Teknik yardım sağlamak için uyarıcı tartışmalar ve Üyeler Zhan laboratuarında sağlamak için Zhang laboratuarında üye teşekkür. Bu araştırma hibe NSFC, Çin ' in M.O.S.T. üzerinden 973 programının (için E.E.Z. ve C.Z.) 2012CB837700 31500860 (C.Z. için) ve Pekin Belediye hükümetten fon tarafından desteklenmiştir. E.E.Z. Çinliler "İşe alım programı küresel gençlik uzmanlar" tarafından desteklendi.

Bu iletişim kuralı tüm prosedürleri ile onayı kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC), Ulusal Biyolojik Bilimler Enstitüsü, Pekin, Çin'in devlet düzenlemelerine uygun olarak yapılmıştır.
1. Cry1 floresan muhabir inşaatı
Not: önceki sirkadiyen çalışmalarda bioluminescence sistem2,12kullanarak,13 ritmik dLuc ifade ikna etmek için sirkadiyen bir organizatörü bir hale luciferase (dLuc) ile sigorta. Bir floresan muhabir geliştirmek için bozulma luciferase ritmik dVenus ifade ikna etmek için istikrarsızlığın floresans protein ile (dVenus) değiştirildi. P (Cry1) nesil-dVenüs muhabir aşağıda açıklanmıştır, hangi yapı şu anda Addgene için teslim ediliyor ve yakında akademik kullanıma açık olacak.
<ol><li>İşlevsel fare Cry1 organizatörü (+328 Cry1 gen, transkripsiyon başlangıç sitesi ''-'' 1 belirlenmiş-1208 bp bölgesine) yükseltmek. PCR enzim (KOD Plus Neo) kullanın, astar F1 ve R1 (bkz. Tablo 2), fare genom Cry1 organizatörü DNA parçası yükseltmek için bir şablon ve üreticinin PCR protokolü gibi.</li>
	<li>İntron 336 Cry114sirkadiyen saat fonksiyonu için önemli olan Cry1 gen yükseltmek. PCR enzim astar F2 ve R2, fare genom bir şablon ve intron 336 DNA parçası yükseltmek için üreticinin PCR protokolü olarak kullanın.</li>
	<li>Venüsyükseltmek. PCR enzim astar F3 ve R3, pVENUS-N1 plazmid bir şablon ve Venüs DNA parçası yükseltmek için üreticinin PCR protokolü olarak kullanın.</li>
	<li>NLS-D2 DNA parçası yükseltmek. PCR enzim astar F4 ve R4, pcDNA3.3-d2eGFP plazmid NLS-D2 DNA parçası yükseltmek için üreticinin PCR Protokolü ve bir şablon olarak kullanın.</li>
	<li>DNA parçası 1 exon 1 sentez.</li>
	<li>DNA parçası 2 intron 336 ve Venüs DNA parçası arasındaki bağlayıcı olarak sentez.</li>
	<li>PAAV-EF1a-çift floxed-hChR2 (H134R) kesme - mCherry - WPRE-HGHpA vektör plazmid MluI ve EcoRI enzimleri ile. Jel ekstraksiyon kiti daha büyük DNA parçası arındırmak için kullanın. Üreticinin iletişim kuralını kullanırlar.</li>
	<li>Gibson derleme mix ve onun standart protokolü kullanarak, birlikte pAAV-P (Cry1)-intron336-Venus-NLS-D2-WPRE-HGHpA muhabir üretmek için DNA parçalarının hepsini topla. Üreticinin iletişim kuralını kullanırlar.</li>
</ol>2. virüs Adeno ilişkili15 imalatı
<ol><li>Aşağıdaki plazmid DNA stokları hazırlamak: 31.25 µg, pRV1, pH21 31.25 µg, pFdelta6 125 µg ve pAAV-p (Cry1) - intron336 - 62.5 µg Venüs-NLS - D2-WPRE-HGHpA.</li>
	<li>293T hücre beş 15 cm yemekleri hazırlamak ve hücreleri % 90 birleşmesi olana kadar bekle.</li>
	<li>Plazmid transfection reaktif protokol sonrası 297T hücrelere transfect. Her yemek için kullanın pRV1 6.25 µg, pH21, pFdelta6, 25 µg, pAAV-p (Cry1) 12.5 µg 6.25 µg-intron336-Venus-NLS-D2-WPRE-HGHpA ve 120 µL transfection reaktif.</li>
	<li>72 h transfection sonra bir pipet silah kullanarak her plaka hücrelerden ayırmak; hücreleri iki 50 mL tüpler içine hasat.</li>
	<li>Hücreleri 800 x g 10 dk de cips ve süpernatant atın. Hücreleri fosfat tamponlu tuz (PBS) 20 mL her tüpün içine yerleştirerek yıkayın; hücreleri 800 x g 10 dk de cips ve süpernatant atın.</li>
	<li>Granül 150 mM NaCl ve 20 mM Tris çözüm, pH 8.0 resuspend; çözüm/tüp 25 mL kullanın. Taze hazırlanmış % 10 sodyum deoxycholate (içinde dH2O) 1,25 mL her tüp için ekleyin. Benzonase nükleaz mL başına 50 adet son bir konsantrasyon ekleyin ve iyice karıştırın. 1s için 37 ° C'de kuluçkaya.</li>
	<li>Hücresel enkaz 3000 x g 15dk için de centrifuging tarafından kaldırın. Daha fazla tüm enkaz 0,45 mikron şırınga filtreden karışımı iterek kaldırıldığından emin olmak; Bu adımı heparin sütunlarının engelleme engellemeye yardımcı olur.</li>
	<li>Peristaltik pompa kullanarak heparin sütunlarını ayarlama; 1 mL/dk, yok hava kabarcıkları sütunlara tanıtıldı sağlanması için akış hızı ayarlayın.</li>
	<li>Bir 150 mM NaCl, 20 mM Tris çözüm, pH 8,0 10 mL içeren sütunlar equilibrate. Her sütun için virüs içeren çözüm ekleyin. Bir 100 mm NaCl, 20 mM Tris çözüm, pH 8.0 20 mL sütunlarla yıkayın. Sonra 5 mL şırınga kullanarak, ardından 1 mL 300 mm NaCl ve 20 mM Tris çözüm, pH 8.0 sütunlar 1 mL 200 mm NaCl ve 20 mM Tris çözüm pH 8.0, ile yıkayın.</li>
	<li>450 mM NaCl, 20 mM Tris çözüm, faz 8.0, 4 mL tarafından takip 3 mL 400 mM NaCl, 20 mM Tris çözüm, faz 8.0, virüs elute için bir 5 mL şırınga kullanın ve son olarak 3 mL 500 mm NaCl tarafından , 20 mM Tris çözüm, faz 8.0. Ayıklanan malzemeleri toplamak.</li>
	<li>Rekombinant adeno ilişkili virüs (rAAV) konsantrasyon için çıkarılan malzemeler, bir anda 4 mL santrifüj filtre cihazları 100.000 moleküler ağırlığı kesme yüklemek. Her 4-mL örnek akış yoluyla atarak oda sıcaklığında 5 min için 2000 x g, santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Tüm çıkarılan malzemeler santrifüj filtre cihazları çalıştırdığınız zaman PBS 4 mL ekleyin ve karışımı yaklaşık 250 μL santrifüj kapasitesi. RAAVs Kaldır (viral titresi-meli var olmak hakkında 2-8 x 1012 viral parçacıkların mL başına) santrifüj filtre cihazları, aliquot ve-80 ° C kadar kullanım mağazasında. Bu aşamada, virüs için birkaç ay depolanabilir.</li>
</ol>3. rAAV enjeksiyon ve yetişkin fare SCN (sahne) içine Optik Fiber ekleme
