Biz NIH hibe R01 DE021683, R01 DE019434, U01 HL099776, Oak Vakfı ve Pediatrik Rejeneratif Tıp Hagey Laboratuvarı destek için minnettarım.

NOT: Etik deyimi: omurgalı hayvanları da içeren tüm araştırmalar Laboratuvar Hayvan Bakım Stanford İdari Paneli (APLAC) tarafından onaylanan uyarınca protokoller yapıldı. 1. Hazırlık <ol><li> Ticari olarak temin edilebilen yoğunluk gradyan hücre ayırma ortamı, 10 ml, 50 ml konik bir tüp içinde oda sıcaklığına gelmeye (polisükroz ve sodyum Diatrizoate içeren, 1,077 gr / ml&#39;lik bir yoğunluğa ayarlanır) izin verin. </li><li> Akış sitometrik hazırlayın (FACS) 1x Fosfat tamponlu tuz (PBS) ve% 2 fetal buzağı serumu (FCS) ile tampon. 50 ml&#39;lik bir şişe almak ve yoğunluk gradyan hücre ayırma ortamı aşama esnasında kullanım için, oda sıcaklığında, bu kısım korumak. </li><li> Izolasyon prosedürü sırasında izole doku ve hücreleri korumak için hazır bir kova buz var. </li></ol> 2. Kültür Medya hazırlayın <ol><li> Bazal ortam hazırlayın: MEM (Minimal Essential Medium), fenol kırmızısı (500 mi), glutamat (1x) olmadan FCS (10x), 10,000 birim / ml penisilinn, (1x). </li><li> 0.22 mikron filtre ile bazal ortamı Filtre. </li><li> Kemik iliği makrofaj indüksiyon ortamı hazırlayın: <ol><li> Aşama 2.1&#39;de üretilmiş olan bazal ortam, 50 ml alın. </li><li> 10 7 M nihai konsantrasyonda prostaglandin E2 (PGE2, Bay 352,465 g / mol) ilave edin. </li><li> 10 ng / ml&#39;de makrofaj-koloni uyarı faktörü (M-CSF) ekleyin. </li><li> Medya uyarıcı kemik iliği makrofaj nihai çözüm filtre etmeyin. </li></ol></li><li> Osteoklast indüksiyon ortamı hazırlayın: <ol><li> Aşama 2.1&#39;de üretilmiş olan bazal ortam, 50 ml alın. </li><li> Ekle 10 7 M nihai konsantrasyonda Prostaglandin E2 (PGE2, Bay 352,465 g / Mol) </li><li> 10 ng / ml&#39;de makrofaj-koloni uyarı faktörü (M-CSF) ekleyin. </li><li> 10 ng / ml&#39;de RANKL ekleyin. </li><li> Osteoklast indüksiyon ortamı nihai çözüm filtre etmeyin. </li></ol></li></ol> 3. Kemik İliği İzolasyonu <ol><li> Bir C57BL / 6 fare öldürülürservikal dislokasyon karbondioksit inhalasyonu yöntemi kullanılarak. NOT: Kemirgenler uygun teknik, donanım ve maddeleri kullanılarak eğitilmiş personel tarafından ötenazi gerekir. </li><li> Pozisyonu bir diseksiyon gemide fare güvenli ve% 70 alkol ile sprey ve. </li><li> Femur, fibula, humerusu ve omurga ayır. <ol><li> Yatar pozisyonda fare ile başlayın. Dikey alt ekstremite boyunca bir kesi yapmak ve yumuşak doku ekleri bölünmesi ile femur ve tibia uzunluğu boyunca diseksiyon ile başlar. Son olarak, iskelet tamamen kemikleri ücretsiz diz ve kalça eklemi kemikleri yerinden. </li><li> Humerus izole etmek için üst ekstremite uzunluğu boyunca bir kesi yapmaya devam edin. Yumuşak doku kapsül eki diseksiyon ile omuz ve dirsek eklemleri de humerus yerinden. </li><li> Fare eğilimli yatıyor böylece nihayet, üzerinde fareyi çevirin. Orta hatta, omurganın uzunluğu boyunca bir cilt kesi yapmak. Paravertebral yumuşak gözlemlemekparavertebral yumuşak doku kütle içinden kesme omurganın kemiksi kenarı boyunca omurga ve insizyon her tarafında dokusu gibi. Bir makas kullanma, boyun üssünde omurga boyunca yatay bir kesim yapmak ve yumuşak doku eki omurgayı kurtararak