenchymal stem cells (MSCs)-especially those isolated from adipose tissue (Ad-MSCs)-have gained special attention as a renewable, abundant source of ...