<ol><li>Sirkadiyen floresans muhabir taşıyan rAAVs enjeksiyon SCN içine<ol>
<li>5 µL rAAV yük (virüs titresi ilgili 2-8 x 1012 virüs parçacıkları mL başına) mikro şırınga içine.</li>
		<li>Bir yetişkin fare (2 için 5-aylık, C57BL/6 arka plan) tedavisiydi (80 mg/kg) ile mayi enjeksiyon yolu ile anestezi. Yeterli bir ayak parmağı-çimdik yanıt eksikliği ile anestezi derinliği için kontrol edin.</li>
		<li>Kürk fare başından kaldırın ve sonra fareyi stereotaksik aparatı monte için makas kullanın. Yolu ile dolaşan sıcak su battaniye ya da başka bir ısıtma cihazı imzalat hayvanlar için bir ısı kaynağı sağlar. Not: Alternatif olarak, kürk kaldırmak için depilatory krem veya elektrikli saç kesme makineleri kullanın.</li>
		<li>Cerrahi sitesi uygun dezenfeksiyon ajanlar ile temizleyin. Örneğin, bu arasında steril su ya da alkol ve iyot, betadin veya klorheksidin scrubs alternatif olarak sulandırmak. En az 3 kere tekrar edin. Cerrahi sitesi asmak.</li>
		<li>Bir kesik kafa derisi içinde yapmak ve kafatası maruz makas kullanın.</li>
		<li>Bregma ve lambda aynı yatay düzlemde çoğu stereotaksik aparatı ayarlayın; bregma iki sathını aynı yatay düzlemde olun.</li>
		<li>Kullanım bir steril pamuklu çubukla H2O2/h2O beyin kapaklarini zarar için %4 oranında batırılmış. O zaman bir temiz, steril pamuklu çubukla temizleyin ve kafatası yüzeyini kuru için kullanın.</li>
		<li>Mikro bir matkap kullanarak, bir delik yaklaşık 1 mm çap 0,46 mm arka ve 0,25 mm bregma için yanal olun.</li>
		<li>
Fi Temiz pamuk steril bez fizyolojik serum çözüm ile kemik parçaları beynin maruz yüzeyinden temizlemek için kullanın.</li>
		<li>Beyin, mikro şırınga ucu 0,46 mm arka olduğunu kontrol ettikten ve kafatası yüzeyinden 0,25 mm lateral bregma ve 5.7 mm derin bir mikro şırınga takın.</li>
		<li>500 enjekte rAAV (50 nL min-1) mikro şırınga rAAV tam difüzyon sağlamak için enjeksiyon sonra 10 dk için yerinde bırakarak SCN (sahne), içine nL.</li>
		<li>Yavaş yavaş mikro şırınga geri alıyorum.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fiber optik sahne alanı'na ekleyin.<ol>
<li>Bir fiber optik bıçak kullanarak, bir lif 17 mm uzunluğu, optik fiber her iki tarafında düzgün olduğundan emin kesti.</li>
		<li>Optik lif seramik yüksük yerleştirin ve fiber optik ve seramik hakla yüzeylerin floş sağlama optik fiber ile metil etil keton peroksit (AB tutkal), seramik hakla için düzeltin.</li>
		<li>Soğuk sterilant çözüm veya etilen oksit varlığımla temiz.</li>
		<li>Sonra rAAV enjeksiyon (adım 3.1.11), seramik hakla içeren optik fiber SCN (sahne) yerleştirin.</li>
		<li>Seramik hakla ve diş reçine kullanarak kafatası üzerine fiber optik düzeltmek ve kurumasını sağlar.</li>
		<li>Diş reçine yüzey ile arka oje sürün. 3.1.2 için 3.2.5, rAAV denetimi için gerçek enjeksiyon atlama özetlenen yordamları yineleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ameliyat sonrası bakım<ol>
<li>Fareler gibi buprenorfin 2 mg/kg vücut ağırlığı, ameliyat sonrası ağrı kesici sağlamak subkutan, günde iki kez.</li>
		<li>Anesteziden geliyorlar iken fare kurtarma kafese koyun.</li>
		<li>Tek tek bir koşulda 12 h açık/koyu (ışık şiddeti ~ 100 lux kafesin dibinde) gıda/su kullanılabilir ad libitumile ev fareler. Sekiz gün daha fazla deneme önce yeterli kurtarma süresi için izin vermek ve en uygun floresan muhabir ifade sağlamak için ayrılan.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. in vivo floresans sinyal izleme ve veri toplama
<ol><li>Sekiz gün ameliyat sonra bağlanmak fare kafasına fiber floresans sinyal kayıt memurlar ile (Örn., Gene Observer). Arka plan sinyal kurmak için denetim fareler SCN floresans sinyal kontrol edin. Gözlem ve floresan sinyal İzleyicisi'ni kullanarak bu sinyal ölçümü yapmak.</li>
	<li>Deneysel fare floresans sinyalinin kontrol fare aynı operasyonu ile değerlendirin. Bu büyük olasılıkla belgili tanımlık uç optik fiber SCN kaçırdı gösterir gibi olan viral vektör alınan ama hangi yalnızca arka plan sinyal analizi, görüntüler fare hariç. Bu ilk önlemleri sonra fareler floresans sinyal stabilize etmek için izin vermek başka bir 2 hafta için ev onların kafes dönün.</li>
	<li>3 hafta sonra farelerin floresans sinyal kayıt memurlar ile bağlayın. 15 floresans ölçmek s 100 Hz frekansta her 10 min. Bu ölçümler sırasında fareler yiyecek/su kullanılabilir ad libitumile onların kafes içinde serbestçe hareket ediyor. Bir ışık şiddeti ~ 100 lux, kafesin altındaki kullanın ve bir uç arasında 15-20 µW optik fiber lazer güç.</li>
	<li>Tüm kayıtları tamamlanmasından sonra fare ile % 4 paraformaldehyde, sıvı ve kaldırmak ve optik fiber yerleşimini kontrol etmek için beyin dilim. Optik fiber uç doğru SCN implante değil Eğer fareler çözümleme dışı bırakmak.</li>
</ol>5. veri analizi ve sunum