omurga, kuyruk ekleme hemen yakınına, sonunda. </li></ol></li><li> Kemikler hasat edildikten sonra, buz üzerinde FACS tampon saklayın. </li><li> Kemiklerden kas ve yumuşak doku temizlemek için kağıt mendil kullanın. </li><li> FACS tamponu, 3 ml olan bir havan ve tokmak kullanarak içine temizlenmiş kemikleri yerleştirin. </li><li> Havanda hafifçe kemikleri Crush. </li><li> 70 mikron hücre süzgecinden geçirilmesiyle 50 ml konik tüp içine kan lekeli sıvısı ve transferi kapalı aspirat. </li><li> 5 mi FACS ezilmiş kemiğe tampon ve daha fazla ezmek ekleyin. Yine, bir pipet kullanılarak, sıvıyı çıkarın ve 70 mikron süzgecinden 50 ml&#39;lik konik tüpe aktarın. </li><li> Tipik olarak, kemik TWI ezmekTaze FACS tampon çözeltisi içinde üç kez, sıvı kırmızı leke duruma gelene kadar, bir havan, taze FACS tampon ilave 5 ml ekleyerek, her zaman kullanarak ce. </li><li> Hücre topağı elde etmek için 4 ° C&#39;de 5 dakika süreyle 200 x g&#39;de kemik iliği çözeltisi santrifüjleyin. </li></ol> Kemik İliği Hücrelerinin 4. dereceli ayırma <ol><li> FACS tamponu, 10 ml supernatant ve tekrar süspansiyon aspire (oda sıcaklığında muhafaza edilen). </li><li> Ticari olarak temin edilebilen yoğunluk gradyan hücre ayırma ortamı (RT) 10 ml içeren 50 ml&#39;lik konik bir tüp. </li><li> Yoğunluk gradyan hücre ayırma medya üzerine kemik iliği çözüm Katman. Yavaş yavaş elektrikli pipet kullanarak bunu. Açı pipet konik tüpün üstüne yakın iç yüzeyine karşı ucu ve yaklaşık 30 ° konik tüp eğin. Yoğunluk gradyan hücre ayırma ortamı rahatsız etmeyecek şekilde pipet üzerinde yavaş hız ayarını kullanarak, yavaşça kemik iliği çözüm sınırdışı. NOT: Sonuçta orada olacakİki çözümleri (hücresel çözüm ve yoğunluk gradyan hücre ayırma medya çözümü) arasında açık bir tanımı olabilir. </li><li> Bir RT santrifüj kullanılarak, 15 dakika boyunca 200 x g&#39;de dengeli bir santrifüjde yoğunluk gradyan hücre ayırma ortamı ve hücre çözeltisi santrifüj. Buna ek olarak, yoğunluk gradyanlı bir hücre ayırma ortamı gradyanı kullanılarak, yeterli faz ayrımını sağlamak için santrifüj üzerine hızlanma ve yavaşlama çıkarın. </li><li> Santrifüj işleminden sonra, söz konusu kemik iliği hücreleri içeren parçalı orta tabaka aspire. </li><li> Yeni bir konik tüp içine bu hücreleri aktarın. Hücreleri yıkamak için (buz üzerinde tutulur), ek FACS tampon 20 ml ilave edilir. </li><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika süreyle 200 x g&#39;de santrifüjleyin bir hücre tanesinin elde edildi. </li><li> Bir hemositometre kullanılarak hücre sayımı için izin vermek için ortam uyarıcı makrofaj 1 ml nihai hücre topağı tekrar. </li></ol> 5. Hücre Sayım <ol><li> Hücre çözeltisine 10 ul alın ve karıştırıntripan mavisi 10 ul. Yük elde edilen karışımı 10 ul bir hemositometrede üzerine püskürtüldüğü ve çözeltinin ml&#39;si başına hücre sayısı elde edilir. </li></ol> 6. Hücre Kültürleme <ol><li> 24 oyuklu plakanın her oyuğuna makrofaj uyarıcı ortam 2 ml yerleştirin. </li><li> Her kuyuya 200.000 hücreleri ekleyin. NOT: Bizim tecrübelerimize göre, hücre-kaplama yoğunluk osteoklastlann vitro kültürlenmesinde yeterli için en önemli gerekliliklerden biridir. </li><li> Yavaşça, 37 ° C&#39;de normal bir inkübatör plaka