<ol><li>Ölçü floresans sinyal her 10 min 15 s, 100 Hz 1500 veri noktaları verim, bir frekansta. Bu 1500 puan ortalama floresans sinyal vasıl birisi tutkucun zaman nokta çevirir. Zaman içinde birden çok ortalamalar komplo Cry1 transkripsiyon ritmi altında serbestçe fare hareket eden bir denetim ışık koşulunda SCN (sahne) karşılık gelen bir sinyal zaman eğrisi oluşturur.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Welsh, D. K., Takahashi, J. S., Kay, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suprachiasmatic+nucleus:+cell+autonomy+and+network+properties.">Suprachiasmatic nucleus: cell autonomy and network properties.</a> Annual Review of Physiology. 72, 551-577 (2010).</li><li>Zhang, E. E., Kay, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clocks+not+winding+down:+unravelling+circadian+networks.">Clocks not winding down: unravelling circadian networks.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11, 764-776 (2010).</li><li>Takahashi, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+architecture+of+the+mammalian+circadian+clock.">Transcriptional architecture of the mammalian circadian clock.</a> Nature Reviews Genetics. 18, 164-179 (2017).</li><li>Yoo, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PERIOD2::LUCIFERASE+real-time+reporting+of+circadian+dynamics+reveals+persistent+circadian+oscillations+in+mouse+peripheral+tissues.">PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 101, 5339-5346 (2004).</li><li>Davidson, A. J., Castanon-Cervantes, O., Leise, T. L., Molyneux, P. C., Harrington, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+jet+lag+in+the+mouse+suprachiasmatic+nucleus+and+peripheral+circadian+timing+system.">Visualizing jet lag in the mouse suprachiasmatic nucleus and peripheral circadian timing system.</a> European Journal of Neuroscience. 29, 171-180 (2009).</li><li>Savelyev, S. A., Larsson, K. C., Johansson, A. S., Lundkvist, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slice+preparation,+organotypic+tissue+culturing+and+luciferase+recording+of+clock+gene+activity+in+the+suprachiasmatic+nucleus.">Slice preparation, organotypic tissue culturing and luciferase recording of clock gene activity in the suprachiasmatic nucleus.</a> Journal of Visualized Experiments. (48), (2011).</li><li>Yamaguchi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression:+View+of+a+mouse+clock+gene+ticking.">Gene expression: View of a mouse clock gene ticking.</a> Nature. 409, 684-684 (2001).</li><li>Ono, D., Honma, K. I., Honma, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+and+ultradian+rhythms+of+clock+gene+expression+in+the+suprachiasmatic+nucleus+of+freely+moving+mice.">Circadian and ultradian rhythms of clock gene expression in the suprachiasmatic nucleus of freely moving mice.</a> Science Reports. 5, 12310 (2015).</li><li>Ono, D., Honma, S., Honma, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+PER2::LUC+rhythms+in+the+olfactory+bulb+of+freely+moving+mice+depend+on+the+suprachiasmatic+nucleus+but+not+on+behaviour+rhythms.">Circadian PER2::LUC rhythms in the olfactory bulb of freely moving mice depend on the suprachiasmatic nucleus but not on behaviour rhythms.</a> European Journal of Neuroscience. 42, 3128-3137 (2015).</li><li>Ono, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissociation+of+Per1+and+Bmal1+circadian+rhythms+in+the+suprachiasmatic+nucleus+in+parallel+with+behavioral+outputs.">Dissociation of Per1 and Bmal1 circadian rhythms in the suprachiasmatic nucleus in parallel with behavioral outputs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 114, E3699-E3708 (2017).</li><li>Reppert, S. M., Weaver, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+circadian+timing+in+mammals.">Coordination of circadian timing in mammals.</a> Nature. 418, 935-941 (2002).</li><li>Liu, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redundant+function+of+REV-ERBalpha+and+beta+and+non-essential+role+for+Bmal1+cycling+in+transcriptional+regulation+of+intracellular+circadian+rhythms.">Redundant function of REV-ERBalpha and beta and non-essential role for Bmal1 cycling in transcriptional regulation of intracellular circadian rhythms.</a> PLoS Genetics. 4, e1000023 (2008).</li><li>Maywood, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+core+circadian+feedback+loop+in+suprachiasmatic+nucleus+of+mCry1-luc+transgenic+reporter+mouse.">Analysis of core circadian feedback loop in suprachiasmatic nucleus of mCry1-luc transgenic reporter mouse.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110, 9547-9552 (2013).</li><li>Ukai-Tadenuma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delay+in+feedback+repression+by+cryptochrome+1+is+required+for+circadian+clock+function.">Delay in feedback repression by cryptochrome 1 is required for circadian clock function.</a> Cell. 144, 268-281 (2011).</li><li>McClure, C., Cole, K. L., Wulff, P., Klugmann, M., Murray, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+titering+of+recombinant+adeno-associated+viral+vectors.">Production and titering of recombinant adeno-associated viral vectors.</a> Journal of Visualized Experiments. 57, e3348 (2011).</li><li>Yamaguchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mice+genetically+deficient+in+vasopressin+V1a+and+V1b+receptors+are+resistant+to+jet+lag.">Mice genetically deficient in vasopressin V1a and V1b receptors are resistant to jet lag.</a> Science. 342, 85-90 (2013).</li><li>Nagano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+abrupt+shift+in+the+day/night+cycle+causes+desynchrony+in+the+mammalian+circadian+center.">An abrupt shift in the day/night cycle causes desynchrony in the mammalian circadian center.</a> Journal of Neuroscience. 23, 6141-6151 (2003).</li><li>Golombek, D. A., Rosenstein, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology+of+Circadian+Entrainment.">Physiology of Circadian Entrainment.</a> Physiological Reviews. 90, 1063-1102 (2010).</li><li>Mei, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+in+vivo+recording+of+circadian+rhythms+in+brains+of+freely+moving+mice.">Long-term in vivo recording of circadian rhythms in brains of freely moving mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115, 4276-4281 (2018).</li></ol>

Yazarlar hiçbir ifşa etmek çıkar çatışması var.

Dilim kültür4,5, RT-PCR16ve in situ hibridizasyon17, hayvanların öldürülmesi gerektiren gibi ex vivo Yöntemler aksine kayıt yöntemi içinde vivo sağlar Müfettişler sirkadiyen gen ekspresyonu yaşayan hayvan çalışmaya. Bu nedenle, bu teknoloji farklı fiziksel tedirginlikler (Örneğin, uykusuzluk, stres, gıda alımı, vb) sinir sirkadiyen saat üzerinde et...

Memelilerde, bütün vücudun sirkadiyen ritim eksojen çevresel değişiklikler (Örneğin, ışık, sıcaklık, stres, vb)1bir kişinin yanıt koordine etmek suprachiasmatic çekirdeği (SCN) yönetir. Çekirdek saat bileşenleri Per1-3, Cry1-2, saatve Bmal1oluşur ve her hücrenin sirkadiyen saat düzenleyen merkezi bir rol oynamaktadır. Transkripsiyon harekete geçirmek, saat/BMAL1, başına ifade ikna etmek için heterodimerdir davranan SCN her hücrede ve CRY. PER / CRY karmaşık sonra 24 saat tam2,3' e alır bir transkripsiyon çeviri geri besleme döngüsü oluşturmak için saat/BMAL1 işlevini engeller.
SCN önceki çalışmaları esas olarak ex vivo SCN dilim kültür Yöntem4,5,6 istihdam ve bu yaklaşım değerli bilgileri sağlamış olması iken, kendi sınırlamaları yeteneğimizi inhibe eksojen uyaranlara (Örneğin, ışık) etkisi kritik bu bölgede ikamet eden hücrelerin yanı sıra diğer beyin çekirdekleri SCN üzerinde etkisi ile ilgili verileri alır. 2001 yılında Hitoshi Okamura'nın grup içinde vivo monitör sirkadiyen saat gen ekspresyonu bioluminescence sisteme serbestçe fare7hareketli SCN (sahne) kullanmak için ilkti. Ken-Ichi Honma'nın grup daha fazla kayıt sistemi SCN (sahne)8',9,10bioluminescence vivo içinde gelişmekte olan son birkaç yıl harcadı. Birlikte, bu çalışmalarda araştırmacılar ile sirkadiyen saat sürekli karanlık veya ışık nabız sonra izleme olanağı sağladı. Ancak, bioluminescence sürekli açık/koyu döngüsü sırasında ışık sirkadiyen saat11, SCN-aracılı sürüklenme için gerekli baskın sinyal olması ile birleştiğinde izlenmesi için izin vermek için çok karanlık olduğu için yoktur bioluminescence kayıt ile ilgili sınırlamalar üstesinden deneysel Yöntem geliştirme için artan talebi. Geçerli raporu fareler serbestçe hareket SCN vivo içinde sirkadiyen saat izlemek için inşa edilmiş bir floresan tabanlı sistem açıklar. Bu kullanımı kolay yöntem sürekli açık/koyu döngüsü sırasında izleme izin verir ve gerçek zamanlı olarak ve yüksek zamansal çözünürlükte SCN sirkadiyen saat genlerin transkripsiyon uzun vadeli gözlenmesi için izin verir.