yeri ve çalkalayın. </li><li> 3 gün boyunca ortamı değiştirmek etmeyin. </li><li> Makrofaj uyarıcı medyada 3 gün sonra, osteoklast medya ortamı değiştirmek. </li><li> Bundan sonra, noktası, büyük, çok çekirdekli osteoklastlar kültür plaka üzerinde görünür olmalıdır hangi 5-7 gün, günlük ortamı değiştirmek. </li></ol> 7. Boyama ile Tartratın Dirençli Asit Fosfataz (TRAP) <ol><li> In vitro cul 5-7 gün sonraTüre, iyi kültürden ortamı aspire. </li><li> 1x PBS ile üç kez hafifçe kuyuları yıkayın. </li><li> % 4 paraformaldehit çözeltisi ekleyerek hücreleri düzeltmek ve 4 ° C&#39;de 1 saat bekletin. </li><li> Bu süre boyunca, 37 ° C&#39;ye kadar ön ısıtma ile (ticari olarak temin edilebilir), TRAP leke hazırlar. </li><li> Paraformaldehid içinde 1 saat sonra, paraformaldehid aspire ve 1 x PBS ile hafifçe 3 kez yıkayın. </li><li> Plakanın her oyuğuna önceden ısıtılmış TRAP leke 1 ml ilave edilir lekelenmesine. </li><li> Işıktan korunan, 1 saat boyunca 37 ° C&#39;de bir kuluçka makinesi içinde plaka koyun. </li><li> 1 saat sonra, TRAP leke aspire. </li><li> Önceden ısıtılmış deiyonize su ile gözler 3 kez yıkayın. </li><li> 1-2 dakika Gill&#39;ın Hematoksilin (DİKKAT) ile kuyu Counterstain. </li><li> Parlak bir alan mikroskobu kullanarak görüntü osteoklastlar. </li><li> Leke yeterli bir renk yoğunluğu kadar deiyonize su ile kuyu yıkayın çekirdekler blu görünür tipik zaman, elde edilirör. </li></ol> 8. Osteoklast Rezorpsiyon Deneyi <ol><li> Kemik alt-tabaka ya da bir inorganik kristal şeklinde kalsiyum fosfat kaplama ya ile önceden kaplanmış olan bir ticari olarak temin edilebilir 24 oyuklu polistiren kültür kaplarına kullanın. </li><li> Her bir kuyuya makrofaj uyarıcı ortam 2 ml yerleştirin. </li><li> Her bir oyuğa aşama 2 sonunda elde edilen 200,000 yeni izole edilmiş kemik iliği hücreleri ekleyin. </li><li> Yavaşça 3 gün boyunca 37 ° C&#39;de bir kuluçka makinesi içinde konulmadan önce, plakayı çalkalayın. </li><li> 3. günde, osteoklast farklılaşma medya ortamı değiştirmek. </li><li> 5-7 gün osteoklast farklılaşma medya ile günlük medya değişiklikleri gerçekleştirin. </li></ol> Osteoclast Resorpsiyon Faaliyet 9. Quantification <ol><li> Aşağıda açıklandığı gibi, mineralize alt-tabaka üzerinde osteoklast farklılaştırma ortamı içinde in vitro kültürü 5-7 gün sonra, resorpti oluşturmak osteoklastların yeteneğini değerlendirmek için, mineralli yüzeyini analizçukurları, osteoklastik aktivitenin bir göstergesi. </li><li> Erimesi tahlil plaka aspire medya ve her iyi% 10 çamaşır suyu çözeltisi 100 ul ekleyin. </li><li> Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca% 10 çamaşır suyu solüsyonu ile hücreleri inkübe edin. </li><li> Damıtılmış su ile gözler 3 kez yıkayın. </li><li> Kalan suyu aspire ve plaka fazla suyu silkeleyin ve 3-5 saat kurumaya bırakın. </li><li> Piyasada mevcut Von Kossa boyama kiti ile plaka Counterstain un-rezorbe alt tabakanın kolay görünüm için izin. </li><li> Rezorbe yüzeyinin temsili parçaların görüntülerini çekmek için parlak bir alan mikroskobu kullanın. </li><li> Görüntü analiz yazılımı kullanılarak, osteoklastik kemik erimesini aktivitesinin ölçümü için izin vermek için rezorbe yüzeyinin yüzdesi hesaplanır. </li></ol>

<ol>
	<li>Sims, N. A., Martin, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+the+activities+of+bone+formation+and+resorption:+a+multitude+of+signals+within+the+basic+multicellular+unit.">Coupling the activities of bone formation and resorption: a multitude of signals within the basic multicellular unit.</a> BoneKEy reports. 3, 481 (2014).</li><li>Kahn, A. J., Simmons, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+cell+lineage+in+bone+using+a+chimaera+of+chick+and+quial+embryonic+tissue.">Investigation of cell lineage in bone using a chimaera of chick and quial embryonic tissue.</a> Nature. 258, 325-327 (1975).</li><li>Walker, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+resorption+restored+in+osteopetrotic+mice+by+transplants+of+normal+bone+marrow+and+spleen+cells.">Bone resorption restored in osteopetrotic mice by transplants of normal bone marrow and spleen cells.</a> Science. 190, 784-785 (1975).</li><li>Burger, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+formation+of+osteoclasts+from+long-term+cultures+of+bone+marrow+mononuclear+phagocytes.">In vitro formation of osteoclasts from long-term cultures of bone marrow mononuclear phagocytes.</a> The Journal of experimental medicine. 156, 1604-1614 (1982).</li><li>Underwood, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+where+comes+the+osteoclast.">From where comes the osteoclast.</a> The Journal of pathology. 144, 225-226 (1984).</li><li>Lacey, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bench+to+bedside:+elucidation+of+the+OPG-RANK-RANKL+pathway+and+the+development+of+denosumab.">Bench to bedside: elucidation of the OPG-RANK-RANKL pathway and the development of denosumab.</a> Nature reviews. Drug discovery. 11, 401-419 (2012).</li><li>Brown, J. E., Coleman, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Denosumab+in+patients+with+cancer-a+surgical+strike+against+the+osteoclast.">Denosumab in patients with cancer-a surgical strike against the osteoclast.</a> Nature reviews. Clinical oncology. 9, 110-118 (2012).</li><li>Khosla, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minireview:+the+OPG/RANKL/RANK+system.">Minireview: the OPG/RANKL/RANK system.</a> Endocrinology. 142, 5050-5055 (2001).</li><li>Boyle, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+roles+of+MAPK+kinases+MKK3+and+MKK6+in+osteoclastogenesis+and+bone+loss.">Differential roles of MAPK kinases MKK3 and MKK6 in osteoclastogenesis and bone loss.</a> PloS one. 9, (2014).</li><li>Hofbauer, L. C., Heufelder, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+receptor+activator+of+nuclear+factor-kappaB+ligand+and+osteoprotegerin+in+bone+cell+biology.">Role of receptor activator of nuclear factor-kappaB ligand and osteoprotegerin in bone cell biology.</a> Journal of molecular medicine (Berlin, Germany). 79, 243-253 (2001).</li><li>Teramachi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+IL-6+Expression+in+Osteoclasts+is+Necessary+but+not+Sufficient+for+the+Development+of+Paget's+Disease+of+Bone.">Increased IL-6 Expression in Osteoclasts is Necessary but not Sufficient for the Development of Paget's Disease of Bone.</a> Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. , (2013).</li><li>Catalfamo, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperglycemia+induced+and+intrinsic+alterations+in+type+2+diabetes-derived+osteoclast+function.">Hyperglycemia induced and intrinsic alterations in type 2 diabetes-derived osteoclast function.</a> Oral diseases. 19, 303-312 (2013).</li><li>Schueler, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intratibial+injection+of+human+multiple+myeloma+cells+in+NOD/SCID+IL-2Rgamma(null)+mice+mimics+human+myeloma+and+serves+as+a+valuable+tool+for+the+development+of+anticancer+strategies.">Intratibial injection of human multiple myeloma cells in NOD/SCID IL-2Rgamma(null) mice mimics human myeloma and serves as a valuable tool for the development of anticancer strategies.</a> PloS one. 8, (2013).</li><li>Xing, L., Boyce, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RANKL-Based+Osteoclastogenic+Assays+from+Murine+Bone+Marrow+Cells.">RANKL-Based Osteoclastogenic Assays from Murine Bone Marrow Cells.</a> Methods in molecular biology (Clifton, N.J). 1130, 307-313 (2014).</li><li>Weischenfeldt, J., Porse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+Marrow-Derived+Macrophages+(BMM):+Isolation+and+Applications.">Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications.</a> CSH protocols. , (2008).</li><li>Yamamoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoblasts+provide+a+suitable+microenvironment+for+the+action+of+receptor+activator+of+nuclear+factor-kappaB+ligand.">Osteoblasts provide a suitable microenvironment for the action of receptor activator of nuclear factor-kappaB ligand.</a> Endocrinology. 147, 3366-3374 (2006).</li><li>Yasuda, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclast+differentiation+factor+is+a+ligand+for+osteoprotegerin/osteoclastogenesis-inhibitory+factor+and+is+identical+to+TRANCE/RANKL.">Osteoclast differentiation factor is a ligand for osteoprotegerin/osteoclastogenesis-inhibitory factor and is identical to TRANCE/RANKL.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 3597-3602 (1998).</li><li>Lacey, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoprotegerin+ligand+is+a+cytokine+that+regulates+osteoclast+differentiation+and+activation.">Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation.</a> Cell. 93, 165-176 (1998).</li><li>Teitelbaum, S. L., Ross, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+regulation+of+osteoclast+development+and+function.">Genetic regulation of osteoclast development and function.</a> Nature reviews. Genetics. 4, 638-649 (2003).</li><li>Agas, D., Sabbieti, M. G., Marchetti, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocrine+disruptors+and+bone+metabolism.">Endocrine disruptors and bone metabolism.</a> Archives of toxicology. 87, 735-751 (2013).</li><li>Manolagas, S. C., O'Brien, C. A., Almeida, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+estrogen+and+androgen+receptors+in+bone+health+and+disease.">The role of estrogen and androgen receptors in bone health and disease.</a> Nature Reviews Endocrinology. 9, 699-712 (2013).</li><li>Martin, T. J., Udagawa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormonal+regulation+of+osteoclast+function.">Hormonal regulation of osteoclast function.</a> Trends in endocrinology and metabolism. 9, 6-12 (1998).</li><li>Nakamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+prevents+bone+loss+via+estrogen+receptor+alpha+and+induction+of+Fas+ligand+in+osteoclasts.">Estrogen prevents bone loss via estrogen receptor alpha and induction of Fas ligand in osteoclasts.</a> Cell. 130, 811-823 (2007).</li><li>Bellido, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+interleukin-6,+osteoclastogenesis,+and+bone+mass+by+androgens.+The+role+of+the+androgen+receptor.">Regulation of interleukin-6, osteoclastogenesis, and bone mass by androgens. The role of the androgen receptor.</a> The Journal of clinical investigation. 95, 2886-2895 (1995).</li><li>Roato, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+among+cells+of+bone,+immune+system,+and+solid+tumors+leads+to+bone+metastases.">Interaction among cells of bone, immune system, and solid tumors leads to bone metastases.</a> Clinica., &amp; developmental immunology. 2013, (2013).</li><li>Autio, K. A., Morris, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+bone+physiology+for+the+treatment+of+metastatic+prostate+cancer.">Targeting bone physiology for the treatment of metastatic prostate cancer.</a> Clinical advances in hematolog., &amp; oncology. 11, 134-143 (2013).</li><li>Sottnik, J. L., Keller, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+and+targeting+osteoclastic+activity+in+prostate+cancer+bone+metastases.">Understanding and targeting osteoclastic activity in prostate cancer bone metastases.</a> Current molecular medicine. 13, 626-639 (2013).</li></ol>