<table><tbody><tr><td>KOD Plus Neo</td><td>TOYOBO</td><td>KOD-401</td><td>Reagent</td></tr><tr><td>pVENUS-N1</td><td>addgene</td><td>#61854</td><td>Plasmid</td></tr><tr><td>pcDNA3.3_d2eGFP</td><td>addgene</td><td>#26821</td><td>Plasmid</td></tr><tr><td>pAAV-EF1a-double floxed-hChR2(H134R)-mCherry-WPRE-HGHpA</td><td>addgene</td><td>#20297</td><td>Plasmid</td></tr><tr><td>MluI</td><td>Thermo Scientific</td><td>FD0564</td><td>Reagent</td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>Thermo Scientific</td><td>FD0274</td><td>Reagent</td></tr><tr><td>Gibson Assembly Mix</td><td>NEB</td><td>E2611s</td><td>Reagent</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td>12566014</td><td>Reagent</td></tr><tr><td>Syringe Filter</td><td>EMD Millipore</td><td>SLHV033RS</td><td>0.45&amp;nbsp;&amp;micro;m&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>HiTrap heparin columns</td><td>gelifesciences</td><td>17-0406-01</td><td>1 mL&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Amicon ultra-4 centrifugal filter</td><td>EMD Millipore</td><td>&amp;nbsp;UFC810024</td><td>100,000 MWCO</td></tr><tr><td>Benzonase nuclease</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1014</td><td>Reagent</td></tr><tr><td>Sodium deoxycholate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5670</td><td>Make fresh solution for each batch</td></tr><tr><td>mouse stereotaxic apparatus</td><td>B&amp;amp;E TEKSYSTEMS LTD</td><td>#SR-5M/6M</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>pentobarbital</td><td>SigmaAldrich</td><td>#1507002</td><td>Reagent</td></tr><tr><td>mouse stereotaxic apparatus</td><td>B&amp;amp;E TEKSYSTEMS LTD</td><td>#SR-5M/6M</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Hydrogen peroxide solution</td><td>SigmaAldrich</td><td>#216763</td><td>Reagent</td></tr><tr><td>Optical Fiber</td><td>Thorlabs</td><td>FT200EMT</td><td>0.39 NA, &amp;Oslash;200 &amp;micro;m</td></tr><tr><td>microsyringe pump</td><td>Nanoliter 2000 Injector, WPI</td><td></td><td>Equipment</td></tr><tr><td>ceramic ferrule</td><td>Shanghai Fiblaser</td><td></td><td>230&amp;thinsp;&amp;mu;m I.D., 2.5 mm O.D.</td></tr><tr><td>Gene Observer</td><td>BiolinkOptics</td><td></td><td>Equipment</td></tr></tbody></table>

in vivo monitoring of circadian clock gene expression in the mouse suprachiasmatic nucleus using fluorescence reporters

Bu teknik aracılı fiber optik floresans kayıtları rekombinant adeno ilişkili virüs dayalı gen gazetecilere kesin teslim ile birleştirir. Bu yeni ve kullanımı kolay vivo içinde floresans izleme sistemi saat gene, Cry1, transkripsiyon ritmine fareler serbestçe hareket suprachiasmatic çekirdeğinde (SCN) kaydetmek için geliştirilmiştir. Bunu yapmak için bir Cry1 transkripsiyon floresans muhabir tasarlanmış ve Adeno ilişkili virüs paketlenmiş. Arıtılmış, konsantre virüs SCN (sahne) o zaman beynin yüzeyine tespit edildi bir optik kablo, ekleme ve ardından fare içine enjekte ettiler. Hayvanlar için ev onların kafes döndü ve bir 1 ay ameliyat sonrası iyileşme döneminde yeterli muhabir ifade emin olmak izin. Floresan sonra serbestçe fareler bir vivo içinde bizim kurum olarak inşa edilmiş sistem izleme yoluyla hareket kaydedildi. Kayıt sistemi içinde vivo için 488 nm lazer ile bir 1 × 4 ışın-kırık ışık eşit güç dört lazer uyarma çıkışları bölünmüş birleştiğinde. Bu kurulum bize aynı anda dört hayvanlardan kaydetmek etkin. Her biri verilmiş floresan sinyallerini bir photomultiplier tüp ve bir veri alma kartı toplanmıştır. Buna ek olarak önceki bioluminescence vivo içinde sirkadiyen saat kayıt tekniği için kayıt sistemi bu floresans in vivo sirkadiyen saat gen ekspresyonu ışık döngüsü sırasında kayıt izin.

Floresans muhabir tasarımı Cry1 Şekil 1Agösterisinde idi. Yaklaşımı kullanarak ayrıntılı 500 yukarıda, nL rAAV-p (Cry1) - intron336 - Venüs-NLS-D2 başarıyla bir yetişkin fare SCN enjekte ettiler ve sağlam Venüs ifade (Şekil 1B, 1 C) sergilenmektedir. Floresan sinyallerini 12 h/12 h açık/koyu (LD) ve karanlık/koyu (DD) koşulları (Şekil 2) alt?...

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Monitoring of Circadian Clock Gene Expression in the Mouse Suprachiasmatic Nucleus Using Fluorescence Reporters at JoVE.com

In Vivo Monitoring of Circadian Clock Gene Expression in the Mouse Suprachiasmatic Nucleus Using Fluorescence Reporters

Bu yeni geliştirilmiş floresans tabanlı teknoloji uzun vadeli, suprachiasmatic çekirdeği (SCN) sirkadiyen saat genlerde transkripsiyonu gerçek zamanlı olarak ve yüksek zamansal çözünürlükte fareler serbestçe hareket izleme sağlar.

Vivo Sirkadiyen saat gen ekspresyonu floresans gazetecilere kullanarak fare Suprachiasmatic çekirdeği olarak izlenmesi

This technique combines optical fiber mediated fluorescence recordings with the precise delivery of recombinant adeno-associated virus based gene ...

in-vivo-monitoring-circadian-clock-gene-expression-mouse

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Vivo Monitoring of Circadian Clock Gene Expression in the Mouse Suprachiasmatic Nucleus Using Fluorescence Reporters

8.2K Görüntüleme.  Peking University. Bu yeni geliştirilmiş floresans tabanlı teknoloji uzun vadeli, suprachiasmatic çekirdeği (SCN) sirkadiyen saat genlerde transkripsiyonu gerçek zamanlı olarak ve yüksek zamansal çözünürlükte fareler serbestçe hareket izleme sağlar.

Video: In Vivo Monitoring of Circadian Clock Gene Expression in the Mouse Suprachiasmatic Nucleus Using Fluorescence Reporters

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental changes. Considerable progress in our understanding of the tight connection between the circadian clock and most aspects of physiology has been made in the field over the last decade. However, unraveling the molecular basis that underlies the function of the circadian oscillator in humans stays of highest technical challenge. Here, we provide a detailed description of an experimental approach for long-term (2-5 days) bioluminescence recording and outflow medium collection in cultured human primary cells. For this purpose, we have transduced primary cells with a lentiviral luciferase reporter that is under control of a core clock gene promoter, which allows for the parallel assessment of hormone secretion and circadian bioluminescence. Furthermore, we describe the conditions for disrupting the circadian clock in primary human cells by transfecting siRNA targeting CLOCK. Our results on the circadian regulation of insulin secretion by human pancreatic islets, and myokine secretion by human skeletal muscle cells, are presented here to illustrate the application of this methodology. These settings can be used to study the molecular makeup of human peripheral clocks and to analyze their functional impact on primary cells under physiological or pathophysiological conditions.