Yazarların hiçbiri beyan açıklanmasını veya çıkar çatışması vardır.

Kolayca in vitro osteoklastlann sayıda izole ve yetiştirmek için bir yetenek kemik biyoloji ve osteoklast-aracılı hastalıkların anlayışı ilerletmek için yardımcı sorumlu olmuştur. Son zamanlarda osteoklast formasyonu, farklılaşma ve canlılık 16-18 başlıca düzenleyicisi olarak tespit edilmiştir zaman, bu yol RANKL ayırdedilebilmesidir. Kemik iliği osteoclastların in vitro kültürü ekim yoğunluğu büyük ölçüde bağımlı olan bizim ...

Kemik remodeling dinamik ve kemik erimesinin 1 ile kemik oluşumu birleştirmesini kapsar. Bu sıkı düzenlenmiş süreç normal homeostasisin sırasında iskeleti korunmasından sorumlu olup, yaralanma ve hastalığa karşı. Osteoklastlar kemik organik ve inorganik matris hem rezorbe yeteneğine sahip olan benzersiz sonunda, çok çekirdekli hücrelerdir. Osteoklastlar kemik iliği 2-5&#39;in monosit / makrofaj elde edilir. Osteoklast fonksiyonuna veya oluşumundaki anormallikler osteoporoz gibi yaygın durumlar dahil olmak üzere klinik durumlar, çeşitli neden olabilir. In vitro osteoklastlan oluşturmak için yeteneği kemik biyoloji 6 anlayışımızda önemli ilerlemeler sağladı. Bunun bir sonucu olarak, yeni terapötik maddeler, 7 önemli morbidite ve mortalite sorumlu olan osteoklast ile ilgili hastalıkların tedavisi için ortaya çıkmaktadır </s&gt; kadar. Kemik kütlesi ve gücü homeostatik bakım kemik oluşturan osteoblast ve kemik osteoklastı 8,9 uyumlu eylem gerektirir. Kemik homeostazı burada osteoklast aktivitesi, kemik kütlesi ve yoğunluğu 10 patojenik kaybına yol açar artış, menopoz sonrası osteoporoz da dahil olmak üzere bir dizi hastalık, değiştirilir. İnsan hastalığı, transgenik fare modelleri artmasıyla, insan kemik hastalığı 11-13 osteoklastların rolünü deşifre için daha fazla olanak vardır. Birçok varyasyon 9,12,14 anlatılmış olan osteoklast kültür teknikleri için çeşitli protokoller, literatürde yer almaktadır. Xing ve arkadaşları, fare kemik iliği hücrelerinden osteoclastogenic deneylerinin açıklamasında, aşağıda tarif edilen protokole benzer bir metodoloji tarif eder. Ancak uzun kemik hasat sonrası kemik iliği hücreleri çıkarmak için, Xing vd. Α-MEM tam ortam ile ilik boşluğu yıkayın14. Catalfamo, osteoklast fonksiyonuna hipergliseminin etkisini inceleyen ve hücreler, kemik iliği yıkama ile harekete geçirilen bir yöntem olup, en yapışmayan hücreler 12 atılır etmektedir, 24 saat boyunca kültürlenir tarif da Boyle ve diğerleri tarafından kullanılan bir tekniktir . 9 Bunlar daha önce yayınlanan protokolleri tek bir kemiğin iki ucunu kesmek gerekir aynı zamanda, bir iğne batması ve değerli kemik iliği kaybı riski tanıtır kemik iliği, sıkıcı bir uygulama, kızarma uygulamasını zorunlu kılmaktadır. Biz tarif protokolü, Weischenfeldt ve diğerleri tarafından tarif makrofaj izolasyon yöntemine benzer osteoklastlar izole etmek için bir havan ve tokmak kullanımını uygular. 15 Bizim deneyim, ancak, genellikle elde edilen, osteoklast üretimi açısından değişik sonuçlar, daha önce yayınlanmış teknikleri sonuçlarını kullanarak bu osteoklast izolasyonu ve in vitro kültür içindebir yetersizlik osteoklastlan yetiştirmek için. Bu nedenle, varlığında, ilk olarak makrofajlar ve daha sonra osteoklastlar oluşturan kaplama hücrelerinin% 70-80 yaklaşık verim ile in vitro olarak çok çekirdekli osteoklastlar çok sayıda üretmek üzere fare kemik iliği tutarlı izolasyonu sağlayan bir protokol tasarladılar osteoklast indüksiyon medya.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1017">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:503px;">Name of the Material/Equipment</td>
			<td style="width:165px;">Company</td>
			<td style="width:175px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:175px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM, no glutamine, no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>51200-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">M-CSF, recombinant mouse</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PMC2044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant Mouse TRANCE/RANK L/TNFSF11 (E. coli expressed)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>462-TEC-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Prostaglandin E2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Histopaque-1077</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acid Phosphatase, Lekocyte (TRAP) kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>387A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Osteoassay bone resorption plates, 24 well plates</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>3987</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

osteoclast derivation from mouse bone marrow

<html> Osteoklastlar kemik iliği monosit / makrofaj türetilen çok özel hücreler bulunmaktadır. Kemiğin organik ve inorganik matrisler hem emmek üzere onların sağlıyor bu iskeletin yeniden modellenmesini düzenlenmesinde önemli bir rol oynadığı anlamına gelir. Birlikte, osteoblastlar ve osteoklastlar kemik erimesini ve sağlık ve hastalık sırasında normal iskeleti korumak için birlikte hareket eden kemik oluşumunu hem içeren dinamik bağlantı işlemi için sorumludur. Vücutta ana kemik-rezorbe hücre olarak, osteoclast farklılaşmasında ve işlev değişikliklerin vücudun derin etkilere neden olabilir. Değiştirilmiş osteoklast fonksiyonuna bağlı hastalıklar, daha yaygın olarak, aşırı osteoklastik kemik erimesi oluşumunu kırılma yatkınlık olan osteoporoz, patolojileri gözlenen nedeniyle hematopoez için kemik iliği boşluk oluşturmak için başarısızlık öldürücü yenidoğan hastalığın şiddeti değişebilir. ent &quot;&gt; in vitro yüksek sayılarda osteoklastlan izole etmek için bir yeteneği kemik yeniden çevriminin anlaşılması önemli gelişmeler için izin verdi ve bu hastalıklar ile mücadele yeni tedavi stratejilerinin keşif için yol açmıştır. Burada, izole edilmesi ve osteoklastların sayıda verecek fare kemik iliğinden osteoclastların yetiştirmek için bir protokol açıklar.

<html> Bu yöntemin amacı, kolay bir hafta içinde, tipik olarak, in vitro olarak, osteoklastların sayıda izole edildi. Osteoklastların sayıda başarıyla izolasyonu, tartrat-dirençli asit fosfataz lekeleme (Şekil 1A) kullanılarak teyit edilmiştir. Büyük osteoklastlar çok çekirdekli (genellikle ≥ 3 çekirdekleri) ile büyük mor hücreler olarak görülür. Bu protokolü kullanarak, osteoklast ortalama olarak 30 kadar çekirdeklerin (Şekil 1B) ile osteoklastlan i...

Watch this Scientific Journal Video about Osteoclast Derivation from Mouse Bone Marrow at JoVE.com

Osteoclast Derivation from Mouse Bone Marrow

Osteoklastlar vücutta ana kemik-rezorbe hücresi vardır. Çok sayıda osteoklastlar izole etmek için bir yeteneği osteoklast biyoloji anlama konusunda önemli ilerlemelere yol açmıştır. Bu protokol, yetiştirilmesi ve in vitro olarak osteoklast aktivitesi miktarının, izole edilmesi için bir yöntem açıklanmaktadır.

Fare Kemik İliği osteoklast türetilmesi

Osteoclasts are highly specialized cells that are derived from the monocyte/macrophage lineage of the bone marrow. Their unique ability to resorb both the ...

osteoclast-derivation-from-mouse-bone-marrow

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Unit 1

Fibroblast Transformation and Muscle Stem Cells

SCIENTISTS IN ACTION

24.0K Görüntüleme.  Stanford University School of Medicine.  Osteoklastlar vücutta ana kemik-rezorbe hücresi vardır. Çok sayıda osteoklastlar izole etmek için bir yeteneği osteoklast biyoloji anlama konusunda önemli ilerlemelere yol açmıştır. Bu protokol, yetiştirilmesi ve in vitro olarak osteoklast aktivitesi miktarının, izole edilmesi için bir yöntem açıklanmaktadır. 

Video: Osteoclast Derivation from Mouse Bone Marrow

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are derived from the blastocyst of the early embryo and are pluripotent in differentiative ability.  Their vast differentiative potential has made them the focus of much research centered on deducing how to coax them to generate clinically useful cell types.  The successful derivation of hematopoietic stem cells (HSC) from mouse ESC has recently been accomplished and can be visualized in this video protocol.  HSC, arguably the most clinically exploited cell population, are used to treat a myriad of hematopoietic malignancies and disorders.  However, many patients that might benefit from HSC therapy lack access to suitable donors.  ESC could provide an alternative source of HSC for these patients.  The following protocol establishes a baseline from which ESC-HSC can be studied and inform efforts to isolate HSC from human ESC.  In this protocol, ESC are differentiated as embryoid bodies (EBs) for 6 days in commercially available serum pre-screened for optimal hematopoietic differentiation.  EBs are then dissociated and infected with retroviral HoxB4.  Infected EB-derived cells are plated on OP9 stroma, a bone marrow stromal cell line derived from the calvaria of  M-CSF-/- mice, and co-cultured in the presence of hematopoiesis promoting cytokines for ten days.  During this co-culture, the infected cells expand greatly, resulting in the generation a heterogeneous pool of 100s of millions of cells.  These cells can then be used to rescue and reconstitute lethally irradiated mice.