Here, we describe settings to monitor in parallel circadian bioluminescence and the secretory activity of human islet cells and primary myotubes. For this, we employed lentiviral gene delivery of a luciferase core clock reporter, followed by in vitro synchronization and collection of outflow medium by continuous cell perifusion.

İnsan Primer Hücre Kültürleri içinde Sirkadyen Saat Gen İfade ve Hormon salgısını Paralel Ölçümü

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Genetik

In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells

The circadian rhythm is a fundamental physiological process present in all organisms that regulates biological processes ranging from gene expression to sleep behavior. In vertebrates, circadian rhythm is controlled by a molecular oscillator that functions in both the suprachiasmatic nucleus (SCN; central pacemaker) and individual cells comprising most peripheral tissues. More importantly, disruption of circadian rhythm by exposure to light-at-night, environmental stressors and/or toxicants is associated with increased risk of chronic diseases and aging. The ability to identify agents that can disrupt central and/or peripheral biological clocks, and agents that can prevent or mitigate the effects of circadian disruption, has significant implications for prevention of chronic diseases. Although rodent models can be used to identify exposures and agents that induce or prevent/mitigate circadian disruption, these experiments require large numbers of animals. In vivo studies also require significant resources and infrastructure, and require researchers to work all night. Thus, there is an urgent need for a cell-type appropriate in vitro system to screen for environmental circadian disruptors and enhancers in cell types from different organs and disease states. We constructed a vector that drives transcription of the destabilized luciferase in eukaryotic cells under the control of the human PERIOD 2 gene promoter. This circadian reporter construct was stably transfected into human mammary epithelial cells, and circadian responsive reporter cells were selected to develop the in vitro bioluminescence assay. Here, we present a detailed protocol to establish and validate the assay. We further provide details for proof of concept experiments demonstrating the ability of our in vitro assay to recapitulate the in vivo effects of various chemicals on the cellular biological clock. The results indicate that the assay can be adapted to a variety of cell types to screen for both environmental disruptors and chemopreventive enhancers of circadian clocks.

In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells

An in vitro bioluminescence assay to determine cellular circadian rhythm in mammary epithelial cells is presented. This method utilizes mammalian cell reporter plasmids expressing destabilized luciferase under the control of the PERIOD 2 gene promoter. It can be adapted to other cell types to evaluate organ-specific effects on circadian rhythm.

Vitro Sirkadiyen ritim meme epitel hücreleri ayırdetmek için bioluminescence tahlil

The circadian rhythm is a fundamental physiological process present in all organisms that regulates biological processes ranging from gene expression to ...

Slice Preparation, Organotypic Tissue Culturing and Luciferase Recording of Clock Gene Activity in the Suprachiasmatic Nucleus

A central circadian (~24 hr) clock coordinating daily rhythms in physiology and behavior resides in the suprachiasmatic nucleus (SCN) located in the anterior hypothalamus. The clock is directly synchronized by light via the retina and optic nerve. Circadian oscillations are generated by interacting negative feedback loops of a number of so called "clock genes" and their protein products, including the Period (Per) genes. The core clock is also dependent on membrane depolarization, calcium and cAMP 1. The SCN shows daily oscillations in clock gene expression, metabolic activity and spontaneous electrical activity. Remarkably, this endogenous cyclic activity persists in adult tissue slices of the SCN 2-4. In this way, the biological clock can easily be studied in vitro, allowing molecular, electrophysiological and metabolic investigations of the pacemaker function.
The SCN is a small, well-defined bilateral structure located right above the optic chiasm 5. In the rat it contains ~8.000 neurons in each nucleus and has dimensions of approximately 947 &mu;m (length, rostrocaudal axis) x 424 &mu;m (width) x 390 &mu;m (height) 6. To dissect out the SCN it is necessary to cut a brain slice at the specific level of the brain where the SCN can be identified. Here, we describe the dissecting and slicing procedure of the SCN, which is similar for mouse and rat brains. Further, we show how to culture the dissected tissue organotypically on a membrane 7, a technique developed for SCN tissue culture by Yamazaki et al. 8. Finally, we demonstrate how transgenic tissue can be used for measuring expression of clock genes/proteins using dynamic luciferase reporter technology, a method that originally was used for circadian measurements by Geusz et al. 9. We here use SCN tissues from the transgenic knock-in PERIOD2::LUCIFERASE mice produced by Yoo et al. 10. The mice contain a fusion protein of PERIOD (PER) 2 and the firefly enzyme LUCIFERASE. When PER2 is translated in the presence of the substrate for luciferase, i.e. luciferin, the PER2 expression can be monitored as bioluminescence when luciferase catalyzes the oxidation of luciferin. The number of emitted photons positively correlates to the amount of produced PER2 protein, and the bioluminescence rhythms match the PER2 protein rhythm in vivo 10. In this way the cyclic variation in PER2 expression can be continuously monitored real time during many days. The protocol we follow for tissue culturing and real-time bioluminescence recording has been thoroughly described by Yamazaki and Takahashi 11.

The procedure of preparing slices containing the adult mouse hypothalamic suprachiasmatic nucleus (SCN), and a rapid way to culture the SCN tissue in organotypic culture condition, are reported. Further, the measurement of oscillatory clock gene protein expression using dynamic luciferase reporter technology is described.

Dilim hazırlanması, Organotipik Doku ekimi ve suprakiazmatik nükleus Saat Gen Faaliyet Lusiferaz Kayıt

A central circadian (~24 hr) clock coordinating daily rhythms in physiology and behavior resides in the suprachiasmatic nucleus (SCN) located in the ...