This protocol details the derivation of transplantable hematopoietic stem cells from mouse embryonic stem cells (ESC) and their subsequent injection into lethally irradiated recipient mice. Briefly, ESC are differentiated as embryoid bodies, which are then infected with retroviral HoxB4 and co-cultured with OP9 stromal cells and hematopoietic cytokines.

Murin Embriyonik Kök Hücre Hematopoetik Kök Hücre türetilmesi

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Biyoloji

Culture of myeloid dendritic cells from bone marrow precursors

Myeloid dendritic cells (DCs) are frequently used to study the interactions between innate and adaptive immune mechanisms and the early response to infection. Because these are the most potent antigen presenting cells, DCs are being increasingly used as a vaccine vector to study the induction of antigen-specific immune responses. In this video, we demonstrate the procedure for harvesting tibias and femurs from a donor mouse, processing the bone marrow and differentiating DCs in vitro. The properties of DCs change following stimulation: immature dendritic cells are potent phagocytes, whereas mature DCs are capable of antigen presentation and interaction with CD4+ and CD8+ T cells. This change in functional activity corresponds with the upregulation of cell surface markers and cytokine production. Many agents can be used to mature DCs, including cytokines and toll-like receptor ligands. In this video, we demonstrate flow cytometric comparisons of expression of two co-stimulatory molecules, CD86 and CD40, and the cytokine, IL-12, following overnight stimulation with CpG or mock treatment. After differentiation, DCs can be further manipulated for use as a vaccine vector or to generate antigen-specific immune responses by in vitro pulsing using peptides or proteins, or transduced using recombinant viral vectors. 

This video demonstrates the procedure for differentiating myeloid dendritic cells from mouse bone marrow. Isolation of mouse tibia and femur, and processing of bone marrow are demonstrated. Pictures demonstrating cell morphology before and after differentiation, and figures depicting cell phenotype and IL-12 production following maturation using CpG are shown.

Myeloid dendritik hücreler kemik iliği öncüleri Kültür

Myeloid dendritic cells (DCs) are frequently used to study the interactions between innate and adaptive immune mechanisms and the early response to ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

Hazırlık Elektroporasyon murin Kemik İliği itibaren İlköğretim Hematopoetik Hücre Kültürleri

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Homing of Hematopoietic Cells to the Bone Marrow

Homing is the phenomenon whereby transplanted hematopoietic cells are able to travel to and engraft or establish residence in the bone marrow. Various chemomkines and receptors are involved in the homing of hematopoietic stem cells. [1, 2]
This paper outlines the classic homing protocol used in hematopoietic stem cell studies. In general this involves isolating the cell population whose homing needs to be investigated, staining this population with a dye of interest and injecting these cells into the blood stream of a recipient animal. The recipient animal is then sacrificed at a pre-determined time after injection and the bone marrow evaluated for the percentage or absolute number of cells which are positive for the dye of interest. In one of the most common experimental schemes, the homing efficiency of hematopoietic cells from two genetically distinct animals (a wild type animal and the corresponding knock-out) is compared. This article describes the hematopoietic cell homing protocol in the framework of such as experiment.

This article describes a protocol used to study the homing of hematopoietic cells to their niches in the bone marrow.

Kemik İliği Hematopoetik Hücreler, Homing

Homing is the phenomenon whereby transplanted hematopoietic cells are able to travel to and engraft or establish residence in the bone marrow.  Various ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum (dpc) mouse embryos.  Developing gonadal ridges from mouse embryos (C57BL6J) were dissociated by mechanical disruption with collagenase, then plated in a mouse embryo fibroblast feeder layer (MEF-CF1) that was previously mitotically inactivated with mitomycin C in the presence of knockout media and supplemented with Leukemia Inhibitor Factor (LIF), basic Fibroblast Growth Factor (bFGF), and Stem Cell Factor (SCF).  Using these optimized methods for PCG identification, isolation, and establishment of culture conditions permits long term cultures of EG cells for more than 40 days.  The embryonic germinal cell lines showed embryonic phenotype and expression of common used markers of the pluripotent state.  Isolation and derivation of germinal cells in culture provide a tool to understand their development in vitro and offer the opportunity to monitor cumulative damage at genetic and epigenetic levels after exposure to oxidative stress.

The ability of embryonic germinal cells to differentiate into primordial germinal cells during early development stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum mouse embryos.

Fare Embriyonik Germinal Hücreleri İzolasyon ve türetilmesi

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Derivation of Mouse Trophoblast Stem Cells from Blastocysts

Specification of the trophectoderm is one of the earliest differentiation events of mammalian development. The trophoblast lineage derived from the trophectoderm mediates implantation and generates the fetal part of the placenta. As a result, the development of this lineage is essential for embryo survival. Derivation of trophoblast stem (TS) cells from mouse blastocysts was first described by Tanaka et al. 1998. The ability of TS cells to preserve the trophoblast specific property and their expression of stage- and cell type-specific markers after proper stimulation provides a valuable model system to investigate trophoblast lineage development whereby recapitulating early placentation events. Furthermore, trophoblast cells are one of the few somatic cell types undergoing natural genome amplification. Although the molecular pathways underlying trophoblast polyploidization have begun to unravel, the physiological role and advantage of trophoblast genome amplification remains largely elusive. The development of diploid stem cells into polyploid trophoblast cells in culture makes this ex vivo system an excellent tool for elucidating the regulatory mechanism of genome replication and instability in health and disease. Here we describe a protocol based on previous reports with modification published in Chiu et al. 2008.

In this video, we demonstrate the isolation of mouse blastocysts and the derivation of trophoblast stem cells from blastocysts. We also describe conditions for maintenance of the stem cell property as well as induction of differentiation in culture.

Blastosist Fare trofoblast Kök Hücre türetilmesi

Specification of the trophectoderm is one of the earliest differentiation events of mammalian development. The trophoblast lineage derived from the ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

İsteyerek Pluripotent Kök Hücrelerinin Elde Edilen Fare Üretimi

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

Yetişkin Fare Kalvaryal Kemik İliği içinde Hematopoietik kök hücrelerin Vivo 4-Boyutlu Takip

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Expression of Fluorescent Fusion Proteins in Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells and Macrophages

Dendritic cells and macrophages are crucial cells that form the first line of defense against pathogens. They also play important roles in the initiation of an adaptive immune response. Experimental work with these cells is rather challenging. Their abundance in organs and tissues is relatively low. As a result, they cannot be isolated in large numbers. They are also difficult to transfect with cDNA constructs. In the murine model, these problems can be partially overcome by in vitro differentiation from bone marrow progenitors in the presence of M-CSF for macrophages or GM-CSF for dendritic cells. In this way, it is possible to obtain large amounts of these cells from very few animals. Moreover, bone marrow progenitors can be transduced with retroviral vectors carrying cDNA constructs during early stages of cultivation prior to their differentiation into bone marrow derived dendritic cells and macrophages. Thus, retroviral transduction followed by differentiation in vitro can be used to express various cDNA constructs in these cells. The ability to express ectopic proteins substantially extends the range of experiments that can be performed on these cells, including live cell imaging of fluorescent proteins, tandem purifications for interactome analyses, structure-function analyses, monitoring of cellular functions with biosensors and many others. In this article, we describe a detailed protocol for retroviral transduction of murine bone marrow derived dendritic cells and macrophages with vectors coding for fluorescently-tagged proteins. On the example of two adaptor proteins, OPAL1 and PSTPIP2, we demonstrate its practical application in flow cytometry and microscopy. We also discuss the advantages and limitations of this approach.

In this article, we provide a detailed protocol for the expression of fluorescent fusion proteins in murine bone marrow derived dendritic cells and macrophages. The method is based on the transduction of bone marrow progenitors with retroviral constructs followed by differentiation into macrophages and dendritic cells in vitro.

Kemik iliği türevi fare dendritik hücreleri ve makrofajlar floresan Fusion proteinlerin ifade

Dendritic cells and macrophages are crucial cells that form the first line of defense against pathogens. They also play important roles in the initiation ...

Isolation, Purification, and Differentiation of Osteoclast Precursors from Rat Bone Marrow

Osteoclasts are large, multinucleated, and bone-resorbing cells of the monocyte-macrophage lineage that are formed by the fusion of monocytes or macrophage precursors. Excessive bone resorption is one the most significant cellular mechanisms leading to osteolytic diseases, including osteoporosis, periodontitis, and periprosthetic osteolysis. The main physiological function of osteoclasts is to absorb both the hydroxyapatite mineral component and the organic matrix of bone, generating the characteristic resorption appearance on the surface of bones. There are relatively few osteoclasts compared to other cells in the body, especially in adult bones. Recent studies have focused on how to obtain more mature osteoclasts in less time, which has always been a problem. Several improvements in the isolation and culture techniques have developed in laboratories in order to obtain more mature osteoclasts. Here, we introduce a method that isolates bone marrow in less time and with less effort compared to the traditional procedure, using a special and simple device. With the use of density gradient centrifugation, we obtain large amounts of fully differentiated osteoclasts from rat bone marrow, which are identified by classical methods.

Osteoclasts are tissue-specific macrophage polykaryons derived from the monocyte-macrophage lineage of hematopoietic stem cells. This protocol describes how to isolate bone marrow cells so that large quantities of osteoclasts are obtained while reducing the risk of accidents found in traditional methods.