Nörobilim

Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate a method to fabricate suction electrodes that are used to examine CPG activity, or fictive locomotion, in dissected rodent spinal cords. The rodent spinal cords are placed in artificial cerebrospinal fluid and the ventral roots are drawn into the suction electrode. The electrode is constructed by modifying a commercially available suction electrode. A heavier silver wire is used instead of the standard wire given by the commercially available electrode. The glass tip on the commercial electrode is replaced with a plastic tip for increased durability. We prepare hand drawn electrodes and electrodes made from specific sizes of tubing, allowing consistency and reproducibility. Data is collected using an amplifier and neurogram acquisition software. Recordings are performed on an air table within a Faraday cage to prevent mechanical and electrical interference, respectively.

A demonstration of the fabrication and use of an extracellular suction electrode used to measure electrophysiological recordings of neonatal rodent spinal cords in vitro

Omurilik Elektrofizyoloji II: Ekstrasellüler Emiş Elektrot İmalatı

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate ...

Real-time Bioluminescence Imaging of Notch Signaling Dynamics during Murine Neurogenesis

Notch signaling regulates the maintenance of neural stem/progenitor cells by cell-cell interactions. The components of Notch signaling exhibit dynamic expression. Notch signaling effector Hes1 and the Notch ligand Delta-like1 (Dll1) are expressed in an oscillatory manner in neural stem/progenitor cells. Because the period of the oscillatory expression of these genes is very short (2 h), it is difficult to monitor their cyclic expression. To examine such rapid changes in the gene expression or protein dynamics, fast response reporters are required. Because of its fast maturation kinetics and high sensitivity, the bioluminescence reporter luciferase is suitable to monitor rapid gene expression changes in living cells. We used a destabilized luciferase reporter for monitoring the promoter activity and a luciferase-fused reporter for visualization of protein dynamics at single cell resolution. These bioluminescence reporters show rapid turnover and generate very weak signals; therefore, we have developed a highly sensitive bioluminescence imaging system to detect such faint signals. These methods enable us to monitor various gene expression dynamics in living cells and tissues, which are important information to help understand the actual cellular states.

Neural stem/progenitor cells exhibit various expression dynamics of Notch signaling components that lead to different outcomes of cellular events. Such dynamic expression can be revealed by real-time monitoring, not by static analysis, using a highly sensitive bioluminescence imaging system that enables visualization of rapid changes in gene expressions.

Murin Nörogenezi Sırasında Çentik Sinyal Dinamiğinin Gerçek Zamanlı Biyolüminesans Görüntülemesi

Notch signaling regulates the maintenance of neural stem/progenitor cells by cell-cell interactions. The components of Notch signaling exhibit dynamic ...

Gelişim Biyolojisi

Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

The circadian pacemaker circuit orchestrates rhythmic behavioral and physiological outputs coordinated with environmental cues, such as day/night cycles. The molecular clock within each pacemaker neuron generates circadian rhythms in gene expression, which underlie the rhythmic neuronal functions essential to the operation of the circuit. Investigation of the properties of the individual molecular oscillators in different subclasses of pacemaker neurons and their interaction with neuronal signaling yields a better understanding of the circadian pacemaker circuit. Here, we present a time-lapse fluorescent microscopy approach developed to monitor the molecular clockwork in clock neurons of cultured Drosophila larval brain. This method allows the multi-day recording of the rhythms of genetically encoded fluorescent circadian reporters at single-cell resolution. This setup can be combined with pharmacological manipulations to closely analyze real-time response of the molecular clock to various compounds. Beyond circadian rhythms, this multipurpose method in combination with powerful Drosophila genetic techniques offers the possibility to study diverse neuronal or molecular processes in live brain tissue.

Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

The goal of this protocol is to establish ex vivo Drosophila larval brain culture optimized to monitor circadian molecular rhythms with long-term fluorescence time-lapse imaging. The application of this method to pharmacological assays is also discussed.

Tek hücreli çözünürlük Floresans canlı görüntüleme Drosophila sirkadiyen saatler larva beyin kültür

The circadian pacemaker circuit orchestrates rhythmic behavioral and physiological outputs coordinated with environmental cues, such as day/night cycles. ...

Monitoring Cell-autonomous Circadian Clock Rhythms of Gene Expression Using Luciferase Bioluminescence Reporters

In mammals, many aspects of behavior and physiology such as sleep-wake cycles and liver metabolism are regulated by endogenous circadian clocks (reviewed1,2). The circadian time-keeping system is a hierarchical multi-oscillator network, with the central clock located in the suprachiasmatic nucleus (SCN) synchronizing and coordinating extra-SCN and peripheral clocks elsewhere1,2. Individual cells are the functional units for generation and maintenance of circadian rhythms3,4, and these oscillators of different tissue types in the organism share a remarkably similar biochemical negative feedback mechanism. However, due to interactions at the neuronal network level in the SCN and through rhythmic, systemic cues at the organismal level, circadian rhythms at the organismal level are not necessarily cell-autonomous5-7. Compared to traditional studies of locomotor activity in vivo and SCN explants ex vivo, cell-based in vitro assays allow for discovery of cell-autonomous circadian defects5,8. Strategically, cell-based models are more experimentally tractable for phenotypic characterization and rapid discovery of basic clock mechanisms5,8-13.
Because circadian rhythms are dynamic, longitudinal measurements with high temporal resolution are needed to assess clock function. In recent years, real-time bioluminescence recording using firefly luciferase as a reporter has become a common technique for studying circadian rhythms in mammals14,15, as it allows for examination of the persistence and dynamics of molecular rhythms. To monitor cell-autonomous circadian rhythms of gene expression, luciferase reporters can be introduced into cells via transient transfection13,16,17 or stable transduction5,10,18,19. Here we describe a stable transduction protocol using lentivirus-mediated gene delivery. The lentiviral vector system is superior to traditional methods such as transient transfection and germline transmission because of its efficiency and versatility: it permits efficient delivery and stable integration into the host genome of both dividing and non-dividing cells20. Once a reporter cell line is established, the dynamics of clock function can be examined through bioluminescence recording. We first describe the generation of P(Per2)-dLuc reporter lines, and then present data from this and other circadian reporters. In these assays, 3T3 mouse fibroblasts and U2OS human osteosarcoma cells are used as cellular models. We also discuss various ways of using these clock models in circadian studies. Methods described here can be applied to a great variety of cell types to study the cellular and molecular basis of circadian clocks, and may prove useful in tackling problems in other biological systems.

Circadian clocks function within individual cells, i.e., they are cell-autonomous. Here, we describe methods for generating cell-autonomous clock models using non-invasive, luciferase-based real-time bioluminescence technology. Reporter cells provide tractable, functional model systems for studying circadian biology.

Lusiferaz Biyoparlaklık Gazeteciler kullanma Gen Ekspresyonunun Hücre-özerk Sirkadiyen Saat Ritimleri İzlenmesi

In mammals, many aspects of behavior and physiology such as sleep-wake cycles and liver metabolism are regulated by endogenous circadian clocks ...

Biyoloji

Rapid Analysis of Circadian Phenotypes in Arabidopsis Protoplasts Transfected with a Luminescent Clock Reporter

The plant circadian clock allows the anticipation of daily changes to the environment. This anticipation aids the responses to temporally predictable biotic and abiotic stress. Conversely, disruption of circadian timekeeping severely compromises plant health and reduces agricultural crop yields. It is therefore imperative that we understand the intricate regulation of circadian rhythms in plants, including the factors that affect motion of the transcriptional clockwork itself.
Testing circadian defects in the model plant Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) traditionally involves crossing specific mutant lines to a line rhythmically expressing firefly luciferase from a circadian clock gene promoter. This approach is laborious, time-consuming, and could be fruitless if a mutant has no circadian phenotype. The methodology presented here allows a rapid initial assessment of circadian phenotypes. Protoplasts derived from mutant and wild-type Arabidopsis are isolated, transfected with a rhythmically expressed luminescent reporter, and imaged under constant light conditions for 5 days. Luminescent traces will directly reveal whether the free-running period of mutant plants is different from wild-type plants. The advantage of the method is that any Arabidopsis line can efficiently be screened, without the need for generating a stably transgenic luminescent clock marker line in that mutant background.

The circadian clock regulates about a third of the Arabidopsis transcriptome, but the percentage of genes that feed back into timekeeping remains unknown. Here we visualize a method to rapidly assess circadian phenotypes in any mutant line of Arabidopsis using luminescent imaging of a circadian reporter transiently expressed in protoplasts.

Bir Lüminesans Saat Reporter ile Arabidopsis Protoplasts transfekte içinde Sirkadiyen fenotipleri Hızlı Analizi

The plant circadian clock allows the anticipation of daily changes to the environment. This anticipation aids the responses to temporally predictable ...

Flexible Measurement of Bioluminescent Reporters Using an Automated Longitudinal Luciferase Imaging Gas- and Temperature-optimized Recorder (ALLIGATOR)

Luciferase-based reporters of cellular gene expression are in widespread use for both longitudinal and end-point assays of biological activity. In circadian rhythms research, for example, clock gene fusions with firefly luciferase give rise to robust rhythms in cellular bioluminescence that persist over many days. Technical limitations associated with photomultiplier tubes (PMT) or conventional microscopy-based methods for bioluminescence quantification have typically demanded that cells and tissues be maintained under quite non-physiological conditions during recording, with a trade-off between sensitivity and throughput. Here, we report a refinement of prior methods that allows long-term bioluminescence imaging with high sensitivity and throughput which supports a broad range of culture conditions, including variable gas and humidity control, and that accepts many different tissue culture plates and dishes. This automated longitudinal luciferase imaging gas- and temperature-optimized recorder (ALLIGATOR) also allows the observation of spatial variations in luciferase expression across a cell monolayer or tissue, which cannot readily be observed by traditional methods. We highlight how the ALLIGATOR provides vastly increased flexibility for the detection of luciferase activity when compared with existing methods.

Flexible Measurement of Bioluminescent Reporters Using an Automated Longitudinal Luciferase Imaging Gas- and Temperature-optimized Recorder ALLIGATOR

Genetically encoded luciferase is a popular non-invasive reporter of gene expression. Use of an automated longitudinal luciferase imaging gas- and temperature-optimized recorder (ALLIGATOR) enables longitudinal recording from bioluminescent cells under a wide range of conditions. Here we show how ALLIGATOR may be used in the context of circadian rhythms research.

Kollarındaki gazetecilere bir otomatik boyuna Luciferase gaz ve sıcaklık optimize Kaydedici (timsah) Imaging kullanarak esnek ölçüm

Luciferase-based reporters of cellular gene expression are in widespread use for both longitudinal and end-point assays of biological activity. In ...

Sirkadiyen Ritim Çalışmaları için İnsan Bağırsak Enteroidlerinin Optimize Edilmesi

Monitoring Circadian Oscillations with a Bioluminescence Reporter in Organoids

Most living organisms possess circadian rhythms, which are biological processes that occur within a period of approximately 24 h and regulate a diverse repertoire of cellular and physiological processes ranging from sleep-wake cycles to metabolism. This clock mechanism entrains the organism based on environmental changes and coordinates the temporal regulation of molecular and physiological events. Previously, it was demonstrated that autonomous circadian rhythms are maintained even at the single-cell level using cell lines such as NIH3T3 fibroblasts, which were instrumental in uncovering the mechanisms of circadian rhythms. However, these cell lines are homogeneous cultures lacking multicellularity and robust intercellular communications. In the past decade, extensive work has been performed on the development, characterization, and application of 3D organoids, which are in vitro multicellular systems that resemble in vivo morphological structures and functions. This paper describes a protocol for detecting circadian rhythms using a bioluminescent reporter in human intestinal enteroids, which enables the investigation of circadian rhythms in multicellular systems in vitro.

Yazar Spotlight: Çok Hücreli Sistemlerde Sirkadiyen Ritimlerin İn Vitro Araştırmaları

Circadian rhythms, which exist in most organisms, regulate the temporal organization of biological processes. 3D organoids have recently emerged as a physiologically relevant in vitro model. This protocol describes the use of bioluminescent reporters to observe circadian rhythms in organoids, enabling in vitro investigations of circadian rhythms in multicellular systems.

Organoidlerde Biyolüminesans Raportörü ile Sirkadiyen Salınımların İzlenmesi

Most living organisms possess circadian rhythms, which are biological processes that occur within a period of approximately 24 h and regulate a diverse ...